Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Функциональная характеристика Na Published: March 30, 2015 doi: 10.3791/52453
* These authors contributed equally

Abstract

Эндосом подкисление имеет решающее значение для широкого диапазона процессов, таких как переработка белка и деградации, рецептора десенсибилизации и нейромедиаторов нагрузке в синаптических пузырьках. Это подкисление описано быть опосредовано протонных АТФаз, в сочетании с CLC транспортеры хлорида. Высоко-сохраняется электронейтральных протоны перевозчиков, Na + / H + теплообменник (NHE) 6, 7 и 9 также выражены в этих отсеках. Мутации в генах были связаны с человеческими когнитивных и нейродегенеративных заболеваний. Как это ни парадоксально, их роли остаются неизвестными, так как их внутриклеточная локализация помешала подробного функционального характеристику. Эта рукопись показывает способ, чтобы решить эту проблему. Он состоит из отбора мутантных клеточных линий, способных выдерживать острую цитозольного подкисление с сохранением внутриклеточного NHEs на плазматической мембране. Затем изображает две дополнительные протоколы для измерения ионов селективность и активностьэтих теплообменников: (I), основанный на измерениях внутриклеточных рН с помощью флуоресцентной видеомикроскопия, и (II), выполненный на базе быстрой кинетики поглощения лития. Такие протоколы могут быть экстраполированы на другие измерения, не электрогенных транспортеры. Кроме того, процедура отбора, представленные здесь формирует клетки с фенотипом дефектного внутриклеточного хранения. Таким образом, эти клетки также выразить другие везикулярного мембранные белки в плазматической мембране. Поэтому стратегия эксперимента изображены здесь может представлять собой потенциально мощный инструмент для изучения других внутриклеточных белков, которые затем будут высказанные на плазматической мембране вместе с везикулярного Na + / H + теплообменники, используемые для отбора.

Introduction

Большинство внутриклеточных отсеков отображения кислую просвета рН, что является ключевым параметром для созревания, торговли, переработки белков и гормонов и нейротрансмиттеров Загрузка. Было показано, что рН градиент между цитозоле и везикулярной содержания генерируется вакуоли H + АТФазы 1, соединенный с везикулярных CLC хлорида транспортеров 2. И в нокаут (KO) мышей и больных людей, важность этих перевозчиков было выделено тяжелых фенотипов, вызванных мутациями в генах 3-6.

Члены натрий-водородного обменных SLC9A семьи, также называемый NHEs для Na + / H + теплообменников, как было показано, являются ключевыми эффекторами в внутриклеточного рН и регулирования объема клеток, а также в транспортной векторное кислотно-основных эквивалентов по эпителии , Кроме того, в плазматической мембране NHEs, три очень сохраняется Na + / H + теплообменники, NHE 6, 7и 9 выражены в транс-Гольджи сеть и в ранних эндосом 7. Мутации в генах были связаны с Angelman-как или Christianson Синдромы 8-9 семьи на основе аутизма 10 и дефицита внимания с гиперактивностью 11-12. Эти теплообменники также принимали участие в нейродегенеративных проблем, таких как болезнь Альцгеймера восприимчивости 13 и Х-хромосомой умственной отсталостью смежных генов синдромов 14. Взятые вместе, эти исследования подчеркивают важность этих внутриклеточных NHEs в развитии и / или функции головного мозга.

Внутриклеточная локализация этих теплообменников позволяет точные измерения их ионов селективности, направление транспортировки, кинетические параметры и регулирования. Как и в случае для всех перевозчиков, выраженных в внутриклеточных отсеков, крайне трудно оценить их биохимические деятельности и, следовательно, в полной мере понять свои физиологические функции и Mechanизмы лежащие в основе их патологические последствия. Основываясь на высокой цитозольным концентрации K +, наиболее общепринятым гипотеза, что они работают как K + в сочетании протонов отток перевозчиков. Существование такой утечки протонов были предположили, что это может уравновесить протонного накачки по V-АТФазы, с тем, чтобы поддерживать в стационарном состоянии везикулярного рН. Целью этой статьи является визуальной (I), чтобы продемонстрировать способ, который позволяет генетический выбор клеточных линий, которые экспрессируют такие везикулярных транспортеров на их плазматической мембране, и (II), чтобы показать два независимых подхода для измерения функции этих транспортеров.

Три десятилетия назад, Pouysségur и Франки были пионерами генетический подход, который позволил в молекулярное клонирование и характеристика членов семьи NHE 15. Это было основано на токсичность внутриклеточных протонов в качестве скринингового метода. Первым шагом было получение клеточных линий с дефицитомв любом Na + / H + обмена выражены в плазматической мембране, используя обратимость этого транспортера. Фибробласты линии (CCL39 клеток) были с предустановленной Na + или Li +, а затем помещают в кислой внеклеточной среде (рН 6,5) в течение 2 ч. Это привело к смерти клеток, экспрессирующих функциональный Na + / H + обмена и к выбору антипортера-дефицитных клеток (линия PS120 клетки) 16. При культивировании в бикарбоната свободной среде, эти клетки очень чувствительны к острой внутриклеточного подкисления. Следовательно, выражение любого функционального механизма протон оттока в мембране будет положительно выбран (см 17), если такие клетки представляются острых внутриклеточных acidifications. Такие методы подкисления можно использовать для выделения клеточных линий с торговлей дефекты, позволяющие принудительного экспрессии дикого типа внутриклеточных NHEs на плазматической мембране.

Как эукариотической Na + / H+ Теплообменники электронейтральна, они не поддаются оценке с помощью электрофизиологических методов, которые были использованы с большим успехом для измерения каналов. Эта рукопись поэтому демонстрирует, как для измерения активности этого теплообменника внутриклеточными измерений рН и быстрых кинетики поглощения лития. Как основные понятия же, интересно отметить, что многие процессы, разработанные для раздела выбора также используются непосредственно для функциональных измерений.

Интересно, что мы обнаружили, что дефект оборот присутствует в клеточных линий, выбранных с помощью подхода, описанного в этой рукописи приводит к большей экспрессии других везикулярных белков на плазматической мембране, например, везикулярного калиевого канала TWIK1 18. Это указывает на то, к выбору генерального механизма дефектов хранения для везикулярного трансмембранных белков. Следовательно, это процедура отбора, и клетки, которые он генерирует маяпредставляют собой перспективный инструмент для научного сообщества, действующего на мембранных белков внутриклеточных отсеков. Как и методы измерения, представленные здесь, могут быть применимы для изучения других не электрогенных перевозчиков.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. H + Убийство Выбор

  1. Клеточные линии
    1. Стабильно трансфекции NHE-дефицитных клеток (например, CCL39, полученных PS120 клеточную линию 16) с использованием любой комбинации экспрессирующий вектор млекопитающих и способа трансфекции, который будет производить эффективные выходы и выбор трансфекции в клеточной линии фибробластов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На протяжении многих лет фосфат кальция осадков 19 был использован с хорошими выходами трансфекции. Это был заменен более недавно коммерческими реагентами, такими как Lipofectamine2000, Трансфекции выполняется в соответствии с инструкциями изготовителя.
  2. Решения
    1. Подготовить три стерильные растворы, описанные ниже. Эти решения стерилизацию фильтрованием (0,22 мкм).
      1. Подготовка NH + 4 Загрузка раствора (рН 7,4), содержащего 50 мМ NH 4 Cl, 70 мМ хлорида холина, 5 мМ KCl, 1 мМ MgCl 2, 2 мМ CaCl 2, 5 мМ GLucose и 15 мм MOPS при рН 7,4.
      2. Приготовьте промывочный раствор (рН 7,0), содержащего 120 мМ хлорида холина, 5 мМ KCl, 1 мМ MgCl 2, 2 мМ CaCl 2, 5 мМ глюкозы и 15 мМ HEPES при рН 7,0.
      3. Готовят раствор для восстановления (рН 7,4), содержащего 120 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1 мМ MgCl 2, 2 мМ CaCl 2, 5 мМ глюкозы и 15 мМ HEPES при рН 7,4.
  3. Перед началом выбора, получения клеточной культуры инкубатор, который можно использовать при 37 ° С без дополнительного CO 2 из внешнего резервуара (называется СО 2 - "свободный" инкубатор), а 5% СО 2 приведет к буферизации, что может привести к нарушению подкисление. Amplify клеточной линии, экспрессирующей NHE процентного до примерно 2 х 10 8 клеток (как правило, около 20 сливные 100 мм чашках).
  4. H + убивая процедуру:
    1. Инкубируйте клетки, экспрессирующие внутриклеточный NHE интереса в течение 1 часа в растворе загрузка, по 37 ° C в CO 2 -свободных инкубатора.
    2. Аспирируйте загрузки раствора, а затем промыть их дважды в описанных выше-промывочный раствор. Выполните этот шаг эффективно устранить остаточную внеклеточный NH 4 Cl которые наносили бы ущерб создание крутого NH 4 + градиент, который будет генерировать подкисление.
    3. Устранить полоскания среды путем аспирации и инкубировать клетки в течение одного часа в растворе для восстановления снова при 37 ° С в свободном инкубаторе СО 2.
    4. Заменить восстановления среды с регулярной культуральной среде DMEM (обычно с 7,5% FCS) и клетки растут в стандартных условиях культивирования (37 ° C в увлажненной атмосфере с 5% CO 2 и 95% воздуха).
  5. Повторите этот цикл отбора два раза в неделю до тех пор, стабильные клоны появляются.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соблюдайте особую осторожность в отношении культуры клеток и условий отбора. Месяцы работы может быть разрушен каких-либо загрязнений, которые более склонны к OCCur после длительного периода культуры и повторных клеток манипуляций.
    1. Здесь укажите, нужно ли усиливать клонов и характеризуют их по отдельности, как будет описано в разделах 2-3, или объединить их вместе, чтобы создать клеточной популяции до характеристик.
  6. Применить Повод (примерно раз в две недели), чтобы сохранить подкисления-устойчивых клеток счетчиком-выбирая те, которые, возможно, вернулся к кислотно-чувствительных фенотип родителей (рис 1б).

2. Внутриклеточные рН Измерения

2.1) флуоресценции рН изображений

  1. Используйте Логометрический рН-чувствительных люминесцентные BCECF краситель / AM, который является рН-чувствительного при возбуждении 490 нм и имеет 445 нм изосбестической, следующие протоколы производителя.
    1. Кроме того, использование других рН-чувствительных зондов, следующих протоколов изготовителя.
  2. Используйте изображения установлен консостоящей из инвертированного микроскопа, соединенного с видеокамерой высокой чувствительностью. Одета этот набор 450 нм и 490 нм узких интерференционных полос фильтров в паре с подходящим кварцевых нейтральной плотности фильтров для возбуждения.
    1. Если возможно, используйте соответствующий набор фильтров и условий освещения на настройки сопоставимых значений флуоресценции для λ1 и λ2 так, чтобы отношение стремится к 1. Также избегайте базальные значения флуоресценции, установленные либо насыщения или слишком низко, как для λ1 и / или λ2. Это может дать важные артефакты, как и тогда отношение не может уже обнаружены, хотя внутриклеточный pH меняется.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта система должна позволить быстрое перфузии, покадровой возбуждения на двух вышеупомянутых длинах волн и приобретение на соответствующей длины волны излучения (535 нм для BCECF). Если на персонаже систему с программным обеспечением, позволяющим автоматическое назначение и хранение данных.

2,2) Измерение NHE Вперед деятельности (экструзияПротоны из цитозоля)

  1. Подкислите клетки от 1 ч инкубации в растворе NH 4 + загрузка (см шаг 1,4) в отсутствие CO 2.
  2. Добавить BCECF-AM (5 мкМ конечная концентрация) в растворе в течение последних пяти минут, а затем промойте его с NH 4 + загрузки раствора для удаления внеклеточного зонд.
  3. Установите клеток на микроскопе и принимать несколько изображений для записи стабильную базовую линию. Заливать промывочный раствор (см. Выше) Это приводит к снижению флуоресценции, соответствующей подкисления.
  4. После стабилизации рН, заливать любой из приведенных ниже решений для измерения коэффициента извлечения рН, опосредованных Li + / H +, Na + / H + или K + / H + обмена. Каждое решение содержит потенциал связи катион быть проверены на H + обмена. Если один из них транспортируется, это приведет к увеличению флуоресценции при 495 нм, что будет-корреспондентвторых на рейз внутриклеточного рН:
    120 мМ LiCl, 5 мМ KCl, 1 мМ MgCl 2, 2 мМ CaCl 2, 5 мМ глюкозы и 15 мМ HEPES при рН 7,4
    120 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1 мМ MgCl 2, 2 мМ CaCl 2, 5 мМ глюкозы и 15 мМ HEPES при рН 7,4
    125 мМ КСl, 1 мМ MgCl 2, 2 мМ CaCl 2, 5 мМ глюкозы и 15 мМ HEPES при рН 7,4

2,3) Измерение активности обратной NHE

ПРИМЕЧАНИЕ: принцип здесь, чтобы инвертировать трансмембранных ионных градиентов.

  1. Перед измерением нагрузки клетки с внутриклеточным катионом интерес (см ниже).
  2. Инкубируйте их в течение 5 мин с BCECF / AM (этап 2.2.2); промойте их, установить их на видео микроскопа.
  3. Заливать загрузки решением и получить несколько изображений, чтобы записать стабильный базовый уровень.
  4. После базового стабилизации, изображения вариации рН, когда клетки перфузии с внеклеточной кислой среде, содержащей 120 мМ хлорид холина, 5 мМ KCl, 1 мМ MgCl 2, 2 мМ CaCl 2, 5 мМ глюкозы и 15 мМ MES при рН 6,5.
  5. Для загрузки LiCl, инкубировать клетки в течение 2 ч в растворе, содержащем 120 мМ LiCl, 5 мМ KCl, 1 мМ MgCl 2, 2 мМ CaCl 2, 5 мМ глюкозы и 15 мМ HEPES при рН 7,4. Внутриклеточные литий измеряется атомно-абсорбционной спектроскопии дает значение примерно 60 мм.
  6. Для Na + загрузки, инкубировать клетки в течение двух часов в растворе, содержащем 120 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1 мМ MgCl 2, 2 мМ CaCl 2, 5 мМ глюкозы и 15 мМ HEPES при рН 7,4 в присутствии 1 мМ оуабаина блокировать Na / K АТФ-азы. В этих условиях, внутриклеточная концентрация Na +, находится в диапазоне от 40 мм.
    Примечание: К + загрузки нет необходимости в цитозольной концентрации К + в пределах от 140 мм и наружу направленной К + градиент, следовательно, легко достичь.

2,4) Лечение и калибровка данных:

Примечание: Этот шаг относится как к прямой и обратной измерений.

  1. В конце каждого эксперимента, заливать клеток с раствором 140 мМ KCl, 20 мМ HEPES и 5 мкМ нигерицина доводили до рН между 6,5 и 7,4.
  2. Сбор данных, как показали измерения флуоресценции от изображения (уровни серого, представляющие уровни интенсивности) и экспорта в соответствии текстовом формате и лечения, как описано ниже, используя программы электронных таблиц.
  3. Рассчитать внутриклеточные значения рН для каждой отдельной клетки или области, представляющей интерес, используя следующее уравнение:
    рН = рКа + (Log (R-Rmin) / (R макс -R)) X F мин (λ2) / F MAX (λ2)
  4. С помощью F мин (λ2) / F ма х (λ2) Коэффициент если есть отбеливание зонда или утечки, что приводит к снижению в 450 нм флуоресценции всей экспериментов. Это, однако, очень редко наблюдается в условиях, используемых в DESсываются эксперименты.
  5. Как видно из данных калибровки присутствуют в конце каждого измерения рН, проверить соответствующие расчетные значения отличаются от значений рН, используемых для калибровки. Если это так, то все регулировки экспериментально определенные значения рН до калибровки с помощью следующей процедуры:
    1. Рассчитать следующий фактор (Q, разность между измеренным значениям / разница между значениями калибровки). Умножьте весь набор данных через Q. Сделайте окончательную регулировку путем добавления или вычитания так, что расчетные значения будут равны соответствующие значения калибровки.

3. Измерения начальных скоростей NHE7 быстрыми Li + Поглощение

  1. Семенной клеток на нескольких луночные планшеты (от 6 до 24-а) и подкисляют, используя либо их технику загрузки + NH 4, описанное выше, или альтернативно нигерицин / бычий сывороточный альбумин (БСА) подкисление описано в 20.
  2. Поддержание коротких и последовательных поглощения фотохимических окислителей длительности (как правило, в одну минуту или ниже), чтобы убедиться, что транспорт работает в начальных скоростей условиях. Также убедитесь, что все решения, используемые для поглощения являются изотонический.
  3. В конце этого времени поглощения, тщательно предотвращения проникновения среды и промыть клетки четыре раза охлажденным на льду забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS). Выполните следующие моет как можно быстрее (менее 10 секунд для четырех из них идеален), чтобы предотвратить лития отток.
  4. Лизиса клеток в 25% -ной азотной кислоты. Применение 250 мкл на лунку 25% -ной азотной кислоты и оставьте на, по меньшей мере 1 ч, затем в каждую лунку лома с концом наконечника пипетки и передавать весь суспензии также в новом миcrocentrifuge трубки.
  5. Передача лизата в 1,5 мл микроцентрифужных пробирках отцентрифугированы в течение 5 минут при 15000 х г (комнатная температура), чтобы удалить остатки клеток.
  6. Измерьте содержание лития в супернатантах методом атомно-абсорбционной спектроскопии 21.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Различные компании предоставляют атомные абсорбционные спектрометры, которые должны быть оснащены литиевыми полым катодом лампы. Следуйте инструкциям производителя, как эти машины очень точны, но и весьма сложным.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Выбор:

H + убивая выбор основан на диффузии аммония слабого основания, как показано на фиг.1А. Действие слабых оснований и кислот диффузии на внутриклеточный рН был впервые Вальтер бора и сотрудников 22. Элегантный идея использовать это явление для создания смертельной подкисление для положительного генетического отбора Затем была разработана Жак Pouysségur 17. При таком протоколе, внутриклеточный рН падает до примерно 5,5 после стадии промывки. Клетки, которые не экспрессируют функциональный NHE на плазматической мембране не может восстановить нейтральное значение рН, и показывают типичную подкисленного аспект с плоской формой и зернистой цитозоле (Фиг.1В). После повторных циклов селекции (около двух H + убивая процедуры / неделю), клетки, которые полностью и стабильно пережить это закисление (рис 1в) возникнуть на частоте около 10 -7.Это приведет к образованию отдельных клеточных клонов, которые могут быть либо характеризующихся по отдельности или объединенных для получения клеточных популяций, если это необходимо. Стандартные опыты, такие как поверхности клеток или РНК биотинилирования молчания может быть проведена для контроля, что белок, экспрессируемый на плазматической мембране действительно внутриклеточного NHE, такие как NHE7 (смотри, например, Милосавлевич др. 18). Кроме того, ОТ-ПЦР и последующего секвенирования должны быть выполнены, чтобы проверить возможные мутации в последовательности внутриклеточных NHEs, выраженные в выбранной клеточной линии.

Функциональная характеристика:

Флуоресценции видеомикроскопии:

Активность и селективность ионов из внутриклеточных NHEs выраженные в плазматической мембране могут быть охарактеризованы путем измерения изменения внутриклеточного рН, вызванного этими NHEs в различных условиях. Для этого набор видеомикроскопии оснащен подсветкой, апНастройки приобретение d к изображению логометрический датчик, таких как BCECF / AM схематизировано на рисунке 2А. 2В и показывают типичные изменения в значениях флуоресценции непосредственно полученных при возбуждении на 490 и 450 нм, после NH 4 + погрузки подкисления. рис 2D показывает кривую рН, полученные из этих значений флуоресценции после лечения данными, указанными в пункте 2.4).

Литий Поглощение:

Вместе с водородом и натрием, литием содержит часть первой колонке таблицы Менделеева, и было показано, что эффективность сочетания катиона на Na + / H + теплообменников. Можно воспользоваться этой информацией к быстрой установки кинетики поглощения лития, для того, чтобы измерить в деталях функциональные параметры Na + / H + теплообменников. Как этого катиона отсутствует цитоплазме клеток, накопление его на Cytosolic подкисление будет количественно отражают активность плазматической мембраны NHE. Кроме того, в нмоль пикомолярных концентрации лития может быть измерена с высокой точностью с помощью атомной абсорбционной спектрометрии. Таким образом, этот подход является очень мощным, когда в сочетании с выбором плазматической мембраны, выраженных везикулярного обменников. Рисунок 3 иллюстрирует протокол измерения, описанной в 3) в разделе протоколов. Клетки, предпочтительно высевали на нескольких луночных планшетах (6 до 24) подкисляют, как описано выше. Кинетическая начинается с инкубации клеток в среде, содержащей литий, а другие катионы или ингибиторы интереса (фиг.3А).

Чтобы остановить поглощение, клетки затем представлены четыре быстрых промывок в ледяной PBS. Быстро Операционная удаляет любые внеклеточный литий, обеспечивая при этом никаких существенных литий отток не происходит (рис 3б). Концентрации лития в каждую лунку затемизмерена с помощью атомной абсорбционной спектроскопии (фиг.3С), и начальные скорости поглощения лития, которые непосредственно дают активность теплообменника в стационарном состоянии получают в виде измерений наклона времени накопления лития, конечно (рис 3D).

Что касается ферментативной кинетике, доза-ответ начальных скоростей могут быть использованы для получения значения Км для субстратов (фиг.4А) значений Ki для ингибиторов. Интересной особенностью транспортеров является то, что различные катионы соединительные будут соревноваться за транспортом. Это дает возможность измерения км для натрия конкуренции с поглощением лития (рис 4В).

Рисунок 1
Рисунок 1: Выбор клеток, экспрессирующих внутриклеточного Na + / H + </ Сильной> теплообменник на их плазматической мембране. (А) стратегия трех шагов H + убивает селекцию клеток, экспрессирующих функциональный немутантного и не-меченого внутриклеточного NHE в плазматической мембране. (B) Этап контрастной микроскопии изображение PS120 родительских клеток, представленных на нагрузки кислоты. Шкала бар: 25 мкм (С) фазово-контрастной микроскопии изображение PS120 клеток, выбранных для экспрессии везикулярного теплообменника на плазматической мембране, после кислотного нагрузки. Масштабная линейка: 25 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Фиг.2
Рисунок 2: измерение внутриклеточного рН () Принцип измерения pH видеомикроскопии.. (Б) Есвертка излученного флуоресценции (595 нм) в BCECF рН зонда следующих возбуждения на 490 нм. L: Кислотная нагрузка, Ri; Промыть RE: восстановление, Cal6.5: калибровку во внутриклеточных рН 6,5, Cal7.0: Калибровка внутриклеточного рН 7,0 (C) Эволюция излучаемого флуоресценции (595 нм) BCECF рН зонда После возбуждения при 450 нм. L: Кислотная нагрузка, Ri; Промыть RE: восстановление, Cal6.5: калибровку во внутриклеточных рН 6,5, Cal7.0: Калибровка внутриклеточного рН 7,0 (D) Эволюция внутриклеточного рН вычисляется из флуоресцентных нм отношений в BCECF рН 490/450 Зонд и от калибровочных точек. L: Кислотная нагрузка, Ri; Промыть RE: восстановление, Cal6.5: калибровку во внутриклеточных рН 6,5, Cal7.0: Калибровка внутриклеточного рН 7,0 Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой цифры.


Рисунок 3:. NHE активность, измеренная по начальных скоростей поглощения Li + (- C) Схема, изображающая различные критические шаги измерительной техники (D) пример взвешенного времени, конечно поглощения лития для везикулярного NHE7 теплообменника выразил в плазме мембрана. Обратите внимание на линейность кинетических рамках экспериментальных условиях, обеспечивая измерение начальных скоростей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4
Рисунок 4: Типичные кривые доза-реакция по NHE7 (исходные данные из 18).Начальные скорости поглощения лития были измерены с помощью 1-минутные кинетики. (А) кривой доза-реакция для внеклеточного лития. (B) Конкуренция различных концентраций внеклеточного натрия на 1 мМ внеклеточного поглощения лития. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот протокол описывает, как выбрать клетки, экспрессирующие внутриклеточного Na + / H + обменники на плазматической мембране без изменения их первичной последовательности путем сайт-направленного мутагенеза. Эти теплообменники теперь могут быть охарактеризованы.

Этот метод основан на клеточной токсичности внутриклеточных протонов, чтобы выбрать клеточные линии, которые экспрессируют будет везикулярного Na + / H + обменники на плазматической мембране. Можно было бы, в принципе, использовать другие катионы, которые могут быть подозреваемых к перевозке, такие как Li +, K +, или Cs +. Тем не менее, это добавляет дополнительный уровень неопределенности. Если выбор не дает никакого положительного клона, тогда будет трудно оценить, насколько проходят катион не транспортируется или теплообменник не в плазматической мембране. По этим причинам, выбор были выполнены с использованием Na + в связи катиона, как это внеклеточный зиЬзЬгели нашел в высоком содержании в физиологических условиях. Это привело к выбору вариантов, выражающих NHE7 18, а также NHE6 и NHE9 на плазматической мембране (поэт и Counillon, неопубликованные результаты).

Это выражение плазматическая мембрана позволяет измерять перевозчиков функциональных параметров методами, которые могут до сих пор быть использованы только для плазмы мембранных транспортеров. Конечно, это не возможно, чтобы исключить, что такое изменение в мембранном окружении может повлиять на функциональные особенности везикулярного NHEs. Тем не менее, эта стратегия может быть, стоит использовать, по крайней мере по трем причинам: (я) внутриклеточная экспрессия NHE6, 7 и 9 исключает какую-либо подробного функционального измерения, (II) мембранные среды и белковые или липидные партнеры в основном было показано, влияют тонкими регулирования Механизмы других NHEs, а не их очень основные черты этих перевозчиков (сродство к связи катионов, избирательность, направленности, рНarmacological особенности). Так что это очень вероятно, что те будут оставаться в неизменном виде мембраны выражения везикулярного NHEs. (III) Знание функциональных механизмов и фармакологические профили плазматической мембраны выраженной везикулярного механизма, то тогда можно сделать измерения везикулярного рН для решения этих возможных расхождений между плазматической мембраной и везикулярного выражения.

Другим потенциальным недостатком этого метода является то, что стратегия, описанный здесь, может привести к выбору других клеток, экспрессирующих H + экструзии механизма, чем трансфицированных везикулярного Na + / H + теплообменник (например, плазматической мембраны NHE, или Н + АТФазы, например, ). Несмотря на то, никогда не наблюдалось в лаборатории, поэтому важно использовать классическую клеточной поверхности маркировки, соединенный с глушителей на самом деле убедиться, что NHE интерес действительно выразил в плазматической мембране, способствуя, Na + или Li + и др. 18).

Чтобы охарактеризовать деятельность этих перевозчиков, два протокола, соответственно на основе внутриклеточных изменений рН и ионных потоков описаны. Первый способ требует использования рН-чувствительных флуоресцентных зондов и адекватной флуоресценции видеосистеме микроскопии. Этот метод, который используется многими группами в поле, была разработана в 1980-х годах, во-первых, используя флюориметров для измерения сигналов образуют клеток в суспензии 23, а затем с помощью цифровой приобретение измерить отдельные клетки путем связывания возбуждения флуоресценции и приобретение для видеомикроскопии 24. Последний метод теперь стал очень быстро и легко, из-за высокой производительности камеры, освещения и компьютерных систем. Интересно, что компании обычно предоставляют очень информативные технические листы вместе со своими флуоресцентных зондов. Эти изменения рН предоставить важную информациючтобы определить характер внеклеточных катионов в сочетании с протонной оттока. В этом отношении важно отметить, что продолжительность предварительной инкубации аммония должен быть тщательно отрегулированы в зависимости от клеток, используемых для измерений. CCL39 полученных фибробласты, поддержка очень хорошо один час загрузки 50 мм NH 4 Cl. Это приводит к очень сильной кислотности, который позволяет NHE полной активации и производит сильный сигнал для измерений (условий) Vmax. Тем не менее, другие клетки, такие как кардиомиоциты или первичных клеток почек не будет поддерживать такую ​​важную нагрузку аммония. Стоит выполнения нескольких предварительных испытаний с различного времени инкубации или NH 4 концентраций Cl. Причина такой разницы в чувствительности к NH 4 Cl не ясны. Они могут быть связаны с возможной экспрессию транспортных систем аммония 25,26. Аналогично раствор без натрия, который используется для полоскания полости загрузки решение не может быть допущеноклетками, такими как, например кардиомиоцитов. Хотя начальные скорости будут менее точно определены, следует заливать непосредственно восстанавливающего раствора после загрузки аммония.

Кроме того, измерения внутриклеточных рН также обеспечивают простой способ исследовать обратимые свойства этих теплообменников, как в реверсном режиме будет производить окисление, которые будут легко обнаружены снижением уровня флуоресценции BCECF, что может быть выражено как значения рН после калибровки , Ограничения этих экспериментов, является отсутствие точной количественной оценки транспортной деятельности, а вариаций рН эксперименты измерения, которые работают на логарифмической шкале и ограниченных внутриклеточного буферной емкости. Последние могут быть измерены и изменения рН умножается на выход ионных потоков буферной емкости. Тем не менее, этот процесс сочетает в себе несколько экспериментальных ошибок (по измерениям рН, измерения буферной емкости, и Calibraния), и поэтому не очень количественным. Следовательно, чтобы получить доступ к ферментативные константы плазматической мембраны выражается транспортер, методы быстрого потока ионов гораздо более простым и точным.

Потому что внутриклеточное содержание в миллимолярной диапазоне, индикаторы NHE-опосредованные изменения в цитозоле натрия невозможно. В дальнейшем, в течение многих лет такие методы захвата были основаны на использовании радиоактивных изотопов, таких как Na + 22. Эта рукопись описывает нерадиоактивного метода, для которого 22 Na +, заменяется лития, основанный на обоснование, что этот катион, который также используется NHEs, отсутствует цитозоле клетки и может быть измерена с высокой точностью с помощью атомно-абсорбционной спектрометрии 21. После того, как в соответствующих условиях (времени и концентрации лития) для измерения линейных поглощений (т.е.., Находясь в начальных скоростей условиях) определяются и родственности для других катионов потенциал связи и / илиИнгибиторы может быть точно измерена, как показано на рисунках 3 и 4. В прошлом потенциальное ограничение в том, что метод поглощения лития, конечно, могут функционировать только в том случае, если теплообменник интерес значительно транспортирует этот катион. Если это не так, то экспериментатор должен будет опираться или на вышеуказанных измерений внутриклеточного рН и будет использовать радиоактивный поглощение натрия.

Такой набор экспериментов привели недавно привели к наблюдению, что NHE7 внутриклеточного Na + / H + теплообменник, который был первоначально полагают, Н + / К + транспортер, который будет alkalinize везикулы, на самом деле механизм подкисления эндосом в сочетании с натрием 18. Это имеет глубокие последствия для внутриклеточных отсеков, как до сих пор эта роль считалось, что посвящена + АТФазы VH. Поскольку каждый член семьи NHE появляется показать очень удельная кинетическая сигнатуры окрыло его физиологической роли, заманчиво предположить, что характеристика NHE6 и NHE9 используя методы, описанные в этой статье, показывают новые и неожиданные возможности, которые будут освещены свои физиологические функции.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Standard cell culture equipement Used for H+ killing selection composed of many devices with different catalog numbers
Incubator with CO2 Sanyo MCO15A
Incubator without CO2 Heraeus instrument BB6220
Laminar flow hood PSM1200NF Fisher  52010120
DMEM medium sigma D5796
FBS gold GE Healthcare A15-151
Penicilin/streptomycin PAA P11-010
Trypsin 10x PAA L11-003
Atomic Absorption spectrometer with Zeeman furnace system Thermo Scientific ICE 3500 GFZ
LiCl sigma L4408
Nitric Acid sigma 438073
Fluorescence videomicroscopy set Leica Composed of many devices with different catalog numbers
Inverted automated microscope Leica DMI6000B
microscope stand leica 11888906
11888911
11505180
11888377
incident fluorescence leica 11888901
11504166
motor bracket leica 11888379
11505234
11521505
11522106
LED transmission light  leica 8097321
8102034
11521580
motorized plate leica 11522068
11531172
11521734
11521719
11888423
11888424
camera output leica 11888373
11507807
11888393
11888259
11888258
11541510
images acquisition/analysis software leica 11888375
optics leica 11506507
11506243
11506203
fluorescence Xenon lamp leica DMI6000
camera hamamatsu 8100601
metafluor/Mmfluor software 11640905
pH sensitive probe, BCECF-AM life technologies B1170
Nigericin Sigma N7143

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Marshansky, V., Futai, M. The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function. Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).
  2. Jentsch, T. J. Chloride and the endosomal-lysosomal pathway: emerging roles of CLC chloride transporters. J Physiol. 578 (3), 633-640 (2007).
  3. Kornak, U., et al. Mutations in the a3 subunit of the vacuolar H(+)-ATPase cause infantile malignant osteopetrosis. Hum Mol Genet. 9 (13), 2059-2063 (2000).
  4. Gunther, W., Piwon, N., Jentsch, T. J. The ClC-5 chloride channel knock-out mouse - an animal model for Dent's disease. Pflugers Arch. 445 (4), 456-462 (2003).
  5. Kasper, D., et al. Loss of the chloride channel ClC-7 leads to lysosomal storage disease and neurodegeneration. Embo J. 24 (5), 1079-1091 (2005).
  6. Poet, M., et al. Lysosomal storage disease upon disruption of the neuronal chloride transport protein ClC-6. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (37), 13854-13859 (2006).
  7. Nakamura, N., Tanaka, S., Teko, Y., Mitsui, K., Kanazawa, H. Four Na+/H+ exchanger isoforms are distributed to Golgi and post-Golgi compartments and are involved in organelle pH regulation. J Biol Chem. 280 (2), 1561-1572 (2005).
  8. Gilfillan, G. D., et al. SLC9A6 mutations cause X-linked mental retardation, microcephaly, epilepsy, and ataxia, a phenotype mimicking Angelman syndrome. Am J Hum Genet. 82 (4), 1003-1010 (2008).
  9. Mignot, C., et al. Novel mutation in SLC9A6 gene in a patient with Christianson syndrome and retinitis pigmentosum. Brain & Development. 35 (2), 172-176 (2013).
  10. Morrow, E. M., et al. Identifying autism loci and genes by tracing recent shared ancestry. Science. 321 (5886), 218-223 (2008).
  11. Lasky-Su, J., et al. Genome-wide association scan of the time to onset of attention deficit hyperactivity disorder. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet. 147B (8), 1355-1358 (2008).
  12. Franke, B., Neale, B. M., Faraone, S. V. Genome-wide association studies in ADHD. Hum Genet. 126 (1), 13-50 (2009).
  13. Meda, S. A., et al. A large scale multivariate parallel ICA method reveals novel imaging-genetic relationships for Alzheimer's disease in the ADNI cohort. Neuroimage. 60 (3), 1608-1621 (2012).
  14. Zhang, L., et al. A microdeletion in Xp11.3 accounts for co-segregation of retinitis pigmentosa and mental retardation in a large kindred. Am J Med Genet A. 140 (4), 349-357 (2006).
  15. Sardet, C., Franchi, A., Pouysségur, J. Molecular cloning, primary structure, and expression of the human growth factor-activatable Na+/H+ antiporter. Cell. 56 (2), 271-280 (1989).
  16. Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L'Allemain, G., Paris, S. A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).
  17. Franchi, A., Cragoe, E., Pouysségur, J. Isolation and properties of fibroblast mutants overexpressing an altered Na+/H+ antiporter. J Biol Chem. 261 (31), 14614-14620 (1986).
  18. Milosavljevic, N., et al. The Intracellular Na+/H+ Exchanger NHE7 effects a Na+ coupled, but not K+ coupled proton-loading mechanism in endocytosis. Cell Reports. 7 (3), 1-8 (2014).
  19. Wigler, M., et al. Transformation of mammalian cells with genes from procaryotes and eucaryotes. Cell. 16 (4), 777-785 (1979).
  20. Lacroix, J., Poët, M., Maherel, C., Counillon, L. A mechanism for the activation of the Na/H exchanger NHE-1 by cytoplasmic acidification and mitogens. EMBO Reports. 5 (1), 91-96 (2004).
  21. Milosavljevic, N., et al. Nongenomic Effects of Cisplatin: Acute Inhibition of Mechanosensitive Transporters and Channels without Actin Remodeling. Cancer Res. 70 (19), 7514-7522 (2010).
  22. Boron, W. F., De Weer, P. Intracellular pH transients in squid giant axons caused by CO2, NH3, and metabolic inhibitors. J Gen Physiol. 67 (1), 91-112 (1976).
  23. Paradiso, A. M., Tsien, R. Y., Machen, T. E. Na+-H+ exchange in gastric glands as measured with a cytoplasmic-trapped, fluorescent pH indicator. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (23), 7436-7440 (1984).
  24. Paradiso, A. M., Tsien, R. Y., Machen, T. E. Digital image processing of intracellular pH in gastric oxyntic and chief cells. Nature. 325, 447-450 (1987).
  25. Quentin, F., et al. RhBG and RhCG, the putative ammonia transporters, are expressed in the same cells in the distal nephron. J Am Soc Nephrol. 14 (3), 545-554 (2003).
  26. Geyer, R. R., Musa-Aziz, R., Enkavi, G., Mahinthichaichan, P., Tajkhorshid, E., Boron, W. F. Movement of NH3 through the human urea transporter B: a new gas channel. Am J Physiol Renal Physiol. 304 (12), F1447-F1457 (2013).

Tags

Клеточная биология выпуск 97 внутриклеточным генетики соматических клеток Na
Функциональная характеристика Na<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; Теплообменники внутриклеточных отсеках с помощью Протон-убивает Выбор выразить их в плазматической мембране
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Milosavljevic, N., Poët, M.,More

Milosavljevic, N., Poët, M., Monet, M., Birgy-Barelli, E., Léna, I., Counillon, L. Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane. J. Vis. Exp. (97), e52453, doi:10.3791/52453 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter