Abstract
Fødsel asfyksi, som forårsager hypoxisk-iskæmisk encefalopati (HIE), tegner sig for 0.660.000 dødsfald på verdensplan hvert år, omkring en fjerdedel af verdens 2,9 millioner neonatale dødsfald. Dyremodeller for HIE har bidraget til forståelsen af patofysiologien i HIE, og har fremhævet den dynamiske proces, der forekommer i hjerneskade på grund af perinatal asfyksi. Således har dyreforsøg foreslået en tid-vindue for post-fornærmelse behandlingsstrategier. Hypotermi er testet som en behandling for HIE i pdiglet modeller og efterfølgende vist sig effektive i kliniske forsøg. Variationer af modellen er blevet anvendt i studiet af tillægsbehandling neurobeskyttende metoder og smågrise undersøgelser af xenon og melatonin har ført til klinisk fase I og II forsøg 1,2. Den pattegris HIE Modellen er yderligere brugt til neonatale resuscitation- og hæmodynamiske studier samt i undersøgelser af cerebral hypoxi på celleniveau. Det er imidlertid en teknisk udfordrendemodel og variationer i protokollen kan resultere i enten for mild eller for svær hjerneskade. I denne artikel viser vi de tekniske procedurer, der er nødvendige for at etablere en stabil pattegris model af neonatal HIE. Første er den nyfødte gris (<24 timer gamle, median vægt 1500 g) bedøvet, intuberet, og overvåges i en opsætning sammenlignelig med den, der findes i en neonatal intensivafdeling. Global hypoxi-iskæmi induceres ved at sænke fraktion den inspiratoriske oxygen at opnå global hypoxi, iskæmi gennem hypotension og en flad sporamplitude integreret EEG (AEEG) indikerer cerebral hypoxi. Overlevelse fremmes ved at justere iltning ifølge AEEG respons og blodtryk. Hjerneskade kvantificeres ved histopatologi og magnetisk resonans efter 72 timer.
Introduction
Perinatal asfyksi er en akut og ofte uforudset tilstand forbundet med hypoxisk-iskæmisk encefalopati (HIE). Det overordnede mål med denne protokol er at demonstrere en pattegrisenes overlevelse model af perinatal hypoxisk-iskæmisk encefalopati. Denne model kan anvendes til at undersøge effekten af forskellige grader af hypoxi-iskæmi på neonatal hjerne og eksperimentelle behandlinger på neuropatologi, magnetisk resonans billeddannelse og spektroskopi (MRI og MRS) og biomarkører i kropsvæsker såsom blod, cerebrospinalvæske og urin . Modellen er også vist sig nyttig til undersøgelse af kardiovaskulære system, åndedrætssystemet, nyre og lever, som alle er påvirket i global hypoxi-iskæmi.
Perinatal asfyksi er resultatet af kompromitteret iltforsyning intrapartum eller i umiddelbar efter fødslen periode. Intrapartum hypoxiske begivenheder udgør 0.660.000 dødsfald på verdensplan hvert år, omkring en fjerdedel af verdens 2,9 million neonatale dødsfald i 2012 3. I 2010 1150000 babyer blev anslået til at have udviklet neonatal encephalopati efter fødslen asfyksi 4. HIE defineret som encephalopati hos spædbørn født efter 34 ugers svangerskab forekommer i 1-3 / 1.000 levendefødte 5 i den industrialiserede verden og op til 8,5 / 1.000 levendefødte i udviklingslandene 4. Risikoen for døden er 10-60%, og risikoen for neurologiske handicap i overlevende 30-100% 6,7. 50200000 handicap leveår (DALYs) tilskrives intrapartum hypoxiske begivenheder 4. I øjeblikket den eneste anden end støttende til HIE behandling er post-hypoksisk hypotermi. Således fremskridt i diagnostiske procedurer og behandlingsstrategier er afgørende for at forbedre forvaltningen af HIE 8.
Forbedringer i prognosen efter perinatal asfyksi og forvaltning af neonatal hjerneskade er baseret på at udvide kendskabet til de underliggende sygdomsmekanismer end mulige behandlinger. Dyremodeller for HIE er særligt anvendelige som forskellige kliniske hændelser kan føre til HIE og forekomsten i en enkelt fødsel center er lav 5. En forsøgsopstilling, hvor påvirkning af biologisk variation kan minimeres, er afgørende, når tester nye prognostiske og diagnostiske redskaber og behandlingsstrategier. En dyremodel bør tilnærme den kliniske situation så tæt som muligt og dermed bidrage til forståelsen af de patologiske mekanismer bag den inducerede skade og den dynamiske proces involveret i sygdommen og ITs udfald 9. Dyremodeller for neonatal HIE har inkluderet en række arter, herunder gnavere, lam og svin. Til sammenligning nyfødte gris har højere lighed med en human nyfødt med hensyn til størrelse, kardiovaskulære system 10 og hjerne løbetid på leveringstidspunktet 11,12. Overvågning, instrumentering og resultatevaluering i gris modellen ligner that anvendes i den kliniske behandling af spædbørn med HIE. Følgelig er der en høj grad af oversættelse til nyfødte pleje fra denne model.
Smågrise modeller af perinatal hypoksi og HIE anvendes af mange grupper og varierer i en række områder 13. Ifølge formålet med forsøget, skal omhyggelig opmærksomhed på valget af medicin, metode til at fremkalde hypoxi-iskæmi, metode til at kontrollere fornærmelse varighed og sværhedsgrad, post-fornærmelse genoplivning og pleje, og resultatevaluering. For at undgå bias et randomiseret forsøg design skal altid anvendes i interventionelle studier.
Den anvendte metode ved at inducere hypoxisk-iskæmisk skade er vigtig. Global hypoxi fører til HIE resulterer ofte i multiorgansvigt involverer hjerne, hjerte, lunger, nyrer og lever. Afhængigt af de evaluerede resultater, bør modeller for HIE være baseret på global hypoxi og iskæmi i stedet stole på fokal iskæmi, f.eks., Ved ligering af bilotid arterier 14. En nylig papir anvendes en kombination af hypoxi (FiO 2 12%) og halspulsåren kompression under opretholdelse gennemsnitlige arterielle blodtryk> 40 mm Hg 2. En anden gruppe induceret global hypoksi med 8% O2 indtil negativ baseoverskud> 20 mmol / L eller betyde arterielt blodtryk (MABP) <15 mm Hg, og aflivet dyrene på 4 timer 15. Hypoxi er også blevet titreret ved minutvolumen (til 30-40% af baseline), MABP (til 30-35 mm Hg) og arteriel pH (6,95-7,05) 16.
Vis alle modeller af global hypoxi-iskæmi titreres ved AEEG undertrykkelse magen til den i denne rapport, har vist encephalopati, der er klinisk, elektrofysiologisk, og neuropatologisk sammenlignes med den tilstand, der findes i den kvalt sigt spædbarn 17,18.
Graden af HIE inducerede er afgørende. En nyttig dyremodel for HIE skal også give mulighed for afprøvning af nye diagnostisk procedurer og behandlingsmuligheder. For at aktivere dette, bør modellerne fremkalde moderat HIE, hvor der er en behandling potentiale som alvorlig hjerneskade med ringe eller ingen behandling potentiale ville være mindre relevant, når de evaluerer nye behandlinger. Tolerance til hypoxi varierer betydeligt fra forsøgsdyr. Tidligere undersøgelser har vist, at en mere konsekvent hjerneskade kan opnås, og at flere dyr overlever 17,19 ved individualisere den inducerede hypoxia i henhold til hver gris er cerebral respons vurderet ved amplitude integreret electroencefalografi (AEEG) snarere end at bruge et sæt FiO 2 værdi i hele hypoxisk begivenhed. Varigheden af AEEG undertrykkelse korrelerer med graden af hjerneskade, med få histopatologiske ændringer på <20 min AEEG undertrykkelse og alvorlige krampeanfald stigende ved> 45 min AEEG undertrykkelse. En nylig gennemgang af neurobeskyttende behandlinger for HIE peget på behovet for overlevelse modeller muliggør adfærdsmæssige udfald measninger i dyremodeller 20.
Der er talrige fordele ved den præsenterede HIE pattegris model. Den er baseret på en art, hvor resultaterne er meget sandsynligt at oversætte til den menneskelige fysiologi. Globale hypoxi-iskæmimodeller multiorgansvigt og titrering af hypoxi-iskæmi af AEEG inducerer en konsistent grad af hjerneskade med overlevelse kliniske relevante resultater, såsom at biomarkører, kan MRI og adfærd vurderes på relevante tidspunkter.
Piglet modeller af perinatal asfyksi og HIE har ikke alene bidraget væsentligt til aktuel indsigt i HIE patofysiologi, men har forud også med succes kliniske forsøg, i sidste ende resulterer i nye behandlinger hos mennesker. Piglet modelstudier spillede en central rolle i etableringen af hypotermi som en behandling for HIE 21, og anvendes i neonatal genoplivning forskning 22. Forskellige grupper har brugt smågrise modeller, når du udfører forskning inden for asfyksi og HIE, end studier inkluderer hypotermi 23, a-melanocyt-stimulerende hormon 24, hjertestop 25, tyrosin hydroxylase aktivitet 26, gentagen eksponering hypoxisk 27, NMDA-receptor-aktivitet 14, og nær-infrarød spektroskopi 28.
Den pattegris HIE model præsenteres i denne rapport, er teknisk udfordrende at arbejde med, da mindre justeringer i løbet af proceduren kan resultere i enten for mild eller for svær hjerneskade 29,2. Vi fandt, at den eksisterende litteratur manglede tilstrækkelige detaljer til at reproducere tidligere offentliggjorte modeller. Således har vi her demonstrerer hvert trin i de tekniske procedurer, der er nødvendige for etablering af en gris 72 timers overlevelse model i denne rapport, så forskerne til at etablere denne avancerede model for studiet af HIE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den nuværende protokol blev godkendt af Dansk Dyreforsøgstilsynet. Alle forsøgsdyr blev bedøvet hele procedurerne. Gengivelse af denne protokol skal ske i overensstemmelse med nationale etik og retningslinjer for dyrevelfærd, og godkendt af de lokale etiske råd.
1. Dyr
- Dansk Landrace smågrise <24 timers gamle vejer ca. 1.500 - 2.000 g.
2. Anæstesi og vedligeholdelse Væsker
- Forberede det nødvendige udstyr til anæstesi (figur 1): En maske til sevofluran administration, alkoholkompresser, perifer intravenøs kateter, elastik, sprøjter med saltvand, propofol (5 mg / kg), fentanyl (10 ug / kg), og procain benzylpenicillin (15.000 IU / kg).
- Inducere anæstesi ved at levere 1-2% sevofluran gennem åndedrætsværn.
- Vurdere anæstesidybden ved at vurdere for palpebral og tilbagetrækning REFLexes. Når sikkert, at grisen er dybt bedøvet, perkutant indsætte et perifert intravenøst kateter ind i øret vene.
- For at bekræfte åbenheden af perifer intravenøs kateter skylles kateteret med 1-2 ml sterilt 0,9% saltvand. Administrere bolusinjektioner af propofol (5 mg / kg) og fentanyl (10 ug / kg). Efter bolusinjektion administration gennemskylles iv kateter en anden gang ved hjælp af 1-2 ml sterilt 0,9% saltvand.
- Sted sprøjter med propofol (10 mg / ml) og fentanyl (10 ug / ml) i to separate infusions- sprøjten pumper. Forbinde iv rør fra de to sprøjtepumper til en tre-vejs stophane sammenføjning infusioner til en enkelt linje, der er forbundet med den intravenøse kateter. Start kontinuerlig iv infusion af propofol (4-12 mg / kg / time) og fentanyl (10 ug / kg / time). Når kontinuerlige infusioner kører, ikke giver yderligere bolus injektioner af propofol og fentanyl.
- Afbryd administration af sevofluran gas Anesthesia.
- Injicere procaine benzylpenicillin (15.000 IE / kg) subkutant eller intramuskulært som pr lokale retningslinjer for antibiotisk profylakse. Gentag dagligt. Videoen viser sc administration, som i smågrise har vist sig at resultere i højere plasmakoncentration og længere halveringstid i forhold til im administration.
- Anvend øjet smøremiddel salve for at forhindre udtørring af øjnene. Træk det nederste øjenlåg forsigtigt ned for at danne en lomme-lignende åbning. Klem en lille mængde salve inde i lommen. Vågent øje til at distribuere salve. Check for tørhed time- og genanvende efter behov.
- Indlede en kontinuert rate infusion af 5% dextrose / 0,45% NaCl iv ved 10 ml / kg / time. Reducer hastigheden til 5 ml / kg / time under og efter hypoxi. Juster infusionshastighed for at opretholde blodsukkerniveauer mellem 2-10 mmol / l.
Figure 1. Udstyr til anæstesi og intubation. Klik her for at se en større version af dette tal.
3. Intubering og ventilation
- Forberede det nødvendige udstyr til intubation (figur 1): rocuroniumbromid (1 mg / kg) for muskel afslapning, et reb slynge (binde begge ender af den samme 4 mm nylon reb sammen for at danne en cirkel som vist i figur 1) til åbning munden, en bomuld tippes vatpind og veterinærmedicinske laryngoscope med lige blad, xylocain spray (100 mg / ml), forskellige størrelser endotracheale rør med manchet (str 3,0 mm, 2,5 mm, 2,0 mm), 500 ml selvoppustelige taske (pose ventil maske) til ventilation, 2 ml sprøjte til manchet inflation, og stetoskop.
- Intubere ved at følge nedenstående trin:
- Sted pattegris i liggende stilling understøtter halsen fra hver side for at sikre en lige larynx passage til intubation.
- Estimere længden af det endotracheale rør ved måling fra spidsen af snude til brystbenet hak (typisk omkring 13 cm).
- Sted reb slynge rundt om overkæben (nedad), og hold underkæben og tungen opad for at holde munden åben.
- Administrere rocuroniumbromid (1 mg / kg) iv at inducere muskelafslapning.
- Brug laryngoskop at løfte tunge opad.
- Brug bomuld podepind at frigøre grisens lange epiglottis, som kan være enten retroverted i esophagus eller fanget bag den bløde gane.
- Advance laryngoskop at holde epiglottis løftet mod tungen basen muliggør fuld visning af arytenoid brusk og stemmebånd.
- Påfør xylocain spray (100 mg / ml) topisk i struben at forhindre larynx spasmer.
- Advance endotrakealtube gennem stemmebåndene. Brug en roterende bevægelse til støtte vedtagelsen af de smalle luftrør brusk. Advance rør according til premeasured afstand og oprette forbindelse til en selvoppustelige taske (pose ventil maske) til manuel ventilation. For at reducere friktion under intubation spray den distale 1/3 af det endotracheale rør med xylocain spray.
- For at bekræfte korrekt endotrakealtube placering: observere for nogen indikation af åndedrætsbesvær, ausculate brystet lytte efter bilateral indgang luft i begge lunger, visuelt bekræfte tilstedeværelsen af kondens i den proksimale del af endotrachealrøret og kontrollere tilstedeværelsen af enden tidevandsenergi kulstof dioxid med en kolorimetrisk kuldioxid detektor eller ved ekspiratorisk CO 2 læsning på mekanisk ventilator hvis tilgængelig. Normal ende tidevandsenergi kuldioxid er omkring 5%. En værdi over 2% sammen med en normalt udseende bølgeform vil bekræfte, at det endotracheale rør er i luftrøret.
- Pump endotrachealrøret manchet for at forhindre aspiration. Manchetten dæktryk skal være mindre end 25 cm H 2 O for at undgå iskæmisk skade til det omgivende væv. Holder endotrachealrøret på plads, vind et stykke tape rundt om røret, lukke kæben og fortsætte taping omkring snuden for at fastgøre slangen på plads. Træk forsigtigt på røret for at sikre, at det bliver på plads.
- Tilslut endotrachealt rør til mekanisk ventilator.
- Juster ventilator indstillinger: volumen ventilation, tidalvolumen (TV): 10 ml / kg [eller peak inspiratoriske tryk (PIP) 15 cm med trykstyret ventilation]. Positive slutekspirationstryk (PEEP): 5 cm. I: E-forhold 1: 2. Respirationsfrekvens: 35 (juster hastighed for at opretholde end-tidal CO 2 mellem 4,5-5,5 kPa).
4. Overvågning og kropsvæske Sampling
Figur 2. Udstyr til overvågning.ank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
- Forbered det nødvendige udstyr til overvågning (figur 2): tape, steril smøremiddel, sonde til kontinuerlig rektal temperaturmåling, elektrokardiogram (EKG) elektroder, pulsoximeter, barberblade, og EEG elektroder.
- Sted mætning sonde på et bagben, smøre rektal temperatursonde og indsætte 6 cm i rektum, placere overliggende strålevarmerserien og / eller opvarmet oppustelig luftmadras at opretholde den rektale temperatur ved den fysiologiske niveau på 38,5 til 39 ° C, og sted EKG elektroder.
- Placer pattegris i bugleje at barbere områder på 1 cm x 1 cm til placering af subkutane kanyle EEG elektroder; en foran hvert øre, og referenceelektroden i midterlinjen lige bag øjnene. Rengør elektroden site med en spritserviet, derefter indsætte nålen elektrode subkutant. Sikker elektroder med tape og tilbagevenden pattegris til liggende position.
- Tænd AEEG skærm.
BEMÆRK: Amplituden integrerede EEG består af en tæt spor med øvre og lavere marginer. Nedre og øvre margener i denne model er typisk 15-50 μV, ofte højere end set hos spædbørn. Under hypoxi er det vigtigt at bemærke, at artefakt fra EKG'et kan fejlagtigt ophøje AEEG spor. Bolus medicin (propofol eller fentanyl) kan også forbigående undertrykke AEEG spor og bør undgås, hvis muligt under eksperimentet. Administration af lægemidler og kliniske begivenheder bør mærkes at lette fortolkningen af AEEG spor.
- Forbered nødvendig for at placere navlestrengen katetre til central arterielt blodtryk overvågning og blodprøvetagning (Figur 3) udstyr: sterile handsker, steril draperinger, skalpel, spritservietter, sterile klude, navlestrengen vene kateter (5 Fr), umbilical arterie kateter (3.5 Fr ), sutur sæt med pincet, buede mikro pincet, saks, nål indehaveren og sutur (fx størrelse 3-0), transparent selvklæbende plaster, 5 ml sprøjter til blodprøvetagning.
Figur 3. Udstyr til navlestrengen linjer og blodprøvetagning. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Sterilisere og drapere området omkring navlen. Brug en skalpel til at skære navlestrengen så tæt på huden som muligt. Hvis dette ikke udsætte navlestrengen skibe i bedøvede gris, klippe navlestrengen hud 2 mm under navlestrengen at eksponere skibene. Identificere de to små umbilical arterier og den ene større navlestrengsvenen (figur 4).
- Brug buede mikro pincet til at spile arterien (figur 4), og sæt navlestrengen arteriekateter(3,5 Fr). Skøn indsættelse længde i cm til 3 x vægt (kg) + 10 (empiriske formel baseret på korrekt placering i faldende aorta over nyrearterierne på obduktion).
- Placer en anden 5 Fr kateter 5 cm ind i navlestrengen vene (figur 4). Bekræft intravaskulær kateter placering ved blod tilbage. Sikker katetre ved at placere en pung-string sutur omkring navlen, passerer suturen slutter omkring hver af de umbilical katetre og binde en knude. Cover katetre med transparent selvklæbende forbinding.
- Saml blodprøver på forhånd specificerede tidspunkter: 1) umiddelbart før hypoxi, 2) 30 min i hypoxisk fornærmelse 3) i slutningen af 45 min hypoxiske fornærmelse 4) 2 timer efter hypoksisk fornærmelse. Kan vælges afhængigt af formålet med forsøget andre tidspunkter for blodprøver.
- Bruge arteriel blodgas analyse fra blodprøver, der udtages under hypoxi at kontrollere gas ændringer blod forårsaget af hypoxi-iskæmi (tabel 1). Bemærk, at pattegrisene have lav hæmoglobin ent fødslen (ca. 8 g / dl) og kan blive anæmiske fra hyppig blodprøvetagning. Trække mindre end 2 ml blod / kg legemsvægt pr uafgjort, mindre end 5 ml blod / kg legemsvægt inden for 24 timer, og holde sig til lokale retningslinjer for blodprøvetagning. Tegn på anæmi omfatter faldende hæmatokrit og takykardi.
- Tilslut arteriel linje til en skærm for fortsætter intraarteriel blodtryksmonitorering (MABP). Brug venøs linje for væske og medicin administration.
Figur 4. Umbilical fartøjer. Umbilical vene (til højre) og en af to umbilical arterier (til venstre). Klik her for at se en større version af dette tal.
5. Hypoxi
- Vent 60 minutter efter endt overvågning. Fremkalde hypoxi ved at skifte til en 4% O 2 N2-gas blanding. Overvåg vitale parametre og AEEG nøje og fortsætte hypoxi i 45 min.
- Når AEEG spor er fladt (øvre margen <7 μV), justere iltning ved at ændre inspirerede oxygen fraktion (FiO 2) og gennemsnitlig luftvejstryk til det højeste FiO 2-niveau opretholde en flad spor AEEG ifølge rutediagrammet vist i figur 5. Målet for MABP under 70% af baseline i mindst 10 minutter og hvis nødvendigt nedre FiO 2 for at sikre hypotension og iskæmi. Den beskrevne plan for hypotension er tidligere blevet vist af andre 19,13,30 at producere relevant hypoxisk-iskæmisk hjerneskade.
- I tilfælde af svær hypotension (MABP <25 mm Hg) behandle trinvis på følgende: kortvarigt øge FiO 2 ved 1-5%, saltvand bolus (10 ml / kg), infusion af dopamin (5-20 ug / kg / min), og infusion af noradrenalin (20 ng-1 ug / kg / min).
- I tilfælde af anfald, der varer> 10 min (kloniske, toniske or myokloniske anfald, typisk fokal eller som angivet af pludselige ændringer i AEEG amplitude) behandle trinvis med (tillader 30 min før man går videre til den næste injektion): langsom bolus af phenobarbital iv 20 mg / kg, gentag phenobarbital iv 20 mg / kg, og midazolam iv 0,5 mg / kg.
- Hvis anfald udvikler og er nonresponsive til medicinsk behandling eutanasi er indikeret.
Figur 5. Hypoxi-iskæmi flowchart. Flowchart viser justeringer i iltning (F i O 2 og P aw) i henhold til AEEG respons. Middel luftvejstryk (P aw) blev justeret ved at ændre PIP / TV (lavere PIP giver lavere P aw) og respirationsfrekvens (lavere RR giver lavere P aw). Target AEEG = øvre margin på spor <5 μV og nedre margin af spor> 3 μV (gennemsnitligt 4 μV). Targethjertefrekvens (HR) => 80. Target betyde arterielt blodtryk (MABP) = MABP> 25. Klik her for at se en større version af dette tal.
6. 72 hr overlevelse
- Overvåg gris nøje efter hypoxiske fornærmelse, og gradvis nedbringe satserne for infusion af propofol og fentanyl. Ekstuberes ved det punkt, hvor dyret trækker vejret frivilligt.
- Under overlevelse periode, holde smågrise på et dyr facilitet med 24 timers ur af personale uddannet i intensiv behandling og overvågning. Administrere iv glucose infusioner 20 ml / kg 2-3 time. Ved 26-48 timer efter hypoxi-iskæmi delvis sutteflaske kan initieres. Aspiration til luftrøret og lungerne kan ske ved sutteflaske hvis gag reflex ikke er til stede.
- Hvis det er relevant for eksperimentet, evaluere neurologisk status ved hjælp scoringssystem udviklet af Thoresen et al., Beskrevet idetaljer i den originale publikation 17.
7. Resultat Evaluering
- Efter 72 timer, bedøver og ventilere igen som beskrevet i afsnit 2 og 3. Udfør MR-scanning med relevante billeddiagnostiske modaliteter som beskrevet af Munkeby et al 31 og andre 2.
- Ved afslutningen af eksperimentet aflive smågrise med en dødelig dosis af pentobarbital (5 g / kg iv).
- Forbered hjernen til undersøgelse i henhold til målet om eksperimentet.
- For hjernen histologi på formalin fikseret væv:.. Bruge kardiel perfusion med 4% paraformaldehyd i PBS, efterfulgt af dissektion og post-fiksering i paraformaldehyd som beskrevet af Robertson et al 2, Chakkarapani et al 1 eller Liu et al 18 eller fjerne hjernen og fordybe i 4% paraformaldehyd som beskrevet af Andresen et al. 32
- Til analyse kræver snap-frosset væv (f.eks RNAanalyse eller enzym aktivitetsassays 33):. Fjern hjernen, dissekere ud hjerneområder af interesse og snap-freeze væv blokke af maksimalt 1 cm x 1 cm i flydende nitrogen som beskrevet af Munkeby et al 33
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Virkningerne af hypoxi-iskæmi på hjernen, der opstår under den inducerede spot dokumenteres ved at registrere AEEG spor. En repræsentant AEEG-kurve er vist i figur 6.
Figur 6. Repræsentant AEEG spor. Lav amplitude på grund af hypoxi-iskæmi. Klik her for at se en større version af dette tal.
De ekstreme værdier af pH, basen overskud, og laktat under hypoxi registreres sammen med puls og blodtryk. Klinisk neurologi scoring udføres 17. Data fra et forsøgsdyr med en varighed på 38 min med lav amplitude AEEG og en fornærmelse fører til HIE med lav pH og relativ hypotension, er vist i tabel 1.
| AEEG <7uV (min) | pH lavt under fornærmelse | Base overskydende lavt under fornærmelse | Laktat høj under fornærmelse | MABP baseline | MABP høj | MABP lav | HR høj | HR lav |
| 37,5 | 6,93 | -19,80 | 19 | 48 | 72 | 33 | 219 | 162 |
Tabel 1. Repræsentative fysiologiske data. For en pattegris med 38 min på AEEG <7 μV de ekstreme pH-værdier, baseoverskud, lactat, hjertefrekvens (HR) og blodtryk (MABP) inden for 45 min af hypoxi er angivet.
MR ved 72 timer kan afsløre skader afhængig af de nærmere retningslinjer, der anvendes. Figur 7 viser en T2 vægtet MRI billede med hypoxisk-iskæmisk skade.
Figur 7. Repræsentative T2 vægtet MRI billede. T2-wighted billede i aksialt plan, 72 timer efter hypoxi-iskæmi. Normal signalintensitet i mesencephalon, pons og medulla oblongata. Diffus unormal signalintensitet hele den hvide substans i begge halvkugler. T2-vægtede MR viser læsioner svarende til diffus iskæmisk infarkt. Klik her for at se en større version af dette tal.
H & E-farvning viser neuronal skade som set på hematoxylin og eosin pletten. Forskellige grupper har offentliggjort forskellige pointsystemer til kvantificering af graden af histologiske skader på enten 0,5 interval skala fra 0-4 17 eller en skala fra 0-9 for 5 forskellige hjerneområder med en maksimal skade score på 45 13.
Figur 8. Repræsentativ histopatologi. Lysmikroskop billede med hematoxylin og eosin pletten. Beskadigede neuroner er eosinofil med en lille kerne (pile). Billedet blev taget til fange ved 200x forstørrelse. Scale bar = 50 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Forventet udfald fra model: Tidligere publicerede undersøgelser med anvendelse af sammenlignelige modeller har resulteret i ca. 20% døde pattegrise, 10% uden skader og 70% overlevende med hjerneskade 19. Disse undersøgelser korrelerer godt med vores resultater. Multi orgel skade manifester ved 1) laktat acidose 2) anuri (nyreskade) 3) hypotension (hjerte-iskæmisk skade), og kan kontrolleres ved visuel inspektion og histopatologi af organer post mortem. I denne model hjertedysfunktioner påvist ved stigning i kardial troponin T og iskæmiske læsioner på hjerte-undersøgelse 18. Kliniske tegn på encefalopati kan kvantificeres ved neurologisk scoring og inkludere ændringer i respiration, bevidsthed, orientering, gåture, tone, aktivitetsniveau, sutter, vokalisering og tilstedeværelsen af patologiske bevægelser som beskrevet af andre 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På grund af dets kompleksitet, kan den beskrevne model kun gennemføres i faciliteter, der er akkrediteret og har erfaring med dyreforsøg. Godkendelse af lokale etiske udvalg skal indhentes før initiering af forsøgene, og optimal dyrevelfærd skal sikres på alle tidspunkter. Som model er baseret på overlevelsen af forsøgsdyrene, er det vigtigt, at et sterilt miljø opretholdes under invasive procedurer til at forebygge infektioner.
Valget af anæstesi er vigtigt, da de fleste, hvis ikke alle anæstetika har potentielle neurobeskyttende egenskaber. Forskelle i resultat mellem tidligere publicerede modeller kan have været skyldes til dels forskelle i bedøvelsesmidler, der anvendes, såsom halothan eller propofol 17,19. Dette er et punkt, der sjældent berørt i litteraturen, som anæstesi ikke kan udelades, og der er en mangel på beviser, som ville være gældende for denne model. Vores pragmatiske tilgang er at bruge så få different bedøvelsesmidler som muligt, dvs. sevofluran anvendes kun kortvarigt, derefter propofol og fentanyl infunderes kontinuerligt. I vores eksperimenter medicin boli påvirker AEEG forbigående, mens de opholder sig inden for de specificerede grænser for kontinuerlig infusion ikke. Ved testning neurobeskyttende behandlinger bias undgås ved anvendelse af et randomiseret forsøg design.
Det mest kritiske trin i modellen er etableringen af hypoxisk-iskæmisk insult, som det primære mål er at inducere en moderat til svær hypoxisk-iskæmisk insult, mens på samme tid sikrer dyr overlevelse. Den unikke kvaliteten af denne HIE model er evnen til at rumme de forskellige biologiske reaktioner på hypoksi fra dyr til dyr. Titrering af ilt levering til den højest mulige fraktion resulterer i en deprimeret AEEG (<7 μV), giver mulighed for justeringer i henhold til hver enkelt piglet's tolerance over for hypoxi, hvilket sikrer en høj overlevelsesprocent kombineret med maksimal Neurological skade 19. Varigheden af flade spor AEEG under 45 min af iltmangel skal sammenlignes med graden af histopatologiske skade for evaluering og optimering af skade sværhedsgrad. Andre forskere ved hjælp af modellen, på samme måde har gradueret den hypoxisk-iskæmisk insult fra mild til svær afhængigt af varigheden af AEEG undertrykkelse. Som tidligere er blevet vist anfald i denne model til at korrelere med alvorligheden af hjerneskade på histopatologi 17 med lidt behandling potentiale, anbefaler vi et niveau af hypoxi-iskæmi sværhedsgraden ikke producerer anfald.
De fleste undersøgelser ved hjælp af pattegris HIE model omfatter 10 min med lav MABP (MABP <70% af baseline) 19. Björkman et al. fandt, at hvis varieres ilttilførsel under hypoxi, graden af hjerneskade var uafhængig af det tidsrum MABP var under 35 mm Hg 19. Pilotforsøg udføres, når oprettelse af nuværende HIE model, afslørede, at sustained hypotension hvor MABP var lavere end 25 mm Hg var forbundet med svær hjerneskade og permanent flad spor AEEG. Således må øjeblikkelig reaktion på alvorlig hypotension skal sikres for at undgå omfattende hjerneiskæmi efterfulgt af hjerne-død.
Den post-hypoksisk periode er også kritisk. Mange tidligere undersøgelser har reoxygenated undersøgelse dyr ved anvendelse af 100% oxygen, som vides at forværre hjerneskade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Warm-touch-pediatric blanket | Covidien | 5030840 | |
| Adhesive Apertrue Drape | Barrier | 915447 | |
| Utility Drape (sterile) 75x80 cm | Barrier | 800530 | |
| Neoflon | BD - Luer | 391350 | |
| Laryngoscope | Miller | 85-0045 | |
| Endotracheal tube 2.5 mm | Covidien | 111-25 | |
| Endotracheal tube 3.0 mm with cuff | Unomedical | MM61110030 | |
| Endotracheal tube 3.5 mm with cuff | Unomedical | MM61110035 | |
| Anesthesia machine | GE Healthcare | 1009-9002-000 | |
| EEG - electrodes/disposable subdermal needle electrode | Cephalon | ACCE120550 | |
| ECG - electrodes | medtronic | 3010107-003 | |
| ECG-electrodes for MR | philips | ACCE120550 | |
| Arterial blood sampler - aspirator | Radiometer medical ApS | 956552 | |
| Polyurethane Umbilical vein catheter (5 Fr/Ch) | Covidien | 8888160341 | |
| Polyurethane Umbilical vein catheter (3,5 Fr/ch) | Covidien | 8888160333 | |
| Suture set (size 3-0) | Covidien | 8886 623341 | |
| BD Spinal needle 0.7x38mm | BD needles | 405254 | |
| Gas with 96% Nitrogen / 4% oxygen | Air Liquide | made on order | |
| NeuroMonitor (CFM) system | Natus Medical Incorporated | OBM70002 |
References
- Chakkarapani, E., et al. Xenon enhances hypothermic neuroprotection in asphyxiated newborn pigs. Annals of. 68, 330-341 (2010).
- Robertson, N. J., et al. Melatonin augments hypothermic neuroprotection in a perinatal asphyxia model. Brain : a journal of neurology. 136, 90-105 (2013).
- Lawn, J. E., et al. Every Newborn: progress, priorities, and potential beyond survival. Lancet. 384, 189-205 (2014).
- Lee, A. C., et al. Intrapartum-related neonatal encephalopathy incidence and impairment at regional and global levels for 2010 with trends from 1990. Pediatric research. 74, Suppl 1. 50-72 (2013).
- Kurinczuk, J. J., White-Koning, M., Badawi, N. Epidemiology of neonatal encephalopathy and hypoxic-ischaemic encephalopathy. Early human development. 86, 329-338 (2010).
- Shankaran, S., Woldt, E., Koepke, T., Bedard, M. P., Nandyal, R. Acute neonatal morbidity and long-term central nervous system sequelae of perinatal asphyxia in term infants. Early human development. 25, 135-148 (1991).
- Robertson, C. M., Finer, N. N., Grace, M. G. School performance of survivors of neonatal encephalopathy associated with birth asphyxia at term. The Journal of pediatrics. 114, 753-760 (1989).
- Bennet, L., Booth, L., Gunn, A. J. Potential biomarkers for hypoxic-ischemic encephalopathy. Seminars in feta., & neonatal medicine. 15, 253-260 (2010).
- Yager, J. Y., Ashwal, S. Animal models of perinatal hypoxic-ischemic brain damage. Pediatric neurology. 40, 156-167 (2009).
- Buckley, N. M. Maturation of circulatory system in three mammalian models of human development. Comparative biochemistry and physiology. A, Comparative. 83, 1-7 (1986).
- Dobbing, J., Sands, J. Comparative aspects of the brain growth spurt. Early human development. 3, 79-83 (1979).
- Dobbing, J., Sands, J. Quantitative growth and development of human brain. Archives of disease in childhood. 48, 757-767 (1973).
- Foster, K. A., et al. An improved survival model of hypoxia/ischaemia in the piglet suitable for neuroprotection studies. Brain research. 919, 122-131 (2001).
- LeBlanc, M. H., Li, X. Q., Huang, M., Patel, D. M., Smith, E. E. AMPA antagonist LY293558 does not affect the severity of hypoxic-ischemic injury in newborn pigs. Stroke; a journal of cerebral circulation. 26, 1908-1914 (1995).
- Andresen, J. H., et al. Nicotine affects the expression of brain-derived neurotrophic factor mRNA and protein in the hippocampus of hypoxic newborn piglets. J Perinat Med. 37, 553-560 (2009).
- Cheung, P. Y., Gill, R. S., Bigam, D. L. A swine model of neonatal asphyxia. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
- Thoresen, M., et al. A piglet survival model of posthypoxic encephalopathy. Pediatric research. 40, 738-748 (1996).
- Liu, X., Tooley, J., Loberg, E. M., Suleiman, M. S., Thoresen, M. Immediate hypothermia reduces cardiac troponin I after hypoxic-ischemic encephalopathy in newborn pigs. Pediatric research. 70, 352-356 (2011).
- Bjorkman, S. T., et al. Hypoxic/Ischemic models in newborn piglet: comparison of constant FiO2 versus variable FiO2 delivery. Brain research. 1100, 110-117 (2006).
- Robertson, N. J., et al. Which neuroprotective agents are ready for bench to bedside translation in the newborn infant. The Journal of pediatrics. 160, 544-552 (2012).
- Jacobs, S. E., et al. Cooling for newborns with hypoxic ischaemic encephalopathy. Cochrane Database Syst Rev. 1, CD003311 (2013).
- Andresen, J. H., et al. Resuscitation with 21 or 100% oxygen in hypoxic nicotine-pretreated newborn piglets: possible neuroprotective effects of nicotine. Neonatology. 93, 36-44 (2008).
- Karlsson, M., et al. Delayed hypothermia as selective head cooling or whole body cooling does not protect brain or body in newborn pig subjected to hypoxia-ischemia. Pediatric research. 64, 74-78 (2008).
- Kovacs, J., et al. Asphyxia-induced release of alpha-melanocyte-stimulating hormone in newborn pigs. Peptides. 22, 1049-1053 (2001).
- Varvarousi, G., et al. Asphyxial cardiac arrest, resuscitation and neurological outcome in a Landrace/Large-White swine model. Laboratory animals. 45, 184-190 (2011).
- Tammela, O., Pastuszko, A., Lajevardi, N. S., Delivoria-Papadopoulos, M., Wilson, D. F. Activity of tyrosine hydroxylase in the striatum of newborn piglets in response to hypocapnic hypoxia. Journal of neurochemistry. 60, 1399-1406 (1993).
- Cote, A., Barter, J., Meehan, B. Age-dependent metabolic effects of repeated hypoxemia in piglets. Canadian journal of physiology and pharmacology. 78, 321-328 (2000).
- Tichauer, K. M., et al. Assessing the severity of perinatal hypoxia-ischemia in piglets using near-infrared spectroscopy to measure the cerebral metabolic rate of oxygen. Pediatric research. 65, 301-306 (2009).
- Jasani, M. S., Salzman, S. K., Tice, L. L., Ginn, A., Nadkarni, V. M. Anesthetic regimen effects on a pediatric porcine model of asphyxial arrest. Resuscitation. 35, 69-75 (1997).
- Chakkarapani, E., Thoresen, M., Liu, X., Walloe, L., Dingley, J. Xenon offers stable haemodynamics independent of induced hypothermia after hypoxia-ischaemia in newborn pigs. Intensive care medicine. 38, 316-323 (2012).
- Munkeby, B. H., et al. A piglet model for detection of hypoxic-ischemic brain injury with magnetic resonance imaging. Acta radiologica. 49, 1049-1057 (2008).
- Andresen, J. H., et al. Newborn piglets exposed to hypoxia after nicotine or saline pretreatment: long-term effects on brain and heart. J Matern Fetal Neonatal Med. 22, 161-168 (2009).
- Munkeby, B. H., et al. Resuscitation with 100% O2 increases cerebral injury in hypoxemic piglets. Pediatric research. 56, 783-790 (2004).
