Abstract
Asphyxie unter der Geburt, die hypoxisch-ischämischen Enzephalopathie (HIE) verursacht, entfallen 0,66 Mio. Todesfälle weltweit jedes Jahr rund ein Viertel der weltweit 2,9 Millionen Todesfälle bei Neugeborenen. Tiermodelle von HIE haben zum Verständnis der Pathophysiologie in HIE beigetragen hat und den dynamischen Prozess, der in Hirnverletzung auftreten aufgrund perinataler Asphyxie hervorgehoben. So haben Untersuchungen an Tieren ein Zeitfenster für die Post-Beleidigung Behandlungsstrategien vorgeschlagen. Hypothermie hat sich als Behandlung für HIE in pdiglet Modellen getestet und anschließend in klinischen Studien nachgewiesen wirksam. Variationen des Modells sind in der Studie von Zusatz neuroprotektive Verfahren und Ferkel Studien von Xenon und Melatonin angewendet worden sind, um die klinische Phase I und II führten Studien 1,2. Die Ferkel HIE Modell wird weiter für neonatale resuscitation- und hämodynamische Studien sowie in Untersuchungen von zerebrale Hypoxie auf zellulärer Ebene verwendet. Es ist jedoch eine technisch anspruchsvolleModell und Variationen in dem Protokoll kann entweder zu leicht oder zu schweren Hirnschäden führen. In diesem Artikel zeigen wir die technischen Verfahren für die Schaffung eines stabilen Ferkel Modell der neonatalen HIE notwendig. Zuerst wird die neugeborenen Ferkel (<24 h alt, Durchschnittsgewicht 1500 g) anästhesiert, intubiert und in ein ähnlicher Aufbau wie in einer Intensivstation gefunden überwacht. Globale Hypoxie-Ischämie durch Absenken des inspiratorischen Sauerstofffraktion, globale Hypoxie, Ischämie durch Hypotonie und eine flache Spur Amplitude integriert EEG (aEEG), der zerebrale Hypoxie erreichen induziert. Überleben durch Anpassung Sauerstoffversorgung nach dem aEEG Antwort und der Blutdruck vorangetrieben. Hirnverletzung durch Histopathologie und Magnetresonanztomographie nach 72 h quantifiziert.
Introduction
Perinatale Asphyxie ist eine akute und oft unvorhergesehene Zustand mit hypoxisch-ischämischen Enzephalopathie (HIE) zugeordnet ist. Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, eine Ferkelüberlebensmodell der perinatalen hypoxischischämischer Enzephalopathie zu demonstrieren. Dieses Modell kann verwendet werden, um die Wirkung der verschiedenen Grade der Hypoxie-Ischämie am Gehirn und neonatalen von experimentellen Behandlungen auf Neuropathologie, Magnetresonanzbildgebung und Spektroskopie (MRI und MRS) und Biomarker in Körperflüssigkeiten wie Blut, Rückenmarksflüssigkeit und Urin zu untersuchen . Das Modell hat sich auch als nützlich für die Untersuchung der Herz-Kreislauf-System, die Atmungsorgane, Nieren- und Leber, die alle in globale Hypoxie-Ischämie betroffen.
Perinatale Asphyxie ist das Ergebnis beeinträchtigt Sauerstoffversorgung intrapartum oder in der unmittelbaren postpartalen Zeitraum. Intrapartum hypoxischen Ereignissen entfallen 0,66 Millionen Todesfälle weltweit jedes Jahr rund ein Viertel der weltweit 2,9 Mio.Ionen neonatalen Todesfälle in 2012 3. Im Jahr 2010 1,15 Millionen Babys wurden schätzungsweise neonatalen Enzephalopathie entwickelt, nach der Geburt Asphyxie 4 haben. HIE definiert als Enzephalopathie bei Säuglingen in der 34. Schwangerschaftswoche geboren tritt in 1-3 / 1000 Lebendgeburten 5 in den Industrieländern und bis zu 8,5 / 1.000 Lebendgeburten in den Entwicklungsländern 4. Das Sterberisiko ist 10-60%, und das Risiko neurologischer Behinderung in Lebenden 30-100% 6,7. 50.200.000 Behinderung bereinigte Lebensjahre (DALYs) an intrapartum hypoxischen Ereignissen 4 zurückgeführt. Derzeit die einzige Behandlung, andere als unterstützend für HIE ist post-hypoxischen Unterkühlung. Daher sind Fortschritte in der Diagnostik und Behandlungsstrategien wesentlich zur Verbesserung der Verwaltung von HIE 8.
Verbesserungen in der Prognose nach perinatale Asphyxie und Verwaltung der neonatalen Hirnverletzung sind auf den Ausbau Kenntnisse der zugrunde liegenden Krankheitsmechanismen auf der Grundlage einerd mögliche Behandlungen. Tiermodellen für HIE sind insbesondere als verschiedene klinische Ereignisse zu HIE führen und die Häufigkeit in jeder einzelnen Geburt Zentrum niedrig 5. Eine Versuchsanordnung, in der der Einfluss der biologischen Variation minimiert werden kann, ist von wesentlicher Bedeutung bei der Prüfung von neuen prognostischen und Diagnose- und Behandlungsstrategien. Ein Tiermodell sollte die klinische Situation so weit wie möglich anzunähern und damit einen Beitrag zum Verständnis der pathologischen Mechanismen der induzierten Schädigung und den dynamischen Prozess in der Krankheit und es ist Ergebnis 9 beteiligt zugrunde. Tiermodellen von neugeborenen HIE haben eine Reihe von Arten, einschließlich Nagetiere, Lamm und Schwein enthalten. Im Vergleich dazu hat der neugeborenen Ferkel höhere Ähnlichkeit mit einem menschlichen Neugeborenen hinsichtlich Größe, Herz-Kreislauf-System 10 und Gehirn Fälligkeit zum Zeitpunkt der Lieferung 11,12. Monitoring, Instrumentation und Ergebnisevaluation in der Ferkel Modell ähnelt that in der klinischen Versorgung von Säuglingen mit HIE verwendet. Dementsprechend gibt es ein hohes Maß an Übersetzung in Pflege des Neugeborenen von diesem Modell.
Ferkel Modellen einer perinatalen Hypoxie und HIE werden von vielen Gruppen verwendet und variieren in einer Reihe von Bereichen 13. Entsprechend dem Zweck des Versuchs muss sorgfältig auf die Wahl der Medikamente bezahlt werden, Verfahren zur Induktion der Hypoxie-Ischämie, Verfahren zur Steuerung der Dauer und Schwere Beleidigung, post-Beleidigung Wiederbelebung und Pflege und Ergebnisevaluation. Zum Vorspannen eine randomisierte Studie Design sollte immer in Interventionsstudien verwendet werden vermeiden.
Das angewendet wird, wenn induzierende hypoxischen ischämischen Verletzungen Verfahren wichtig ist. Globale Hypoxie führt zu HIE oft zu Multiorganversagen mit Gehirn, Herz, Lunge, Nieren und Leber. Je nach den Ergebnissen beurteilt, sollte Modelle von HIE auf globale Hypoxie und Ischämie basieren und nicht auf fokale Ischämie, zB angewiesen., Durch Ligation der Autootid Arterien 14. Eine kürzlich Papier aufgebracht eine Kombination von Hypoxie (FiO 2 12%) und Arteria carotis Kompression während den mittleren arteriellen Blutdruck> 40 mm Hg 2. Eine andere Gruppe induzierte globale Hypoxie um 8% O 2 bis negativer Base Excess> 20 mmol / L oder mittleren arteriellen Blutdruck (MAD) <15 mm Hg, und opferte die Tiere bei 4 h 15. Hypoxie wurde auch von Herzleistung titriert wurde (30-40% des Ausgangswertes), MABP (30-35 mm Hg) und der arterielle pH-Wert (6,95-7,05) 16.
Modelle der globalen Hypoxie-Ischämie durch aEEG Unterdrückung ähnlich der in diesem Bericht enthaltenen titriert haben Enzephalopathie, das in Kliniken, elektrophysiologisch nachgewiesen und neuropathologisch vergleichbar mit dem Zustand, in dem erstickt tige Säugling 17,18 gefunden.
Der Grad der induzierten HIE ist wesentlich. Ein nützliches Tiermodell der HIE muss auch für die Erprobung neuer dia ermöglichengnostischen Verfahren und Behandlungsmöglichkeiten. Um dies zu ermöglichen, sollten die Modelle moderate HIE, wo es eine Behandlung Potenzial als schwere Hirnschädigung mit wenig oder keiner Behandlung Potenzial wäre weniger relevant bei der Bewertung neuer Behandlungen zu induzieren. Toleranz gegenüber Hypoxie variiert beträchtlich zwischen den Versuchstieren. Frühere Studien haben gezeigt, dass eine konsequentere Hirnschädigung erreicht werden kann und dass mehr Tiere überleben 17,19 durch Individualisierung des induzierter Hypoxie nach Hirnantwort jedes Ferkel durch Amplituden integriert Elektroenzephalographie (aEEG) bewertet und nicht mit einem Satz FiO2-Wert in der gesamten hypoxische Ereignis. Die Dauer aEEG Unterdrückung korreliert mit dem Grad der Gehirnverletzung, mit wenigen histopathologischen Veränderungen bei <20 min aEEG Unterdrückung und schwere Krämpfe Erhöhung bei> 45 min aEEG Unterdrückung. Eine kürzlich durchgeführte Überprüfung der neuroprotektive Behandlungen für HIE identifiziert die Notwendigkeit für das Überleben Modelle ermöglichen Verhaltens Ergebnis measnahmen im Tiermodell 20.
Es gibt zahlreiche Vorteile des vorgestellten HIE Ferkelmodell. Es basiert auf einer Art, bei der Ergebnisse mit hoher Wahrscheinlichkeit auf die menschliche Physiologie zu übersetzen beruht. Globale Hypoxie-Ischämie-Modellen Multiorganversagen und Titration von Hypoxie-Ischämie durch aEEG induziert eine konsequente Grad der Hirnschädigung mit dem Überleben klinisch relevante Ergebnisse, dass Biomarker, MRI und Verhalten kann bei entsprechenden Zeitpunkten ausgewertet werden.
Piglet Modelle perinatale Asphyxie und HIE haben nicht nur wesentlich zur aktuellen Einblick in HIE Pathophysiologie, sondern auch erfolgreich voran klinischen Studien, was letztlich zu neuen Therapien bei Menschen. Piglet Modellstudien spielte eine Schlüsselrolle bei der Schaffung Hypothermie als Behandlung für HIE 21 und werden in Wiederbelebung von Neugeborenen Forschungs 22 verwendet. Verschiedene Gruppen haben Ferkel-Modelle verwendet werden, wenn die Durchführung von Untersuchungen innerhalb Asphyxie und HIE eind Studien umfassen Hypothermie 23, alpha-Melanozyten-stimulierendes Hormon 24, Herzstillstand 25, Tyrosin-Hydroxylase-Aktivität 26, wiederholt hypoxischen Exposition 27, NMDA-Rezeptor-Aktivität 14 und Nahinfrarotspektroskopie 28.
Die Ferkel HIE Modell in diesem Bericht ist technisch anspruchsvoll, mit zu arbeiten, als kleinere Anpassungen im Laufe des Verfahrens kann in entweder zu leicht oder zu schwere Hirnschädigung 29,2 führen. Wir haben festgestellt, dass die vorhandene Literatur fehlte ausreichend detaillierte zuvor veröffentlichten Modelle reproduzieren. So haben wir hier zeigen, jeden Schritt der technischen Verfahren für die Einrichtung eines Ferkel 72 Stunden Überlebensmodell in diesem Bericht erforderlich, die Forscher, um dieses erweiterte Modell für die Untersuchung von HIE etablieren.
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Protocol
Dieses Protokoll wurde von der dänischen Tierversuche Inspektion genehmigt. Alle Versuchstiere wurden während der Verfahren anästhesiert. Reproduktion dieses Protokoll muss in Übereinstimmung mit den nationalen Ethik und Tierschutz-Richtlinien durchgeführt werden, und von den lokalen Ethikkommissionen genehmigt.
1. Tiere
- Dänische Landrasse Ferkel <24 Stunden alt mit einem Gewicht von ca. 1.500 - 2.000 g.
2. Anästhesie und Wartungsflüssigkeiten
- Bereiten Sie die Geräte für die Anästhesie benötigt (Abbildung 1): Eine Maske für Sevofluran Verwaltung, Alkoholtupfer, periphere intravenöse Katheter, Gummiband, Spritzen mit Kochsalzlösung, Propofol (5 mg / kg), Fentanyl (10 ug / kg) und Procain Benzylpenicillin (15.000 IU / kg).
- Induzieren Anästhesie durch die Bereitstellung von 1-2% Sevofluran über eine Atemmaske.
- Beurteilen Sie die Narkosetiefe durch die Bewertung für palpebral und Entzugs reflexes. Wenn Sie sicher, dass das Ferkel ist tief anästhesiert, perkutan einen peripheren intravenösen Katheter legen Sie in die Ohrvene.
- , Um die Durchgängigkeit des peripheren intravenösen Katheter bestätigen, spülen Sie den Katheter mit 1-2 ml steriler 0,9% Salzlösung. Verabreichen Bolusinjektionen von Propofol (5 mg / kg) und Fentanyl (10 ug / kg). Nach Bolusinjektion Verwaltung spülen Sie den intravenösen Katheter ein zweites Mal mit 1-2 ml steriler 0,9% Salzlösung.
- Platz Spritzen mit Propofol (10 mg / ml) und Fentanyl (10 ug / ml) in zwei separate Spritzeninfusionspumpen. Verbinden iv Rohre von den zwei Spritzenpumpen zu einem Dreiwegehahn Füge Infusionen in eine Zeile, die zur intravenösen Katheter angeschlossen ist. Starten kontinuierlicher iv-Infusion von Propofol (4-12 mg / kg / h) und Fentanyl (10 ug / kg / h). Sobald Dauerinfusionen ausgeführt werden, geben Sie nicht weiter Bolusinjektionen von Propofol und Fentanyl.
- Unterbrechen der Verabreichung des Sevofluran Gas anesthesia.
- Injizieren Procain Benzylpenicillin (15.000 IU / kg) subkutan oder intramuskulär gemäß den örtlichen Richtlinien für Antibiotika-Prophylaxe. Wiederholen Sie täglich. Das Video zeigt subkutaner Verabreichung, die bei Ferkeln wurde gezeigt, dass im höheren Plasmakonzentration und eine längere Halbwertszeit zur Folge, verglichen mit intramuskulärer Verabreichung.
- Bewerben Auge Schmiermittel Salbe, um das Trocknen der Augen zu vermeiden. Ziehen Sie das Unterlid vorsichtig nach unten, um eine taschenförmige Öffnung bilden. Geben Sie eine kleine Menge der Salbe in der Tasche. Auge um Salbe zu verteilen. Überprüfen Sie für Trockenheit Stunden und erneut nach Bedarf.
- Starten Sie eine kontinuierliche Rate Infusion von 5% Dextrose / 0,45% NaCl iv bei 10 ml / kg / h. Reduzieren Rate auf 5 ml / kg / h während und nach der Hypoxie. Einzustellen Infusionsrate auf den Blutzuckerspiegel bei 2-10 mmol / l zu halten.
Figure 1. Ausrüstung für Anästhesie und Intubation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
3. Intubation und Beatmung
- Bereiten Sie die Geräte zur Intubation erforderlich (Abbildung 1): Rocuroniumbromid (1 mg / kg) für die Muskelentspannung, eine Seilschlinge (binden die beiden Enden des gleichen 4 mm Nylon-Seil zusammen, um einen Kreis zu bilden, wie in Abbildung 1 dargestellt) zum Öffnen der Mund, kippte ein Wattestäbchen und Veterinär Laryngoskop mit gerader Klinge, Xylocain-Spray (100 mg / ml), verschieden große Endotrachealtuben mit Manschette (Größe 3,0 mm, 2,5 mm, 2,0 mm), 500 ml selbstfüllende Beutel (Beutel-Ventil Maske) für Lüftung, 2 ml Spritze für Aufpumpen der Manschette und Stethoskop.
- Intubieren, indem Sie die folgenden Schritte aus:
- Ort Ferkel in der Rückenlage die Unterstützung der Hals von jeder Seite, ein gerader Kehlkopf pas sichernSalbei zur Intubation.
- Schätzen Sie die Länge des Tubus durch Messung von der Spitze des Mauls bis zum Brustbeinkerbe (in der Regel ca. 13 cm).
- Platz Seilschlinge um den Oberkiefer (nach unten) und halten Sie Unterkiefer und Zunge nach oben, um den Mund offen zu halten.
- Verwalten Rocuroniumbromid (1 mg / kg) iv zu Muskelentspannung zu induzieren.
- Verwenden Laryngoskop, die Zunge nach oben zu heben.
- Verwenden Sie die Baumwolltupfer, um die Ferkel lange Kehldeckel, die entweder in die Speiseröhre retroverted oder hinter dem Gaumensegel gefangen werden kann befreien.
- Voran Laryngoskop nach den Kehldeckel gegen den Zungengrund ermöglicht den Augen der Aryknorpel und Stimmbänder angehoben halten.
- Bewerben Xylocain-Spray (100 mg / ml) topisch in den Kehlkopf zu Kehlkopfkrämpfe zu verhindern.
- Voran Endotrachealtubus durch die Stimmbänder. Verwenden Sie eine Drehbewegung um die Weitergabe der schmalen Trachealknorpel unterstützen. Vorausrohr according auf die vorgemessenen Entfernung und eine Verbindung zu einem selbstfüllende Tasche (Beatmungsbeutel) für die manuelle Lüftung. Zu helfen, die Reibung während der Intubation zu reduzieren sprühen die distalen 1/3 des Endotrachealtubus mit Xylocain-Spray.
- Um zu bestätigen, richtigen Endotrachealtubus Platzierung: beobachten, für jeden Hinweis auf Schwierigkeiten beim Atmen, ausculate die Brust hört für bilaterale Lufteintritt in beiden Lungen, visuell zu bestätigen das Vorhandensein von Kondensation in dem proximalen Teil des Endotrachealtubus, und überprüfen Sie das Vorhandensein von endtidale Kohlen Kohlendioxid mit einer farbmetrischen Kohlendioxid-Detektor oder exspiratorische CO 2 Messwert auf dem Beatmungsgerät, falls verfügbar. Normale endtidale Kohlendioxid um rund 5%. Ein Wert von über 2% zusammen mit einem normal erscheinende Wellenform bestätigt, daß der Tubus in der Luftröhre.
- Pumpen Sie den Endotrachealtubus Manschette, um Aspiration zu verhindern. Manschetteninflationsdruck sollte weniger als 25 cm H 2 O, um ischämischen Schäden zu vermeiden an das umgebende Gewebe. Halten des Endotrachealtubus in Ort, wickeln Sie ein Stück Klebeband um das Rohr, schließen Sie den Kiefer und weiterhin Taping um die Schnauze, um das Rohr zu befestigen. Ziehen Sie vorsichtig an dem Rohr, um sicherzustellen, dass es an Ort und Stelle bleibt.
- Schließen Endotrachealtubus zu mechanischen Ventilator.
- Passen Sie Einstellungen des Beatmungsgerätes: volumenkontrollierten Beatmung, Atemvolumen (TV): 10 ml / kg [oder Inspirationsspitzendruck (PIP) 15 cm mit der druckkontrollierten Beatmung]. Positive endexspiratorischen Druck (PEEP): 5 cm. I: E-Verhältnis 1: 2. Atemfrequenz: 35 (justieren Rate zu endexspiratorischen CO 2 zwischen 4,5-5,5 kPa zu halten).
4. Monitoring und Körperflüssigkeiten Sampling
Abbildung 2. Ausrüstung für die Überwachung.ank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
- Bereiten Sie die für die Überwachung (Abbildung 2) benötigte Ausrüstung: Klebeband, steriles Gleitmittel, Messsonde zur kontinuierlichen rektale Temperaturmessung, Elektrokardiogramm (EKG) Elektroden, Pulsoximeter, Rasierer, und EEG-Elektroden.
- Platz Sättigung Sonde an einem Hinterbein, schmieren rektale Temperatursonde und legen Sie 6 cm in das Rektum, legen Kopfstrahlungsheizung und / oder beheizte aufblasbare Luftmatratze, die rektale Temperatur an der physiologischen Ebene von 38,5 bis 39 ° C zu halten und Platz ECG Elektroden.
- Platzieren Ferkel in der Bauchlage, um Bereiche von 1 cm x 1 cm für die Platzierung der Subcutannadel EEG-Elektroden Rasur; eine vor jedem Ohr, und die Referenzelektrode in der Mittellinie direkt hinter den Augen. Die Elektrode Website mit einem Alkoholtupfer reinigen, legen Sie dann die Nadelelektrode subkutan. Sichere Elektroden mit Klebeband und Rück Ferkel in die Rückenlage position.
- Schalten Sie aEEG Monitor.
HINWEIS: Die integrierte EEG Amplitude besteht aus einer dichten Trace mit oberen und unteren Rand. Unteren und oberen Ränder in diesem Modell sind in der Regel 15 bis 50 & mgr; V, oft höher als bei Kindern gesehen. Während Hypoxie ist es wichtig zu beachten, dass aus dem EKG-Artefakt fälschlicherweise erhöhen die aEEG Spur. Bolus Medikamente (Propofol oder Fentanyl) können auch vorübergehend unterdrücken die aEEG Spur und sollte vermieden werden, wenn möglich, während des Experiments. Verabreichung von Medikamenten und klinischen Ereignissen sollte markiert werden, um Auslegung des aEEG Spur zu erleichtern.
- Bereiten Sie die für die Platzierung Nabelkatheter zur zentralen arteriellen Blutdruckmessung und Blutabnahme (Abbildung 3) benötigte Ausrüstung: sterile Handschuhe, sterilen Abdeckung, Skalpell, Alkoholtupfer, sterile Tücher, Nabelvenenkatheter (5 Fr), Nabelarterienkatheter (3,5 Fr ), Nahtmaterial mit einer Pinzette, gebogen Mikro Zangen, Scheren, Nadelhalter und Nahtmaterial (SetzB Größe 3-0), transparente Klebepflaster, 5 ml Spritzen zur Blutentnahme.
Abbildung 3. Ausrüstung für Nabellinien und Blutentnahme. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
- Sterilisieren und drapieren Sie den Bereich um den Nabel. Verwenden Sie ein Skalpell, um die Nabelschnur so nah an der Haut wie möglich zu schneiden. Wenn dies der Nabelgefäße in der narkotisierten Ferkel aussetzen, schneiden Sie die Nabelhaut 2 mm unterhalb der Nabelschnur, die Gefäße aus. Identifizieren Sie die beiden kleinen Nabelarterien und die eine größere Nabelvene (Abbildung 4).
- Verwenden gekrümmte Mikropinzette, um die Arterie (Abbildung 4) erweitern sich und legen Sie die Nabelarterienkatheter(3,5 Fr). Estimate Einbaulänge in cm bis 3 x Gewicht (kg) + 10 (Summenformel basierend auf korrekte Platzierung in absteigender Aorta oberhalb Nierenarterien auf Autopsie).
- Legen Sie eine zweite 5 Fr-Katheter 5 cm in die Nabelvene (Abbildung 4). Stellen Sie sicher, intravaskulären Katheter Platzierung von Blutrück. Sichere Katheter durch Platzieren einer Tabaksbeutelnaht um den Nabel, übergeben Sie die Fadenenden um jede der Nabelkatheter und verknoten. Decken Katheter mit transparenten Klebeverband.
- Sammeln von Blutproben zu vorgegebenen Zeitpunkten: 1) unmittelbar vor der Hypoxie, 2) 30 Minuten in hypoxischen Insult 3) am Ende der 45 min hypoxischen Insult 4) 2 h nach hypoxischen Insult. Je nach dem Zweck des Experiments anderen Zeitpunkten Blutproben gewählt werden.
- Verwenden arterielle Blutgasanalyse von Blutproben bei Hypoxie getroffen werden, um die Blutgasveränderungen durch Hypoxie-Ischämie (Tabelle 1) verursacht zu überprüfen. Beachten Sie, dass Ferkel haben niedrige Hämoglobin eint Geburt (ca. 8 g / dL) und können anämisch durch häufige Blutentnahme. Zurückzuziehen weniger als 2 ml Blut / kg Körpergewicht pro Ziehung, weniger als 5 ml Blut / kg Körpergewicht innerhalb von 24 h und sich an die örtlichen Richtlinien zur Blutabnahme. Anzeichen von Anämie sind abnehm Hämatokrit und Tachykardie.
- Schließen arteriellen Leitung an einen Monitor für weiterhin intraarterieller Blutdrucküberwachung (MABP). Verwenden venöse Leitung für Fluid and Drug Administration.
Abbildung 4. Nabelgefässe. Nabelvene (rechts) und einem der beiden Nabelarterien (links). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
5. Hypoxie
- Warten Sie 60 Minuten nach Abschluss der Überwachung. Induzieren Hypoxie durch den Wechsel zu einer 4% O 2 2 Gasgemisch. Überwachung von Vitalparametern und aEEG eng und weiter Hypoxie für 45 min.
- Sobald die aEEG Spur ist flach (Oberrand <7 & mgr; V), Sauerstoffzufuhr einzustellen, indem die eingeatmete Sauerstofffraktion (FiO 2) und mittleren Atemwegsdruck auf den höchsten FiO 2 level Aufrechterhaltung einer flachen Spur aEEG nach dem in 5 gezeigten Flussdiagramm. Ziel für MABP unter 70% des Ausgangswertes für mindestens 10 min und bei Bedarf niedriger FiO 2 zu Hypotonie und Ischämie zu gewährleisten. Die beschriebene Niveau der Hypotonie wurde bereits früher von anderen 19,13,30 gezeigt, dass sie relevant hypoxisch-ischämischen Hirnverletzung zu erzeugen.
- Im Falle von schweren Hypotonie (MABP <25 mm Hg) zu behandeln schrittweise wie folgt: kurz erhöhen FiO2 um 1-5%, Salz Bolus (10 ml / kg), Infusion von Dopamin (5-20 & mgr; g / kg / min) und Infusion von Noradrenalin (20 ng-1 ug / kg / min).
- Bei Pfändungen dauerhaft> 10 min (klonische, tonische or myoklonischen Anfällen, in der Regel als fokale oder durch plötzliche Veränderungen in aEEG Amplitude) angegeben zu behandeln schrittweise mit (was 30 Minuten, bevor Sie mit der nächsten Injektion): langsame Bolus von Phenobarbital iv 20 mg / kg, wiederholen Sie Phenobarbital iv 20 mg / kg und Midazolam iv 0,5 mg / kg.
- Wenn Anfälle entwickeln und sind unempfindlich gegen Arzneimitteltherapie Euthanasie angezeigt.
Abbildung 5. Hypoxie-Ischämie Flussdiagramm. Flussdiagramm, Anpassungen in Sauerstoffversorgung (F i O 2 und P aw) nach aEEG Antwort. Mittleren Atemwegsdruck (P aw) wurde durch Änderung PIP / TV (untere PIP gibt niedrigeren P aw) und Atemfrequenz eingestellt (Unter RR gibt niedrigeren P aw). Ziel aEEG = oberen Rand der Spur <5 & mgr; V und unteren Rand der Spur> 3 & mgr; V (Durchschnitt 4 & mgr; V). ZielHerzfrequenz (HR) => 80 Ziel mittleren arteriellen Blutdruck (MAD) = MABP> 25. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
6. 72 Stunden Überlebens
- Überwachen Sie die Ferkel eng nach der hypoxischen Beleidigung, und nach und nach reduzieren die Preise der Infusion von Propofol und Fentanyl. Extubieren an dem Punkt, an dem das Tier freiwillig atmen.
- Während der Überlebenszeit, halten Ferkel bei einem Tier-Anlage mit 24-Stunden-Uhr von Personal auf der Intensivstation und Überwachung geschult. Verwalten iv Glukoseinfusionen 20 ml / kg 2-3 stündlich. Bei 26 bis 48 Stunden nach der Hypoxie-Ischämie Teilflaschennahrung kann eingeleitet werden. Aspiration in die Luftröhre und Lungen können durch Füttern mit der Flasche auf, wenn der Würgereflex nicht vorhanden ist.
- Wenn die für die Versuchs bewerten neurologischen Status mit Punktesystem, das von Thoresen et al., Beschrieben inDetail in der Originalpublikation 17.
7. Ergebnisevaluation
- Nach 72 Stunden, zu betäuben und wieder zu lüften, wie in Kapitel 2 beschrieben und 3. Führen MRT-Untersuchung mit den entsprechenden bildgebenden Verfahren, wie durch Munkeby et al 31 und andere 2 beschrieben.
- Am Ende des Experiments euthanize Ferkel mit einer letalen Dosis von Pentobarbital (5 g / kg iv).
- Vorbereiten des Gehirns zur Prüfung nach dem Ziel des Experiments.
- Für Hirn-Histologie auf Formalin-fixierten Gewebe:.. Verwenden Herz- Perfusion mit 4% Paraformaldehyd in PBS, gefolgt von Präparation und post-Fixierung in Para wie von Robertson et al 2, Chakkarapani et al 1 oder Liu et al 18 oder entfernen Sie das Gehirn und tauchen in 4% Paraformaldehyd durch Andresen et al. 32
- Für die Analyse erfordern Schnapp gefrorenen Gewebe (zB RNAAnalyse oder Enzymaktivitätsassays 33). Den Gehirn sezieren Gehirnregionen von Interesse und Schnappgefriergewebeblöcke von maximal 1 cm x 1 cm in flüssigem Stickstoff, wie durch Munkeby et al 33
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Representative Results
Die Wirkungen von Hypoxie-Ischämie am Gehirn, die während der induzierten Insult auftreten, durch Aufzeichnen der Spur aEEG dokumentiert. Ein Vertreter aEEG Trace wird in 6 gezeigt.
Abbildung 6. Repräsentative aEEG Spur. Low Amplitude aufgrund von Hypoxie-Ischämie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Die Extremwerte der pH-Wert, Base Excess und Laktat bei Hypoxie werden zusammen mit der Herzfrequenz und Blutdruck aufgezeichnet. Klinische Neurologie Scoring ist 17 durchgeführt. Daten aus einem Versuchstier mit einer Dauer von 38 min mit geringer Amplitude aEEG und ein Insult was zu HIE mit niedrigem pH-Wert und der relativen Hypotonie, werden in Tabelle 1 gezeigt.
| aEEG <7uV (min) | pH niedriger während Beleidigung | Basenüberschuss niedriger während Beleidigung | Laktat Hoch während Beleidigung | MABP Baseline | MABP Hoch | MABP niedrig | HR Hoch | HR niedrig |
| 37,5 | 6.93 | -19,80 | 19 | 48 | 72 | 33 | 219 | 162 |
Tabelle 1. Repräsentative physiologische Daten. Für ein Ferkel mit 38 min von aEEG <7 & mgr; V den Extremwerten der pH-Wert, Basenüberschuss, Laktat, Herzfrequenz (HR) und den Blutdruck (MAD) innerhalb der 45 Minuten von Hypoxie aufgelistet.
MRT bei 72 h kann zu Verletzungen je nach verwendeten Modalitäten zu offenbaren. 7 zeigt eine T2 gewichteten MRT-Bild mit hypoxisch-ischämische Verletzung.
Abbildung 7. Repräsentative T2 gewichteten MRT Bild. T2-wighted Bild in axialen Ebene, 72 Stunden nach der Hypoxie-Ischämie. Normale Signalintensität im Mittelhirn, Pons und Medulla oblongata. Diffuse abnorme Signalintensität in der gesamten weißen Substanz in beiden Hemisphären. Die T2-gewichteten MRT zeigt Läsionen entsprechend ischämischen Infarkt diffundieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
H & E Färbung zeigt neuronaler Verletzung wie auf Hämatoxylin und Eosin-Färbung zu sehen. Verschiedene Gruppen haben verschiedene Scoring-Systeme zur Quantifizierung der Grad der histologischen Schädigung entweder auf einem 0,5 Intervall Skala von 0-4 17 oder einer Skala von 0-9 5 verschiedenen Hirnregionen mit einer maximalen Punktzahl von Verletzungen 45 13 veröffentlicht.
Abbildung 8. Repräsentative Histopathologie. Lichtmikroskopische Aufnahme mit Hämatoxylin und Eosin-Färbung. Beschädigten Neuronen eosinophile mit einem kleinen Kern (Pfeile). Das Bild wurde in 200-facher Vergrößerung erfasst. Maßstabsbalken = 50 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Erwartetes Ergebnis von Modell: bisher veröffentlichten Studien mit vergleichbaren Modellen haben in etwa 20% tote Ferkel, 10% ohne Verletzungen und 70% überlebende mit Hirnschädigung 19 geführt. Diese Studien korrelieren gut mit unseren Ergebnissen. Multi Organschäden manifestiert durch 1) Laktatazidose 2) Anurie (Nierenschädigung) 3) Hypotonie (ischämische Herzschädigung) und kann durch visuelle Inspektion und Histopathologie von Organen überprüft werden post mortem. In diesem Modell, kardiale Dysfunktiondurch Erhöhung der Troponin T und ischämische Läsionen auf Herz Prüfung 18 nachgewiesen. Klinische Zeichen einer Enzephalopathie kann durch neurologische Punkte quantifiziert werden und Änderungen der Atmung, Bewusstsein, Orientierung, Wandern, Ton, Aktivität, saugen, Stimmgebung und das Vorhandensein von pathologischen Bewegungen wie von anderen 17 beschrieben.
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Discussion
Aufgrund seiner Komplexität kann das beschriebene Modell nur in Einrichtungen akkreditiert implementiert und in Tierversuchen erlebt werden. Genehmigung durch lokalen Ethikausschüsse müssen vor Beginn der Experimente erhalten werden kann, und eine optimale Tierschutz muss jederzeit gewährleistet sein. Da das Modell auf das Überleben der Testtiere basiert, ist es wichtig, dass eine sterile Umgebung während invasiven Verfahren um Infektionen zu verhindern, gehalten.
Die Wahl der Anästhesie ist wichtig, da die meisten, wenn nicht alle Anästhetika Potenzial neuroprotektiven Eigenschaften. Unterschiede im Ergebnis zwischen den zuvor veröffentlichten Modelle können zu Unterschieden in der Anästhesie verwendet werden, wie Halothan oder Propofol 17,19 geschuldet worden teilweise. Dies ist ein Punkt, der selten auf in der Literatur berührt wird, wie Anästhesie kann nicht weggelassen werden, und gibt es einen Mangel an Beweisen, die sein für dieses Modell würde. Unsere pragmatischen Ansatz ist es, so wenige differen verwendent Anästhetika wie möglich ist, dass Sevofluran nur kurzzeitig, da an Propofol und Fentanyl kontinuierlich infundiert verwendet. In unseren Experimenten Medikamente beeinflussen die Boli aEEG vorübergehend, während Sie innerhalb der festgelegten Grenzen für die kontinuierliche Infusion nicht. Bei der Prüfung neuroprotektive Behandlungen Vorspannung wird durch die Verwendung eines randomisierten Studie Design vermieden.
Der wichtigste Schritt im Modell Einrichtung des hypoxisch-ischämischen Schädigung, als das primäre Ziel ist es, induzieren eine mäßige bis schwere hypoxisch-ischämischen Schädigung bei gleichzeitiger Gewährleistung Überleben der Tiere. Die einzigartige Qualität dieses HIE-Modell ist die Fähigkeit, die unterschiedliche biologische Reaktionen auf Hypoxie von Tier zu Tier aufzunehmen. Titration der Sauerstoffzufuhr zu der höchstmöglichen Bruchteil was zu einer depressiven aEEG (<7 & mgr; V), ermöglicht die Anpassungen nach jedem einzelnen piglet's Toleranz gegenüber Hypoxie und sorgt so für eine hohe Überlebensrate bei maximaler neurologiCal Verletzungen 19. Die Dauer der flachen Spur aEEG während der 45 min der Hypoxie sollte mit dem Grad der Verletzung für histopathologische Bewertung und Optimierung der Verletzungsschwere verglichen werden. Andere Forscher unter Verwendung des Modells, wurden in ähnlicher Weise zu starken Abhängigkeit von der Dauer der Unterdrückung aEEG benotet die hypoxisch-ischämischen Schädigung von mild. Wie Anfälle in diesem Modell wurden zuvor gezeigt worden, um mit der Schwere der Hirnverletzung auf Histopathologie 17 mit wenig Behandlung Potenzial korrelieren, empfehlen wir ein Niveau von Hypoxie-Ischämie Schwere nicht produziert Anfälle.
Die meisten Studien mit dem Ferkel HIE Modell sind 10 min mit niedrigem MABP (MABP <70% des Ausgangswertes) 19. Björkman et al. festgestellt, dass, wenn die Sauerstoffzufuhr während der Hypoxie variiert der Grad der Gehirnverletzung war unabhängig von der Zeitdauer MABP war unter 35 mm Hg 19. Pilotversuche durchgeführt, wenn die Gründung der vorliegenden HIE-Modell, ergab, dass sustained Hypotonie, wo MABP war geringer als 25 mm Hg wurde mit schweren Hirnverletzungen und dauerhaft flache Spur aEEG verbunden. So müssen unmittelbare Reaktion auf schwere Hypotonie sichergestellt werden, um umfangreiche Hirnischämie gefolgt von Gehirn-Tod zu vermeiden.
Die Post-hypoxischen Zeitraum ist ebenfalls kritisch. Viele frühere Studien haben Studientieren durch die Verwendung von 100% Sauerstoff, der dafür bekannt ist, Gehirnverletzung verschärfen reoxygeniert.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Warm-touch-pediatric blanket | Covidien | 5030840 | |
| Adhesive Apertrue Drape | Barrier | 915447 | |
| Utility Drape (sterile) 75x80 cm | Barrier | 800530 | |
| Neoflon | BD - Luer | 391350 | |
| Laryngoscope | Miller | 85-0045 | |
| Endotracheal tube 2.5 mm | Covidien | 111-25 | |
| Endotracheal tube 3.0 mm with cuff | Unomedical | MM61110030 | |
| Endotracheal tube 3.5 mm with cuff | Unomedical | MM61110035 | |
| Anesthesia machine | GE Healthcare | 1009-9002-000 | |
| EEG - electrodes/disposable subdermal needle electrode | Cephalon | ACCE120550 | |
| ECG - electrodes | medtronic | 3010107-003 | |
| ECG-electrodes for MR | philips | ACCE120550 | |
| Arterial blood sampler - aspirator | Radiometer medical ApS | 956552 | |
| Polyurethane Umbilical vein catheter (5 Fr/Ch) | Covidien | 8888160341 | |
| Polyurethane Umbilical vein catheter (3,5 Fr/ch) | Covidien | 8888160333 | |
| Suture set (size 3-0) | Covidien | 8886 623341 | |
| BD Spinal needle 0.7x38mm | BD needles | 405254 | |
| Gas with 96% Nitrogen / 4% oxygen | Air Liquide | made on order | |
| NeuroMonitor (CFM) system | Natus Medical Incorporated | OBM70002 |
References
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