Abstract
La acidificación endosomal es crítica para una amplia gama de procesos, como el reciclaje de proteínas y la degradación, la desensibilización del receptor y neurotransmisor de carga en las vesículas sinápticas. Esta acidificación se describe estar mediado por ATPasas de protones, junto a los transportadores de cloruro ClC. Altamente conservadas protones electroneutral transportadores, la Na + / H + (NHE) intercambiadores de 6, 7 y 9 también se expresan en estos compartimentos. Las mutaciones en sus genes se han relacionado con enfermedades cognitivas y neurodegenerativas humanas. Paradójicamente, su papel sigue siendo difícil, ya que su localización intracelular ha impedido caracterización funcional detallada. Este manuscrito muestra un método para resolver este problema. Esta consiste en la selección de líneas celulares mutantes, capaces de sobrevivir a la acidificación citosólica aguda mediante la retención de NHEs intracelulares a la membrana plasmática. A continuación, representa dos protocolos complementarios para medir la selectividad y actividad de los ionesde estos intercambiadores de: (i) uno en base a mediciones de pH intracelulares mediante microscopía de fluorescencia de vídeo, y (ii) uno basado en la cinética rápida de la absorción de litio. Estos protocolos pueden ser extrapolados a medir otros transportistas no electrógenos. Además, el procedimiento de selección que aquí se presenta genera células con un fenotipo defectuoso retención intracelular. Por lo tanto estas células también expresar otras proteínas de membrana vesicular en la membrana plasmática. Por consiguiente, la estrategia experimental representado aquí puede constituir una herramienta potencialmente potente para estudiar otras proteínas intracelulares que se expresan a continuación en la membrana plasmática junto con el vesicular Na + / H + intercambiadores utilizados para la selección.
Introduction
La mayoría de los compartimentos intracelulares muestran un pH luminal ácida, que es un parámetro clave para la maduración, el tráfico, el reciclaje de las proteínas u hormonas y neurotransmisores de carga. Se ha demostrado que el gradiente de pH entre el citosol y vesicular contenido es generado por vacuolar H + ATPasas 1, acoplado a los transportadores vesiculares de cloruro ClC 2. Tanto en ratones knock-out (KO) y los pacientes humanos, la importancia de estos transportadores ha sido destacada por los fenotipos pesados causadas por mutaciones en sus genes 3-6.
Los miembros de la familia SLC9A intercambiadores de sodio-hidrógeno, también denominado NHEs de Na + / H + intercambiadores, han mostrado ser efectores clave en el pH intracelular y la regulación del volumen celular, así como en el transporte vectorial de equivalentes de ácido-base través de los epitelios . Además de los NHEs de la membrana plasmática, tres altamente conservadas Na + / H + intercambiadores, NHE 6, 7y 9 se expresan en la red trans-Golgi y en los endosomas tempranos 7. Las mutaciones en sus genes se han relacionado con Angelman similar o Christianson Síndromes 8-9, basado en la familia autismo 10 y Déficit de Atención e Hiperactividad 11-12. Estos intercambiadores también han estado involucrados en problemas neurodegenerativos como el Alzheimer y la susceptibilidad a la enfermedad 13 genes contiguos retraso mental ligado al cromosoma X síndromes 14. En conjunto, estos estudios ponen de relieve la importancia de estos NHEs intracelulares en el desarrollo y / o la función cerebral.
La localización intracelular de estos intercambiadores impide mediciones precisas de su selectividad de iones, dirección de transporte, parámetros cinéticos, y la regulación. Como es el caso para todos los transportadores expresados en compartimentos intracelulares, es extremadamente difícil de evaluar sus actividades bioquímicas y por lo tanto para comprender plenamente sus funciones fisiológicas y la mechanismos subyacente sus implicaciones patológicas. En base a la alta concentración citosólica K +, la hipótesis más comúnmente aceptada era que estaban trabajando como K +, junto transportadores de salida de protones. La existencia de una fuga de protones tales había planteado la hipótesis, ya que puede contrarrestar de bombeo de protones por las V-ATPasas con el fin de mantener un pH constante vesicular estado. El objetivo de este artículo es visual (i) para demostrar un método que permite la selección genética de líneas celulares que expresan tales transportadores vesiculares en su membrana plasmática, y (ii) para mostrar dos enfoques independientes para medir las funciones de estos transportadores.
Hace tres décadas, Pouysségur y Franchi han sido pioneros en un enfoque genético que permitió la clonación molecular y caracterización de los miembros de la familia NHE 15. Esto se basó en la toxicidad de protones intracelulares como un método de cribado. El primer paso fue obtener líneas celulares deficientesen cualquier / H + intercambio Na + expresado en la membrana plasmática, utilizando la reversibilidad de este transportador. Los fibroblastos (línea de células CCL39) se precargados con Na + o Li + y luego se colocan en un medio extracelular ácido (pH 6,5) durante 2 horas. Esto condujo a la muerte de las células que expresan un funcional Na + / H + de cambio y para la selección de células-antiporter deficiente (línea celular PS120) 16. Cuando se cultiva en un medio libre de bicarbonato, estas células son muy sensibles a la acidificación intracelular aguda. En consecuencia, se seleccionará positivamente la expresión de cualquier mecanismo de eflujo de protones funcional en la membrana plasmática (véase 17), si dichas células se someten a acidificación intracelular agudas. Tales técnicas de acidificación pueden ser utilizados para aislar líneas celulares con el tráfico de defectos que permiten la expresión forzada de NHEs intracelulares WT en la membrana plasmática.
Como eucariota Na + / H+ Intercambiadores son electroneutral, que no son mensurables por los métodos electrofisiológicos que se han utilizado con gran éxito para medir canales. Por tanto, este manuscrito demuestra cómo medir la actividad de este intercambiador por mediciones de pH intracelular y cinética rápida de la absorción de litio. Como los conceptos subyacentes son los mismos, es interesante notar que muchos de los procesos desarrollados para la sección de selección también se utilizan directamente para las mediciones funcionales.
Curiosamente, hemos observado que el defecto tráfico presente en las líneas celulares seleccionadas usando el enfoque descrito en este manuscrito conduce a una mayor expresión de otras proteínas vesiculares en la membrana plasmática, tales como el canal de potasio vesicular TWIK1 18. Esto señala hacia la selección de un mecanismo general defecto de retención para proteínas transmembrana vesiculares. Por lo tanto este procedimiento de selección y las células que genera mayoconstituyen una herramienta prometedora para la comunidad científica que trabaja en las proteínas de la membrana de los compartimentos intracelulares. Además de las técnicas de medición presentados aquí podrían ser aplicables para el estudio de otros transportistas no electrógenos.
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Protocol
1. H + Selección Matar
- Líneas celulares
- Transfectar células establemente NHE-deficientes (por ejemplo, la línea celular PS120 CCL39 derivado 16) utilizando cualquier combinación de vector de expresión de mamífero y el método de transfección que produzca rendimientos de transfección eficientes y selección en una línea celular de fibroblastos.
NOTA: Durante muchos años, Fosfato de Calcio precipitación 19 se utilizó con buenos rendimientos de transfección. Esto ha sido reemplazado más recientemente por reactivos comerciales tales como Lipofectamine2000, las transfecciones se llevaron a cabo siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Transfectar células establemente NHE-deficientes (por ejemplo, la línea celular PS120 CCL39 derivado 16) utilizando cualquier combinación de vector de expresión de mamífero y el método de transfección que produzca rendimientos de transfección eficientes y selección en una línea celular de fibroblastos.
- Soluciones
- Prepare tres soluciones estériles se describen a continuación. Esterilizar estas soluciones por filtración (0,22 micras).
- Preparar una solución de NH 4 + Loading (pH 7,4) compuesto por 50 mM NH 4 Cl, 70 mM de cloruro de colina, 5 mM KCl, 1 mM de MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5 mM glucose y 15 mM MOPS a pH 7,4.
- Preparar una solución de enjuague (pH 7,0) compuesta de 120 mM de cloruro de colina, 5 mM KCl, 1 mM de MgCl 2, 2 mM CaCl 2, glucosa 5 mM y 15 mM de HEPES a pH 7,0.
- Preparar una solución de recuperación (pH 7,4) compuesto por NaCl 120 mM, 5 mM KCl, 1 mM de MgCl 2, 2 mM CaCl 2, glucosa 5 mM y 15 mM de HEPES a pH 7,4.
- Prepare tres soluciones estériles se describen a continuación. Esterilizar estas soluciones por filtración (0,22 micras).
- Antes de comenzar la selección, obtener una incubadora de cultivo celular que puede ser utilizado a 37 ° C sin CO adicional 2 del tanque externo (denominado CO 2 - incubadora "libre"), tal como 5% de CO 2 resultará en búfer que pueden poner en peligro el acidificación. Amplificar la línea celular que expresa el NHE de interés hasta aproximadamente 2 x 10 8 células (típicamente alrededor de 20 confluentes 100 placas mm).
- H + procedimiento matar:
- Se incuban las células que expresan el NHE intracelular de interés durante 1 hora en la carga de soluciones, en 37 ° C en el incubador de CO2 exento.
- Aspirar la solución de carga y luego enjuague dos veces en la solución descrita aclarado anteriormente. Realice este paso de manera eficiente para eliminar el residual extracelular NH 4 Cl que puedan afectar a la creación de un gradiente de NH 4 + empinada que va a generar la acidificación.
- Eliminar el medio de enjuague por aspiración y se incuban las células durante una hora en una solución de recuperación de nuevo a 37 ° C en la incubadora de CO 2 libre.
- Reemplazar el medio de recuperación con medio de cultivo regular (típicamente DMEM con 7,5% de FCS) y crecer las células en condiciones de cultivo estándar (37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO2 y 95% de aire).
- Repita este ciclo de selección dos veces por semana hasta que los clones estables surgen.
NOTA: Tenga especial cuidado en relación con el cultivo celular y las condiciones de selección. Meses de trabajo puede ser arruinado por la contaminación que es más propenso a oCCur después de un largo periodo de la cultura y las manipulaciones celulares repetidas.- Aquí, elija si desea amplificar los clones y caracterizar de forma individual se describe con más detalle en las secciones 3.2 o agruparse entre sí para generar una población celular antes de la caracterización.
- Aplicar selección ocasional (aproximadamente una vez cada dos semanas) para retener las células resistentes a la acidificación por el contador-seleccionar aquellos que puedan haber revertido al fenotipo sensible a los ácidos de los padres (Figura 1B).
2. Las mediciones de pH intracelular
2.1) Imaging pH Fluorescencia
- Utilice la radiométrica sensible al pH colorante fluorescente BCECF / AM, que es sensible al pH cuando se excita a 490 nm y posee un punto isosbéstico nm 445, siguiendo los protocolos del fabricante.
- También puede utilizar otras sondas sensibles al pH, siguiendo los protocolos del fabricante.
- Utilice una estafa de imágenes setconsistente de un microscopio invertido acoplado a una cámara de vídeo de alta sensibilidad. Equipar este conjunto con 450 nm y 490 filtros de interferencia de banda estrecha nm emparejados con los filtros de densidad neutra cuarzo apropiada para la excitación.
- Si es posible, utilice el conjunto adecuado de los filtros y las condiciones de iluminación para configurar los valores de fluorescencia comparables para λ1 y λ2 manera que la relación se aproxima a 1. Evite también los valores de fluorescencia basal que se establecen ya sea saturar o demasiado baja, tanto para λ1 y / o λ2. Esto puede producir artefactos importantes como entonces la relación no puede sido detectable aunque pH intracelular está cambiando.
NOTA: Este sistema debe permitir la perfusión rápida, la excitación de lapso de tiempo en las dos longitudes de onda antes mencionados y la adquisición en la longitud de onda de emisión adecuada (535 nm para BCECF). Dotar al sistema de software que permite la adquisición automática de datos y almacenamiento.
- Si es posible, utilice el conjunto adecuado de los filtros y las condiciones de iluminación para configurar los valores de fluorescencia comparables para λ1 y λ2 manera que la relación se aproxima a 1. Evite también los valores de fluorescencia basal que se establecen ya sea saturar o demasiado baja, tanto para λ1 y / o λ2. Esto puede producir artefactos importantes como entonces la relación no puede sido detectable aunque pH intracelular está cambiando.
2.2) Medición de NHE Forward Actividad (Extrusión deLos protones desde el citosol)
- Se acidifica células mediante una incubación de 1 hora en la solución de NH 4 + Carga (véase el paso 1.4) en ausencia de CO 2.
- Añadir BCECF-AM (concentración final 5 mM) a la solución para los últimos cinco minutos y luego enjuague con NH 4 + solución de carga para eliminar la sonda extracelular.
- Montar las células en el microscopio y tomar varias imágenes para grabar una línea de base estable. Perfundir la solución de lavado (véase más arriba). Esto se traduce en una caída de la fluorescencia correspondiente a la acidificación.
- Después de la estabilización del pH, perfundir cualquiera de las soluciones dadas a continuación para medir las tasas de recuperación de pH mediadas por Li + / H +, Na + / H + o K + / H + de cambio. Cada solución contiene un catión de potencial de acoplamiento a ensayar para H + de cambio. Si uno de ellos es transportado, esto se traducirá en un aumento de fluorescencia a 495 nm que correspond a un aumento en el pH intracelular:
120 mM LiCl, 5 mM KCl, 1 mM de MgCl 2, 2 mM CaCl 2, glucosa 5 mM y 15 mM de HEPES a pH 7,4
NaCl 120 mM, 5 mM KCl, 1 mM de MgCl 2, 2 mM CaCl 2, glucosa 5 mM y 15 mM de HEPES a pH 7,4
125 mM KCl, 1 mM de MgCl 2, 2 mM CaCl 2, glucosa 5 mM y 15 mM de HEPES a pH 7,4
2.3) Medición de NHE Actividad Inversa
NOTA: El principio aquí es invertir los gradientes iónicos transmembrana.
- Antes de la medición, cargar las células con el catión intracelular de interés (véase más adelante).
- Incubar durante 5 min con BCECF / AM (véase el paso 2.2.2); enjuagarlos, montarlos en el microscopio de vídeo.
- Perfundir la solución de carga y tome varias imágenes a grabar una línea de base estable.
- Después de la estabilización de la línea de base, la imagen de las variaciones de pH cuando las células se perfunden con un medio ácido extracelular que contiene 120 mM de cloruro de colina, 5 mM KCl, 1 mM de MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5 mM de glucosa y MES 15 mM a pH 6,5.
- Para LiCl carga, incubar las células durante 2 horas en una solución compuesta de 120 mM LiCl, 5 mM KCl, 1 mM de MgCl 2, 2 mM CaCl 2, glucosa 5 mM y 15 mM de HEPES a pH 7,4. De litio intracelular medido por espectroscopia de absorción atómica produce un valor de alrededor de 60 mM.
- Para Na + carga, incubar las células durante dos horas en una solución compuesta por NaCl 120 mM, 5 mM KCl, 1 mM de MgCl 2, 2 mM CaCl 2, glucosa 5 mM y 15 mM de HEPES a pH 7,4 en presencia de ouabaína 1 mM para bloquear la Na / K ATPasa. En estas condiciones, la concentración intracelular de Na + es en el intervalo de 40 mM.
NOTA: K + carga no es necesario ya que K + citosólico concentración está en el rango de 140 mm y un gradiente de K + hacia el entorno es por lo tanto fácil de lograr.
2.4) Tratamiento y calibración de datos:
NOTA: Este paso se aplica tanto a las mediciones de avance y retroceso.
- Al final de cada experimento, las células perfundir con una solución de 140 mM KCl, 20 mM HEPES y 5 mM nigericin ajustado a valores de pH entre 6,5 y 7,4.
- Recopilar datos como medidas de fluorescencia de las imágenes (niveles de gris que representan los niveles de intensidad) y la exportación bajo el formato de texto y tratar como se explica a continuación utilizando un programa de hoja de cálculo.
- Calcular los valores de pH intracelulares para cada celda o región de interés utilizando la siguiente ecuación individual:
pH = pKa + (Log (R-Rmin) / (R max -R)) x F min (λ2) / F max (λ2) - Utilice el F min (λ2) / F ma x (λ2) Relación de si hay blanqueo sonda o fugas, lo que resulta en una disminución en la fluorescencia de 450 nm a lo largo de los experimentos. Esto sin embargo es muy raramente observada en las condiciones utilizadas en el desexperimentos crito.
- Como los datos de calibración están presentes al final de cada medición de pH, comprobar si los correspondientes valores calculados difieren de los valores de pH utilizados para la calibración. Si es el caso, entonces ajustar todos los valores de pH determinados experimentalmente a la calibración mediante el siguiente procedimiento:
- Calcula el siguiente cociente (Q, la diferencia entre el medido valores / Diferencia entre los valores de calibración). Multiplique el conjunto de datos por Q. Haga el ajuste final de la adición o sustracción de manera que los valores calculados serán iguales a los valores de calibración correspondientes.
3. Las mediciones de los precios iniciales de NHE7 por Fast Li + Captación
- Sembrar las células en placas de pocillos múltiples (de 6 a 24 pocillos) y se acidifica usando ya sea la técnica de carga + NH 4 descrito anteriormente, o alternativamente el / albúmina de suero bovino (BSA) descrito en la acidificación nigericin 20.
- Mantener duraciones cortas de captación y consistentes (típicamente un minuto, o más adelante) para asegurar que el transporte opera en condiciones iniciales tasas. También asegúrese de que todas las soluciones utilizadas para la captación son isotónicas.
- Al final del tiempo de absorción, eliminar cuidadosamente el medio absorción y lavar las células cuatro veces con solución salina de fosfato enfriado con hielo tamponada (PBS). Realizar estos lavados tan rápido como sea posible (menos de 10 seg para los cuatro de ellos es ideal) para evitar que el eflujo de litio.
- Lisar las células en ácido nítrico 25%. Aplicar 250 l por pocillo de ácido nítrico al 25% y dejar que repose durante al menos 1 hora, después desechar cada pocillo con el final de la punta de la pipeta y transferir toda la suspensión bien en un nuevo mitubo crocentrifuge.
- Transferir el lisado en 1,5 ml tubos de microcentrífuga, centrifugar durante 5 minutos a 15.000 xg (temperatura ambiente) para eliminar los restos celulares.
- Mida el contenido de litio de los sobrenadantes mediante espectroscopía de absorción atómica 21.
NOTA: Diferentes empresas ofrecen los espectrómetros de absorción atómica, que tienen que estar equipados con una lámpara de cátodo hueco de litio. Siga las instrucciones del fabricante ya que estas máquinas son muy precisos pero también bastante delicada.
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Representative Results
Selección:
La selección + matando H se basa en la difusión de la base débil de amonio, tal como se representa en la Figura 1A. El efecto de las bases débiles y ácidos difusión sobre el pH intracelular ha sido promovida por Walter Boro y colaboradores 22. El elegante idea de utilizar este fenómeno para producir una acidificación letal para la selección genética positiva luego fue desarrollada por Jacques Pouysségur 17. En virtud de un protocolo de este tipo, el pH intracelular cae a aproximadamente 5,5 después de la etapa de aclarado. Las células que no expresan un NHE funcional en la membrana plasmática no se pueden recuperar un valor de pH neutro y mostrar un aspecto típico acidificada con una forma plana y un citosol granular (Figura 1B). Después de repetidos ciclos de selección (aproximadamente dos H + matando procedimientos / semana), las células que sobreviven totalmente y de forma estable esta acidificación (Figura 1C) emerger, a una frecuencia de aproximadamente 10 -7.Esto dará lugar a la formación de clones celulares individuales que pueden ser ya sea caracteriza individualmente o agrupadas, para obtener poblaciones celulares si se desea. Experimentos estándar, tales como biotinilación de la superficie celular o silenciamiento de ARN pueden llevarse a cabo para controlar que la proteína expresada en la membrana plasmática es de hecho un intracelular NHE como NHE7 (véase, por ejemplo Milosavljevic et al. 18). Además, RT-PCR y posterior secuenciación deben realizarse para verificar eventuales mutaciones en la secuencia de los NHEs intracelulares expresadas en la línea celular seleccionada.
Caracterización funcional:
Fluorescencia videomicroscopia:
La actividad y selectividad de los iones intracelulares NHE expresadas en la membrana plasmática puede ser caracterizado por la medición de los cambios en el pH intracelular inducida por estos NHE en diversas condiciones. Por esta videomicroscopy un conjunto equipado con una iluminaciónajustes de adquisición de imagen d a una sonda radiométrica tales como BCECF / AM se esquematiza en la Figura 2A. Figura 2B y 2C muestran las variaciones típicas en los valores de fluorescencia obtenidos directamente para excitaciones a 490 y 450 nm, después de un NH 4 + cargar la acidificación. Figura 2D muestra la curva de pH obtenido a partir de estos valores de fluorescencia después del tratamiento de datos descrito en 2.4).
La captación de litio:
Junto con hidrógeno y sodio, litio comprende parte de la primera columna de la tabla periódica y ha demostrado ser un catión de un acoplamiento eficiente para la Na + / H + intercambiadores. Es posible tomar ventaja de esta información para la configuración rápida cinética de la absorción de litio, con el fin de medir en detalles los parámetros funcionales de Na + / H + intercambiadores. Como este catión está ausente de citoplasma de la célula, su acumulación en cytla acidificación osolic se cuantitativamente reflejar la actividad de la membrana plasmática NHE. Por otra parte, las concentraciones nanomolar a picomolar de litio se puede medir con gran exactitud utilizando espectrometría de absorción atómica. Por lo tanto, este enfoque es muy potente cuando se combina con la selección de la membrana plasmática expresadas intercambiadores vesiculares. La Figura 3 ilustra el protocolo de medición descrito en 3) de la sección de protocolos. Las células, preferiblemente sembradas en placas de múltiples pocillos (6 a 24) se acidifican como se describió anteriormente. La cinética se inicia con la incubación de las células en medio que contiene litio, y los otros cationes o inhibidores de interés (Figura 3A).
Para detener la absorción, las células se someten a cuatro aclarados rápidos en PBS enfriado con hielo. Operando rápidamente elimina cualquier extracelular de litio al tiempo que garantiza que no se produce flujo de salida de litio significativa (Figura 3B). Concentración de litio en cada pocillo es entoncesmedido utilizando espectroscopia de absorción atómica (Figura 3C), y las tasas iniciales de captación de litio, lo que dió directamente la actividad del intercambiador en estado estacionario se obtienen como mediciones de pendiente de la evolución en el tiempo la acumulación de litio (Figura 3D).
En cuanto a la cinética de la enzima, la dosis-respuesta de las tasas iniciales se puede utilizar para derivar valores de Km para sustratos (Figura 4A) de los valores de Ki para los inhibidores. Una característica interesante de los transportadores es que diferentes cationes de acoplamiento competirán para el transporte. Esto da la posibilidad de medir la Km para el sodio por la competencia con la absorción de litio (Figura 4B).
Figura 1: Selección de células que expresan un intracelular de Na + / H + </ Strong> intercambiador en su membrana plasmática. (A) Estrategia para los tres pasos H + matando selección de células que expresan un NHE funcional no mutado y no etiquetado intracelular en la membrana plasmática. Imagen de microscopía (B) de contraste de fase de células parentales PS120 sometidos a una carga de ácido. Barra de escala: 25 micras (C) de contraste de fase imagen de microscopía de células PS120 seleccionados para la expresión de un intercambiador vesicular en la membrana plasmática, después de una carga de ácido. Barra de escala: 25 m Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: mediciones de pH intracelular (A) Principio de medición videomicroscopy pH.. (B) Evolution de la fluorescencia emitida (595 nm) de la sonda de pH BCECF después de una excitación a 490 nm. L: carga ácida, Ri; Enjuague, Re: recuperación, Cal6.5: calibración a un pH intracelular de 6,5, Cal7.0: Calibración a un pH intracelular de 7.0 (C) Evolución de la fluorescencia emitida (595 nm) de la sonda de pH BCECF después de una excitación a 450 nm. L: carga ácida, Ri; Enjuague, Re: recuperación, Cal6.5: calibración a un pH intracelular de 6,5, Cal7.0: La calibración con un pH intracelular de 7.0 (D) Evolución del pH intracelular calculado a partir de los coeficientes de fluorescencia 490/450 nm de la BCECF pH sonda y de los puntos de calibración. L: carga ácida, Ri; Enjuague, Re: recuperación, Cal6.5: calibración a un pH intracelular de 6,5, Cal7.0: La calibración con un pH intracelular de 7.0 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3:. La actividad NHE medido por las tasas iniciales de Li + absorción (A - C) Esquema que representa los diferentes pasos críticos del Ejemplo técnica de medición (D) de un transcurso de tiempo de medición de la captación de litio para el vesicular NHE7 intercambiador expresó en el plasma membrana. Tenga en cuenta la linealidad de la cinética dentro de las condiciones experimentales, asegurando la medición tasas iniciales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Típico Las curvas de dosis-respuesta para NHE7 (datos originales de 18).Las velocidades iniciales de captación de litio se midieron utilizando la cinética de 1 minuto. (A) curva dosis-respuesta para el litio extracelular. (B) La competencia de diferentes concentraciones de sodio extracelular en 1 mM de captación de litio extracelular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo describe cómo seleccionar las células que expresan intracelular de Na + / H + intercambiadores en la membrana plasmática sin alterar su secuencia primaria por mutagénesis dirigida al sitio. Estos intercambiadores de ahora se pueden caracterizar.
Este método se basa en la toxicidad celular de protones intracelulares para seleccionar líneas celulares que expresarán vesicular Na + / H + intercambiadores en la membrana plasmática. Podría ser posible, en principio, el uso de otros cationes que pueden ser sospechosos de ser transportados, como Li +, K +, o Cs +. Sin embargo, esto agrega un nivel adicional de incertidumbre. Si la selección no produce ningún clon positivo, entonces será difícil evaluar si el catión probado no se transporta o el intercambiador no es en la membrana plasmática. Por estas razones, las selecciones se han realizado utilizando Na + como un catión de acoplamiento ya que esto es el substr extracelularcomieron encuentra en mayor abundancia en condiciones fisiológicas. Esto condujo a la selección de variantes que expresan NHE7 18, así como NHE6 y NHE9 en la membrana plasmática (poeta y Counillon, resultados no publicados).
Esta expresión en la membrana de plasma permite la medición de los transportadores de parámetros funcionales por métodos que podrían sólo hasta ahora pueden utilizar para transportadores de membrana de plasma. Por supuesto que no es posible excluir que tal cambio en el entorno de la membrana puede afectar a las características funcionales de los NHEs vesiculares. Sin embargo, esta estrategia podría ser digno de usar por lo menos tres razones: (i) la expresión intracelular de NHE6, 7 y 9 se opone a cualquier medida funcional detallado, (ii) los entornos de membrana y proteínas o lípidos asociados en su mayoría se han mostrado afectar sutil de reglamentación Mecanismos de los demás NHEs y no sus características muy fundamentales de estos transportadores (afinidades por cationes de acoplamiento, selectividad, direccionalidad, phcaracterísticas armacological). Así que es muy probable que los que se mantendrán sin cambios por la expresión en la membrana de las NHEs vesiculares. (Iii) El conocimiento de los mecanismos funcionales y los perfiles farmacológicos de un mecanismo vesicular expresado-membrana plasmática, es entonces posible hacer mediciones de pH vesicular para hacer frente a los posibles discrepancias entre la membrana plasmática y la expresión vesicular.
Otra limitación potencial de esta técnica es que la estrategia aquí descrita puede conducir a la selección de células que expresan otro H + mecanismo de extrusión que el vesicular transfectadas Na + / H + intercambiador (tal como una membrana de plasma NHE, o una ATPasa H +, por ejemplo, ). A pesar de que nunca fue observado en el laboratorio, por lo que es crucial para utilizar el etiquetado de la superficie celular clásica junto a silenciar para verificar realmente que la NHE de interés es en verdad expresada en la membrana plasmática y media la de Na + o Li + et al. 18).
Para caracterizar la actividad de estos transportadores, dos protocolos, respectivamente basan en las variaciones del pH intracelular y los flujos de iones se describen. El primer método requiere el uso de sondas fluorescentes sensibles al pH y un sistema de microscopía de fluorescencia de vídeo adecuada. Este método, que se utiliza por muchos grupos en el campo, se ha desarrollado en la década de 1980, primero utilizando fluorímetros para medir las células de formulario señales en suspensión 23, a continuación, se utiliza la adquisición digital para medir las células individuales por el acoplamiento de excitación de fluorescencia y la adquisición de videomicroscopy 24. Esta última técnica se ha convertido en muy rápido y fácil, debido a la alta rendimiento de las cámaras, la iluminación y los sistemas informáticos. Curiosamente, las empresas suelen proporcionar fichas técnicas muy informativos junto con sus sondas fluorescentes. Estas variaciones de pH proporcionan información importantepara determinar la naturaleza de los cationes extracelulares junto con el eflujo de protones. A este respecto, es importante notar que la duración de la preincubación de amonio tiene que ser ajustado cuidadosamente en función de las células utilizadas para las mediciones. Fibroblastos CCL39 derivados, soportan muy bien la carga de una hora con 50 mM NH 4 Cl. Esto resulta en una acidificación muy fuerte que permite la activación completa NHE y produce una señal fuerte para las mediciones (condiciones de Vmax). Sin embargo, otras células como los cardiomiocitos o células renales primarias no apoyarían una carga de amonio tan importante. Vale la pena realizar varios ensayos preliminares con diferentes tiempos de incubación o NH 4 Cl concentraciones. La razón de estas diferencias en la sensibilidad a NH 4 Cl no están claras. Ellos pueden estar relacionados con la posible expresión de los sistemas de transporte de amonio 25,26. Del mismo modo la solución libre de sodio que se utiliza para enjuagar la solución de carga no puede ser toleradapor las células, tales como cardiomiocitos, por ejemplo. Aunque las velocidades iniciales se determinaron con menos precisión, es necesario para perfundir directamente con la solución de recuperación después de la carga de amonio.
Además, las mediciones de pH intracelulares también proporcionan una manera sencilla de investigar las propiedades reversibles de estos intercambiadores como el modo inverso producirá una acidificación que se detecta fácilmente por una disminución en el nivel de fluorescencia BCECF que puede ser expresado como un valores de pH después de la calibración . Las limitaciones de estos experimentos es la falta de una cuantificación exacta de las actividades de transporte, ya que las variaciones de pH experimentos medida, que operan en una escala logarítmica y están limitadas por la capacidad amortiguadora intracelular. Este último puede ser medido y variaciones de pH multiplicado por la capacidad amortiguadora flujos de iones rendimiento. Sin embargo, este proceso combina varios errores experimentales (en mediciones de pH, del valor de la capacidad de amortiguación y calibraciónción) y por lo tanto no es altamente cuantitativo. Por lo tanto para acceder a las constantes enzimáticas de la membrana plasmática expresado transportador, las técnicas de flujo de iones rápida son mucho más sencilla y precisa.
Debido a que los contenidos intracelulares están en el rango milimolar, la detección de cambios mediados por NHE en sodio citosólico no es posible. De ahora en adelante, por año tales técnicas de captación se basan en el uso de radioisótopos tales como 22 Na +. Este manuscrito describe un método no radiactivo para el que 22 Na + se sustituye por litio, basado en la razón de que este catión que también es utilizado por NHE, está ausente de citosol de la célula y se puede medir con gran exactitud utilizando espectrometría de absorción atómica 21. Una vez que las condiciones apropiadas (tiempo y concentración de litio) para medir las captaciones lineales (es decir., Estar en condiciones iniciales tasas) se determinan, afinidades por los otros cationes acoplamiento potencial y / oinhibidores se pueden medir con precisión como se muestra en las Figuras 3 y 4. Una última limitación potencial es que el método de captación de litio por supuesto, sólo puede funcionar si el intercambiador de interés transporta significativamente este catión. Si no es el caso, el experimentador tendrá que depender ya sea en las mediciones del pH intracelular mencionadas anteriormente, o tendrá que utilizar la absorción de sodio radiactivo.
Un conjunto de experimentos tales han llevado recientemente llevado a la observación de que la NHE7 intracelular de Na + / H +, que se creía inicialmente para ser un H + / K + transportador que alcalinizar vesículas era en realidad un mecanismo de acidificación endosomal acoplado al sodio 18. Esto tiene implicaciones profundas para los compartimentos intracelulares como hasta ahora se pensaba que este papel que se dedicará a los VH + ATPasas. A medida que cada miembro de la familia NHE parece mostrar una firma cinética o muy específicaala a su papel fisiológico, es tentador para la hipótesis de que la caracterización de NHE6 y NHE9 utilizando los métodos descritos en este artículo revelará novela y características inesperadas que pondrá de relieve sus funciones fisiológicas.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard cell culture equipement | Used for H+ killing selection composed of many devices with different catalog numbers | ||
| Incubator with CO2 | Sanyo | MCO15A | |
| Incubator without CO2 | Heraeus instrument | BB6220 | |
| Laminar flow hood PSM1200NF | Fisher | 52010120 | |
| DMEM medium | sigma | D5796 | |
| FBS gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Penicilin/streptomycin | PAA | P11-010 | |
| Trypsin 10x | PAA | L11-003 | |
| Atomic Absorption spectrometer with Zeeman furnace system | Thermo Scientific | ICE 3500 GFZ | |
| LiCl | sigma | L4408 | |
| Nitric Acid | sigma | 438073 | |
| Fluorescence videomicroscopy set | Leica | Composed of many devices with different catalog numbers | |
| Inverted automated microscope | Leica | DMI6000B | |
| microscope stand | leica | 11888906 | |
| 11888911 | |||
| 11505180 | |||
| 11888377 | |||
| incident fluorescence | leica | 11888901 | |
| 11504166 | |||
| motor bracket | leica | 11888379 | |
| 11505234 | |||
| 11521505 | |||
| 11522106 | |||
| LED transmission light | leica | 8097321 | |
| 8102034 | |||
| 11521580 | |||
| motorized plate | leica | 11522068 | |
| 11531172 | |||
| 11521734 | |||
| 11521719 | |||
| 11888423 | |||
| 11888424 | |||
| camera output | leica | 11888373 | |
| 11507807 | |||
| 11888393 | |||
| 11888259 | |||
| 11888258 | |||
| 11541510 | |||
| images acquisition/analysis software | leica | 11888375 | |
| optics | leica | 11506507 | |
| 11506243 | |||
| 11506203 | |||
| fluorescence Xenon lamp | leica | DMI6000 | |
| camera | hamamatsu | 8100601 | |
| metafluor/Mmfluor software | 11640905 | ||
| pH sensitive probe, BCECF-AM | life technologies | B1170 | |
| Nigericin | Sigma | N7143 |
References
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