Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

מבדק נפח קטן להערכה בקטריאלי / הפיטופלנקטון Co-תרבות שימוש במים-Pulse-Amplitude-אופנן (WATER-PAM) Fluorometry

Published: March 11, 2015 doi: 10.3791/52455
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, University of Alberta

Abstract

שיטות מקובלות למניפולציה ניסויית של microalgae יש מועסקי כמויות גדולות של התרבות (20 מיליליטר עד 5 L), כך שהתרבות יכולה להיות subsampled לאורך הניסוי 1-7. Subsampling של כמויות גדולות יכול להיות בעייתי מכמה סיבות: 1) זה גורם לשינוי בשטח פן הנפח והכולל: יחס נפח של התרבות במהלך הניסוי; 2) פסאודו-שכפול (כלומר, לשכפל דגימות מאותו בקבוק הטיפול 8) לעתים קרובות מועסק ולא משכפל אמיתי (דגימה כלומר, מטיפולים לשכפל); 3) משך הניסוי מוגבל על ידי הנפח הכולל; ו 4) תרבויות axenic או חיידקי חיידקים הרגילים קשים לשמור במהלך ניסויים לטווח ארוך כזיהום מתרחש בדרך כלל במהלך subsampling.

השימוש בצלחות microtiter מאפשרת כרכי 1 מיליליטר תרבות שישמשו לכל לשכפל, עם עד 48 טיפולים נפרדים בתוךצלחת סנטימטר 12.65 x 8.5 x 2.2, ובכך להקטין את הנפח הניסיוני ומאפשר לשכפול נרחב ללא subsampling כל טיפול. בנוסף, טכניקה זו יכולה להיות שונה כדי להתאים מגוון רחב של פורמטים ניסיוניים כוללים: שיתוף תרבויות חיידקים-אצות, בדיקות פיזיולוגיה של אצות, ורעלן הקרנת 9-11. בארות בודדות עם אצה, חיידק ו / או שיתוף תרבויות ניתן לדגום לנוהלי מעבדה רבים, כולל, אך לא מוגבלת ל: WATER-Pulse-Amplitude-אופנן (WATER-PAM) fluorometry, מיקרוסקופיה, יחידת מושבת חיידקי יוצרים (CFU) רוזנים וcytometry זרימה. השילוב של fluorometry פורמט צלחת microtiter ומים-PAM מאפשר מדידות מהירות מרובות של תשואת פוטו ופרמטרים אחרים פוטו עם שונות נמוכות בין דגימות, שחזור גבוה וימנע את החסרונות רבים של subsampling בַּקבּוּק או בקבוק חרוטי במהלך ניסוי .

Introduction

הפיסיולוגיה הפיטופלנקטון באופן מסורתי למדה בניסויים טווינה-סולם הנעים בין 20 מיליליטר בצלוחיות חרוטי עד 5 L בcarboys 1-7. בקנה מידה ניסיוני זה דורש subsampling לניטור ניסוי, כהקרבת דגימות לשכפל לכל נקודת זמן יוצרת הגדרת ניסוי בלתי ניתנת לניהול.

היכולת להגדיל את מספר ניסויים בלתי תלויים תוך השימוש באותו מרחב חממה יומית על ידי miniaturizing הנפח הניסיוני לניסויי פיזיולוגיה אצות יהיה להפחית או לבטל את המגבלות של subsampling ופסאודו-שכפול מכמויות גדולות. פורמט צלחת microtiter פותח עבור bioassays אצות באמצעות 1 מיליליטר נפח תרבות לניסוי מניפולציה אצות בתנאים משתנים. נפח קטן וניסיוני זה מאפשר למספר החזרות להיות מוגבר, מגדיל שחזור ניסוי בשל השתנות ירד בין דגימות ולשכפלניסויים, ומאפשר שכפול אמיתי תוך שמירה על בקרת ניסוי (כלומר, תרבויות אצות axenic) עבור 140 ימים (איור 2) 12.

פורמט צלחת microtiter זה מותאם בקלות למגוון רחב של שאלות ניסיוניות, כגון: האם יש חיידק אינטראקציה סימביוטית, ניטראלית או פתוגניים עם מארח האצות שלה? האם התוספת של מגרה מתחם או רעילה לאצה? שאלות אלו ואחרות ניתן לטפל באופן תפוקה גבוהה מהיר באמצעות פורמט חדש זה 9-11.

צלחת תרבות microtiter 48 היטב מאפשרת לכל 1 מיליליטר גם להיות התקנה ניסיונית עצמאית שתדגם בנקודת זמן אחת. ניתן לדגום פרמטרים שונים מזה 1 מיליליטר כולל נפח, אך לא רק: הקרינה כלורופיל ופרמטרי פוטו באמצעות fluorometry במים Pulse-Amplitude-אופנן (WATER-PAM) (ראה חומרים וציוד שולחן) 13. Fluorometry במים PAM הוא טכניקה מהירה ולא פולשנית, שניתן להשתמש כדי לפקח על ניסויים שבוצעו עם אצות 13. זה מאפשר מדידה של יעילות פוטוסינתזה ובריאות PSII מקטן נפח תרבות (150-300 μl של התרבות בדילול מלא במדיום ל2-4 מיליליטר נפח מים-PAM) 14,15. בנוסף לfluorometry במים PAM, התקנה זו יכולה לשמש כדי למדוד מגוון של פרמטרים אחרים, כולל, אך לא מוגבלת ל: מיקרוסקופיה לדמיין את החיידקים מצורפים לתאים ושינויים במורפולוגיה של תאי אצות אצות; מושבת חיידקים יוצרת יחידת ספירה (CFU); וcytometry זרימה לספירת תאי אצות ותת-אוכלוסיות זיהוי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. חישובים להתקנה ניסיונית

  1. חשב את הנפח של אצות ו / או תרבויות חיידקים זקוקים לבקרה שתידרש לניסוי כולו על ידי שימוש במשוואה 1:
    משוואת 1
    איפה y שווה למספר הבקרות הדרושות ליום וz שווה למספר הימים.
  2. חשב את הנפח של תרבויות אצות ו / או בקטריאלי, הדרושים לשיתוף תרבויות לניסוי באמצעות משוואה 2:
    משוואה 2
    הערה: ניתן להחליף את הניסויים "התרבות המשותפת" עם כל מסך מתחם; רק להתאים את המתחם הסופי, ממס וריכוזי אצות שיתאימו לעיצוב ניסיוני.
  3. השתמשו במשוואות 1 ו -2 כדי לחשב את הנפח הסופי של תרבות אצות מוקדם מעריכים (בדרך כלל 5 ימים ל~ 10 4 תאים / מיליליטר אבל זה צריך להיקבע על ידי performing עקומת צמיחת אצות) הנדרשת לניסוי (כרך זה נחוץ לשלב 2.3) באמצעות משוואה 3:
    משוואה 3
  4. השתמש במשוואות 1 ו -2 כדי לחשב את הנפח הסופי של 10 4 CFU / ml תרבות חיידקים (או ריכוז חיסון רצוי) הנדרש לניסוי (כרך זה נחוץ לשלב 4.2) באמצעות משוואה 4:
    משוואה 4
    הערה: השתמש בתוספת של 10 מיליליטר בשלבים 1.3 ו -1.4 לחשבון pipetting שגיאה וכל בדיקות שמבוצעות (למשל, במים PAM, cytometry זרימה, מיקרוסקופיה, וכו ') על 0 ד. הגדל את נפח זה במידת צורך כדי להתאים את עיצוב ניסיוני.
    הערה: לחישוב דוגמא של ניסוי 8 ימים ראה סעיף 10. ראה טבלה נוספת למתכוני תקשורת.

2. תאי אצת גידול להגדרת ניסוי

  1. לבודד או להשיגמתרחב תרבות אצות axenic.
  2. העברת הסביבה נקיה מחיידקים 10% מהנפח הסופי של תרבות האצות לתוך מדיום אצות סטרילי (למשל, L1 או בינוני אצות ימיות דומה, ראה חומרים וציוד שולחן), על מנת להבטיח דילול 1: 9 של תרבות של אצות במדיום חדש. לגדול האצה מדוללת בחממה יומית באמצעות תנאי גידול נקבעו בעבר לזן ש( למשל, C ° 18 עם 16: 8 שעות אור: מחזור כהה משמש בדרך כלל).
  3. כאשר התרבות הגיעה מוקדם מעריכי-שלב, מחדש תרבות האצה באותו מדיום אצות סטרילי (למשל, L1 או בינוני אצות ימיות דומה), להבטיח את הריכוז הסופי הוא 1: 9 דילול ושהנפח הסופי של אצות הוא שווה לV מחושב (שלב 1.3).
    הערה: חשוב כדי להבטיח תרבויות אלה axenic. לבדוק את כל התקשורת של אצות ובקבוקי מניית אצות לזיהום על ידי ציפוי aliquot 20 μl על מדיום חיידקים ימי כללי (לדוגמא, ימיתמרק בתוספת 2,216 אגר 1.5% או דומה).
  4. לגדול בתרבות של אצות לשלב מוקדם מעריכים (~ 10 4 תאים / מיליליטר).
    הערה: לכל זן אצות עקומת צמיחה ייחודית בהתאם לתנאי culturing. שלב מוקדם מעריכים (~ 10 4 תאים / מיליליטר) ניתן לקבוע על ידי ביצוע עקום צמיחת אצות המבוססים על צפיפות תאים (כלומר באמצעות cytometry זרימה או מיקרוסקופ).

3. הכנת תאי חיידקים לחיסון

  1. טרום לקבוע את ריכוז החיידקים (CFU / ml) וצפיפות אופטית (OD) של החיידק בשלב נייח על ידי עושה עקומת צמיחה בתנאים הבינוני והתפתחות חיידקים נבחרו (לדוגמא, ימי מרק 2,216 ב 25 ° C ו -160 סל"ד, או דומה). השתמש במידע זה כדי לגדל את התאים (שלב 3.3) ולאחר מכן לדלל את התאים בצורה נכונה בשלב 3.7.
  2. הסביבה נקיה מחיידקים להעביר מושבת חיידקים מבודדת וטרי גדלה מצלחת 1.5% אגר (למשל, ימי מרק 2,216 גמישיםmented עם אגר 1.5% או בינוני מוצק חיידקים ימיים דומה) לתוך 5 מיליליטר של מדיום נוזלי חיידקים (למשל, ימי מרק 2,216 או בינוני חיידקים ימיים דומה).
  3. לגדול החיידק לשלב נייח על תוף מתגלגל או שייקר (~ 12-36 שעות, תלוי בחיידק). לתכנן את הניסוי כך שהחיידק מגיע שלב נייח (~ אוגוסט 10 - ספטמבר 10 CFU / ml) באותו הזמן שתאי האצה הגיעו לשלב מוקדם מעריכים (~ מיליליטר / 10 4 תאים).
  4. בעזרת פיפטה, לשטוף את כל biofilm המצורף למבחנה לתוך המדיום. פיפטה 1 מיליליטר של תרבית חיידקים מעורבות היטב לתוך microtube 1.5 מיליליטר סטרילי. צנטריפוגה 1 דקות ב14,000 x ז.
  5. הסר ולהשליך supernatant (תקשורת חיידקים) מבלי לשבש את גלולה (תאי חיידקים). הוסף 1 מיליליטר של תקשורת סטרילית אצות (למשל, L1 או דומה) לmicrotube (עם גלולה). microtube מערבולת כדי resuspend גלולה בתקשורת אצות.
  6. לשטוף את השני:חזור על שלב 3.5.
    הערה: זה קריטי כדי לשטוף את תאי חיידקים עם תקשורת אצות כדי להסיר ביסודיות את כל חומרי ההדפסה חיידקים, שאריות תאים, חלבונים מופרשים ומולקולות קטנות מהתאים לפני inoculating האצות איתם כמו זה יכול לשנות את ההרכב התזונתי של תקשורת האצות או להציג את המולקולות ביו למסך.
  7. סדרתי לדלל את תאי חיידקיים שטפו בתקשורת אצות, לריכוז סופי שהוא פי 100 יותר מרוכזים מאשר הריכוז הרצוי הסופי החיידקים (CFU / ml). שמור את microtube המכיל תאים שנשטפו ומדולל בתקשורת אצות לשלב 4.2.
    הערה: תכנית הניסוי המבוסס על שיש יחס של 1: 1 של אצות לחיידקים על 0 ד. כדי לעשות ריכוז חיידקים ראשוני רצוי זה לניסוי הוא 10 4 CFU / ml, ולכן בשלב 3.7 התאים הראשוניים צריכים להיות מדוללים באופן סדרתי עד 10 6 CFU / ml.

4. חיידקים הכנה לניסויהתקנת אל

  1. הכן 4 צלוחיות חרוטי סטרילי autoclaved זכוכית ולתייג אותם: א) "בקבוק אצות שליטה ', ב)" בקבוק המניה בדילול מלא חיידקים', ג) 'בקבוק שליטת חיידקים', ו-ד) 'בקבוק שיתוף התרבות'.
  2. לדלל את ההשעיה חיידקים מ צעד 3.7 1:99 בתקשורת אצות סטרילי כדי נפח סופי = V B (שלב 1.4). הפוך את הדילול במניות הבקבוק שכותרתו מדוללת חיידקים (שלב 4.1).
    הערה: בדוגמא הקודמת (שלב 4.2), דילול 1:99 זה נותן ריכוז סופי של 10 4 CFU / ml. בקבוק מערבולת לערבב תאים.
  3. שליטת V פיפטה (שלב 1.1) מהמניות בדילול מלא החיידקים ולשים אותו בבקבוק שליטת החיידקים.
  4. שליטת פיפטה V של מדיום סטרילי אצות לתוך בקבוק שליטת החיידקים (זה דילול 1: 1). בקבוק מערבולת לערבב תאים ומניח בצד לצעד 7.3.
  5. שיתוף תרבות פיפטה V מהמניות בדילול מלא חיידקיםבקבוק כדי בקבוקון שיתוף התרבות, להגדיר בקבוק בצד לצעד 6.1.
    הערה: כאשר עושים שיתוף תרבויות מרובות באותו האצה בפעם אחת (כלומר, תרבות משותפת של שני חיידקים שונים מבודדת עם שליטה אחד) יש צורך לחשב מחדש את שיתוף תרבות V עבור כל זן בנפרד ולאחר מכן חזור על שלב 4.5 לכל שיתוף תרבות בנפרד. זה הכרחי גם כדי להגדיל את V מחושב בשלב 1.3 לכלול גם שיתוף תרבויות שמוצגים במשוואה 5:
    משוואה 5

5. הכנת אצות להגדרת ניסוי

  1. לערבב בעדינות התרבות המוקדמת מעריכי אצות (משלב 2.4) עם קצה פיפטה רחב-פה עד תאים מופיעים גם מעורבים.
  2. שליטת V פיפטה מבקבוק מניית האצות לבקבוק שליטת האצות. בעדינות פיפטה באמצעות פיפטה 10 מיליליטר. לאחר מכן להחזיר את בקבוק מניית האצות בחממה היומית.
  3. המשך V פיפטהרול של מדיום אצות סטרילי לבקבוק שליטת אצות (זה דילול 1: 1). מערבולת לערבב בקבוק ומקום בחממה היומית, עד צורך לצעד 7.4.

6. ניסויי משותף תרבות הכנה

  1. בעדינות פיפטה שיתוף תרבות V מהבקבוק מניית האצות לתוך בקבוק שיתוף תרבות חיידקים משלב 4.5. חזור בקבוק שיתוף תרבות לחממה היומית עד צורך לצעד 7.5.
    הערה: הריכוז של חיידקים בשליטת החיידקים צריך להיות שווה לריכוז החיידקים בשיתוף התרבות הניסיונית. באופן דומה, הריכוז של אצות בשליטת האצות צריך להיות שווה לריכוז של אצות בשיתוף התרבות הניסיונית. על ידי כך אותם ריכוזי חיידקים ואצות ראשוניים, צפיפות האוכלוסייה ניתן להשוות לאורך כל הניסוי.

7. הגדרת הצלחות microtiter

  1. לחלק צלחת microtiter 48 היטב סטרילי לפי איור 1.תווית מעל בארות חיצוניות המכילות דגימות או diluent סטרילי או לא פוטוסינתזה.
    הערה: רנדומיזציה של בארות הצלחת ניתן לעשות לדגימות שנלקחו באותו היום. לדוגמא, ברבע 1 יהיה נדגם בד 1 בניסוי; הבארות שיש באופן אקראי הן B2 - 4 וC2 - 4. השאירו את המערכת של הצלחת מלאה בתמיסה סטרילית, כפי שמוצג באיור 1.

איור 1
. איור 1. ייצוג סכמטי של מיקום מדגם בצלחת microtiter 48 היטב ולס הוא להיות מלא באופן הבא: עמודות 1 ו -6, בארות באמצעות F ( מעגל 1 ) מלאים עם 1 מיליליטר 1x PBS (או פתרון / תקשורת סטרילית אחרת). שורות וF, בארות 2-8 ( מעגל 2 ) מלאים עם 1 מיליליטר שליטת חיידקים; roבארות B ו- E ws 2-8 ( מעגל 3 ) מלאים עם 1 מיליליטר שליטת אצות; שורות C ו- D, בארות 2-8 ( מעגל 4 ) מלאים בשיתוף תרבות מיליליטר 1. הצלחת מחולקת 4 רביעים (A2, A5, D2, וD5) הרביעים האלה הם כל ימי דגימה ספציפיים 1-4, זה צריך להיות באופן אקראי בכל צלחות ומסומנות בהתאם. בתוך כל יום אנו ממליצים באופן אקראי, שליטת האצות ( מעגל 5 ) ותרבות משותפת ( מעגל 6 בארות) באמצעות מחולל מספרים אקראי. תווית המכסה מעל PBS 1x ו / או בארות שליטת חיידקים כדי למנוע הצללה של תרבויות אצות.

  1. פתרון פיפטה 1 מיליליטר פוספט 1x חיץ (PBS, pH 7.4) או תמיסה סטרילית אחרת בבארות המתאימות כפי שמצוין באיור 1. בצע לאט ובזהירות זו. PBS יהיה change החוזק היוני של מדיום האצות ו / או התרבות משותפת אם זה ניתז בבארות אחרות כך לטפל בזהירות.
  2. פיפטה 1 מיליליטר של תרבות שליטת חיידקים לתוך בארות שכותרתו שליטת חיידקים (איור 1). לערבל את בקבוק החיידקים לפני pipetting כל צלחת כדי למנוע התישבות חיידקים.
  3. 1 פיפטה מיליליטר של תרבות שליטת אצות לתוך בארות שכותרתו שליטת אצות באמצעות קצה רחב הפה פיפטה (איור 1). לערבל את בקבוק האצות באופן סדיר כמו בקבוק החיידקים. אם האצה נוטה לשקוע או לצוף, מערבולת באופן סדיר כמו שצריך כדי לשמור על תרבות אחידה מבחינה ויזואלית.
  4. באמצעות קצה הפה פיפטה רחב, פיפטה 1 מיליליטר של התרבות המשותפת בבארות המתאימות (איור 1). מתערבל בקבוק שיתוף התרבות באופן סדיר כמו הבקבוק של אצות.
  5. לאטום כל צלחת עם parafilm ומקום בחממה יומית בטמפרטורה הרצויה ומחזור אור היומי (18 ° C עם 16: 8 שעות אור: מחזור כהה משמש בדרך כלל). השארהצלחות בחממה היומית עד מוכן לקחת PAM קריאה (סעיף 8). להבטיח את כל הצלחות מכוונים באותו הכיוון כדי לאפשר חשיפה לאור עולה בקנה אחד.
  6. קח aliquot 20 μl מPBS, תקשורת אצות, אצות ומניית שליטת אצות ושחרר צלחת על מדיום הלא סלקטיבי מתאים (למשל, הימי מרק 2,216 תוספת אגר 1.5%) ו דגירה צלחות ב18-25 מעלות צלזיוס במשך 72 שעות לבדיקת זיהום. אם צמיחה מופיעה באף אחד מהפתרונות שלא צריך להכיל חיידקים, אז לא צריכים להיות השתמשו בנתונים אלה.
  7. קח קריאות fluorometry PAM באמצעות המדגם שנותר מצלוחיות שליטה ושיתוף התרבות של אצות לfluorometry הניסיוני 0 ד PAM קריאה (ראה שלב 8.1). כל מדידות 0 ד אחרים גם צריכה להתבצע עם השליטה שתישאר אצות, שליטה בקטריאלי ודגימות התרבות המשותפת.

8. קריאת PAM Fluorometry לוקח מדוגמאות במלאי

  1. אפס במים PAMעם תקשורת אצות סטרילי בקובט נקי לפני נטילת קריאות 8.
  2. פיפטה 300 μl מצלוחיות שליטה או שיתוף התרבות של אצות לתוך קובט נקי המכיל 2.7 מיליליטר של המדיום זהה אצות המשמש בניסוי. מערבבים את המדגם ומדללים בעדינות עם קצה הפה פיפטה רחב.
  3. נגב את כל טביעות האצבעות-מחוץ לקובט עם רקמה לפני הצבת קובט במים-PAM.
  4. הנח קובט לתוך מים-PAM. מכסה את המדגם עם הכובע ולאפשר לו להסתגל כהה במשך 3 דקות. פעמים הסתגלות כהות משתנות בהתאם למין של אצות, ויש לקבוע לאצה מסוימת בשימוש בניסוי. הימנע פעמים הסתגלות כהות ארוכות (> 20 דקות) על ידי לקיחת קריאות במים PAM במהלך אמצע המחזור האפל של החממות יומי אצות 16,17.
  5. לאחר אימוצו הכהה, פגע F 0 כפתור. אם קריאות הקרינה הן מעל 3,900, לדלל מדגם 1: 1 במדיום אצות. Dark-להסתגל ל3 דקות וtak נוספיםקריאה חדשה ea. אם הקריאות מ 'F 0 או F הן עדיין מעל 3,900, תמשיך לדלל המדגם 1: 1 במדיום אצות עד הקריאות מ' F 0 וF נמצאות מתחת 3,900.
    הערה: הקפד לתת דין וחשבון לדילולים אלה בעת הקלטת הקרינה סופית: למשל, אם מדגם האצות מדולל 1: 9 בהעברה הראשונית מהבאר אל צינור הדילול, אז קריאת הקרינה אצות של 500 יש לכפול ההפוך של הגורם לדילול (במקרה זה 10) והקרינה בפועל של הצינור הוא אז 5,000.
  6. לאחר הגדרת F 0, לקחת דופק להרוות (SAT-פולס) קריאה כל sec 90 על ידי לחיצה על כפתור SAT לקחת קריאות מ 'F. מרווח הזמן בין הקריאה עשוי להיות מותאם בהתאם לזן אצות. מדגם מחק.
  7. חזור על שלבים 8.1-8.6 לדגימות שנותרו.

9. קריאת PAM Fluorometry לוקח מהצלחות microtiter

  1. תווית6 צינורות מדגם סטרילי של> 3 מיליליטר נפח לבארות B2 - 4 לC2 שליטה ובארות אצות - 4 לשיתוף תרבות החיידקים (ראה פריסת צלחת באיור 1).
  2. Aliquot 2.7 מיליליטר של מדיום אצות סטרילי לתוך צינור אחד.
  3. מניחים צינורות בחממה יומית ולאפשר להם להסתגל לטמפרטורת האצה הייתה גדלה בלמשך 30 דקות.
  4. לפני הסרת צלחת microtiter מן החממה להבטיח שחדירת האור לתוך הבארות הכהות התאקלם מוגבלת על ידי כיסוי הצלחת עם נייר אלומיניום (או דומה), רק להסיר את נייר הכסף בעת העברה באופן פעיל תרבות מהבארות לצינורות הדילול (שלבים 9.5 - 9.7).
  5. הסביבה נקיה מחיידקים לערבב צלחת microtiter הראשונה היטב (גם B2) עם קצה הפה פיפטה רחב על ידי pipetting לאט מעלה ומטה.
  6. השג את צינורות דילול מהעברת החממה והסביבה נקיה מחיידקים 300 μl מהיטב B2 (איור 1) לצינור המדגם המקביל שלה עם טיפ פיפטה פה רחב (זה דילול 1: 9 למדגם במדיום אצות).
  7. חזור על שלבים 9.5-9.6 לבארות הנותרות (B3,4 וC2 - 4).
  8. לכסות צינורות מדגם ברדיד אלומיניום ולהחזיר אותם לחממה היומית עד מוכן למים-PAM.
  9. לבצע קריאות במים PAM כפי שמתואר בצעדים 8.1-8.7. חותם את צלחת microtiter עם parafilm לפני החזרתו לחממה.
  10. חזור על קריאות במרווחי זמן מתוכננים לתקופת הניסוי. התדירות והאורך של דגימה צריכה להיות מתוכנן בתחילת הניסוי.

ניסוי 10. לדוגמא

ניסוי המדגם הוא תרבות משותפת 10 יום של חיידק (BS107 gallaeciensis Phaeobacter) וmicroalga (זן Emiliania huxleyi (CCMP3266)). הוא כולל שליטת אצות, שליטה בקטריאלי, ושיתוף תרבות ניסויים בקטריאלי-אצות.

  1. חישוב כמויות של מניות חיידקים ואצות הנדרשות (שלבים 1.1-1.4)
    משוואה 10
  2. הכן את מניית האצות, V של 40 מיליליטר, על ידי inoculating 4 מיליליטר של אצה ב -36 מיליליטר בינוני וטופחו עד שהצמיחה מוקדמת מעריכים מושגת עם צפיפות תאים של ~ / 10 4 תאי מיליליטר (שלבים 2.1-2.4).
  3. הכן את בקבוק מניית החיידקים על ידי דילול 400 μl של 10 6 CFU / מיליליטר החיידקים המתקבלים בסעיף 3 לV B של 40 מיליליטר עם תקשורת אצות (ריכוז סופי של חיידקים יהיה 10 4 CFU / ml).
  4. העברת מחצית (20 מיליליטר) של המניה בקטריאלי לבקבוק שליטת החיידקים ולהוסיף 20 מיליליטר של תקשורת אצות כדי להפוך את השליטה בקטריאלי. העברת מחצית (20 מיליליטר) מניית האצות לבקבוק שליטת האצות ולהוסיף 20 מיליליטר של תקשורת אצות לפצות את השליטה של ​​אצות (סעיף 5). להעביר 20 מיליליטר הנותר של מניות בקטריאלי לבקבוק שיתוף התרבות ולערבב עם 20 מיליליטר הנותר של מניות אצות להקים שיתוף התרבות (סעיף6).
  5. פיפטה PBS 1x (pH 7.4), בקרות, ושיתוף התרבות בשתי צלחות שכותרתו מראש microtiter (איור 1), 1 מיליליטר לכל טוב. השתמש 3 מיליליטר של בקרות שנותרו ושיתוף תרבויות לעשות 0 מדידות ד (ספירת CFU, במים PAM (סעיף 8), תצפית מיקרוסקופית של מורפולוגיה של תאי אצות, וקיבוע תא אצות לזרימה cytometry).
  6. לקחת קריאות במים PAM לשליטה האצות והתרבות משותפת פעם ביום למשך 10 ד, ותמיד באותו הזמן כמדידות ד 0 נלקחו (סעיף 8).

11. פרמטרים אחרים של ריבית

  1. לקבוע את ריכוז CFU חיידקים: לבצע דילול סדרתי של השליטה בקטריאלי ושיתוף התרבות ב1x סטרילי PBS (או דומה), ולאחר מכן שחרר את הצלחת על ימי מרק 2,216 תוספת אגר 1.5% (או דומה) ולבחון את מספר CFU הגדלים כדי לקבוע את מיליליטר / CFU חיידקים לכל אחד גם 18.
  2. כדי להעריך את ריכוז תאי אצות: לתקן את השליטה ושיתוף אצותתרבות עם 0.15% ריכוז סופי של glutaraldehyde. דגירה של 10 דקות ב, אז פלאש הקפאה בחנקן נוזלי הכהה, ולאחסן ב -80 ° C. תהליך לכל הדגימות על cytometer זרימה (FACS Calibur או דומה) לספור תאי אצות.
  3. שים לב מורפולוגיה אצות תא: תרבויות אצות ושיתוף תרבות חיידקים-אצות באמצעות מיקרוסקופ (כלומר, מיקרוסקופ אור, epifluorescence, או דומה).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

קריאות fluorometry במים PAM.

במים Pulse-Amplitude-אופנן (PAM) fluorometry היא שיטה מהירה ויעילה כדי לקבוע את הקרינה (proxy עבור תוכן כלורופיל) ותשואת פוטוסינתזה (בריאות PSII) של תרבויות אצות. תוכנת PAM WinControl יוצרת גיליון אלקטרוני של ערכי נתונים גולמיים ל( להלן פרמטרים הבסיסיים לדגימות של אצות כהות מותאם):

F 0 = הקרינה של תאים כהים מותאמת

מ 'F = לאחר להרוות דיודות פולטות אור דופק הקרינה המרבית (LED)

F v / m F = (m F -f 0) / m F = תשואת קוונטים פוטנציאלית של מדגם כהה מותאם 19

יש fluorometry PAM שימושים רבים והוא יכול לתת הרבה מידע על photosystem ובריאותם של אלגיאה. בנוסף, יש פרמטרים נוספים שחשובים בעת בדיקת דגימות אור מותאמת. לקריאה נוספת אלה נדונו בהרחבה בביקורות אלה 13,16,20-23. ניתן להעביר נתונים אלה לתוכנת גיליון אלקטרוני או גרפים כדי ליצור גרפים של הקרינה האצות הראשונית (F 0), הקרינה המרבית של אצות (מ 'F), ותשואת קוונטים הפוטנציאלית (F v / m F; האיורים 2 ו -3) . הגרפים באיור 3 מתארים כיצד הקרינה האצות וF v / m F מושפעים מהחיידק על ידי השוואת האצה גדלה לבד (שליטה) לזה שגדלו עם החיידק בשיתוף התרבות לאורך ניסוי שיתוף התרבות של 10 הימים (איור 3 ג). בדוגמא זו, שני מדגם T-test שימש כדי להשוות את הפרמטרים סטטיסטיים בין שני טיפולים בכל יום. באופן דומה, עבור ניסויים שבהם יותר משני טיפולים הנוכחיים, ANOVA יכוליםלשמש. מ 'F קריאה (איור 3) נלקח ישירות לאחר שירווה LED דופק, מה שאומר שQA מקבל אלקטרונים PSII העיקרי מצטמצם באופן מלא ואינו יכול לקבל יותר אלקטרונים מP680 מרכז ריאקצית PSII, ובתור שכזה, כל מרכזי התגובה הם' סגור '17. זה מעכב את שימוש פוטו של אנרגיית אור, מביא לפליטת הקרינה מרבי. אז זה נותן קריאת הקרינה המרבית (מ 'F). איור 3 ג ממחיש ירידה דרמטית בבריאות PSII בין ד 5 ו -10 ד כאשר שיתוף תרבותי עם החיידק בהשוואה לגידול לבד (שליטה). הברים השגיאה סטנדרטיים נגזרים מבארות microtiter שלוש עותקים, שהם ניסויים עצמאיים מאותה תרבויות חיידקים ואצות הורים. השגיאה סטנדרטית הקטנה באופן עקבי מאשרת את החוסן ושחזור של פורמט צלחת microtiter לbioassays אצות שכן היא מאפשרת ניסויים בלתי תלויים, שישמש כrepliקייטס ומבטל את צורך subsample היחידה הניסיונית על משך הניסוי.

איור 2
איור 2. גרפים נציג fluorometry WATER-PAM של עקומת צמיחת 140 d של huxleyi axenic Emiliania (CCMP3266). קריאה () לקרינת אצות הראשונית (F 0), הקרינה אצות המרביות (מ 'F) (ב) ו- ( ג) תשואת קוונטים פוטנציאלית (v F / F מ ') לE. huxleyi מוצג כעיגולים שחורים. הקו בכושר הטוב ביותר עבור F 0 וm F היה יומן 3 פרמטר נורמלי R (SigmaPlot) 2 = 0.94, 0.95 בהתאמה. תשואת קוונטים פוטנציאלית (F v / F מ ') הוא ביטוי ממדים של בריאות פוטוסינתזה, המחושב כ( מ' F - F 0) / m F. הקו בכושר הטוב ביותר עבור F v / העקומה מ 'F היה R פולינום 3 גורם 2 = 0.6. ברים שגיאה מייצגים את שגיאת התקן בין בארות בשלושה עותקים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. גרפים נציג fluorometry WATER-PAM של ניסוי שיתוף culturing 10 ד של Emiliania huxleyi (CCMP3266) עם gallaeciensis Phaeobacter BS107. (א) הקרינה האצות הראשונית (F 0), הקרינה אצות המרבית (מ 'F) (ב) , ותשואת קוונטים פוטנציאלית (C) (F v / F מ ') נמצא בגרף עבור מערכות באצות l (עיגולים פתוחים) ואצת שיתוף תרבותי עם חיידק (עיגולים שחורים). תשואה פוטנציאלית קוונטים (v / m F F) היא ביטוי ממדים של בריאות פוטוסינתזה, המחושב כ( מ 'F - F 0) / m F. ברים שגיאה מייצגים את שגיאת התקן בין בארות בשלושה עותקים. כוכבית (*) מציינת ימים שבם הפרמטרים לטיפולי שליטה ושיתוף תרבות שונים באופן משמעותי. הבדלים בין טיפולים לכל הימים היו לא משמעותיים, למעט 10 ד בכל שלושת הפרמטרים (10 ד - F 0: מבחן t, df = 2.5, t-יחס = -15, p = .0017 *; מ 'F: T- בדיקה, df = 2.1, t-יחס = -16.15, p = 0.003 *; F v / F מ ':. מבחן t, df = -18.68, t-יחס = 2.0, p = .0028 *) אנא לחץ כאן לצפייה גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

צמיחת אצות בפורמט מיניאטורי.

המזעור של תרבויות אצות למיליליטר 1 נפח תרבות בצלחת microtiter מאפשר לשכפול בניסוי להיות מוגבר. זה חשוב כדי להבטיח את האצה היא בריאה לאורך ניסוי; לבצע עקומת צמיחה (איור 2), תוך שימוש בפורמט צלחת microtiter להעריך תקשורת אצות שונות, על מנת להבטיח את הדרישות התזונתיות של האצה הם נפגשו. בנוסף, הוא עשוי להיות חשוב כדי לייעל את מחזור היומי (תקופות אור וחושך) וטמפרטורה. אופטימיזציה הנכונה לאצה נתון יכולה לאפשר לשמירה על תרבויות אצות בריאים בקרינת השיא במשך 26 ד ולאיתור תשואת קוונטים פוטנציאלי לאחר 140 ימים (איור 2).

מזעור השפעות אידוי.

חשוב למזער את השפעות האידוי של מבחני מבוססים נוזל כ'אפקט קצה "הוא בדרך כלל observed שבו יש אידוי גדול יותר בבארות בקצה צלחת microtiter מאשר בבארות ממוקמות לקראת אמצע הצלחת. בעוד אידוי נצפה בקצה צלחות, קצב האידוי אינו מגביל את משך הניסוי כתרבויות אצות בריאים, עם הקרינה השיא ב 26 ד נשמר בפורמט זה (איור 2). כדי למזער את "אפקט קצה" פוטנציאל, 1x PBS (pH 7.4), או תמיסה סטרילית אחרת, הוא aliquoted לתוך בארות לאורך כל ארבעת הקצוות (עמודות וH, שורות 1 ו -6, איור 1).

תאורה בתוך חממה יומית.

צריכה כל מה שיש צלחות microtiter באותו כיוון בחממה היומית. לדוגמא, לאורכו כיוון של צלחות microtiter בחממה אומר שהצלחות ממוקמות לאורך הציר הקצר. אם נעשה שימוש בנטייה זו, תרבויות אצות לאורך BG הציר הארוך (איור 1) יכולות experiencאור ea קל ושיפוע טמפרטורה עקב השינוי במרחק ממקור האור (הנורה הוא מקור של שניהם אור וחום). זה נצפה להשפיע מבחני טמפרטורה על אצות באופן הקיצוני של טווח הטמפרטורה שלהם. כתוצאה מכך זה לא סביר להשפיע רוב האצות גדלו בטמפרטורה האופטימלית שלהם. כדי למזער את ההשפעה של צבע אור וטמפרטורה זו להבטיח כי בקבוקים גדולים יותר אינם יוצרים הצללה, צלחות מקום במרחק עקבי מהאורות, להשתמש בד צל כדי להפחית את רמת האור במידת צורך ולבדוק את עוצמת האור על פני ציר זמן חממה יומית כדי לוודא שהוא נוסע באופן שווה.

הסתגלות כהה של דגימות של אצות לfluorometry במים PAM.

לפני מעביר המים וPAM קריאה חשוב כהה להתאים את הדגימות של אצות, כך שמרכזי תגובת PSII פתוחים באופן מלא וtransthylakoidal שיפוע pH מתפזר באופן מלא, ה מושרה האורשלנו נותנים o האמיתית F וערכים מ 'F שממנו ניתן לחשב F v / m F. דגימת האצה מassay למדידות במים PAM באמצע השלב האפל של מחזור היומי (כלומר, ל16: 8 שעות אור: מחזור כהה, מושב דגימת שעה 2 היה להתבצע מT (כהה) = 3-5 שעות) עושה את זמן הסתגלות כהה קצרות (3-5 דקות) בהשוואה לאמצע מחזור האור (T (האור) = 7-9 שעות) כאשר הסתגלות כהה ארוכה (> 20 דקות) 17. זמן adaption הכהה של האצה משתנה גם בהתאם למין של אצות, תנאי גידול ותנאי האור של מגוון בתי הגידול הטבעי שלה.

רגישות של קריאות fluorometry במים PAM.

במים PAM נועד להיות fluorometer הרגיש ביותר מסוגל לאתר F, מ 'F 0 וF מדגימות כלורופיל נמוכים כגון מים עיליים ים 16. כתוצאה מכך הוא מתאים באופן אידיאלי לminiatuהמבדק rized בי יכולות להיות מדוללת דגימות. בשל רגישות זו חשוב להבין שיש לו את המכונה במים PAM גבול עליון של קריאות הקרינה (כלומר, F, F 0 ו / או מ 'F) אם המדגם אינו מדולל מספיק (איור 4). בתוך תוכנת WinControl הערכים המרביים הם הראשונים מורגש לאחר לחיצת F 0 וקריאת F 0 (מייד לאחר הסתגלות כהה). כתוצאה מכך מ 'F ו- F נמצאים בערך המרבי 4056 (איור 4, לא. 2,286). הערכים המרביים של מטר וF F תלוי בסוג של מדיום אצות המשמש לכיול במים PAM, אבל דגימות מעל גבול הגילוי יכולות להיות מזוהות בקלות בגלל קריאות חוזרות ונשנות עם אותו הערך המרבי להתרחש עד המדגם הוא מדולל מספיק . לאחר דילול 1: 1 בתקשורת אצות, המדגם פחות המרוכז הוא כהה מותאם שוב ומדידת F 0 חזרה על עצמו. ערך Fppears להימדד בצורה נכונה, אבל מ 'F עדיין קורא את הערך המקסימאלי 4056 (איור 4, לא. 2,287). ו 1 בתקשורת אצות שוב וכהה מותאמת ל3 דקות נוספות לפני שלוקח עוד F 0 קריאה וקריאה תקפה התקבלו, כך המדידה הבאה (F) נלקחת: מדגם זה היה מדולל שוב 1 (איור 4, לא 2,288.) F v / החישוב מ 'F תקף. בדוגמא זו, המדגם היה מדולל פעמיים ביחס של 1: 1 עם מדיום, אשר צריך להיות בחשבון בחישוב מ 'F ו- F 0. חשוב לציין כי F v / m F, כפונקציה ישירה של F 0 וm F, הוא באופן שגוי מחושב אם הדגימות מדי מרוכזות למרות היותו ביטוי ממדים של בריאות פוטוסינתזה.

איור 4
תצוגת 4. WinControl איור של כמה קריאות fluorometry WATER-PAM של מדגם אצות ברצף להיות מדולל כדי להשיג את הדילול הנכון. זה מציג דמות אצות קריאות הקרינה המגיעות לגבול העליון של המכונה במים PAM (תיבה אדומה) ואלה שבהם דילול מתאים של המדגם הושג (קופסא ירוקה). בנוסף, נתון זה מתאר חלק מהמשתנים האחרים ששיטה זו מחשבת, אך אלה לא נדונו בפירוט כאן (ראה ביקורות 13,16,20-22). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

זיהום חיידקים.

בכל הניסויים של אצות, אצות בקרה נחוצות כבסיס לבריאות של אצות, ולכן קיימת הכרח שהוא נשאר נקי מזיהום חיידקים לאורך כל הניסוי. זיהום חיידקים מתרחש בקלות שכן איןבחירה (כגון אנטיביוטיקה) ופוטוסינתזה מייצרים כל הזמן פחמן אורגני חדש לצמיחת חיידקים. שתי דרכים החשובות ביותר כדי למנוע זיהום היא להבטיח סטריליות של כל הפתרונות (למשל, תקשורת אצות, 1x PBS, pH 7.4) והציוד בT = 0 d של הניסוי ולשמור על טכניקת aseptic בזמן טיפול צלחות microtiter. הניסוי צריך להיות במעקב לזיהום בכל נקודת זמן על ידי ציפוי aliquot 20 μl מכל בארות שליטת האצות. אם הזיהום נצפה מכל בארות שליטת אצות אז יש לציין קריאות במים PAM fluorometry אלה והוצאו מניתוח הנתונים. אם פתרון השתמש כדי להגדיר את הניסוי גורם לניסוי כולו להיות מזוהם, ואז להשליך את הניסוי ואת כל חומרים כימיים המזוהמים ולהתחיל מחדש. בקרות החיידקים ושיתוף תרבויות חיידקים-אצות יכולות גם להיות מזוהמות וצלחות אגר המשמשות לספירת CFU חיידקים צריכים להיות במעקב לmorphol מושבה החלופיתogies. ובכן ולזיהום לחצות יכול להתרחש בעת הסרת מכסה צלחת microtiter, אך להימנע בקלות על ידי לא הטיה או טלטול של הצלחות והעסקת טכניקת ספטית בזרימה למינרית או בסמוך ללהבה.

יישומים עתידיים.

המבדק נפח קטן זה מספק שיטת סינון מהירה לmicroalgae על ידי שילוב של פורמט צלחת microtiter עם fluorometry במים PAM. דוגמאות ליישומים עתידיים הם שונות, ויכולים לכלול fluorometry PAM ההדמיה, אשר מספק תובנה הווריאציה תאי תאים של בריאות PSII בתוך אוכלוסייה כפי שמבצע fluorometry PAM על תאים בודדים 24. המבדק גם יכול להיות בשילוב עם מיקרוסקופ וcytometry זרימה כפי שנדון בעבר. שילוב נוסף עם הפוטנציאל לספק תובנה נוספת הוא תא צביעה לזרימה cytometry ומיקרוסקופיה להבהיר וריאציה מורפולוגיים בתוך תת-אוכלוסיות של התרבות של אצות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 cu. ft. Diurnal incubator (6012-1) Caron Corporate 112310-6012-1-11 www.caronproducts.com
Nunc EasYFlask 25 cm2, Vent/Close Cap, 7 ml working volume, 200/cs Thermo Fisher Scientific N156340 www.fishersci.ca
Multiwell TC Plates – 48-well BD Biosciences Discovery Labware 353078 www.bdbiosciences.com
P1000 Gilson The Pipetting Standard—Gilson's Pipetman Mandel Scientific Company Inc. GF-F123602 www.mandel.ca
P10mL Gilson The Pipetting Standard—Gilson's Pipetman Mandel Scientific Company Inc. GF-F161201 www.mandel.ca
Wide Orifice Tips nonsterile [100–1,250 µl] VWR International 89079-468 www.ca.vwr.com
Ultrafine Tips nonsterile [100–1,250 µl] VWR International 89079-470 www.ca.vwr.com
Finntip 10 ml [Vol: 1 - 10 ml] Thermo Fisher Scientific 9402151 www.fishersci.ca
WATER-Pulse Amplitude Modulation (Water-ED) Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Germany EDEE0232 www.walz.com
15 mm diameter quartz glass cuvette (WATER-K) Caron Corporate www.caronproducts.com
Sodium chloride (crystalline/certified ACS), Fisher Chemical Thermo Fisher Scientific Thermo Fisher Scientific www.fishersci.ca
BD Difco Marine Broth 2216 BD Biosciences Discovery Labware BD Biosciences Discovery Labware www.bdbiosciences.com
BD Bacto Agar BD Biosciences Discovery Labware BD Biosciences Discovery Labware www.bdbiosciences.com
L1 Medium Kit, 50 L NCMA [National Center for Marine Algae and Microbiota NCMA [National Center for Marine Algae and Microbiota www.ncma.bigelow.org

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Scarratt, M. G., Marchetti, A. Assessing microbial responses to iron enrichment in the Subarctic Northeast Pacific: Do microcosms reproduce the in situ condition? Deep Sea Res Part II Top. Stud. Oceanogr. 53 (20-22), 2182-2200 (2006).
  2. Bidle, K. D., Haramaty, L., Barcelos E Ramos, J., Falkowski, P. Viral activation and recruitment of metacaspases in the unicellular coccolithophore, Emiliania huxleyi. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (14), 6049-6054 (2007).
  3. Moore, L. R., Goericke, R., Chisholm, S. W. Comparative physiology of Synechococcus and Prochlorococcus: influence of light and temperature on growth, pigments, fluorescence and absorptive. Mar. Ecol. Prog. Ser. 116, (1995).
  4. Iglesias-Rodriguez, M. D., Halloran, P. R. Phytoplankton calcification in a high-CO2 world. Science. 320 (5874), 336-340 (2008).
  5. Chen, M., Tang, H., Ma, H., Holland, T. C., Ng, K. Y. S., Salley, S. O. Effect of nutrients on growth and lipid accumulation in the green algae Dunaliella tertiolecta. Bioresour. Technol. 102 (2), 1649-1655 (2011).
  6. Lv, J. -M., Cheng, L. -H., Xu, X. -H., Zhang, L., Chen, H. -L. Enhanced lipid production of Chlorella vulgaris by adjustment of cultivation conditions. Bioresour. Technol. 101 (17), 6797-6804 (2010).
  7. Geider, R., Graziano, L., McKay, R. M. Responses of the photosynthetic apparatus of Dunaliella tertiolecta (Chlorophyceae) to nitrogen and phosphorus limitation. Eur. J. Phycol. 33 (4), 315-332 (1998).
  8. MacIntyre, H. L., Cullen, J. J. Using Cultures to Investigate the Physiological Ecology of Microalgae. Algal Cult. Tech. , 287-326 (2005).
  9. Blaise, C., Vasseur, P. Algal microplate toxicity test. Small-scale Freshw. Toxic. Investig. Vol. 1 Toxic. Test Methods. , 137-179 (2005).
  10. Skjelbred, B., Edvardsen, B., Andersen, T. A high-throughput method for measuring growth and loss rates in microalgal cultures. J. Appl. Phycol. 24, 1589-1599 (2012).
  11. Nagai, T., Taya, K., Annoh, H., Ishihara, S. Application of a fluorometric microplate algal toxicity assay for riverine periphytic algal species. Ecotoxicol. Environ. Saf. 94, 37-44 (2013).
  12. Seyedsayamdost, M. R., Case, R. J., Kolter, R., Clardy, J. The Jekyll-and-Hyde chemistry of Phaeobacter gallaeciensis. Nat. Chem. 3 (4), 331-335 (2011).
  13. Schreiber, U., Schliwa, U., Bilger, W. Continuous recording of photochemical and non-photochemical chlorophyll fluorescence quenching with a new type of modulation fluorometer. Photosynth. Res. 10 (1-2), 51-62 (1986).
  14. Jones, R. J., Ward, S., Amri, A. Y., Hoegh-Guldber, O. Changes in quantum efficiency of photosystem II of symbiotic dinoflagellates of corals after heat stress, and of bleached corals sampled after the 1998 Great Barrier Reef mass bleaching event. Mar. Freshw. Res. 51 (345), 659-668 (1998).
  15. Beer, S., Larsson, C., Poryan, O., Axelsson, L. Photosynthetic rates of Ulva (Chlorophyta) measured by pulse amplitude modulated fluorometry. Eur. J. Phycol. 35 (1), 69-74 (2000).
  16. WATER-PAM Chlorophyll Fluorometer. Instrument Description and Information for Users. , Heinz Walz GmbH. Germany. Available at: http://www.walz.com/downloads/manuals/water-pam/waterp3e.pdf (2013).
  17. Maxwell, K., Johnson, G. M., Heers, J. Chlorophyll fluorescence--a practical guide. J. Exp. Bot. 51 (345), 659-668 (2000).
  18. Herigstad, B., Hamilton, M., Heersink, J. How to optimize the drop plate method for enumerating bacteria. J. Microbiol. Methods. 44 (2), Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11165341 121-129 (2001).
  19. Kooten, O., Snel, J. The use of chlorophyll fluorescence nomenclature in plant stress physiology. Photosynth. Res. 25 (3), Available at: http://www.springerlink.com/index/r3689k5w72782r50.pdf 147-150 (1990).
  20. Maxwell, K., Johnson, G. N. Chlorophyll fluorescence--a practical guide. J. Exp. Bot. 51 (345), 659-668 (2000).
  21. Schreiber, U. Pulse-Amplitude-Modulation (PAM) Fluorometry and Saturation Pulse Method: An Overview. Chlorophyll a Fluoresc. A Signat. Photosynth. , 279-319 (2004).
  22. Roháček, K., Barták, M. Technique of the modulated chlorophyll fluorescence: basic concepts, useful parameters, and some applications. Photosynthetica. 37 (3), 339-363 (1999).
  23. Da Silva, J. M., da Silva, A. B., Pádua, M. Modulated chlorophyll a fluorescence: a tool for teaching photosynthesis. J. Biol. Educ. 41 (4), 178-183 (2007).
  24. Vieira, S., Ribeiro, L., Jesus, B., Cartaxana, P., da Silva, J. M. Photosynthesis assessment in microphytobenthos using conventional and imaging pulse amplitude modulation fluorometry. Photochem. Photobiol. 89 (1), 97-102 (2013).

Tags

מדעי סביבה גיליון 97 הפיטופלנקטון microalgae התרבות משותפת חיידקים במים Pulse-Amplitude-אופנן fluorometry (WATER-PAM) תשואת פוטוסינתזה כלורופיל assay צלחת microtiter המבדק תפוקה גבוהה
מבדק נפח קטן להערכה בקטריאלי / הפיטופלנקטון Co-תרבות שימוש במים-Pulse-Amplitude-אופנן (WATER-PAM) Fluorometry
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bramucci, A. R., Labeeuw, L.,… More

Bramucci, A. R., Labeeuw, L., Mayers, T. J., Saby, J. A., Case, R. J. A Small Volume Bioassay to Assess Bacterial/Phytoplankton Co-culture Using WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) Fluorometry. J. Vis. Exp. (97), e52455, doi:10.3791/52455 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter