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水 - パルス振幅変調(WATER-PAM)蛍光測定を用いて細菌/植物プランクトンの共培養を評価するために小音量バイオアッセイ

Published: March 11, 2015 doi: 10.3791/52455

Abstract

培養物は、実験1-7を通してサブサンプリングすることができるように、微細藻類の実験操作のための従来の方法は、培養物の大量の(5 L 20 ml)を使用している。 1)それは、全体積の変化および表面積を引き起こす:大量のサブサンプリングは、いくつかの理由で問題となることが実験中の培養物の体積比; 2)疑似レプリケーション( すなわち、同じ治療フラスコ8からサ ​​ンプルを複製する)は、多くの場合、むしろ真の複製(複製処理からのすなわち、サンプリング)も採用されている。 3)実験の期間は、総容量によって制限されます。汚染は、一般的にサブサンプリング中に起こるような、4)純粋培養または通常の細菌叢は、長期間の実験の間に維持することが困難である。

マイクロタイタープレートの使用は、内、最大48の別々の治療法を用いて1ml培養毎に使用するボリュームの複製を可能に12.65 X 8.5×2.2センチプレート、それによって実験的なボリュームを減少させ、任意の治療をサブサンプリングすることなく、大規模な複製を可能にする。 9-11をスクリーニングする細菌藻類共培養物、藻類生理学テスト、および毒素:さらに、この技術は、実験を含む種々の型式に適合するように修正することができる。水 - パルス振幅変調(WATER-PAM)蛍光法、顕微鏡検査、細菌のコロニー形成単位(CFU):藻類、細菌および/または共培養は、数々の実験手順のためにサンプリングしたが、これに限定されないことができますと、個々のウェルカウントおよびフローサイトメトリー。マイクロタイタープレート形式とWATER-PAMの蛍光測定の組み合わせは、光化学収率および試料間の低い変動性を有する他の光化学的パラメータの複数の迅速な測定を可能にし、高い再現性実験の過程でカーボイまたは三角フラスコをサブサンプリングの多くの落とし穴を回避する。

Introduction

植物プランクトンの生理機能は、伝統的に三角フラスコ中で20ミリリットルからカーボイ1-7 ​​で5 Lの範囲のメソスケールの実験で研究されている。各時点で複製試料を犠牲にすることは手に負えない実験装置を作成し、この実験的なスケールは、実験的な監視のためのサブサンプリングが必要です。

藻類の生理学実験のための実験容積を小型化することによって、同じ日周インキュベータ·スペースを使用しながら独立した実験の数を増加させる能力は、大量のサンプリング擬似複製の制限を軽減または排除する。マイクロタイタープレート形式は、実験変数の条件で藻類を操作するための1ml培養体積を使用して、藻類のバイオアッセイのために開発された。この実験小容積が増加する反復の数を可能に起因複製試料との間の減少した変動性、実験の再現性を増加させる実験、および140日間( 2)12のための実験対照( すなわち、純粋藻類培養液)を維持しながら、真の複製を可能にする。

このマイクロタイタープレート形式で容易のような実験的な質問、各種のために適合される:細菌は、その藻類ホストと、共生中性または病原性の相互作用がありますか?藻類への化合物の刺激の追加や毒性はありますか?これらおよび他の問題は、この新しい形式9-11を用いた迅速なハイスループットの方法で対処することができる。

48ウェルマイクロタイター培養プレートに1mlずつウェル単一の時点でサンプリングされる独立した実験設定にすることができる。各種パラメータを含め、この1ミリリットルボリュームからサ ​​ンプリングしたが、これらに限定されないことができます:水-パルス振幅変調(WATER-PAM)蛍光法( 材料および機器の表を参照)1を用いたクロロフィル蛍光及び光化学パラメータ3。WATER-PAMの蛍光測定は、藻類13で行われた実験を監視するために使用することができる迅速かつ非侵襲的な技術である。 14,15(WATER-PAMのために4mlの容量- - 2培地で希釈した培養液300μl150)それは小さな培養液量から光合成効率とPSII健康の測定を可能にする。 WATER-PAMの蛍光測定に加えて、この設定を含む他の様々なパラメータを測定するために用いることができるが、これらに限定されない:藻類細胞および藻類細胞形態の変化に付着した細菌を可視化する顕微鏡。単位(CFU)のカウントを形成する細菌のコロニー。と藻類の細胞数と識別する亜集団のためにフローサイトメトリー。

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Protocol

実験のセットアップの1の計算

  1. 藻類および/または式(1)を用いて全実験に必要とされる制御に必要な細菌培養物の体積を計算する。
    式1
    yは日ごとに必要なコントロールの数に等しく、zは日数に等しい。
  2. 式2を使用して、実験の共培養のために必要とされる藻類および/または細菌培養物の体積を計算する。
    式2
    注:これは、任意の化合物画面で「共培養」実験を置換することが可能である。ただ実験計画に合わせて、最終的な化合物、溶媒及び藻類の濃度を調整します。
  3. 早期指数藻類培養物の最終体積を計算するために式1および式2を使用して(一般的に5日〜10 4細胞/ mlで、これはperformiによって決定されるべきである(このボリュームは、式3を用いて、ステップ2.3)に必要とされる実験に必要ngの藻類の成長曲線)
    式3
  4. 式4を使用して(このボリュームはステップ4.2に必要とされる)は、実験に必要な10 4 cfu / mlで細菌培養物(または所望の接種濃度)の最終体積を計算する式1および2を使用します。
    式4
    注:0 D上のエラーと実行され、任意の試験( 例えば、水-PAM、フローサイトメトリー、顕微鏡などペッティングを考慮するためのステップ1.3と1.4で追加の10ミリリットルを使用してください。実験計画に合わせて、必要に応じてこのボリュームを大きくします。
    注:8日間の実験の計算例では、セクション10を参照してくださいメディアのレシピのための補助的な表を参照してください。

実験のセットアップ2.成長する藻

  1. 隔離または入手積極的に純粋藻類培養物を増殖させる。
  2. 無菌的に滅菌した藻類の培地への藻類培養の最終容量の移転10%( 例えば、L1または類似の海藻媒体は、材料および装置の表を参照)、1の確保:新鮮な培地で藻類培養の9希釈。 (:8時間の明:暗サイクルが一般的に使用されている16 例、18℃)、その歪みのために先に決定成長条件を使用して、日中のインキュベーター中で希釈された藻を育てる。
  3. 藻類の最終体積であることが9希釈:文化が初期指数期、再培養に到達したとき、同じ無菌藻類の培地中の藻類( 例えば、L1または類似の海洋藻類の培地)を、最終濃度が1であることを確認V A計算し(ステップ1.3)に等しい。
    注:これらの培養物は無菌であることを確認することが重要です。すべての藻類メディアや汚染の藻類の株式ボトルは、一般的な海洋細菌培地( 例えば、海洋上に20μlのアリコートをメッキすることにより、テスト培養液2216を1.5%寒天または同様のもの)を補充した。
  4. 初期指数期(〜10 4細胞/ ml)に藻類培養を成長させる。
    注:すべての藻類株は、培養条件に応じてユニークな成長曲線を有する。初期対数期(約10 4細胞/ ml)(フローサイトメトリーまたは顕微鏡メトリを用いて、すなわち)細胞密度に基づいて、藻類の成長曲線を実行することによって決定することができる。

3.接種のために細菌細胞を準備する

  1. (選択された細菌の培地および増殖条件で増殖曲線を実行して、定常期の細菌の細菌濃度(cfu / mlで)および光学密度(OD)を予め決定し、例えば、25℃、160 rpmで2216マリンブロス、 )または同様。細胞(ステップ3.3)を成長させるために、この情報を使用して、後のステップ3.7で正しく細胞を希釈する。
  2. 無菌的にしなやかな、1.5%寒天プレート( 例えば、マリンブロス2216から分離し、新たに増殖させた細菌コロニーを転送( 例えば、マリンブロス2216または類似の海洋細菌培地)細菌の液体培地5mlに)は、1.5%寒天または類似の海洋細菌の固形培地でmented。
  3. ( - 細菌に応じて、36時間〜12)ローリングドラムやシェーカー上固定相への細菌を育てる。藻細胞が初期対数期(約10 4細胞/ ml)に達していると同時に- (10 9 cfu / mlで約10 8)細菌が定常期に達するように実験を計画する。
  4. ピペットを用いて、培地中に試験管に添付されたバイオフィルムをダウン洗う。無菌の1.5ミリリットルマイクロチューブにピペットでよく混合細菌培養の1ミリリットル。 14000×gで1分間遠心。
  5. (細菌細胞)を取り外し、ペレットを中断することなく、上清(細菌メディア)を処分する。 (ペレットとの)マイクロチューブに無菌の藻類の媒体( 例えば、L1または類似の)の1ミリリットルを追加します。藻類のメディアでペレットを再懸濁するための渦マイクロチューブ。
  6. 二回目の洗浄:ステップ3.5を繰り返します。
    注:これはの栄養組成を変えることができるようにそれは完全に前に彼らと藻類を接種した細胞からの細菌メディア、細胞残骸、排泄タンパク質および小分子のすべてを除去するために、藻類のメディアと細菌の細胞を洗浄することが重要です藻類メディアまたは画面に生物活性分子を導入。
  7. 直列に所望の最終細菌濃度(cfu / mlで)よりも100倍以上濃縮され、最終濃度を、藻類の培地中で洗浄し、細菌細胞を希釈する。ステップ4.2のための藻類の培地で洗浄し、希釈された細胞を含むマイクロチューブを保存します。
    注:0 D上の細菌に藻の1:1の比率を有することに基づいて実験を計画します。ステップ3.7において、初期セルを直列に10 6 cfuの/ mlに希釈すべきであるので、これを行うために、実験のための所望の初期細菌濃度は、10 4のcfu / mlである。

実験4.準備細菌アルのセットアップ

  1. 4無菌のオートクレーブ処理ガラス三角フラスコを用意し、それらをレーベル:A) '藻類の制御フラスコ'、B ')希釈した細菌株のフラスコ'、C ')細菌の対照フラスコ」と、d)「共培養フラスコを」。
  2. から細菌懸濁液を希釈 最終容量= V B(ステップ1.4)に無菌の藻類のメディアと3.7 1:99ステップ。フラスコラベル希釈した細菌株(ステップ4.1)で希釈してください。
    注:前の例(ステップ4.2)では、この1:99希釈は10 4のcfu / mlの最終濃度を与える。スワールフラスコの細胞を混合する。
  3. 希釈した細菌株からピペットV 制御 (ステップ1.1)と細菌の対照フラスコに入れて。
  4. 細菌のコントロールフラスコに無菌の藻類媒体のピペットV コントロール (これは1:1で希釈)。スワールフラスコは、細胞をミックスし、ステップ7.3のために確保されている。
  5. 希釈した細菌株からピペットV 共培養ステップ6.1用に確保フラスコを設定し、共培養フラスコにフラスコ。
    注:一度に同じ藻類で複数の共培養を行う場合には、個別に各菌株のためのV 共培養を再計算し、ステップを繰り返す必要がある( すなわち、2つの異なる細菌の共培養は、一つの制御と分離株)個別にそれぞれの共培養のために4.5。これは、式5に示される両方の共培養物を含むように、ステップ1.3で算出したV Aを増加させることも必要である。
    式5

実験のセットアップのための藻類の準備5.

  1. 細胞が十分に混合表示されるまで、静かに広口ピペットチップで(ステップ2.4​​から)早期指数関数藻類文化をミックス。
  2. 藻類の対照フラスコに藻類株式ボトルからピペットV コントロール 。穏やかを10mlピペットを用いてピペット。その後、日周インキュベーター内藻類株式ボトルを返す。
  3. ピペットV CONT藻類の対照フラスコに滅菌藻類媒体のROL(これは1:1で希釈)。ステップ7.4に必要とされるまで、昼行性インキュベーターにフラスコと場所を混合する渦巻。

6.準備実験の共培養

  1. ステップ4.5からの細菌の共培養フラスコに藻類の株式フラスコから静かにピペットV 共培養 。ステップ7.5のために必要となるまで昼行インキュベーターに共培養フラスコを返します。
    注:細菌のコントロール中の細菌の濃度は、実験的な共培養中の細菌濃度を同じにする必要があります。同様に、藻類の制御における藻類の濃度は、実験的な共培養で藻類の濃度を同じにする必要があります。同じ初期の細菌と藻類の濃度を有することで、人口密度は、実験を通して比較することができる。

7.マイクロタイタープレートのセットアップ

  1. 図1に従って、滅菌48ウェルマイクロタイタープレートを分割する。滅菌希釈剤または非光合成サンプルのいずれかを含む外側のウェルの上にラベルを付けます。
    注意:プレートのウェルのランダム化は同じ日に採取された試料に対して行うことができる。例えば、第1象限の実験で1からdでサンプリングされる。 4及びC2 - - 図1に示すように滅菌溶液で満たされたプレートの外周を残す4.ランダム化されるべきであるウェルがB2である。

図1
以下ように48ウェルマイクロタイタープレートのウェル中の試料の配置図1略図が満たされるべきである:カラム1及び図6に示すように、A〜Fのウェル( サークル1 )を1mlの1×PBS(または他の滅菌溶液/媒体)で充填される。列AとF、井戸2から8( サークル2 )を1mlの細菌の制御が充填されている。 ROWS BとE、ウェル2から8( サークル3 )を1mlの藻類の制御が充填されている。行CとD、ウェル2から8( サークル4 )を1mlの共培養で満たされる。図4に示すように、これは、プレート全体に無作為化し、それに応じてラベル付けされるべき - プレートを4象限(A2、A5、D2およびD5)、これらの象限1は、各特定のサンプリング日数である分割されている。毎日の中で、我々は(藻類の制御をランダムに助言サークル5 )と共培養( サークル6乱数発生器を使用して)をウェル。藻類培養液のシェーディングを防止するために、1×PBSおよび/または細菌の対照ウェルの上に蓋にラベルを付けます。

  1. ピペット1ミリリットル1×リン酸緩衝溶液(PBS、pH7.4)で、または図1に示されるように、適切なウェル内の他の滅菌溶液をゆっくりと慎重にこれを実行する。 PBS意志ちゃんGE藻類および/または共培養培地のイオン強度は、他のウェルはとても慎重に扱うに跳ねている場合。
  2. ピペットでウェルに細菌の対照培養の1ミリリットル( 図1)は、細菌コントロールのラベル。細菌の沈降を避けるために、各プレートをピペット前に、細菌のフラスコを旋回。
  3. ピペットウェルに藻類コントロール培養物1mlを広口ピペットチップ( 図1)を用いて藻類の制御を標識。として定期的に細菌のフラスコなどの藻類のフラスコを旋回。藻は、シンクまたはフロートする傾向があれば、視覚的に均一な文化を維持するために必要とされると定期的に渦巻く。
  4. 広口ピペットチップ、ピペット適切なウェルにおける共培養物1ml( 図1)を使用して。として定期的に藻類フラスコのような共培養フラスコを旋回。
  5. 所望の温度と日周光周期で日中のインキュベーター中でパラフィルムと場所との各プレートをシール(:8時間の明:16と18℃の暗サイクルが一般的に使用されている)。去る取る準備ができて、PAMの測定値(セクション8)まで、昼行性インキュベーターでプレート。確実にすべてのプレートは、一貫した露光を可能にするために同じ方向に配向されている。
  6. PBS、藻類メディア、藻類ストックと藻類のコントロールから20μlのアリコートを取り、適切な非選択培地上にプレートをドロップ( 例えば、1.5%寒天を補足したマリンブロス2216)と18でプレートをインキュベート- 72、25℃汚染をテストするための時間。成長が細菌を含むべきではないソリューションのいずれかに表示されている場合は、これらのデータは使用すべきではありません。
  7. 読んで実験的な0のDのPAM蛍光測定(ステップ8.1を参照)藻類の制御と共培養フラスコから残りのサンプルを使用してPAM蛍光光度測定値を取る。他0 dの測定も、残りの藻類の制御、細菌の制御および共培養サンプルを用いて実施されるべきである。

株価のサンプルからPAM蛍光測定読み取りを行う8.

  1. ゼロWATER-PAM測定値8をとる前に、きれいなキュベット中の滅菌藻類のメディアと。
  2. 実験に使用したのと同じ藻類培地の2.7ミリリットルを含むクリーンなキュベットに藻類の制御または共培養フラスコからピペット300μL。広口ピペットチップで穏やかにサンプルおよび希釈剤を混ぜる。
  3. 拭き取り組織とキュベットの外側からすべての指紋をWATER-PAMにキュベットを配置する前に。
  4. WATER-PAMにキュベットを置きます。キャップでサンプルをカバーし、3分間暗適応させるためにそれを許可。暗順応時間は、藻類の種に依存して変化し、実験に使用される特定の藻類のために決定されなければならない。藻類の日周インキュベータ16,17の暗サイクルの途中で水-PAMの読みを取ることによって長い暗順応時間(> 20分)は避けてください。
  5. 暗い適応した後、F 0ボタンを押してください。藻類培地中に1:蛍光測定値が3900を超えている場合は、サンプル1を希釈。さらに3分であり、徳のためにダーク適応させるEA新しい読書。 F 0とF m個の測定値が3,900未満になるまで、藻類の培地中で1:F 0またはF Mの測定値が3,900を超える残っている場合は、サンプル1を希釈するために続ける。
    注:最終蛍光を記録するときにこれらの希釈を考慮してください:藻類のサンプルが1に希釈されている場合、インスタンスのために:ウェルから希釈用チューブへの初期転送中に9を、その後500の藻類の蛍光読み取り、逆を掛けする必要があります(この場合は10)に希釈係数を、チューブの実際の蛍光はその後5000である。
  6. F 0を設定した後、F mの測定値取るためにSATボタンを押すことで、すべての90秒を読んで飽和パルス(SAT-パルス)を取る。読みの間の時間間隔は、藻類株に応じて調整することができる。サンプルを捨てる。
  7. 残りのサンプル8.6 - を繰り返して、8.1を繰り返します。

マイクロタイタープレートからPAM蛍光測定読み取りを行う9.

  1. ラベル藻類コントロールウェルC2のための4 - -井戸B2のために> 3ミリリットルの体積の6無菌のサンプル管細菌の共培養のために4( 図1のプレートレイアウトを参照)。
  2. 小分けした各チューブに無菌の藻類培地の2.7ミリリットル。
  3. 場所管昼間インキュベーターで、それらを藻類を30分間成長させた温度に順応することを可能にする。
  4. インキュベーターからマイクロタイタープレートを取り外す前に暗い順応させたウェル内への光の侵入がアルミ箔(または類似の)でプレートを覆うことによって制限されて積極的に希釈管に井戸から文化を転送しながら、唯一の箔を削除することを確認してください(9.5ステップ - 9.7)。
  5. 無菌的にゆっくりとピペッティングして広口ピペットチップとよく最初のマイクロタイタープレート(ウェルB2)を混ぜる。
  6. (広口ピペットチップで、それに対応するサンプルチューブに300μlのよくB2( 図1)からのインキュベーターと無菌的に転送から希釈管を入手藻類培地中のサンプル)の9倍希釈これは1です。
  7. 残りのウェル9.6(B3,4とC2 - - 4)を繰り返して、9.5を繰り返します。
  8. アルミホイルでサンプルチューブをカバーし、水-PAMの準備ができるまで、昼行性インキュベーターに戻す。
  9. 8.7 - 手順8.1で説明したようにWATER-PAMの読み取りを実行します。インキュベーターに戻す前に、パラフィルムでマイクロタイタープレートをシール。
  10. 実験期間中に予定された時間間隔で測定値を繰り返します。サンプリングの頻度および長さは、実験開始時に計画されるべきである。

10.サンプル実験

サンプル実験は、細菌(Phaeobacterのgallaeciensisの BS107)の10日間共培養し、微細藻類(Emiliania石藻株 (CCMP3266))である。それは藻類の制御、細菌の制御、および細菌藻類実験的な共培養が含まれています。

  1. 1ステップ(必要な細菌や藻類の株のボリュームを計算します。1から1.4)
    式10
  2. 36ミリリットル培地で藻類4mlを接種することによって、藻類の株、40ミリリットルのV Aを調製し、初期の指数増殖が約10 4細胞/ ml(2.1ステップ- 2.4)の細胞密度に達するまで、インキュベートした。
  3. (細菌の最終濃度は10 4 cfu / mlでなります)藻類のメディアとの40ミリリットルのV Bに3章で得られた10 6 CFU / mlの細菌400μlの希釈することにより、細菌の株式フラスコを準備します。
  4. 細菌のコントロールフラスコに細菌の株式の半分(20ミリリットル)を転送し、細菌制御を行うために、藻類のメディアの20ミリリットルを追加します。藻類の制御フラスコに半分(20ミリリットル)藻類の株式を移し、藻類制御(第5節)を補うために藻類のメディアの20ミリリットルを追加します。共培養を確立するために、共培養フラスコに細菌の株式の残りの20ミリリットルを移し、藻類株式の残りの20ミリリットルと混合(セクション6)。
  5. 2つの事前標識したマイクロタイタープレート( 図1)は 、ウェルあたり1mlの1×PBS(pH7.4)で、コントロール、および共培養をピペット。 0 D測定(CFUカウント、WATER-PAM(8節)、藻類の細胞形態の顕微鏡観察、フローサイトメトリーのための藻類の細胞固定)を作るために、残りのコントロールと共培養の3ミリリットルを使用してください。
  6. 10日間一日一回藻類の制御と共培養のための水-PAMの読みを取り、常に0のD測定が行われたのと同じ時間(セクション8)で。

関心のある11。その他のパラメータ

  1. 細菌のCFU濃度を決定します。無菌1X PBS(または類似の)中の細菌コントロールと共培養の段階希釈を行い、その後、1.5%寒天(ま​​たは類似の)を補充したマリンブ​​ロス2216上でプレートをドロップし、成長のcfuの数を観察する各ウェル18のための細菌のcfu / mlに決定する。
  2. 藻類の細胞濃度を評価するには、次の藻類の制御と協調を修正グルタルアルデヒドの0.15%の最終濃度の文化。暗い、その後フラッシュ液体窒素で凍結し、-80℃で保存し、10分間インキュベートする。プロセスフローサイトメーター(FACSキャリバーまたは類似の)上のすべてのサンプルは、藻類の細胞をカウントする。
  3. 藻類培養および顕微鏡( すなわち、光学顕微鏡、エピ蛍光、または類似した)を用いて細菌·藻類共培養:藻類細胞の形態を観察します。

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Representative Results

WATER-PAMの蛍光定量法の測定値。

水 - パルス振幅変調(PAM)蛍光光度法、蛍光(クロロフィル含量のプロキシ)と藻類の文化の光合成収率(PSII健康)を決定するための迅速かつ効率的な方法である。 PAM WinControlソフトウェアは、(以下では暗順応藻類のサンプルのための基本的なパラメータである)のための生データ値のスプレッドシートを生成します。

F暗順応細胞の0 =蛍光

F = mの最大蛍光発光ダイオードを飽和した後(LED)パルス

暗順応サンプル19のFのV / f M =(F mの -F 0)/ F mは =潜在的な量子収率

PAMの蛍光測定は、多くの用途があり、Alの光化学と健康に関する多くの情報を与えることができますGAE。また、光に適合サンプルをテストする際に重要な他のパラメータがある。さらにこれらを読み取るためのこれらのレビュー13,16,20-23で詳しく説明します。 (F vを/ F mは 、2および図3)、これらのデータは、最初の藻類の蛍光(F 0)、最大藻類蛍光(F mの )、および潜在的な量子収率のグラフを生成するために、スプレッドシートまたはグラフ作成ソフトウェアに転送することができ。藻類蛍光およびF vを/ F mは単独で成長させた藻類(対照)と比較することにより、細菌に影響されるかを、図3のグラフは、描写が10日間共培養実験を通して共培養における細菌で成長されることに( 図3C)。この例では、2標本t検定を統計的にそれぞれの日に2つの治療間でパラメータを比較した。同様に、実験のためつ以上の治療法は、ANOVA存在する可能性使用することができる。飽和がプライマリPSII電子アクセプタQAが完全に低減され、PSII反応中心P680からのより多くの電子を受け入れることができない、そのように、すべての反応中心'がされることを意味し、パルスをLEDの後( 図3B)を読み出すF mが直接取得され「17を閉じた。これは、最大蛍光発光をもたらし、光エネルギーの光化学的使用を妨げる。これは、最大蛍光(F mの )読みを提供します。共培養細菌を持つだけでは成長している(対照)と比較すると、 図3Cは 5日と10 Dとの間のPSII健康の劇的な減少を示している。標準誤差バーは、同一の親細菌と藻類の培養物からの独立した実験である三連マイクロタイターウェルに由来する。それは独立した実験をREPLIとして使用することを可能にするように一貫して小さい標準誤差は、藻類バイオアッセイのためにマイクロタイタープレート形式の堅牢性と再現性を確認するケイツと実験期間にわたって実験単位をサブサンプリングする必要がなくなります。

図2
図2の代表WATER-PAMは、無菌Emilianiaの円石 (CCMP3266)の140 dの成長曲線のグラフを蛍光測定初期藻類蛍光(F 0)(A)の読み、(B)最大藻類蛍光(F mの )、及び( E.C)潜在的な量子収率(FのV / FのM) 円石黒丸として示されている。最高のF 0のためのフィット感とF mのラインは、それぞれ通常のログ3パラメータ(SigmaPlotの)R 2 = 0.94、0.95であった。潜在的な量子収率(F vは / F m)は、のように計算される光合成健康、無次元表現である(F mは - F 0)/ F mを。 FのV / F mの曲線のベストフィットのラインが3倍多項式R 2 = 0.6であった。エラーバーは、3回のウェル間の標準誤差を表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
Phaeobacter gallaeciensis BS107とEmiliania石藻 (CCMP3266)の10日間共培養実験の図3.代表WATER-PAMの蛍光測定グラフ。(A)初期藻類蛍光(F 0)、(B)最大藻類蛍光(FのM) 、及び(C)潜在的な量子収率(F vを/ F mは )CONTROためにグラフ化されているリットルの藻類(白丸)および藻類、細菌(黒丸)と共培養した。潜在的な量子収率(F vを/ F m)はのように計算される光合成健康、無次元表現である(F mは - F 0)/ F mの 。エラーバーは、3回のウェル間の標準誤差を表す。アスタリスク(*)は、コントロールと共培養の治療のためのパラメータが有意に異なっている日を意味する。すべての日のための治療法との違いは、3つのすべてのパラメータで10 D(10 Dを除く非有意であった- F 0:、DF = 2.5、T-比= -15、P = 0.0017 t検定*; FのM:T-テスト、DF = 2.1、T-比= -16.15、P = 0.003 *; FのV / f M:t検定、DF = -18.68、T-比= 2.0、P = 0.0028 *)。 見るにはこちらをクリックしてくださいこの図の拡大版。

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Discussion

小型化された形式での藻類の成長。

マイクロタイタープレート中の1ml培養体積に藻類培養物の微細化が増加する実験内での複製を可能にする。それは藻が実験を通して、健康であることを確認することが重要です。藻類の栄養要件が満たされていることを確認するために、様々な藻類メディアを評価するために、マイクロタイタープレートフォーマットを用いて、増殖曲線( 図2)を実行する。さらに、それは概日周期(明暗周期)と温度を最適化することが重要である。特定の藻類のための適切な最適化は、26日間から140日間( 図2)の後に潜在的な量子収率を検出するためのピーク蛍光における健全な藻類培養の維持を可能にすることができる。

蒸発の影響を最小限に抑える。

これは、「エッジ効果」のような液体ベースアッセイの蒸発の影響を最小限に抑えることが重要であるO、一般的であるbserved板の中央に向かって位置するウェル内のよりマイクロタイタープレートの縁部におけるウェル中より蒸発がある。蒸発は、プレートの縁で観察されたが、蒸発速度は、この形式で維持された26をd( 図2)でのピーク蛍光を、健康な藻類培養の実験の持続時間を限定するものではない。潜在的な「エッジ効果」を最小化するために、1×PBS(pH7.4)で、または他の滅菌溶液は、すべての4つの辺(列A及びH、行1および6、 図1)に沿ってウェルに分注する。

昼間のインキュベーター内の照明。

マイクロタイタープレートは、全ての昼行インキュベーターで同じ方向を持っている必要があります。例えば、インキュベーター中でマイクロタイタープレートの長手方向の配向は、プレートが短軸に沿って配置されることを意味する。この配向が使用される場合、長軸に沿ってBG藻類培養物( 図1)は、経験豊富できによる光源からの距離の変化にEaはわずかな光および温度勾配(電球の光と熱の両方の源である)。これは、その温度範囲の極限での藻類の温度アッセイに影響を与えることが観察されている。したがって、これは、それらの最適な温度で成長最も藻類に影響を与える可能性は低い。大きなボトルライトから一貫した距離で、場所プレートシェーディングを作成していないことを保証するこの光や温度勾配の影響を最小限に抑えるために、必要に応じて光のレベルを低減し、長軸を横切って光の強度をチェックするために遮光布を使用それは均等に移動することを確実にする日周インキュベーター。

WATER-PAMの蛍光測定のための藻類サンプルの暗順応。

導WATER-PAMは、PSII反応中心が完全に開いていて、光誘起transthylakoidal pH勾配が完全に、目を放散するように藻類サンプルを適応暗に重要であるの読みの前に我々は、F vを/ F mを計算するための真のF oとF mの値を与える。 =暗サイクル、2時間のサンプリング·セッションがT(暗いから実行されるであろう):8時間の明:( すなわち、16のための概日周期の暗期の途中で水-PAM測定するためのアッセイから藻類のサンプリング3 -暗順応が長い9時間)(> 20分)17 - = 7 - (光周期(T(光の真ん中に比べ5分)3)5時間)は、暗順応時間は短くなります。藻の暗適応時間も藻類種、成長条件とは、その自然生息域の光の状態に依存して変化する。

WATER-PAMの蛍光定量測定値の感度。

WATER-PAMは、海洋表層水16などの低クロロフィル試料からF、F 0とF mを検出することができる超高感度蛍光測定できるように設計した。結果的にそれが理想的にminiatuに適していますサンプルは希釈することができるバイオアッセイを、有。この感度のためには、WATER-PAM機は蛍光測定値の上限( すなわち、F、F 0およびF mの )試料が十分に希釈されていない場合( 図4)を有していることを理解することが重要である。 WinControlソフトウェア内の最大値は、F 0を押すと(直接暗順応後に)F 0を読んだ後、最初に顕著である。その結果、FとF mが最大値4056( 図4、なし。2286)である。 FとF mの最大値は、WATER-PAMを較正するために使用される藻類の培地の種類に依存するが、試料が十分に希釈されるまで、同じ最大値を有する繰り返し読みが発生するので、検出限界を超える試料を容易に識別することができる。 1後:藻類の培地中の1希釈、低濃度試料は再び暗順応であり、F 0の測定を繰り返した。 F値α正しく測定するppearsが、F mがまだ最大値を読み取っている4056( 図4、番号2287)。 (。2288 図4、なし):このサンプルは、再び1に希釈した別のF 0読みをとる前に、もう一度、暗い追加の3分間に適応藻類のメディアでの1を、有効な測定値が得られたので、次の測定(F)がとられ、 FのV / F mの計算が有効です。 F mとF 0の計算に考慮される必要がある媒体1の比、この例では、サンプルは、1回希釈した。これは、サンプルがあまりに光合成健康の次元の表現であるにもかかわらず、濃縮されている場合、ダイレクトF 0との関数F mとF vを/ F mは 、誤って計算されることに留意することが重要である。

図4
いくつかのWATER-PAMの図4. WinControl表示を順次正しい希釈を達成するために希釈された藻類の試料の測定値を蛍光測定。この図は、WATER-PAM機械(赤いボックス)の上限に達した藻類の蛍光測定値を表示し、あるものサンプルの適切な希釈は、(グリーンボックス)を実現しています。 (13,16,20-22レビューを参照)を加えて、この数字は、このメソッドは計算していることを他の変数のいくつか示しているが、これらは、ここで詳細に議論されていません。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

細菌汚染。

すべての藻類の実験において、藻類コントロールは藻類の健康のベースラインとして必要であるので、それは、実験を通して、細菌汚染のないままであることが必須である。何があるので、細菌汚染が発生しやすくなるん(抗生物質など)の選択と光合成は常に細菌の成長のための新たな有機炭素を生成します。汚染を避けるために最も重要な二つの方法は、全ての溶液をマイクロタイタープレートの処理中( 例えば、藻類のメディアは、1×PBS、pH7.4)を、実験のT = 0 dの機器や、無菌技術を維持するための無菌性を確保することである。実験はすべて藻類対照ウェルから20μlのアリコートをプレーティングすることにより、各時点での汚染を監視する必要があります。汚染は藻類の対照ウェルのいずれかから観察される場合、それらのWATER-PAMの蛍光測定読み取り値を記録し、データ分析から除外されるべきである。実験を設定するために使用されるソリューションは、実験全体が汚染されます場合は、実験し、すべての汚染された試薬を破棄し、再起動してください。細菌のコントロールや細菌藻類共培養も汚染さになることができますし、細菌CFUカウントに使用した寒天プレートは別のコロニーモルフォリンのために監視する必要がありますそのまま流用。ウェル間のマイクロタイタープレートの蓋を除去する際の交差汚染が発生する可能性があるが、簡単にチルトまたはプレートの揺れと、層流フード中または火炎の近くに無菌技術を使用しないことによって回避される。

将来のアプリケーション。

この小容量バイオアッセイWATER-PAMの蛍光測定マイクロタイタープレート形式を組み合わせることによって、微細藻類のための迅速なスクリーニング方法を提供する。将来の用途の例は、様々であり、それは、個々のセル24にPAMの蛍光測定を行うように、集団内のPSII健康の細胞間の変動への洞察を提供するイメージングPAMの蛍光測定を、含むことができる。バイオアッセイはまた、顕微鏡と組み合わせることと、前述のようにフローサイトメトリーができる。さらなる洞察を提供する可能性のある別の組み合わせは、フローサイトメトリーおよび藻類培養の亜集団内の形態学的変化を明らかにする顕微鏡用細胞染色である。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 cu. ft. Diurnal incubator (6012-1) Caron Corporate 112310-6012-1-11 www.caronproducts.com
Nunc EasYFlask 25 cm2, Vent/Close Cap, 7 ml working volume, 200/cs Thermo Fisher Scientific N156340 www.fishersci.ca
Multiwell TC Plates – 48-well BD Biosciences Discovery Labware 353078 www.bdbiosciences.com
P1000 Gilson The Pipetting Standard—Gilson's Pipetman Mandel Scientific Company Inc. GF-F123602 www.mandel.ca
P10mL Gilson The Pipetting Standard—Gilson's Pipetman Mandel Scientific Company Inc. GF-F161201 www.mandel.ca
Wide Orifice Tips nonsterile [100–1,250 µl] VWR International 89079-468 www.ca.vwr.com
Ultrafine Tips nonsterile [100–1,250 µl] VWR International 89079-470 www.ca.vwr.com
Finntip 10 ml [Vol: 1 - 10 ml] Thermo Fisher Scientific 9402151 www.fishersci.ca
WATER-Pulse Amplitude Modulation (Water-ED) Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Germany EDEE0232 www.walz.com
15 mm diameter quartz glass cuvette (WATER-K) Caron Corporate www.caronproducts.com
Sodium chloride (crystalline/certified ACS), Fisher Chemical Thermo Fisher Scientific Thermo Fisher Scientific www.fishersci.ca
BD Difco Marine Broth 2216 BD Biosciences Discovery Labware BD Biosciences Discovery Labware www.bdbiosciences.com
BD Bacto Agar BD Biosciences Discovery Labware BD Biosciences Discovery Labware www.bdbiosciences.com
L1 Medium Kit, 50 L NCMA [National Center for Marine Algae and Microbiota NCMA [National Center for Marine Algae and Microbiota www.ncma.bigelow.org

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環境科学、97号、植物プランクトン、微細藻類、共培養、細菌、WATER-パルスで変調(WATER-PAM)蛍光法、光合成収率、クロロフィル、マイクロタイタープレートアッセイを、ハイスループットバイオアッセイ
水 - パルス振幅変調(WATER-PAM)蛍光測定を用いて細菌/植物プランクトンの共培養を評価するために小音量バイオアッセイ
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Bramucci, A. R., Labeeuw, L.,More

Bramucci, A. R., Labeeuw, L., Mayers, T. J., Saby, J. A., Case, R. J. A Small Volume Bioassay to Assess Bacterial/Phytoplankton Co-culture Using WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) Fluorometry. J. Vis. Exp. (97), e52455, doi:10.3791/52455 (2015).

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