Abstract
Fødsel kvelning, noe som fører til hypoksisk-iskemisk encefalopati (HIE), utgjør 0.660.000 dødsfall på verdensbasis hvert år, om lag en fjerdedel av verdens 2,9 millioner dødsfall blant nyfødte. Dyremodeller av HIE har bidratt til forståelsen av patofysiologien i HIE, og har fremhevet den dynamiske prosessen som oppstår i hjerneskade på grunn av perinatal asfyksi. Dermed har dyrestudier antydet et tidsvindu for post-fornærmelse behandlingsstrategier. Hypotermi er testet som en behandling for HIE i pdiglet modeller og senere vist seg effektive i kliniske studier. Varianter av modellen har vært brukt i studiet av supplerende nevro metoder og piglet studier av xenon og melatonin har ført til klinisk fase I og II studier 1,2. Piglet HIE modellen er videre brukt for neonatale resuscitation- og hemodynamiske studier samt i undersøkelser av cerebral hypoksi på cellenivå. Det er imidlertid en teknisk krevendemodell og variasjoner i protokollen kan resultere i enten for mild eller for alvorlig hjerneskade. I denne artikkelen viser vi de tekniske prosedyrer som er nødvendige for å etablere en stabil Nøff modell av neonatal HIE. Først blir den nyfødte grisunge (<24 timer gammel, median vekt 1500 g) bedøvet, intubert, og overvåket i et oppsett kan sammenlignes med det som finnes i en neonatal intensivavdeling. Globalt hypoksi-iskemi er indusert ved å senke inspirasjonsoksygenfraksjonen å oppnå global hypoksi, ischemi gjennom hypotensjon og et flatt spor amplitude integrert EEG (aEEG) indikerer cerebral hypoksi. Overlevelse fremmes ved å justere oksygen ifølge aEEG respons og blodtrykket. Hjerneskade er kvantifisert ved histopatologi og magnetisk resonanstomografi etter 72 timer.
Introduction
Perinatal asfyksi er en akutt og ofte uforutsette tilstand forbundet med hypoksisk-iskemisk encefalopati (HIE). Det overordnede målet med denne protokollen er å demonstrere en grisunge overleve modell av perinatal hypoksisk-iskemisk encefalopati. Denne modellen kan brukes til å undersøke effekten av ulike grader av hypoksi-iskemi på neonatal hjernen og eksperimentelle behandlinger på nevropatologi, magnetic resonance imaging og spektroskopi (MR og MRS) og biomarkører i kroppsvæsker som blod, spinalvæske og urin . Modellen har også vist seg nyttig for å undersøke det kardiovaskulære systemet, luftveiene, nyre og lever, som alle er berørt i global hypoksi-iskemi.
Perinatal asfyksi er et resultat av nedsatt oksygentilførsel intrapartum eller i umiddelbar post-partum perioden. Intrapartum hypoksiske hendelser står for 0.660.000 dødsfall på verdensbasis hvert år, om lag en fjerdedel av verdens 2,9 million neonatale dødsfall i 2012 3. I 2010 1,15 millioner babyer ble anslått å ha utviklet neonatal encefalopati etter fødselen asfyksi 4. HIE definert som encefalopati hos barn født etter 34 uker av svangerskapet oppstår i 1-3 / 1000 levende fødte fem i den industrialiserte verden og opp til 8,5 / 1000 levendefødte i utviklingsland 4. Risikoen for å dø er 10-60%, og risikoen for nevrologiske handikap i overlevende 30-100% 6,7. 50200000 uførejusterte leveår (DALY) er tilskrevet intrapartum hypoksiske hendelser 4. I dag den eneste behandlingen annet enn støttende for HIE er post-hypoksisk hypotermi. Dermed fremskritt i diagnostiske prosedyrer og behandlingsstrategier er avgjørende for å forbedre forvaltningen av HIE 8.
Forbedringer i prognosen etter perinatal asfyksi og forvaltning av neonatal hjerneskade er basert på å utvide kunnskapen om underliggende sykdomsmekanismer end mulige behandlinger. Dyremodeller av HIE er spesielt nyttig som ulike kliniske hendelser kan føre til HIE og forekomsten i en enkelt fødsel senter er lav 5. En eksperimentell oppsett der påvirkning av biologisk variasjon kan minimeres, er viktig når du tester nye prognostiske og diagnostiske verktøy og behandlingsstrategier. En dyremodell bør tilnærme den kliniske situasjonen så godt som mulig, og dermed bidra til forståelsen av de patologiske mekanismene bak den induserte skader og dynamisk prosess involvert i sykdom og It'si utfallet 9. Dyremodeller av neonatal HIE har inkludert en rekke arter, inkludert gnagere, lam og svin. Til sammenligning har den nyfødte grisunge større likhet med en human nyfødte med hensyn på størrelse, det kardiovaskulære system 10 og hjerne modenhet ved leveringstidspunktet 11,12. Overvåking, instrumentering og resultatevaluering i Nøff modellen er lik that brukes i klinisk behandling av spedbarn med HIE. Følgelig er det en høy grad av oversettelse til nyfødte seg fra denne modellen.
Grisunger modeller av perinatal hypoksi og HIE blir brukt av mange grupper og varierer i en rekke områder 13. I henhold til formålet med forsøket, må nøye oppmerksomhet rettes mot valget av medisiner, metode for å indusere hypoksi-iskemi, metode for å kontrollere fornærmelse varighet og alvorlighetsgrad, post-fornærmelse gjenoppliving og omsorg, og utfallet evaluering. For å unngå skjevhet en randomisert studie design bør alltid brukes i intervensjonsstudier.
Metoden brukes når indusere hypoksisk-iskemisk skade er viktig. Globalt hypoksi fører til HIE resulterer ofte i flerorgansvikt involverer hjerne, hjerte, lunger, nyre og lever. Avhengig av de evaluerte utfall, bør modeller av HIE være basert på global hypoksi og iskemi stedet for å stole på fokus iskemi, f.eks. Ved ligering av bilotid arterier 14. En nyere artikkel påføres en kombinasjon av hypoksi (FiO 2 12%), og karotidarterien kompresjon under opprettholdelse av gjennomsnittlig arterielt blodtrykk> 40 mm Hg 2. En annen gruppe skapt global hypoksi med 8% O 2 til negative baseoverskudd> 20 mmol / L eller mener arterielle blodtrykk (MABP) <15 mm Hg, og ofret dyrene på 4 t 15. Hypoksi har også blitt titrert av minuttvolumet (30-40% av baseline), MABP (30-35 mm Hg) og arteriell pH (6,95-7,05) 16.
Alle modeller av global hypoksi-iskemi titreres etter aEEG undertrykkelse lik den som presenteres i denne rapporten, har vist encefalopati som er klinisk, elektrofysiologisk, og neuropathologically sammenlignes med tilstanden funnet i kvalt sikt spedbarn 17,18.
Graden av HIE indusert er viktig. En nyttig dyremodell for HIE må også gi rom for utprøving av ny diagnostiske prosedyrer og behandlingstilbud. For å aktivere dette, bør modellene indusere moderat HIE der det er en behandling potensial som alvorlig hjerneskade med lite eller ingen behandling potensialet vil være mindre relevant når man skal vurdere nye behandlinger. Toleranse for hypoksi varierer betydelig mellom forsøksdyr. Tidligere studier har vist at en mer konsekvent hjerneskade kan oppnås, og at flere dyr overlever 17,19 ved individualiserer indusert hypoksi ifølge hver smågris cerebral respons evaluert ved amplitude integrert elektroencefalografi (aEEG) i stedet for ved hjelp av et sett FiO 2 verdi gjennom hele hypoksisk hendelsen. Varigheten av aEEG suppresjon korrelerer med graden av hjerneskade, med få histopatologiske forandringer ved <20 min aEEG undertrykkelse og alvorlige beslag øker ved> 45 min aEEG undertrykkelse. En fersk gjennomgang av nevro behandlinger for HIE identifisert behov for levetidsmodeller slik at atferds utfallet measures i dyremodeller 20.
Det er mange fordeler med den present HIE Nøff modell. Den er basert på en art hvor resultatene er svært sannsynlig å oversette til human fysiologi. Global hypoksi-iskemi modeller multiorgansvikt og titrering av hypoksi-iskemi ved aEEG induserer en konsekvent grad av hjerneskade med overlevelses kliniske relevante utfall slik som biomarkører kan MR og oppførsel skal vurderes på aktuelle tidspunkter.
Piglet modeller av perinatal asfyksi og HIE har ikke bare bidratt vesentlig til dagens innsikt i HIE patofysiologi, men har også lykkes innledes kliniske studier, til slutt resulterer i nye behandlinger hos mennesker. Piglet modellstudier spilt en nøkkelrolle i å etablere hypotermi som behandling for HIE 21, og brukes i gjenopplivning av nyfødte forskning 22. Ulike grupper har brukt piglet modeller når du utfører forskning innen kvelning og HIE, end studier omfatter hypotermi 23 alpha-melanocyte-stimulerende hormon 24, hjertestans 25. tyrosinhydroksylaseaktivitet 26, gjentatt hypoksisk eksponering 27 NMDA reseptor aktivitet 14, og nær-infrarød spektroskopi 28.
Piglet HIE modell presenteres i denne rapporten er teknisk utfordrende å jobbe med, så små justeringer i løpet av prosedyren kan føre til enten for mild eller for alvorlig hjerneskade 29,2. Vi fant ut at den eksisterende litteraturen manglet tilstrekkelig detaljert til å reprodusere tidligere publiserte modeller. Dermed har vi her demonstrere hvert trinn av de tekniske prosedyrer som er nødvendige for etablering av en grisunge 72 timer overlevelse modell i denne rapporten, slik at forskerne å etablere denne avanserte modellen for studiet av HIE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den nåværende protokollen ble godkjent av danske Animal Experiments Datatilsynet. Alle forsøksdyrene ble bedøvet i hele fremgangsmåten. Gjengivelse av denne protokollen skal utføres i samsvar med nasjonale etikk og retningslinjer dyrevelferd, og godkjent av lokale etikkomiteer.
1. Dyr
- Danske Landrace smågris <24 timer gamle som veier ca 1500 - 2000 g.
2. Anestesi og vedlikehold Fluids
- Klargjør utstyret som trengs for anestesi (figur 1): En maske for sevofluran administrasjon, spritservietter, perifert venekateter, gummi band, sprøyter med saltvann, propofol (5 mg / kg), fentanyl (10 mikrogram / kg), og prokain benzylpenicillin (15 000 IU / kg).
- Innledning av anestesi ved å levere 1-2% sevofluran gjennom en pustemaske.
- Vurdere anestesidybden ved å vurdere for palpebral og tilbaketrekking reflekser. Når sikkert at Nøff er dypt bedøvet, percutaneously sette inn et perifert venekateter inn i øret blodåre.
- For å bekrefte åpenheten til det perifere venekateter, skylle kateteret med 1-2 ml steril 0,9% saltvann. Administrere bolusinjeksjoner av propofol (5 mg / kg) og fentanyl (10 ug / kg). Etter bolusinjeksjon administrasjon skylle den intravenøse kateter en gang ved hjelp av 1-2 ml steril 0,9% saltvann.
- Plasser sprøyter med propofol (10 mg / ml) og fentanyl (10 ug / ml) i to separate sprøyteinfusjonspumper. Koble iv rør fra de to sprøytepumper til en tre-veis stoppekran sammenføyning infusjoner i en enkelt linje som er koblet til intravenøst kateter. Begynn kontinuerlig intravenøs infusjon av propofol (4-12 mg / kg / time) og fentanyl (10 ug / kg / time). Når kontinuerlige infusjoner kjører, ikke gi ytterligere bolusinjeksjonene av propofol og fentanyl.
- Må administrasjonen av sevofluran gass ANESThesia.
- Injisere prokain benzylpenicillin (15000 IE / kg) subkutant eller intramuskulært i henhold til lokale retningslinjer for antibiotikaprofylakse. Gjenta daglig. Video viser subkutan administrering, som i grisunger har vist seg å resultere i høyere plasmakonsentrasjon og lengre halveringstid sammenlignet med im administrering.
- Påfør øye smøremiddel salve for å hindre uttørking av øynene. Trekk nedre øyelokk forsiktig ned for å danne en lomme-lignende åpning. Klem en liten mengde salve inne i lommen. Tett øye å distribuere salve. Sjekk for tørrhet time og nytt etter behov.
- Initiere en kontinuerlig infusjon av 5% dekstrose / 0,45% NaCl IV ved 10 ml / kg / time. Reduser hastighet til 5 ml / kg / time i løpet av og etter hypoksi. Juster infusjonshastigheten for å opprettholde blodsukkernivået mellom 2-10 mmol / L.
Figure 1. Utstyr for anestesi og intubasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
3. Intubasjon og Ventilasjon
- Klargjør det utstyr som er nødvendig for intubasjon (figur 1): rokuronium- bromid (1 mg / kg) for muskelavslapning, en løftestropp (tie begge ender av den samme fire mm nylontau sammen for å danne en sirkel som vist på figur 1) for å åpne munnen, pinne og veterinær laryngoskopet med rett blad, xylocain spray (100 mg / ml), forskjellige størrelser endotrakeale rør med mansjett (størrelse 3,0 mm, 2,5 mm, 2,0 mm), 500 ml selvoppblåsende pose (bag ventil en bomulls maske) for ventilasjon, 2 ml sprøyte for mansjettoppblåsing, og stetoskop.
- Intubere ved å følge trinnene nedenfor:
- Plasser piglet i liggende stilling støtte nakken fra hver side for å sikre en rett laryngeal passalvie for intubasjon.
- Estimer lengden av det endotrakeale røret ved å måle fra spissen av snuten på sternummarkering (typisk ca. 13 cm).
- Place tau slynge rundt overkjeven (nedover) og holde underkjeven og tungen oppover for å holde åpne munnen.
- Administrere rokuronium- bromide (1 mg / kg) iv å indusere muskelavslapning.
- Bruk laryngoskopet å løfte tunge oppover.
- Bruk bomullspinne for å frigjøre Nøff lange strupelokket, som kan være enten retrovertert i spiserøret eller fanget bak den bløte ganen.
- Advance laryngoskopet å holde epiglottis løftet mot tungen basen muliggjør full oversikt over arytenoid brusk og stemmebåndene.
- Påfør xylocain spray (100 mg / ml) lokalt i strupehodet for å hindre at strupehodet kramper.
- Advance endotrakealtuben gjennom stemmebåndene. Bruk en roterende bevegelse for å hjelpe bestått av de trange tracheal brusk. Advance tube according til premeasured avstand og koble til en selvoppblåsende pose (bag ventil maske) for manuell ventilasjon. For å bidra til å redusere friksjon under intubasjon spray distale 1/3 av endotrakealtuben med xylocain spray.
- For å bekrefte riktig endotrakealtuben plassering: observere for noen indikasjon på problemer med å puste, ausculate brystet lytter for bilateral luft inntreden i begge lungene, visuelt bekrefte tilstedeværelse av kondens i proksimale aspekt av endotrakealtuben og bekrefte tilstedeværelse av slutten tidevanns karbon dioxide med en kolo karbondioksid detektor eller ved ekspiratorisk CO 2 lesing på mekanisk ventilator hvis tilgjengelig. Normal endetidal karbondioksid er rundt 5%. En verdi over 2% sammen med en normal-lik bølgeform vil bekrefte at det endotrakeale røret er i luftrøret.
- Blås endotrakealtuben mansjetten for å hindre aspirasjon. Cuff lufttrykk skal være mindre enn 25 cm H 2 O for å unngå iskemisk skade til omkringliggende vev. Holder endotrakealtuben på plass, vind et stykke tape rundt røret, lukke kjeven og fortsette taping rundt snuten for å feste røret på plass. Dra forsiktig på røret for å sikre at den holder seg på plass.
- Koble endotrakealtuben til mekanisk ventilator.
- Juster respiratorinnstillinger: volumkontrollert ventilasjon, tidevolum (TV): 10 ml / kg [eller peak inspiratorisk trykk (PIP) 15 cm med trykkstyrt ventilasjon]. Positive enden ekspiratorisk trykk (PEEP): 5 cm. I: E-forholdet 1: 2. Respirasjonsfrekvens: 35 (justere hastigheten for å opprettholde ende-tidal CO 2 mellom 4,5-5,5 kPa).
4. Overvåking og Body Fluid Sampling
Figur 2. Utstyr for overvåking.ank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Klargjør utstyret som trengs for overvåking (figur 2): teip, sterile smøremiddel, sonde for kontinuerlig rektal temperaturmåling, elektrokardiogram (EKG) elektroder, pulsoksymeter, barberhøvel, og EEG elektroder.
- Sted metning sonde på et bakben, smøre rektal temperaturprobe og sett 6 cm inn i rektum, plassere overliggende varmestråler og / eller oppvarmet oppblåsbar luftmadrass for å opprettholde den rektale temperaturen ved den fysiologiske nivå på 38,5 til 39 ° C, og stedet EKG elektroder.
- Plasser piglet i liggende posisjon til å barbere deler av en cm x 1 cm for plassering av subkutane nål EEG elektroder; en foran hvert øre, og referanseelektroden i midtlinjen like bak øynene. Rengjør elektrodestedet med en spritserviett, og sett i nålelektrode subkutant. Sikre elektroder med teip og retur piglet til liggende posisjon.
- Slå på aEEG monitor.
MERK: amplitude integrert EEG består av en tett spor med øvre og lavere marginer. Nedre og øvre marginer i denne modellen er typisk 15-50 uV, ofte høyere enn sett hos spedbarn. Under hypoksi er det viktig å merke seg at artefakt fra EKG kan feilaktig heve aEEG spor. Bolus medikamenter (propofol eller fentanyl) kan også forbigående undertrykke aEEG trase og bør unngås hvis mulig i løpet av eksperimentet. Administrasjon av legemidler og kliniske hendelser bør merkes for å lette tolkningen av aEEG spor.
- Klargjør utstyret som trengs for å plassere navlekateter for sentrale arterielle blodtrykksmåling og blodprøvetaking (figur 3): sterile hansker, steril drapering, skalpell, spritservietter, sterile våtservietter, navlevenekateter (5 Fr), umbilical artery kateter (3,5 Fr ), sutur sett med tang, buede mikro tang, saks, nål holder og sutur (f.eks, størrelse 3-0), transparent lim patch, 5 ml sprøyter for blodprøvetaking.
Figur 3. Utstyr for umbilical linjer og blodprøvetaking. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Sterilisere og drapere området rundt navlen. Bruke en skalpell til å kutte navlestrengen så nær huden som mulig. Hvis dette ikke utsett umbilical årene i bedøvede Nøff, klippe navle huden 2 mm under navlestrengen for å avsløre skipene. Identifisere de to små umbilical arterier og en større umbilical vein (figur 4).
- Bruk buede mikro tang for å strekke arterie (figur 4) og sett navle arteriekateter(3,5 Fr). Estimat innsetting lengde i cm til 3 x vekt (kg) + 10 (empirisk formel basert på riktig plassering i synkende aorta ovenfor nyrearteriene på obduksjon).
- Sett en annen 5 Fr kateter 5 cm inn i navlevenen (figur 4). Kontroller intrakateteriseringen av blod retur. Sikre katetre ved å plassere en veske-streng sutur rundt navlen, passerer sutur ender rundt hver av umbilical katetre og knyt en knute. Dekk katetre med gjennomsiktig bandasje.
- Utlevering blodprøver ved forhåndsbestemte tidspunkter: 1) umiddelbart før hypoksi, 2) 30 min i hypoksisk fornærmelse 3) ved slutten av den 45 min hypoksiske fornærmelse 4) to timer etter hypoksisk fornærmelse. Avhengig av formålet med eksperimentet andre tidspunkter for blodprøver kan velges.
- Bruk arteriell blodgass-analyse av blodprøver tatt under hypoksi for å kontrollere blodgass endringer forårsaket av hypoksi-ischemi (tabell 1). Merk at grisungene har lav hemoglobin ent fødsel (rundt 8 g / dl) og kan bli blodfattig fra hyppige blodprøvetaking. Trekke mindre enn 2 ml blod / kg kroppsvekt per uavgjort, mindre enn 5 ml blod / kg kroppsvekt i løpet av 24 timer og holder seg til lokale retningslinjer for blodprøvetaking. Tegn på anemi inkluderer mink hematokrit og takykardi.
- Koble arteriell linje til en monitor for fortsetter intraarteriell blodtrykksmåling (MABP). Bruk venekateter for væske and Drug Administration.
Figur 4. Umbilical fartøy. Umbilical vene (til høyre) og en av to umbilical arterier (til venstre). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
5. Hypoksi
- Vent 60 minutter etter å ha fullført overvåking. Indusere hypoksi ved å bytte til en 4% O 2 N2 gassblanding. Overvåke vitale parametre og aEEG tett og fortsette hypoksi i 45 min.
- Når aEEG spor er flat (øvre marg <7 uV), justerer oksygene ved å forandre inspirert oksygenfraksjonen (FiO 2) og bety luftveistrykk til det høyeste FiO 2 nivå opprettholde et flatt spor aEEG i henhold til flytskjemaet vist i figur 5. Målet for MABP under 70% av baseline i minst 10 min, og hvis nødvendig lavere FiO 2 for å sikre hypotensjon og iskemi. Den beskrevne nivået av hypotensjon har tidligere vært vist av andre 19,13,30 for å fremstille aktuelle hypoksisk-iskemisk hjerneskade.
- I tilfelle av alvorlig hypotensjon (MABP <25 mm Hg) behandler trinnvis som følger: kort øke FiO 2 med 1-5%, saltvann bolus (10 ml / kg), infusjon av dopamin (5-20 ug / kg / min), og infusjon av noradrenalin (20 ng-1 ug / kg / min).
- Ved anfall som varer> 10 min (klonisk, tonic or myoklone anfall, typisk Focal eller som indikert av plutselige endringer i aEEG amplitude) behandler trinnvis med (slik at 30 min før du går videre til neste injeksjon): langsom bolus av fenobarbital iv 20 mg / kg, gjenta fenobarbital iv 20 mg / kg, og midazolam iv 0,5 mg / kg.
- Hvis beslag utvikle og er nonresponsive til medikamentell behandling dødshjelp er indikert.
Figur 5. Hypoksi-iskemi flytskjema. Flytskjema som viser justeringer i oksygenering (F i O 2 og P aw) i henhold til aEEG respons. Mean luftveistrykk (P aw) ble justert ved å endre PIP / TV (lavere PIP gir lavere P aw) og respirasjonsfrekvens (lavere RR gir lavere P aw). Målrette aEEG = øvre margin på spor <5 uV og lavere margin på spor> 3 uV (gjennomsnittlig 4 uV). Targethjertefrekvens (HR) => 80. Target bety arterielle blodtrykk (MABP) = MABP> 25. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
6. 72 timer overlevelse
- Overvåke piglet tett etter hypoksisk fornærmelse, og gradvis redusere satsene for infusjon av propofol og fentanyl. Extubate ved det punkt ved hvilket dyret puster frivillig.
- Under overlevelse periode, holde grisunger på et dyr anlegg med 24 timers vakt ved personell som er opplært i intensiv- og overvåking. Administrere iv glukose infusjoner 20 ml / kg 2-3 hver time. Ved 26 til 48 timer etter hypoksi-ischemi delvis flaskemating kan igangsettes. Aspirasjon til luftrøret og lungene kan skje ved mating med flaske hvis brekningsrefleksen er ikke til stede.
- Hvis det er aktuelt å forsøket, vurdere neurologisk status ved hjelp av poengsystem utviklet av Thoresen et al., Beskrevet idetalj i originalens 17.
7. Outcome Evaluering
- Etter 72 timer, bedøve og lufte igjen som beskrevet i punkt 2 og 3. Utfør MR-undersøkelse med relevante avbildningsmodaliteter som beskrevet av Munkeby et al 31 og andre to.
- Ved slutten av forsøket avlive grisunger med en dødelig dose av pentobarbital (5 g / kg iv).
- Forberede hjernen for undersøkelse i henhold til målet om forsøket.
- For hjernen histologi på formalinfiksert vev.:. Bruke hjerte perfusjon med 4% paraformaldehyde i PBS, etterfulgt av disseksjon og post fiksing i paraformaldehyde som beskrevet av Robertson et al 2, Chakkarapani et al en eller Liu et al 18 eller fjerne hjernen og lev i 4% paraformaldehyde som beskrevet av Andresen et al. 32
- For analyse krever snap-frosset vev (f.eks RNAanalyse eller enzymaktivitetsanalyser 33). Fjern hjernen, dissekere ut hjerneregioner av interesse og snap-fryse vevsblokker maksimum 1 cm x 1 cm i flytende nitrogen som beskrevet av Munkeby et al 33
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Virkningene av hypoksi-ischemi på hjernen som oppstår under induserte fornærmelse dokumenteres ved å registrere aEEG spor. En representant aEEG kontur er vist i figur 6.
Figur 6. Representative aEEG spor. Lav amplitude på grunn av hypoksi-iskemi. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
De ekstreme verdier av pH, baseoverskudd, og laktat under hypoksi registreres sammen med hjertefrekvens og blodtrykk. Klinisk nevrologi scoring er gjennomført 17. Data fra en eksperimentell dyr med en varighet på 38 min med lav amplitude aEEG og en fornærmelse fører til HIE med lav pH og relativ hypotensjon, er vist i tabell 1.
| aEEG <7uV (min) | pH lav under fornærmelse | Baseoverskudd lav under fornærmelse | Laktat høy under fornærmelse | MABP baseline | MABP høy | MABP lav | HR høy | HR lav |
| 37.5 | 6,93 | -19,80 | 19 | 48 | 72 | 33 | 219 | 162 |
Tabell 1. Representative fysiologiske data. For en grisunge med 38 min av aEEG <7 uV de ekstreme verdier av pH, baseoverskudd, laktat, hjertefrekvens (HR) og blodtrykk (MABP) innen 45 min av hypoksi er oppført.
MR på 72 timer kan avsløre skader avhengig av modaliteter brukes. Figur 7 viser en T2 vektet MR-bilde med hypoksisk-iskemisk skade.
Figur 7. Representative T2-vektet MR-bilde. T2-wighted bilde i aksialplan, 72 timer etter hypoksi-ischemi. Normal signalintensitet i mesencephalon, pons og medulla oblongata. Diffuse unormal signalintensitet hele hvit substans i begge halvkuler. T2-vektet MR viser lesjoner tilsvarende diffuse iskemisk infarkt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
H & E farging viser neuronskade sett på hematoxylin og eosin flekken. Ulike grupper har publisert ulike scoring systemer for å kvantifisere graden av histologiske skade på enten en 0,5 intervall skala fra 0-4 17 eller en skala fra 0-9 for fem ulike områder av hjernen med en maksimal skade score på 45 13.
Figur 8. Representant histopatologi. Lysmikroskop bilde med hematoxylin og eosin flekken. Skadede nevroner er eosinofil med en liten kjerne (piler). Bildet ble tatt til fange ved 200x forstørrelse. Scale bar = 50 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Forventet resultat fra modell: Tidligere publiserte studier med sammenlignbare modeller har resultert i ca 20% døde grisunger, 10% uten skader og 70% overlevende med hjerneskade 19. Disse studiene korrelerer godt med våre funn. Multi skade organ manifesterer ved 1) laktat acidose 2) anuri (nyreskade) 3) hypotensjon (iskemisk hjerteskade) og kan verifiseres ved visuell inspeksjon og histopatologi av organer post mortem. I denne modellen, hjertesvikter vist ved økning i kardial troponin T og ischemiske lesjoner på hjerteundersøkelse 18. Kliniske tegn på encefalopati kan kvantifiseres ved nevrologiske scoring og omfatter endringer i respirasjon, bevissthet, orientering, turgåing, tone, aktivitetsnivå, suger, vokalisering og tilstedeværelsen av patologiske bevegelser som beskrevet av andre 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På grunn av sin kompleksitet, kan den beskrevne modellen skal implementeres i anlegg akkreditert og erfarne i dyreforsøk. Godkjenning av lokale etikkomiteer må innhentes før oppstart av forsøkene, og optimal dyrevelferd må sikres til enhver tid. Ettersom modellen er basert på overlevelsen av testdyrene, er det viktig at et sterilt miljø opprettholdes under invasive prosedyrer for å hindre infeksjoner.
Valget av anestesi er viktig som de fleste om ikke alle anestesimidler har potensielle nervecellene egenskaper. Forskjeller i utfall mellom tidligere publiserte modeller kan ha vært delvis skyldes forskjeller i anestesi brukes, for eksempel halotan eller propofol 17,19. Dette er et punkt som er sjelden berørt i litteraturen, som anestesi ikke kan utelates, og det er en mangelen av bevis som ville gjelde for denne modellen. Vår pragmatisk tilnærming er å bruke så få differenT anestetika som mulig, er at sevofluran er kun brukt en kort stund, deretter på propofol og fentanyl blir tilført kontinuerlig. I våre forsøk medisinering bolusene påvirke aEEG forbigående, mens du bor innenfor de angitte grensene for kontinuerlig infusjon ikke. Når du skal teste nevro behandlinger skjevheter unngås ved hjelp av en randomisert studie design.
Den mest kritiske trinnet i modellen er etableringen av hypoksisk-iskemisk fornærmelse, som det primære målet er å indusere en moderat til alvorlig hypoksisk-iskemisk fornærmelse mens på samme tid sikre dyr overlevelse. Den unike kvaliteten på denne HIE modellen er evnen til å imøtekomme de forskjellige biologiske responser til hypoksi fra dyr til dyr. Titrering av oksygentilførsel til en høyest mulig fraksjonen resulterer i en deprimert aEEG (<7 uV), gir mulighet for justering i henhold til hver enkelt piglet's toleranse overfor hypoksi, og dermed sikre en høy overlevelsesrate kombinert med maksimal Neurological skade 19. Varigheten av flatt spor aEEG i løpet av 45 min til hypoksi skal sammenlignes med den grad av skade histopathologic for evaluering og optimalisering av skade alvorlighetsgrad. Andre forskere som bruker modellen, på samme måte har planert hypoksisk-iskemisk fornærmelse fra mild til alvorlig avhengig av varigheten av aEEG undertrykkelse. Som beslag i denne modellen har tidligere vist seg å korrelere med alvorlighetsgraden av hjerneskade på histopatologi 17 med litt behandling potensial, anbefaler vi en grad av hypoksi-iskemi alvorlighetsgrad ikke produserer beslag.
De fleste studier som bruker Nøff HIE modellen inkluderer 10 min med lav MABP (MABP <70% av baseline) 19. Björkman et al. funnet at hvis oksygentilførsel varieres under hypoksi, graden av hjerneskade var uavhengig av den tidsperioden som MABP var under 35 mm Hg 19. Pilotforsøk utført ved etablering dagens HIE modell, avslørte at sustained hypotensjon hvor MABP var lavere enn 25 mm Hg var assosiert med alvorlig hjerneskade og permanent flatt spor aEEG. Således må umiddelbar respons på alvorlig hypotensjon sikres for å unngå omfattende hjerne-ischemi fulgt av hjerne-død.
Etter hypoksisk perioden er også kritisk. Mange tidligere studier har reoxygenated studie dyr ved anvendelse av 100% oksygen, som er kjent for å forsterke hjerneskade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Warm-touch-pediatric blanket | Covidien | 5030840 | |
| Adhesive Apertrue Drape | Barrier | 915447 | |
| Utility Drape (sterile) 75x80 cm | Barrier | 800530 | |
| Neoflon | BD - Luer | 391350 | |
| Laryngoscope | Miller | 85-0045 | |
| Endotracheal tube 2.5 mm | Covidien | 111-25 | |
| Endotracheal tube 3.0 mm with cuff | Unomedical | MM61110030 | |
| Endotracheal tube 3.5 mm with cuff | Unomedical | MM61110035 | |
| Anesthesia machine | GE Healthcare | 1009-9002-000 | |
| EEG - electrodes/disposable subdermal needle electrode | Cephalon | ACCE120550 | |
| ECG - electrodes | medtronic | 3010107-003 | |
| ECG-electrodes for MR | philips | ACCE120550 | |
| Arterial blood sampler - aspirator | Radiometer medical ApS | 956552 | |
| Polyurethane Umbilical vein catheter (5 Fr/Ch) | Covidien | 8888160341 | |
| Polyurethane Umbilical vein catheter (3,5 Fr/ch) | Covidien | 8888160333 | |
| Suture set (size 3-0) | Covidien | 8886 623341 | |
| BD Spinal needle 0.7x38mm | BD needles | 405254 | |
| Gas with 96% Nitrogen / 4% oxygen | Air Liquide | made on order | |
| NeuroMonitor (CFM) system | Natus Medical Incorporated | OBM70002 |
References
- Chakkarapani, E., et al. Xenon enhances hypothermic neuroprotection in asphyxiated newborn pigs. Annals of. 68, 330-341 (2010).
- Robertson, N. J., et al. Melatonin augments hypothermic neuroprotection in a perinatal asphyxia model. Brain : a journal of neurology. 136, 90-105 (2013).
- Lawn, J. E., et al. Every Newborn: progress, priorities, and potential beyond survival. Lancet. 384, 189-205 (2014).
- Lee, A. C., et al. Intrapartum-related neonatal encephalopathy incidence and impairment at regional and global levels for 2010 with trends from 1990. Pediatric research. 74, Suppl 1. 50-72 (2013).
- Kurinczuk, J. J., White-Koning, M., Badawi, N. Epidemiology of neonatal encephalopathy and hypoxic-ischaemic encephalopathy. Early human development. 86, 329-338 (2010).
- Shankaran, S., Woldt, E., Koepke, T., Bedard, M. P., Nandyal, R. Acute neonatal morbidity and long-term central nervous system sequelae of perinatal asphyxia in term infants. Early human development. 25, 135-148 (1991).
- Robertson, C. M., Finer, N. N., Grace, M. G. School performance of survivors of neonatal encephalopathy associated with birth asphyxia at term. The Journal of pediatrics. 114, 753-760 (1989).
- Bennet, L., Booth, L., Gunn, A. J. Potential biomarkers for hypoxic-ischemic encephalopathy. Seminars in feta., & neonatal medicine. 15, 253-260 (2010).
- Yager, J. Y., Ashwal, S. Animal models of perinatal hypoxic-ischemic brain damage. Pediatric neurology. 40, 156-167 (2009).
- Buckley, N. M. Maturation of circulatory system in three mammalian models of human development. Comparative biochemistry and physiology. A, Comparative. 83, 1-7 (1986).
- Dobbing, J., Sands, J. Comparative aspects of the brain growth spurt. Early human development. 3, 79-83 (1979).
- Dobbing, J., Sands, J. Quantitative growth and development of human brain. Archives of disease in childhood. 48, 757-767 (1973).
- Foster, K. A., et al. An improved survival model of hypoxia/ischaemia in the piglet suitable for neuroprotection studies. Brain research. 919, 122-131 (2001).
- LeBlanc, M. H., Li, X. Q., Huang, M., Patel, D. M., Smith, E. E. AMPA antagonist LY293558 does not affect the severity of hypoxic-ischemic injury in newborn pigs. Stroke; a journal of cerebral circulation. 26, 1908-1914 (1995).
- Andresen, J. H., et al. Nicotine affects the expression of brain-derived neurotrophic factor mRNA and protein in the hippocampus of hypoxic newborn piglets. J Perinat Med. 37, 553-560 (2009).
- Cheung, P. Y., Gill, R. S., Bigam, D. L. A swine model of neonatal asphyxia. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
- Thoresen, M., et al. A piglet survival model of posthypoxic encephalopathy. Pediatric research. 40, 738-748 (1996).
- Liu, X., Tooley, J., Loberg, E. M., Suleiman, M. S., Thoresen, M. Immediate hypothermia reduces cardiac troponin I after hypoxic-ischemic encephalopathy in newborn pigs. Pediatric research. 70, 352-356 (2011).
- Bjorkman, S. T., et al. Hypoxic/Ischemic models in newborn piglet: comparison of constant FiO2 versus variable FiO2 delivery. Brain research. 1100, 110-117 (2006).
- Robertson, N. J., et al. Which neuroprotective agents are ready for bench to bedside translation in the newborn infant. The Journal of pediatrics. 160, 544-552 (2012).
- Jacobs, S. E., et al. Cooling for newborns with hypoxic ischaemic encephalopathy. Cochrane Database Syst Rev. 1, CD003311 (2013).
- Andresen, J. H., et al. Resuscitation with 21 or 100% oxygen in hypoxic nicotine-pretreated newborn piglets: possible neuroprotective effects of nicotine. Neonatology. 93, 36-44 (2008).
- Karlsson, M., et al. Delayed hypothermia as selective head cooling or whole body cooling does not protect brain or body in newborn pig subjected to hypoxia-ischemia. Pediatric research. 64, 74-78 (2008).
- Kovacs, J., et al. Asphyxia-induced release of alpha-melanocyte-stimulating hormone in newborn pigs. Peptides. 22, 1049-1053 (2001).
- Varvarousi, G., et al. Asphyxial cardiac arrest, resuscitation and neurological outcome in a Landrace/Large-White swine model. Laboratory animals. 45, 184-190 (2011).
- Tammela, O., Pastuszko, A., Lajevardi, N. S., Delivoria-Papadopoulos, M., Wilson, D. F. Activity of tyrosine hydroxylase in the striatum of newborn piglets in response to hypocapnic hypoxia. Journal of neurochemistry. 60, 1399-1406 (1993).
- Cote, A., Barter, J., Meehan, B. Age-dependent metabolic effects of repeated hypoxemia in piglets. Canadian journal of physiology and pharmacology. 78, 321-328 (2000).
- Tichauer, K. M., et al. Assessing the severity of perinatal hypoxia-ischemia in piglets using near-infrared spectroscopy to measure the cerebral metabolic rate of oxygen. Pediatric research. 65, 301-306 (2009).
- Jasani, M. S., Salzman, S. K., Tice, L. L., Ginn, A., Nadkarni, V. M. Anesthetic regimen effects on a pediatric porcine model of asphyxial arrest. Resuscitation. 35, 69-75 (1997).
- Chakkarapani, E., Thoresen, M., Liu, X., Walloe, L., Dingley, J. Xenon offers stable haemodynamics independent of induced hypothermia after hypoxia-ischaemia in newborn pigs. Intensive care medicine. 38, 316-323 (2012).
- Munkeby, B. H., et al. A piglet model for detection of hypoxic-ischemic brain injury with magnetic resonance imaging. Acta radiologica. 49, 1049-1057 (2008).
- Andresen, J. H., et al. Newborn piglets exposed to hypoxia after nicotine or saline pretreatment: long-term effects on brain and heart. J Matern Fetal Neonatal Med. 22, 161-168 (2009).
- Munkeby, B. H., et al. Resuscitation with 100% O2 increases cerebral injury in hypoxemic piglets. Pediatric research. 56, 783-790 (2004).
