Abstract
חנק לידה, מה שגורם לחוסר החמצן אנצפלופתיה-איסכמי (hie), מהווה 0,660,000 מקרי מוות ברחבי העולם בכל שנה, כרבע ממקרי המוות של 2.9 מיליון היילודים בעולם. מודלים של בעלי החיים של hie תרמו להבנה של הפתופיזיולוגיה בhie, והדגישו את התהליך הדינמי המתרחש בפגיעה מוחית בשל חנק סביב הלידה. כך, מחקרים בבעלי החיים הראו בזמן חלון לאסטרטגיות טיפול פוסט-עלבון. היפותרמיה נבדקה כטיפול לhie בדגמי pdiglet ולאחר מכן הוכחה כיעיל בניסויים קליניים. וריאציות של המודל יושמו במחקר של שיטות נוירו משלים ומחקרי חזרזיר של קסנון ומלטונין הוביל לשלב קליני I ו- II של ניסויים 1,2. מודל hie החזרזיר משמש עוד ללימודי resuscitation- והמודינמית בילוד, כמו גם בחקירות של היפוקסיה מוחית ברמה תאית. עם זאת, זה מאתגר מבחינה טכניתמודל ושינויים בפרוטוקול עלול לגרום לפגיעה מוחית או קלה או קשה מדי. במאמר זה, אנחנו מדגימים את הנהלים הטכניים הנדרשים להקמת מודל חזרזיר יציב של hie ילוד. ראשית, חזרזיר היילוד (<משקל 1500 גרם 24 שעות ישנות, חציון) הוא הרדים, מחובר לצינורות, ופיקוח בהתקנה דומה לזה שנמצא ביחידה לטיפול נמרצת בילוד. היפוקסיה-איסכמיה עולמית הנגרמת על ידי הורדת חלק חמצן השאיפה להשיג היפוקסיה הגלובלית, איסכמיה דרך תת לחץ דם וEEG משרעת עקבות שטוחות משולב (aEEG) מעיד על חוסר חמצן במוח. הישרדות היא מקודמת על ידי התאמת חמצון פי תגובת aEEG ולחץ דם. פגיעה מוחית היא לכמת ידי histopathology והדמיה בתהודה מגנטית לאחר 72 שעות.
Introduction
חנק סביב הלידה הוא מצב חריף ולעתים קרובות לא צפוי הקשורים לאנצפלופתיה חוסר חמצן-איסכמי (hie). המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא להדגים מודל הישרדות חזרזיר של אנצפלופתיה חוסר חמצן-איסכמי סביב הלידה. מודל זה יכול לשמש כדי לחקור את ההשפעה של דרגות שונות של היפוקסיה-איסכמיה על המוח בילוד ושל טיפולים ניסיוניים על נוירופתולוגיה, הדמיה בתהודה מגנטית וספקטרוסקופיה (MRI וMRS) וסמנים ביולוגיים בנוזלי גוף כמו דם, נוזל השדרתי ושתן . המודל גם הוכיח שימושי לחקר מערכת הלב וכלי הדם, מערכת נשימה, כליות וכבד, אשר כולם מושפעות בהיפוקסיה-איסכמיה הגלובלית.
חנק סביב הלידה הוא התוצאה של ידתית אספקת חמצן בסכנה או בתקופה שלאחר הלידה המיידית. אירועי חוסר חמצן סבים-לידתית בחשבון 0,660,000 מקרי מוות ברחבי העולם בכל שנה, כרבע מטחנת 2.9 בעולםמות יון בילוד בשנת 2012 3. בשנת 2010 1.15 מיליון תינוקות הוערכו פיתח אנצפלופתיה הילוד הבא חנק הלידה 4. Hie מוגדר כאנצפלופתיה בתינוקות שנולדו לאחר 34 שבועות של הריון מתרחש ב1-3 / 1,000 לידה חי 5 בעולם המתועש ועד 8.5 / 1,000 לידה חי במדינות מתפתחות 4. הסיכון למוות הוא 10-60%, ואת הסיכון לנכי נוירולוגית בניצולי 30-100% 6,7. 50.2 מ'שנות חיים נכות מתואמת (DALYs) מיוחסות לאירועי חוסר חמצן ידתית 4. כיום הטיפול היחיד מלבד תומך לhie הוא היפותרמיה לאחר חוסר חמצן. כך, התקדמות בהליכי אבחון ואסטרטגיות טיפול חיונית כדי לשפר את הניהול של hie 8.
שיפורים בפרוגנוזה לאחר חנק וניהול של פגיעה מוחית בילוד סביב הלידה מבוססים על הרחבת ידע של מנגנוני מחלה הבסיסייםטיפולים אפשריים ד. מודלים של בעלי החיים של hie הם שימושיים במיוחד כאירועים קליניים שונים עלולים להוביל לhie ושכיחות בכל מרכז לידה אחת היא 5 נמוכים. הגדרת ניסוי שבו ניתן למזער את ההשפעה של שונות ביולוגיות, היא חיונית בעת בדיקה חדשה כלים פרוגנוסטיים ואבחון ואסטרטגיות טיפול. מודל חיה צריך להתקרב למצב הקליני ככל האפשר, ובכך לתרום להבנתנו את המנגנונים פתולוגיים שבבסיס הפגיעה הנגרמת ולתהליך הדינמי המעורב במחלה ולא האמין, זה התוצאה 9. מודלים של בעלי החיים של hie הילוד כללו מספר המינים, כוללים מכרסמים, כבש, וחזירים. לשם השוואה, יש חזרזיר יילוד דמיון גבוה יותר לתינוק אנושי ביחס לגודל, מערכת לב וכלי דם 10 ובגרות מוח בעת המשלוח 11,12. ניטור, מכשור והערכת תוצאות במודל דומה לחזרזיר thaלא השתמש בטיפול הקליני של תינוקות עם hie. בהתאם לכך, יש מידה גבוהה של תרגום לטיפול שזה עתה נולד ממודל זה.
מודלים חזירונים של היפוקסיה סביב הלידה וhie משמשים קבוצות רבות ושונים זה מזה במספר תחומים 13. על פי מטרת הניסוי, תשומת לב קפדנית חייבת להיות משולם לבחירה של תרופות, שיטה של גרימת היפוקסיה-איסכמיה, שיטה של השליטה משך עלבון וחומרה, החייאה לאחר עלבון וטיפול, והערכת תוצאות. כדי למנוע הטיה עיצוב מחקר אקראי יש להשתמש תמיד במחקרים התערבותיים.
השיטה מיושמת כאשר גרימת פציעת חוסר חמצן-איסכמי היא חשובה. היפוקסיה עולמית המובילה לhie לעתים קרובות תוצאות כישלון רב-איבר מעורב מוח, לב, ריאות, כליות וכבד. בהתאם לתוצאות ההערכה, מודלים של hie צריכים להיות מבוססים על היפוקסיה ואיסכמיה הגלובליות ולא להסתמך על איסכמיה מוקד, למשל., על ידי קשירה של מכוניתעורקי otid 14. נייר האחרון הוחל בשילוב של היפוקסיה (FiO 2 12%) ודחיסת עורק הראשי תוך שמירה על לחץ דם> 40 מ"מ דם ממוצע כספית 2. קבוצה נוספת הנגרמת היפוקסיה העולמית ב -8% O 2 עד עודף> 20 mmol / L בסיס שלילי או מתכוונת לחץ דם דם (MABP) <15 מ"מ כספית, והקריבה את בעלי החיים על 4 שעות 15. היפוקסיה גם כבר טיטרציה ידי תפוקת לב (30-40% מבסיס), MABP (30-35 מ"מ כספית) ו- pH עורקים (6.95-7.05) 16.
מודלים של היפוקסיה-איסכמיה הגלובלית טיטרציה ידי דיכוי aEEG דומה לזו שהוצגה בדוח זה, הוכיחו אנצפלופתיה שהיא קליני, electrophysiologically, וneuropathologically דומה למצב שנמצא בתינוק נחנק לטווח 17,18.
מידת hie המושרית היא חיונית. מודל חיה שימושי של hie גם חייב לאפשר לבדיקה של Dia החדשגנוסטי נהלים ואפשרויות טיפול. כדי לאפשר זאת, המודלים צריכים לגרום hie המתון שבם יש פוטנציאל לטיפול בפגיעה מוחית חמורה עם פוטנציאל טיפול קטן או לא יהיה פחות רלוונטי בעת הערכת טיפולים חדשים. סובלנות להיפוקסיה משתנה במידה ניכרת בין בעלי החיים מבחן. המחקרים קודמים הראו כי פגיעה מוחית עקבית יותר ניתן להשיג ושיותר חיות לשרוד 17,19 באינדיווידואליזציה היפוקסיה המושרית על פי התגובה המוחית של כל חזרזיר הוערכה על ידי electroencephalography משרעת משולב (aEEG) ולא באמצעות FiO ערך 2 סט לאורך אירוע חוסר חמצן. משך דיכוי aEEG בקורלציה למידת פגיעה מוחית, עם כמה שינויים בהיסטופתולוגיות <דיכוי aEEG 20 דקות והתקפים חמורים גדלו ב> 45 דקות דיכוי aEEG. סקירה האחרונה של טיפולי נוירו לhie זיהתה את הצורך במודלים הישרדות מאפשרת שקילת משקל הג תוצאת התנהגותures במודלים של בעלי החיים 20.
ישנם יתרונות רבים של מודל חזרזיר hie הציג. היא מבוססת על מינים שבם תוצאות הן סבירה מאוד לתרגם לפיסיולוגיה האנושית. מודלים היפוקסיה-איסכמיה גלובליות כישלון רב-איברים וטיטרציה של היפוקסיה-איסכמיה ידי aEEG גורם תואר עקבי של פגיעה מוחית עם תוצאות רלוונטיות קליניות הישרדות כך שסמנים ביולוגיים, MRI והתנהגות ניתן להעריך בנקודות זמן רלוונטיות.
המודלים חזרזיר של חנק סביב הלידה וhie לא תרמו באופן משמעותי רק לתובנה נוכחית להפתופיזיולוגיה hie, אלא גם קדמו בהצלחה ניסויים קליניים, וכתוצאה מכך בסופו של טיפולים חדשים בבני אדם. מחקרי מודל חזרזיר מילאו תפקיד מפתח בהקמת היפותרמיה כטיפול לhie 21, ומשמשים במחקר החייאת יילודי 22. קבוצות שונות השתמשו במודלי חזרזיר בעת ביצוע מחקר בחנק וhie,מחקרי ד כוללים היפותרמיה 23, הורמון אלפא-גירוי מלנוציט 24, מדום לב 25, פעילות hydroxylase טירוזין 26, חשיפת חוסר חמצן חזר 27, פעילות הקולטן NMDA 14, וקרובים אינפרא אדום ספקטרוסקופיה 28.
מודל hie החזרזיר מוצג בדוח זה הוא מאתגר מבחינה טכנית לעבוד עם, כהתאמות קלות במהלך ההליך עלולות לגרום לפגיעה מוחית או קלה או קשה מדי 29,2. מצאנו שהספרות הקיימת חסרת פירוט מספיק כדי לשחזר דגמים שפורסמו בעבר. לפיכך, אנו כאן להפגין כל שלב של ההליכים הטכניים הנדרשים להקמת מודל הישרדות 72 שעות חזרזיר בדוח זה, המאפשר לחוקרים לקבוע מודל מתקדם לחקר hie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוטוקול הנוכחי אושר על ידי פיקוח ניסויים בבעלי חיים הדני. כל בעלי החיים המבחן היו מורדמים בכל הנהלים. רבייה של פרוטוקול זה חייבת להתבצע בהתאם לאתיקה לאומית והנחיות לרווחת בעלי החיים, ושאושרה על ידי ועדות אתיקה מקומיות.
1. בעלי חיים
- חזירונים דניים landrace <24 שעות ישנות במשקל כ -1,500 - 2,000 ז.
2. הרדמה ותחזוקת נוזלים
- הכן את הציוד דרוש להרדמה (איור 1): מסכה לממשל sevoflurane, מטליות אלכוהול, קטטר תוך ורידי היקפיים, גומייה, מזרקים עם מי מלח, propofol (5 מ"ג / קילוגרם), פנטניל (10 מיקרוגרם / קילוגרם), וbenzylpenicillin פרוקאין (15,000 IU / קילוגרם).
- לגרום להרדמה על ידי מתן sevoflurane 1-2% באמצעות מסכת נשימה.
- להעריך את עומק ההרדמה על ידי ההערכה לrefl palpebral והנסיגהאקסים. כאשר בטוח שהחזרזיר הוא הרדמה עמוקה, percutaneously להכניס צנתר לוריד היקפי לוריד האוזן.
- כדי לאשר פתיחות של הצנתר לוריד ההיקפי, שטוף את הקטטר עם 1-2 מיליליטר של תמיסת מלח 0.9% סטרילי. להזריק בולוס של propofol (5 מ"ג / קילוגרם) ופנטניל (10 מיקרוגרם / קילוגרם). לאחר ממשל הזרקת בולוס לשטוף את הצנתר לוריד פעם שנייה באמצעות 1-2 מיליליטר של תמיסת מלח 0.9% סטרילי.
- מזרקים מקום עם propofol (10 מ"ג / מיליליטר) ופנטניל (10 מיקרוגרם / מיליליטר) בשתי משאבות נפרדות עירוי מזרק. חבר iv צינורות משתי משאבות המזרק לסתום משולש הצטרפות חליטות לקו יחיד שמחובר לקטטר תוך ורידי. התחל עירוי מתמשך של iv propofol (4-12 מ"ג / קילוגרם / שעה) ופנטניל (10 מיקרוגרם / קילוגרם / שעה). ברגע חליטות רציפות פועלות, לא נותן זריקות בולוס נוספות של propofol ופנטניל.
- ממשל להפסיק של anest גז sevofluranehesia.
- הזרק benzylpenicillin פרוקאין תת עורי (15,000 IU / קילוגרם) או לשריר בהתאם להנחיות מקומיות לטיפול מונע באנטיביוטיקה. חזור יומי. הווידאו מציג ממשל sc, אשר בחזירונים הוכח לגרום לריכוז גבוה יותר פלזמה ומחצית חיים ארוכים יותר בהשוואה לממשל im.
- החל משחה סיכה העין כדי למנוע התייבשות של העיניים. משוך את העפעף התחתון כלפי מטה בעדינות כדי ליצור פתיחה כמו כיס. לסחוט כמות קטנה של משחה בתוך הכיס. עין להפיץ משחה. בדוק יובש השעה ולהחיל מחדש במידת הצורך.
- ליזום עירוי מתמשך שיעור של 5% דקסטרוז / 0.45% iv NaCl ב 10 מיליליטר / קילוגרם / שעה. להפחית שיעור 5 מיליליטר / קילוגרם / שעה במהלך ואחרי היפוקסיה. להתאים את קצב עירוי כדי לשמור על רמות סוכר בדם בין 2-10 mmol / L.
Figuמחדש 1. מכשור להרדמה ואינטובציה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
3. אינטובציה ואוורור
- הכן את הציוד הדרוש לאינטובציה (איור 1): ברומיד rocuronium (1 מ"ג / קילוגרם) להרפיית שרירים, קלע חבל (לקשור את שני הקצוות של אותו חבל ניילון 4 מ"מ יחד כדי ליצור מעגל כמתואר באיור 1) לפתיחה הפה, כותנה הטתה ספוגית ורינגוסקופ וטרינרים עם להב ישר, תרסיס Xylocaine (100 מ"ג / מיליליטר), צינורות שונים בגודל endotracheal עם שרוול (בגדלי 3.0 מ"מ, 2.5 מ"מ, 2.0 מ"מ), 500 מיליליטר שקית ניפוח עצמי (שסתום שקית מסכה) לאוורור, מזרק 2 מיליליטר לאינפלציה שרוול, וסטטוסקופ.
- צנרר על ידי ביצוע השלבים הבאים:
- חזרזיר מקום במצב שכיבה התומך בצוואר מכל צד כדי לאבטח pas גרון ישרמרווה לאינטובציה.
- להעריך את אורכו של הטובוס ידי מדידה מקצה החוטם לחריץ sternal (בדרך כלל סביב 13 סנטימטרים).
- מקום קלע חבל סביב הלסת העליונה (כלפי מטה) ולהחזיק את הלסת ולשון נמוכות כלפי מעלה כדי לשמור על הפה פתוח.
- לנהל ברומיד rocuronium (1 מ"ג / קילוגרם) iv לגרום להרפיית שרירים.
- השתמש רינגוסקופ להרים את הלשון כלפי מעלה.
- השתמש הכותנה הטתה ספוגית לשחרר מכסה הקנה הארוך של החזרזיר, אשר עשוי להיות retroverted או לוושט או נתפס מאחורי החיך הרך.
- לקדם רינגוסקופ לשמור את מכסה הקנה הרים נגד בסיס הלשון מאפשר תצוגה מלאה של הסחוסים arytenoid ומייתרי קול.
- החל תרסיס Xylocaine (100 מ"ג / מיליליטר) מריחה בגרון כדי למנוע התכווצויות בגרון.
- לקדם הטובוס דרך מיתרי קול. השתמש תנועה מסתובבת לסייע לפטירתו של הסחוסים קנה הנשימה הצרים. עכו צינור מראשrding למרחק premeasured ולהתחבר לשקית ניפוח עצמית (מסכת שסתום שקית) לאוורור ידני. כדי לעזור להפחית את החיכוך במהלך אינטובציה לרסס 1/3 הדיסטלי של הטובוס עם תרסיס Xylocaine.
- כדי לאשר מיקום הטובוס נכון: להתבונן לכל אינדיקציה לקשיי נשימה, ausculate חזה האזנה לכניסת אוויר דו-צדדית לשתי הריאות, חזותי לאשר את קיומו של עיבוי בהיבט הפרוקסימלי של הטובוס, ולאמת את הנוכחות של פחמן גאות הסוף דו-חמצני עם גלאי פחמן דו חמצני colorimetric או על ידי CO 2 קריאת נשיפה בהנשמה המכנית אם זמין. הסוף נורמלי פחמן דו-חמצני גאות הוא סביב 5%. ערך מעל 2% יחד עם צורת גל המופיע-נורמלי יאשר שהטובוס הוא בקנה הנשימה.
- לנפח את שרוול הטובוס כדי למנוע שאיפה. לחץ אינפלציה שרוול צריך להיות פחות מ 25 סנטימטרים H 2 O, כדי למנוע נזק איסכמי לרקמות שמסביב. מחזיק הטובוס במקום, בסופו של נייר דבק סביב הצינור, לסגור את הלסת ולהמשיך מקליט סביב החוטם כדי לאבטח את הצינור למקומו. משוך בעדינות על הצינור כדי להבטיח שהוא נשאר במקום.
- חבר הטובוס להנשמה מכאנית.
- התאם את הגדרות הנשמה: אוורור שליטה על עוצמת קול, עוצמת קול של גאות ושפל (טלוויזיה): 10 מיליליטר / קילוגרם [או לחץ שאיפת שיא (PIP) 15 סנטימטר עם אוורור לחץ מבוקר]. לחץ הסוף חיובי נשיפה (PEEP): 5 סנטימטר. אני: E יחס 1: 2. קצב נשימה: 35 (להתאים את קצב כדי לשמור על CO-סוף הגאות 2 בין 4.5-5.5 kPa).
4. ניטור ודגימת נוזל גוף
איור 2. ציוד לניטור.ANK "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
- הכן את הציוד הדרוש לניטור (איור 2): דבק, חומר סיכה סטרילי, בדיקה למדידת טמפרטורה רקטלית רציפה, אלקטרודות רל (אק"ג), אלקטרודות oximeter דופק, גילוח, וEEG.
- בדיקה הרוויה מקום על רגל אחורית, לשמן בדיקה טמפרטורה רקטלית ולהכניס 6 סנטימטר לתוך פי הטבעת, למקם דוד מעל זוהר ו / או מזרן אוויר מתנפח מחומם כדי לשמור על הטמפרטורה רקטלית ברמה הפיזיולוגית של 38.5-39 ° C, וא.ק.ג. המקום אלקטרודות.
- הנח חזרזיר במצב שכיבה לגלח אזורים של 1 סנטימטר x 1 סנטימטר למיקום של אלקטרודות EEG המחט תת עורית; אחד מול כל אוזן, והאלקטרודה ההתייחסות בקו האמצע ממש מאחורי העיניים. נקה את אתר אלקטרודה עם ספוגית אלכוהול, לאחר מכן הכנס את תת עורי אלקטרודה המחט. אלקטרודות מאובטחים עם דבק וחזרזיר חזרה לPO שכיבהsition.
- הפעל צג aEEG.
הערה: משרעת המשולב EEG מורכב מזכר צפוף עם שוליים העליונים ותחתונים. שוליים העליונים ותחתונים במודל זה הם בדרך כלל 15-50 μV, לעתים קרובות יותר מאשר לראות בתינוקות. במהלך היפוקסיה זה חשוב לציין, כי החפץ מא.ק.ג. עלול בטעות להעלות את עקבות aEEG. תרופות בולוס (propofol או פנטניל) עשויות גם לדכא זמני עקבות aEEG ויש להימנע במידת האפשר במהלך הניסוי. מנהל תרופות ואירועים קליניים צריך להיות מסומן כדי להקל על פרשנות של עקבות aEEG.
- הכן את הציוד הדרוש להצבת צנתרים טבור לניטור לחץ דם עורקים מרכזיים ודגימת דם (איור 3): כפפות סטריליות, כורכים סטרילי, אזמל, מטליות אלכוהול, מגבונים סטריליים, קטטר וריד טבור (5 Fr), קטטר עורק טבור (3.5 Fr ), תפר שנקבע עם מלקחיים, מלקחיים מייקר מעוקלים, מספריים, בעל מחט ותפר (למשל, גודל 3-0), תיקון דבק שקוף, 5 מיליליטר מזרקים לדגימת דם.
איור 3. ציוד לקווי טבור ודגימת דם. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
- לעקר ולעטוף סביב טבור האזור. השתמש באזמל כדי לחתוך את חבל הטבור הקרוב לעור ככל האפשר. אם זה לא לחשוף את כלי הטבור בחזרזיר המורדם, לחתוך את עור טבור 2 מ"מ מתחת לחבל הטבור כדי לחשוף את הכלים. לזהות שני עורקי טבור קטנים ווריד אחד גדול טבור (איור 4).
- שימוש במלקחיים מעוקלים מיקרו כדי להרחיב את העורק (איור 4) ולהכניס את צנתר עורקי הטבור(3.5 Fr). אורך אומדן הכנסה בס"מ עד 3 x משקל (קילוגרם) + 10 (נוסחה אמפירית המבוסס על מיקום נכון ביורדים אב העורקים מעל עורקי כליה בניתוח שלאחר מוות).
- מניחים 5 קטטר Fr שני 5 סנטימטר לוריד הטבור (איור 4). ודא מיקום צנתר תוך-ידי החזרת דם. צנתרים מאובטחים על ידי הצבת תפרים טבעתיים סביב הטבור, עוברים התפר מסתיים סביב כל אחד מצנתרי הטבור ולקשור קשר. לכסות צנתרים עם רוטב דבק שקוף.
- לאסוף דגימות דם בנקודות מוגדרות מראש זמן: 1) מייד לפני היפוקסיה, 2) 30 דקות לעלבון חוסר חמצן 3) בסוף עלבון 45 דקות חוסר חמצן 4) 2 שעות לאחר עלבון חוסר חמצן. בהתאם לצורך של נקודות זמן האחרות הניסוי לדגימות דם ניתן לבחור.
- השתמש ניתוח גז דם עורקים מדגימות דם שנלקחו במהלך היפוקסיה לאמת שינויי גז דם הנגרמים על ידי היפוקסיה-איסכמיה (טבלת 1). שימו לב שיש לי חזירונים המוגלובין נמוךלידה לא (בסביבות 8 גרם / ד"ל) ועלולה לסבול מאנמיה מדגימת דם תכופה. למשוך פחות מ -2 מיליליטר דם / משקל קילוגרם לתיקו, פחות מ 5 מיליליטר דם / משקל קילוגרם תוך 24 שעות ולעמוד בהנחיות מקומיות לדגימת דם. סימנים של אנמיה כוללים הפחתת המטוקריט וטכיקרדיה.
- חבר קו עורקים לצג לממשיך ניטור תוך-עורקי לחץ דם (MABP). השתמש קו ורידים לממשל נוזל וסמים.
איור 4. כלי טבור. וריד טבור (מימין) ואחד משני עורקי טבור (משמאל). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
5. היפוקסיה
- חכה 60 דקות לאחר שסיים את המעקב. לגרום היפוקסיה על ידי מעבר לO 4% 2 2 תערובת גז. צג פרמטרים חיוניים וaEEG מקרוב ותמשיך היפוקסיה במשך 45 דקות.
- ברגע שעקבות aEEG היא שטוחות (עליון מרווח <7 μV), להתאים חמצון על ידי שינוי חלק ההשראה החמצן (FiO 2) ואומר לחץ אוויר לרמת 2 FiO הגבוהה ביותר שמירה על עקבות שטוחות aEEG לפי תרשים הזרימה שמוצגת באיור 5. לשאוף MABP מתחת ל -70% מבסיס לפחות 10 דקות ואם יש צורך FiO הנמוך 2 כדי להבטיח ירידה בלחץ דם ואיסכמיה. הרמה תיארה של תת לחץ דם כבר בעבר שמוצגת על ידי אחרים 19,13,30 לייצר פגיעה מוחית איסכמי חוסר חמצן-רלוונטית.
- במקרה של תת לחץ דם חמור (MABP <25 מ"מ כספית) לטפל בשלבים כדלקמן: להגדיל בקצרה FiO 2 על ידי 1-5%, בולוס המלוח (10 מיליליטר / קילוגרם), עירוי של דופמין (5-20 מק"ג / קילוגרם / דקה), ועירוי של נוראדרנלין (20 מיקרוגרם / קילוגרם / דקת ng-1).
- במקרה של התקפים שנמשכים 10 דקות> (o קלוני, טוניקr התקפי myoclonic, בדרך כלל מוקד או כפי שצוינו על ידי שינויים פתאומיים במשרעת aEEG) לטפל בשלבים עם (המאפשר 30 דקות לפני שתמשיך להזרקה הבאה): בולוס האיטי של iv phenobarbital 20 מ"ג / קילוגרם, לחזור על 20 מ"ג / קילוגרם iv phenobarbital, ו iv midazolam 0.5 מ"ג / קילוגרם.
- אם התקפים לפתח וnonresponsive להמתת חסד טיפול התרופתי מצויינים.
איור 5. תרשים הזרימה היפוקסיה-איסכמיה. תרשים זרימה המציגה התאמות בחמצון (F אני O 2 וaw P) על פי תגובת aEEG. אומר לחץ אוויר (AW P) הותאם על ידי שינוי PIP / טלוויזיה (PIP הנמוך נותן P אה נמוך) וקצב נשימה (RR הנמוך נותן P אה נמוך). מקד aEEG = עליון מרווח של עקבות <5 μV ורווחיות נמוכה של העקבות> 3 μV (ממוצע 4 μV). יעדקצב לב (HR) => 80. יעד מתכוון לחץ דם עורקים (MABP) = MABP> 25. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
הישרדות 6. 72 שעות
- לפקח באופן הדוק החזרזיר לאחר עלבון חוסר חמצן, ולהפחית בהדרגה את שיעורי העירוי של propofol ופנטניל. Extubate בנקודה שבה החיה נושמת בהתנדבות.
- במהלך תקופת הישרדות, לשמור על חזרזירים במתקן בעלי חיים עם שעון 24 שעות על ידי צוות המיומן בטיפול ומעקב אינטנסיביים. לנהל חליטות גלוקוז IV 20 מיליליטר / קילוגרם 2-3 שעות. ב26-48 שעות לאחר האכלה מהבקבוק חלקי היפוקסיה-איסכמיה יכול להיות יזם. שאיפה לקנה הנשימה והריאות עלולה להתרחש על ידי האכלה מבקבוק אם רפלקס ההקאה אינו נוכח.
- אם רלוונטי לניסוי, להעריך את מצב נוירולוגים באמצעות שיטת ניקוד שפותחה על ידי ואח תורסן al., תאר בפרטים בפרסום המקורי 17.
הערכת 7. תוצאה
- לאחר 72 שעות, להרדים ולאוורר שוב כפי שתואר בסעיף 2 ו -3 בצעו סריקת MRI עם שיטות הדמיה רלוונטיות כפי שתואר על ידי Munkeby et al 31 ואחרים 2.
- בסוף הניסוי להרדים חזירונים עם מנה קטלנית של pentobarbital (5 גר '/ קילוגרם IV).
- הכן את המוח לבדיקה בהתאם למטרת הניסוי.
- להיסטולוגיה מוח על רקמה קבועה פורמלין:.. להשתמש זלוף לב עם paraformaldehyde 4% ב- PBS, ואחריו לנתיחה שלאחר תיקון-בparaformaldehyde כפי שתואר על ידי רוברטסון ואח '2, אל Chakkarapani et 1 או et al ליו 18 או להסיר את המוח ולטבול בparaformaldehyde 4% כפי שתואר על ידי אנדרסן et al. 32
- לניתוח דורש רקמת Snap-קפוא (למשל, RNAמבחני פעילות ניתוח או אנזים 33):. הסר את המוח, לנתח את אזורי המוח של העניין וsnap-הקפאת רקמה בלוקים של 1 סנטימטר מקסימום x 1 סנטימטר בחנקן נוזלי כפי שתואר על ידי et al Munkeby 33
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ההשפעות של היפוקסיה-איסכמיה על המוח המתרחשות במהלך העלבון המושרה מתועדות על ידי הקלטת עקבות aEEG. עקבות aEEG נציג מוצגת באיור 6.
עקבות איור 6. נציגי aEEG. משרעת נמוכה עקב היפוקסיה-איסכמיה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
הערכים הקיצוניים של חומציות, עודף בסיס, וחומצת חלב במהלך היפוקסיה נרשמים יחד עם קצב לב ולחץ דם. ניקוד נוירולוגיה קליני מתבצע 17. נתונים מבעלי חיים ניסיוניים עם משך זמן של 38 דקות של משרעת הנמוכה aEEG ועלבון המוביל לhie עם pH הנמוך וירידה בלחץ דם יחסית, מוצגים בטבלת 1.
| aEEG <7uV (דקות) | נמוך pH במהלך עלבון | נמוך עודף בסיס בעלבון | גבוה חומצת החלב בעלבון | בסיס MABP | MABP גבוה | MABP נמוך | HR גבוה | נמוך HR |
| 37.5 | 6.93 | -19.80 | 19 | 48 | 72 | 33 | 219 | 162 |
1. הנתונים פיסיולוגיים נציג השולחן. לחזרזיר עם 38 דקות של aEEG <7 μV הערכים הקיצוניים של חומציות, עודף בסיס, חומצת החלב, קצב לב (HR) ולחץ דם (MABP) בתוך 45 דקות של היפוקסיה רשומים.
MRI ב 72 שעות עשוי לחשוף פגיעה בהתאם לשיטות בשימוש. איור 7 מראה T2 משוקלל תמונת MRI עם פציעת חוסר חמצן-איסכמי.
איור 7. הנציגים T2 משוקלל MRI תמונה. תמונת T2-wighted במטוס צירי, לאחר היפוקסיה-איסכמיה 72 שעות. עוצמת אות רגילה בתוך מוארך mesencephalon, פונס ולשד. לפזר עוצמת אות חריגה בכל החומר הלבן בשתי ההמיספרות. MRI T2 משוקלל תערוכות נגעים המתאימים כדי לפזר אוטם איסכמי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
צביעת H & E תערוכות פגיעה עצבית כפי שניתן לראות בhematoxylin וכתם eosin. קבוצות שונות פרסמו מערכות ניקוד שונות לכימות מידת פגיעה היסטולוגית משני קנה מידה 0.5 מרווח של 0-4 17 או בסולם של 0-9 ל5 אזורים שונים במוח עם ציון פגיעה מרבי של 45 13.
דף = "תמיד"> 
איור 8. histopathology נציג. תמונת מיקרוסקופ אור עם hematoxylin וכתם eosin. נוירונים פגומים הם אאוזינופילית עם גרעין קטן (חיצים). התמונה נתפסה ב200x הגדלה. בר סולם = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
תוצאה צפויה ממודל: מחקרים שפורסמו בעבר תוך שימוש במודלים דומים שהסתיימו בחזרזירים מתו כ 20%, 10% ללא פגיעה ו -70% שרדו עם פגיעה מוחית 19. מחקרים אלה לתאם גם עם הממצאים שלנו. מניפסטים רב פציעת איבר על ידי 1) חמצת חומצת החלב 2) anuria (פגיעה בכליות) 3 תת לחץ דם) (פציעת לב איסכמית) ועשוי להיות מאומת על ידי בדיקה וhistopathology של איברים חזותיים אחרי מותו. במודל זה, תפקוד לקוי של לבהודגם על ידי גידול בT טרופונין הלבבי ונגעים איסכמיים בבדיקת לב 18. סימנים קליניים של אנצפלופתיה ניתן לכמת ידי ניקוד נוירולוגיות וכוללים שינויים בנשימה, תודעה, נטייה, הליכה, טון, רמת פעילות, מוצץ, ניקוד ונוכחות של תנועות פתולוגי כמתואר על ידי אחרים 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בשל מורכבותה, המודל שתואר יכול להיות מיושם רק במתקנים המוכרים ומנוסה במחקר בבעלי חיים. אישור על ידי ועדת אתיקה המקומית יש לקבל לפני תחילת הניסויים, ורווחת בעלי חיים אופטימלית יש להבטיח בכל העת. כמודל מבוסס על הישרדותם של בעלי החיים הבדיקה, חשובה שסביבת סטרילית נשמר במהלך פרוצדורות פולשניות כדי למנוע זיהומים.
הבחירה של הרדמה היא חשובה כמו רוב אם לא כל תרופות ההרדמה מאפייני נוירו פוטנציאליים. הבדלים בתוצאות בין דגמים שפורסמו בעבר אולי היו נובעים בחלקו הבדלים בהרדמה משמשים, כגון הלותן או propofol 17,19. זוהי נקודה שנגעה רק לעתים נדירות בספרות, כמו הרדמה לא יכולה להיות מושמטת ויש מחסור בראיות שתהיינה ישים למודל זה. הגישה הפרגמטית שלנו היא להשתמש בכמה בידולהרדמה לא אפשרי, כי הוא sevoflurane משמש לזמן קצר בלבד, ולאחר מכן על propofol ופנטניל הם חדורים ברציפות. בניסויים שלנו בולוס תרופות משפיע על aEEG זמני, תוך שמירה על מסגרת המגבלות שצוינו עבור עירוי מתמשך לא. כאשר בודקים טיפולי נוירו הטיה היא להימנע על ידי שימוש בעיצוב מחקר אקראי.
השלב הקריטי ביותר במודל הוא הקמתה של עלבון חוסר חמצן-איסכמי, כמטרה העיקרית היא לגרום למתונה לעלבון חוסר חמצן-איסכמי חמור בעוד באותו הזמן על מנת להבטיח הישרדות של בעלי חיים. האיכות הייחודית של מודל hie זה היא היכולת להתאים את התגובות ביולוגיות השונות להיפוקסיה מחיה לחיה. כותרות של אספקת חמצן לחלק הגבוה ביותר האפשרי וכתוצאה מכך aEEG (<7 μV) מדוכא, מאפשרת להתאמות על פי כל סובלנות piglet's פרט להיפוקסיה, ובכך להבטיח שיעור הישרדות גבוה בשילוב עם neurolog המרביפציעת iCal 19. משך עקבות שטוחות aEEG במהלך 45 דקות של חוסר חמצן צריך להיות בהשוואה למידת פגיעה היסטופתולוגיות להערכה ואופטימיזציה של חומרת פציעה. חוקרים אחרים תוך שימוש במודל, יש לי דומים מדורגים עלבון חוסר חמצן-איסכמי ממיתון עד חמור בהתאם למשך דיכוי aEEG. כהתקפים במודל זה בעבר הוכחו לתאם עם חומרה של פגיעה מוחית בhistopathology 17 עם פוטנציאל טיפול קטן, אנו ממליצים רמת חומרת היפוקסיה-איסכמיה לא לייצר התקפים.
רוב המחקרים באמצעות מודל hie החזרזיר כוללים 10 דקות של MABP הנמוך (MABP <70% מבסיס) 19. ביורקמן et al. מצא שאם אספקת החמצן מגוונת במהלך היפוקסיה, את מידת פגיעה המוחית הייתה עצמאית של תקופת MABP הזמן היה מתחת ל -35 מ"מ כספית 19. ניסויי פיילוט שבוצעו בעת הקמת מודל hie הנוכחי, חשף sustaine שתת לחץ דם ד בי MABP היה נמוך מ -25 מ"מ כספית היה קשור עם פגיעה מוחית קשה ועקבות באופן קבוע שטוחות aEEG. לפיכך, תגובה מיידית לירידה בלחץ דם חמורה יש להבטיח כדי למנוע איסכמיה מוחית נרחבת אחריו מוות מוחי.
התקופה שלאחר חוסר חמצן היא גם קריטית. מחקרים קודמים רבים reoxygenated חיות מחקר על ידי שימוש בחמצן 100%, אשר ידוע להחמיר פגיעה מוחית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Warm-touch-pediatric blanket | Covidien | 5030840 | |
| Adhesive Apertrue Drape | Barrier | 915447 | |
| Utility Drape (sterile) 75x80 cm | Barrier | 800530 | |
| Neoflon | BD - Luer | 391350 | |
| Laryngoscope | Miller | 85-0045 | |
| Endotracheal tube 2.5 mm | Covidien | 111-25 | |
| Endotracheal tube 3.0 mm with cuff | Unomedical | MM61110030 | |
| Endotracheal tube 3.5 mm with cuff | Unomedical | MM61110035 | |
| Anesthesia machine | GE Healthcare | 1009-9002-000 | |
| EEG - electrodes/disposable subdermal needle electrode | Cephalon | ACCE120550 | |
| ECG - electrodes | medtronic | 3010107-003 | |
| ECG-electrodes for MR | philips | ACCE120550 | |
| Arterial blood sampler - aspirator | Radiometer medical ApS | 956552 | |
| Polyurethane Umbilical vein catheter (5 Fr/Ch) | Covidien | 8888160341 | |
| Polyurethane Umbilical vein catheter (3,5 Fr/ch) | Covidien | 8888160333 | |
| Suture set (size 3-0) | Covidien | 8886 623341 | |
| BD Spinal needle 0.7x38mm | BD needles | 405254 | |
| Gas with 96% Nitrogen / 4% oxygen | Air Liquide | made on order | |
| NeuroMonitor (CFM) system | Natus Medical Incorporated | OBM70002 |
References
- Chakkarapani, E., et al. Xenon enhances hypothermic neuroprotection in asphyxiated newborn pigs. Annals of. 68, 330-341 (2010).
- Robertson, N. J., et al. Melatonin augments hypothermic neuroprotection in a perinatal asphyxia model. Brain : a journal of neurology. 136, 90-105 (2013).
- Lawn, J. E., et al. Every Newborn: progress, priorities, and potential beyond survival. Lancet. 384, 189-205 (2014).
- Lee, A. C., et al. Intrapartum-related neonatal encephalopathy incidence and impairment at regional and global levels for 2010 with trends from 1990. Pediatric research. 74, Suppl 1. 50-72 (2013).
- Kurinczuk, J. J., White-Koning, M., Badawi, N. Epidemiology of neonatal encephalopathy and hypoxic-ischaemic encephalopathy. Early human development. 86, 329-338 (2010).
- Shankaran, S., Woldt, E., Koepke, T., Bedard, M. P., Nandyal, R. Acute neonatal morbidity and long-term central nervous system sequelae of perinatal asphyxia in term infants. Early human development. 25, 135-148 (1991).
- Robertson, C. M., Finer, N. N., Grace, M. G. School performance of survivors of neonatal encephalopathy associated with birth asphyxia at term. The Journal of pediatrics. 114, 753-760 (1989).
- Bennet, L., Booth, L., Gunn, A. J. Potential biomarkers for hypoxic-ischemic encephalopathy. Seminars in feta., & neonatal medicine. 15, 253-260 (2010).
- Yager, J. Y., Ashwal, S. Animal models of perinatal hypoxic-ischemic brain damage. Pediatric neurology. 40, 156-167 (2009).
- Buckley, N. M. Maturation of circulatory system in three mammalian models of human development. Comparative biochemistry and physiology. A, Comparative. 83, 1-7 (1986).
- Dobbing, J., Sands, J. Comparative aspects of the brain growth spurt. Early human development. 3, 79-83 (1979).
- Dobbing, J., Sands, J. Quantitative growth and development of human brain. Archives of disease in childhood. 48, 757-767 (1973).
- Foster, K. A., et al. An improved survival model of hypoxia/ischaemia in the piglet suitable for neuroprotection studies. Brain research. 919, 122-131 (2001).
- LeBlanc, M. H., Li, X. Q., Huang, M., Patel, D. M., Smith, E. E. AMPA antagonist LY293558 does not affect the severity of hypoxic-ischemic injury in newborn pigs. Stroke; a journal of cerebral circulation. 26, 1908-1914 (1995).
- Andresen, J. H., et al. Nicotine affects the expression of brain-derived neurotrophic factor mRNA and protein in the hippocampus of hypoxic newborn piglets. J Perinat Med. 37, 553-560 (2009).
- Cheung, P. Y., Gill, R. S., Bigam, D. L. A swine model of neonatal asphyxia. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
- Thoresen, M., et al. A piglet survival model of posthypoxic encephalopathy. Pediatric research. 40, 738-748 (1996).
- Liu, X., Tooley, J., Loberg, E. M., Suleiman, M. S., Thoresen, M. Immediate hypothermia reduces cardiac troponin I after hypoxic-ischemic encephalopathy in newborn pigs. Pediatric research. 70, 352-356 (2011).
- Bjorkman, S. T., et al. Hypoxic/Ischemic models in newborn piglet: comparison of constant FiO2 versus variable FiO2 delivery. Brain research. 1100, 110-117 (2006).
- Robertson, N. J., et al. Which neuroprotective agents are ready for bench to bedside translation in the newborn infant. The Journal of pediatrics. 160, 544-552 (2012).
- Jacobs, S. E., et al. Cooling for newborns with hypoxic ischaemic encephalopathy. Cochrane Database Syst Rev. 1, CD003311 (2013).
- Andresen, J. H., et al. Resuscitation with 21 or 100% oxygen in hypoxic nicotine-pretreated newborn piglets: possible neuroprotective effects of nicotine. Neonatology. 93, 36-44 (2008).
- Karlsson, M., et al. Delayed hypothermia as selective head cooling or whole body cooling does not protect brain or body in newborn pig subjected to hypoxia-ischemia. Pediatric research. 64, 74-78 (2008).
- Kovacs, J., et al. Asphyxia-induced release of alpha-melanocyte-stimulating hormone in newborn pigs. Peptides. 22, 1049-1053 (2001).
- Varvarousi, G., et al. Asphyxial cardiac arrest, resuscitation and neurological outcome in a Landrace/Large-White swine model. Laboratory animals. 45, 184-190 (2011).
- Tammela, O., Pastuszko, A., Lajevardi, N. S., Delivoria-Papadopoulos, M., Wilson, D. F. Activity of tyrosine hydroxylase in the striatum of newborn piglets in response to hypocapnic hypoxia. Journal of neurochemistry. 60, 1399-1406 (1993).
- Cote, A., Barter, J., Meehan, B. Age-dependent metabolic effects of repeated hypoxemia in piglets. Canadian journal of physiology and pharmacology. 78, 321-328 (2000).
- Tichauer, K. M., et al. Assessing the severity of perinatal hypoxia-ischemia in piglets using near-infrared spectroscopy to measure the cerebral metabolic rate of oxygen. Pediatric research. 65, 301-306 (2009).
- Jasani, M. S., Salzman, S. K., Tice, L. L., Ginn, A., Nadkarni, V. M. Anesthetic regimen effects on a pediatric porcine model of asphyxial arrest. Resuscitation. 35, 69-75 (1997).
- Chakkarapani, E., Thoresen, M., Liu, X., Walloe, L., Dingley, J. Xenon offers stable haemodynamics independent of induced hypothermia after hypoxia-ischaemia in newborn pigs. Intensive care medicine. 38, 316-323 (2012).
- Munkeby, B. H., et al. A piglet model for detection of hypoxic-ischemic brain injury with magnetic resonance imaging. Acta radiologica. 49, 1049-1057 (2008).
- Andresen, J. H., et al. Newborn piglets exposed to hypoxia after nicotine or saline pretreatment: long-term effects on brain and heart. J Matern Fetal Neonatal Med. 22, 161-168 (2009).
- Munkeby, B. H., et al. Resuscitation with 100% O2 increases cerebral injury in hypoxemic piglets. Pediatric research. 56, 783-790 (2004).
