Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Analys av genuttryck Förändringar i Rat Hippocampus Efter Deep Brain Stimulation av Anterior Thalamic Nucleus

Published: March 8, 2015 doi: 10.3791/52457
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Neurosurgery, Brigham & Women's Hospital, Harvard Medical School, 2Division of Brain Sciences, Department of Medicine, Imperial College London

Abstract

Djup hjärnstimulering (DBS) kirurgi, med inriktning olika regioner i hjärnan som de basala ganglierna, thalamus och subtalamiska regioner, är en effektiv behandling för flera rörelsestörningar som inte har lyckats svara på medicinering. Senaste framstegen inom området för DBS kirurgi har börjat utvidga tillämpningen av denna kirurgisk teknik till andra villkor så olika som sjuklig fetma, depression och tvångssyndrom. Trots dessa expanderande indikationer, är lite känt om de underliggande fysiologiska mekanismer som underlättar de gynnsamma effekterna av DBS kirurgi. Ett sätt på denna fråga är att utföra genuttrycksanalys i nervceller som tar emot den elektriska stimuleringen. Tidigare studier har visat att neurogenes i råtta gyrus dentatus framkallas i DBS inriktning av den främre kärnan i thalamus 1. DBS kirurgi med inriktning på ATN används i stor utsträckning för behandling refraktär epilepsi. Det är därför av mycket interest för oss att utforska de transkription förändringar som induceras av elektriskt stimulera ATN. I detta manuskript, beskriver vi våra metoder för stereotaktiskt guidad DBS kirurgi med inriktning på ATN hos vuxna Wistar råttor. Vi diskuterar också de efterföljande stegen för vävnads dissektion, RNA isolering, cDNA förberedelse och kvantitativ RT-PCR för att mäta genuttryck förändringar. Denna metod skulle kunna tillämpas och ändras för att stimulera de basala ganglierna och andra regioner i hjärnan som vanligen kliniskt inriktade. Den genuttryck studie beskrivs här förutsätter en kandidat målgen tillvägagångssätt för att upptäcka molekylära spelare som kan styra mekanismen för DBS.

Introduction

Historien bakom utvecklingen av Deep Brain Stimulation som en neurokirurgisk teknik går tillbaka till 1870-talet då möjligheten att elektriskt stimulera hjärnan kretsar undersöktes 2. Användningen av kronisk högfrekvent stimulering som behandling för neuronala sjukdomar startade under 1960-talet 3. Senare under 1990-talet med tillkomsten av kronisk implantation DBS elektroder 4-6, antalet neuronala sjukdomar som behandlades av DBS fortsatt att öka. Deep Brain Stimulation användes först i USA som en behandling av essentiell tremor 6. Idag operationen används i stor utsträckning för att behandla neuronala sjukdomar som för närvarande untreatable genom farmakologisk intervention. DBS används idag för att behandla rörelserubbningar vid Parkinsons sjukdom och dystoni 7-9. Alzheimerstyp demens, Huntingtons sjukdom, epilepsi, smärta och neuropsykiatriska sjukdomar såsom depression, OCD, Tourettes7; s syndrom och missbruk är några av de villkor mottagliga för behandling av DBS 10-12. Medan DBS operation FDA godkänt för behandling av Parkinsons sjukdom, dystoni och essentiell tremor, användning av DBS för att behandla andra villkor som nämns ovan är i olika stadier av lab och kliniska studier som erbjuder mycket löfte till patienter 13,14.

Kliniskt är DBS operation utförs i två steg. Den första etappen innebär kirurgiskt positionera DBS elektroder vid riktad anatomiska läge med hjälp av en kombination av radiologisk positionering, CT, MR samt mikroelektrod avläsningar för ökad precision. Det andra steget involverar att implantera en pulsgenerator i patientens övre bröstet och installera förlängningen leder från hårbotten till pulsgeneratorn. Baserat på den neurologiskt tillstånd har flera programmeringssystem för pulsgeneratorn standardiserats och kommer att användas för att leverera den önskade spänningen. Den slutliga volTage nås stegvis så att få bästa kliniska svaret med minimal spänning 15. Men i våra studier, till skillnad från de kroniska DBS implantat används kliniskt, för enkelhetens skull har vi tillgripit studera en engångs högfrekvent stimulering (1 timme) i våra djurmodeller.

En del av vår grupps forskning fokuserar på att undersöka användningen av DBS operation för behandlingsresistent epilepsi. Stereotaktiska kirurgiska tillvägagångssätt med högfrekvent stimulering har undersökts av många andra som ett effektivt alternativ för att behandla medicinskt refraktär epilepsi som utgör ca 30% av alla fall av epilepsi 10,16,17. Cerebellär stimulering inriktning kortikala ytan samt de djupa cerebellära kärnorna har använts tidigare som mål att behandla epilepsi 10,18,19. Dessutom har hippocampus stimulering också prövats men med blandade resultat 20,21. Några av de andra undersöktaDBS mål för epilepsi inkluderar hjärnbarken, thalamus, nucleus subthalamicus och vagusnerven 8. Men följande resultat från flera studier under de senaste åren, har den främre talamisk kärnan (ATN) fram som den vanligaste DBS mål för behandling av epilepsi 10,22. Utifrån kunskap om neuroanatomiska kretsar och fynd från djurmodeller, har flera studier fokuserat på den terapeutiska effekten av djup hjärnstimulering av ATN vid behandling av epilepsi 23-26. ATN är en del av det limbiska kretsen och är belägen i den region av hjärnan som påverkar anfallsfrekvens. Studier av Hamani et al., Har testat effekten av ATN-DBS i en pilokarpin inducerade epilepsi modell och fann att bilaterala ATN stimulering långvarig latenser för pilokarpin-inducerad kramper och status epilepticus 24. Vidare högfrekvent stimulering av ATN fann att minska anfallsfrekvensen i en pentylentetrazol (PTZ) modell av epilepsy 25,27-29. Lee et al., Har rapporterat en genomsnittlig minskning av anfallsfrekvensen med cirka 75% vid kronisk djup hjärnstimulering av ATN vid behandling eldfast partiell epilepsi 30.

En ny klinisk studie på behandlingsresistent epilepsi har visat lovande resultat efter DBS operation riktar den främre talamisk kärnan (ATN) 22. En multicenter randomiserad klinisk studie med 110 patienter som genomgick bilateral DBS av ATN för behandling refraktär epilepsi (SANTE rättegång) indikerade en nedgång i anfallsfrekvensen med cirka 40% 31. Resultaten från denna studie antydde också på en fördröjd optimal antiepileptiska effekt observerades vid 2-3 månader efter operationen. Ytterligare studier av Toda et al., Som bekräftas med dessa fynd där de visade neurogenes händer vid ett senare tillfälle inlägg DBS (dag 3-5) i djurmodeller 1. Dessutom Encinas et al., Har rapporterat hippocampus neurogenesis i vuxen mus gyrus dentatus efter högfrekvent stimulering av ATN 32. Tidigare studier 33-35 har rapporterat sjunkande hippocampus neurogenes i vissa epileptiska fall såsom kronisk tinningloben epilepsi och en förening med inlärnings underskott, försämrat minne och spontana återkommande motoriska anfall. Dessutom fanns det en minskning av neurala stamcells progenitor faktorer såsom FGF2 och IGF-1 i den kroniskt epileptiska hippocampus i djurmodeller 33. Med tanke på detta, interventionell strategier såsom DBS som visar en ökning av neurogenes i gyrus dentatus är spännande vägar för forskning. Dessa upptäckter har uppmuntrat oss att utforska ytterligare djupt in i mekanismen underliggande neurogenes efter DBS behandling för epilepsi. Vi har riktat ATN både ensidigt (data inte rapporterats) samt bilateralt (i representativa resultat) och sett förhöjda neurotrofin (BDNF) uttryck i rått gyrus dentatus. Vår cktuellt hypotes är att BDNF uttryck initierar en genexpression kaskad som kulminerar i neurogenes som översätter till det antiepileptiska effekten av DBS kirurgi. I detta papper presenterar vi våra metoder för DBS kirurgi med inriktning på ATN hos råttor följt av genuttrycksanalys som en attraktiv metod för att studera mekanismen bakom fördelarna med DBS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OBS: Etik Uttalande: Alla procedurer diskuteras i detta manuskript är i överensstämmelse med NIH riktlinjer för Animal Research (Guide för skötsel och användning av försöksdjur) och är godkända av Harvard Medical School IACUC kommittén.

1. Förhands kirurgisk Förberedelse

  1. Se till att alla kirurgiska instrument är steriliserade antingen autoklave eller rengöra med antiseptisk lösning och / eller etanol som behövs. Om möjligt, använd sterila engångs utrustning såsom skalp, nål och sprutor.
  2. Täck arbetsbänken med operationsdukar och se till att det finns ett biologiskt avfall som finns.
  3. Väg råttan och beräkna anestesi dos. Använd en ketamin / xylazin-blandning (Ketamin 75 mg / kg och Xylazin 10 mg / kg) för att söva råttorna.
    OBS: Mellan 200-250 g är den optimala vikten för korrekt fixering av djur i den stereotaktiska ramen samt för exakt inriktning av ATN. Isoflurane kan också användas som den anesthetizing medlet.
  4. Dra på två sterila elektroder (steriliseras genom autoklavering eller med etylenoxid) på elektrodhållaren (Figur 2) av en stereotaktisk kirurgisk ram och med hjälp av ett mikroskop (10-40X förstoring), inspektera tips av elektroden för korrekt uppriktning. Säkra de två elektroderna 3,0 mm från varandra.
    OBS: Var noga med att undvika skador på elektrodspetsen genom att peka på hårda ytor.

2. DBS Kirurgi

  1. Injicera Ketamin / Xylazine blanda intraperitonealt till djuret och bekräfta att djuret har nått en kirurgisk plan av anestesi (genom att kontrollera för toe-nypa reflex, andningsfrekvens och djup och korrekthet andning). Avlägsna hår från området av hårbotten som ska snittas och desinficera hårbotten med tre alternerande skurar vardera av Betadine och antingen alkohol eller steril saltlösning. Säkert och placera djuret på den stereotaktiska FRAMe.
  2. Använd cirkulerande varmvattenkuddar för att upprätthålla djurets kroppstemperatur på en optimal nivå. Applicera ögon smörjmedel till djurets ögon att skydda mot övertorkning.
  3. Använd följande stereotaktiska koordinaterna för inriktning ATN (Anterior thalamic kärna): anterioposterior -1,6 mm, mediolateral 1,5 mm och dorsoventral 5,2 mm 1.
    OBS: De stereotaktiska koordinaterna är baserade på Paxinos och Watson (6: e upplagan) råtthjäma atlas 36.
  4. Gör ett snitt i skalpen sagittally att avslöja skallen. Med hjälp av ett par upprullningsdon säkra anskäras hårbotten att exponera skallen. Använd steril koksaltlösning för att spola snittet. Om snittet är för blöt, använd sterila bomullstoppar för att torka. Leta reda på bregma och markera med en svart markering. För att styra positionen för burr hål, göra ytterligare två varumärkena ca 1,5 mm mediolaterally på båda sidor från sagittal suturen och 1,6 mm posteriort om Coronal sutur.
  5. Använd en handhållen borr för att göra de burr hålen. Se till att spetsen på borrhålet är steril genom sterilisering den med etanol. Håll borren vid ungefär 45 ° vinkel mot skallen ytan vid borrning. Ofta växla mellan de två burr hålen för att undvika överdriven värme vid platsen för varje borrhål.
  6. Fortsätt borrning tills dura exponeras. Med hjälp av en nål med sin spets böjd liknar formen av ett "L", ta bort alla trasiga bitar av ben som skulle hindra införandet av elektroden. Var noga med att undvika att skada den underliggande dura och / eller hjärnvävnad och ta av benfragment använder böjd nål.
    OBS: Använd en trubbig nål eller fina trubbig pincett är också ett alternativ.
  7. Fäst den dubbla elektrodaggregatet till den roterande handtaget av den stereotaktiska ramen och fästa handtaget vid en 90 ° vinkel. Använda justeringar i den stereotaktiska ramen, placera den vänstra elektroden precis ovanför bregma.
  8. Använda stereotaktiska justeringar för mediolateral positionering, exakt flytta vänstra elektroden 1,5 mm till vänster sida av bregma sådan att det nu finns två elektroder perfekt i linje längs den kronsömmen men åtskilda med 1,5 mm mediolaterally från bregma.
  9. Använda anterioposterior stereotaktisk justeringar, flytta elektrod 1,6 mm posteriort om kronsömmen.
  10. Använd dorsoventral justeringar för att sänka elektrod att först kontrollera om de burr hål har gjorts på rätt plats så att elektroderna kan sättas in med lätthet, utan att röra de grova kanterna av burr hål. Om så är fallet, sätt elektroderna till ett djup av 5,2 mm från ytan av skallen.
  11. Anslut elektrod via ledningar till en stimulator inställd på 130 Hz, 2,5 V och 90 ^ sek pulsbredd 1.
  12. Leverera högfrekvent stimulering för en timme (eller för en önskad tidsperiod enligt experimentuppställning). Under loppet av stimuleringen, kom ihåg att försäkra proper narkosdjup regelbundet genom att kontrollera frånvaron av fottillbakadragandet som svar på en tå nypa. Komplettera anestesi med ungefär hälften av den initiala dosen som används för att inducera anestesi. Undvik kontaminering av dina sterila handskar vid kontroll narkosdjup och ändra dem om det behövs. Utför unilateral eller bilateral stimulering utifrån sina experimentella behov. Inkludera kontroller såsom lågfrekvent stimulering (för t ex., 10 Hz) och ostimulerade djur (infoga elektroder utan efterföljande stimulering).
  13. Efter stimulering sker, ta bort elektrod noggrant och sutur snittet med 3-0 suturer eller med sterila kirurgiska häftklamrar.
  14. Administrera buprenorfin (0,05 mg / kg) subkutant som analgesi. Övervaka djuret tills den återgår till normal aktivitet och sedan returnera den till bostadsanläggningen.
  15. Efter en viss tid baserad på experimentell design (för t.ex. 0, 3, 6 eller 12 timmar efter DBS operation), Avliva djuret med anestesi överdos. Efter att ha bekräftat frånvaron av vitala tecken, halshugga djuret.
  16. Dissekera ut hjärnan genom att först ta bort huden med sax. Skär genom benet längs sagittal suturen använder dissektion sax. Gör ytterligare två snitt (ungefär en tum vardera) genom benet på båda långsidorna. Använd pincett, lyft delvis avskurna benbit från toppen av skallen att exponera hjärnan.
  17. Med fin sax eller pincett, rubba hjärnan från skallen och överför till en petriskål med kallt PBS på is.
    OBS: Var noga med att undvika skador på hjärnan samtidigt som snitten genom benet.

3. Hippocampus Isolering

OBS: Utför alla efterföljande steg i detta avsnitt på is.

  1. Placera hjärnan på en förkyld akryl hjärnmatris på is. Med användning av ett rakblad, skär hjärnan koronalt vid ungefär 7-8 mm från den främre-mest edGE av hjärnan. Gör en andra snitt koronalt och bakre till den första snittet så att en ca 5 mm tjock hjärna skiva kunde tas bort.
  2. Överför hjärnan skiva till en petriskål med iskall PBS. Använda rakblad, kapa de två halvrunda sektioner och vara noga med att notera vilka halvklotet motsvarar vänster och höger sida respektive. Detta är särskilt viktigt när de utför ensidiga stimuli.
  3. Med fin pincett och sax bort hippocampus försiktigt.
  4. Flash frysa hippocampus vävnad på torris och förvara i -20 ° C frys tills produkten ska de efterföljande RNA extraktionsstegen.
    NOTERA: För långtidsförvaring, är det lämpligt att lagra vävnad i en -80 ° C frys.

4. RNA-extraktion och Kvantitativ PCR

  1. Se till att vävnaden förblir frusen på torr is tills redo för homogenisering.
  2. OBS: Utför detta steg i huvan.
    1. Tillsätt 1 ml Tri-reagens till Hippocampal vävnad i en 1,5 ml centrifugrör och homogenisera den genom att först pipettering flera gånger tills vävnaden bryts i mindre bitar. Ytterligare homogenisera vävnaden genom att passera genom en spruta med en 25 G-nål tills det inte finns någon obruten vävnad synlig. Utför homogenisering stegen på is.
    2. Efter homogenisering av vävnaden, tillåta cellsuspensionen att stå vid rumstemperatur under 5 min för att tillåta cellys.
      OBS: Efter denna punkt cellsuspensionen kan vara snabb fryst och lagras i -70 ° C tills vidare bearbetning.
  3. Lägg 0,2 ml kloroform och blanda genom att vortexa i 20 sekunder och låt lösningen vila vid rumstemperatur under 15 min.
  4. Centrifugera proverna vid 12.000 xg under 15 minuter vid 4 ° C. Efter centrifugering, ta bort rören försiktigt utan att störa de tre separata lager som kommer att vara synlig.
    OBS: Botten (röd) fasen innehåller proteiner, mitt grumlig fas innehåller DNA och den övre klara fasen innehåller RNA.
  5. Överför den övre klara fasen (RNA) in i en färsk 1,5 ml centrifugrör (typiskt 500 | il av RNA-innehållande fas erhålles). Till detta lägger 0,5 ml isopropanol och omskakas. Till detta lägger 2-3 l glykogen (20 mg / ml) som bärare för RNA. Låt provet vila på bordet vid rumstemperatur under 10 min.
  6. Centrifugera provet vid 12.000 xg under 1 timme vid 4 ° C. Se till att RNA-pelleten syns vid botten av röret.
  7. Kasta bort supernatanten och tvätta RNA-pelleten genom tillsättning av 1 ml av 75% etanol (gjord med nukleas fritt vatten). Invertera provet flera gånger tills pelleten lösgör från botten av röret och flyter i lösningen. Centrifugera lösningen vid 12.000 xg under 10 minuter vid 4 ° C.
    OBS: pelleten i 75% etanol kan lagras vid -20 ° C tills ytterligare steg.
  8. Tillåt RNA-pelleten lufttorka genom att lämna rören öppen för 5 min vid rumstemperatur. Ta försiktighetsåtgärder för att undvika over torkning av pellets eftersom det kan påverka dess upplösning i vatten i efterföljande steg.

5. Ta bort DNA från RNA Förberedelse

  1. Lägg 9 pl nukleasfritt vatten till RNA pelleten och se till pelleten löses innan du fortsätter genom att försiktigt vortexa röret. Till detta lägger en il 10x DNas I-buffert och 1 | il rekombinant DNas (från DNas I-kit), blanda genom att försiktigt vicka rören, kortfattat snurra rören och inkubera vid 37 ° C i ett vattenbad under 30 minuter.
  2. Lägg 2 pl DNas inaktivereagens (från DNas I-kit) till provet och inkubera vid rumstemperatur under 2 min och blanda ofta genom att försiktigt ställa röret. Centrifugera vid 12000 xg i 10 min och överföring cirka 10 | il av den klara supernatanten till ett nytt 1,5 ml centrifugrör.
  3. Mät RNA-koncentrationen med hjälp av en Nanodrop eller spektrofotometer.

6. Making cDNA från RNA

  1. Lägg erforderliga volym thpå innehåller 1 mikrogram av RNA och föra den totala volymen till 8 l genom att lägga nukleasfritt vatten. Till detta tillsätt 1 pl 10 mM dNTP blanda och 1 l av slumpmässiga hexamerer från Upphöjd Första Strand Syntes Kit. Blanda försiktigt och inkubera vid 65 ° C under 5 min i antingen ett vattenbad eller på en förprogrammerad termo.
  2. Gör en förblandning innehållande följande reagens: 2 pl av 10x RT-buffert, 4 | j, l av 25 M MgCl2, 2 ^ il 0,1 M DTT och 1 pl av RNAs UT (40 U / | il).
    OBS: Volymerna som anges är per reaktion, skulle användaren behöva skala upp enligt sina experimentella behov.
  3. Efter avlägsnande av RNA-innehållande prov från 65 ° C, ställa in röret vid rumstemperatur under en minut. Lägg 9 pl förblandningslösning och inkubera vid rumstemperatur under 2 min. Lägg ett pl av Superscript II omvänt transkriptas-enzym (50 U / fil) och sedan inkubera vid rumstemperatur under 10 min.
  4. Inkubera proverna vid 42 ° C under 50min för att omvänd transkription skall inträffa.
  5. Inkubera proverna vid 70 ° C under 15 min för att avsluta reaktionen.
  6. Placera proverna på is kort och tillsätt 1 pl RNAsH (2 U / | il) och inkubera vid 37 ° C under 20 min.
  7. Centrifugera kort rören vid 3000 xg för att snurra ner kondensatvätskan.
    OBS: Detta är cDNA som kommer att användas för kvantitativ PCR. cDNA kan lagras i -20 ° C frys tills PCR-setup. cDNA kan också spädas med sterilt vatten innan du fortsätter till PCR.

7. Kvantitativ PCR

  1. Gör en Master Mix innehåller följande reagens (volymer som anges är per reaktion): 6.3 pl 2x SYBR Green Mix, 0,6 pl Framåt Primer (10 M), 0,6 pl Reverse Primer (10 M) och 0,5 pl Nukleasfritt fritt vatten .
    OBS: Primer designen gjordes med hjälp av "Pick Primers" alternativet i NCBI: s nukleotidsekvens sida för genen av intresse.
  2. Lägg 10 l mastermix i varje brunn på en 96 väl PCR Plate. Lägg 2.5 pl cDNA gjorts tidigare till brunnen innehåller mastermix. Se till att ställa in trefaldiga PCR-reaktioner för varje prov.
  3. Efter avslutad tillsättning av mastermix och cDNA, täcker PCR plattan med en optisk klisterfolie för att täta brunnarna. Snurra plattan kort för 5 min vid 500 xg i en bordscentrifug för att sedimentera all vätska till botten av brunnen.
  4. Ladda PCR-plattan på en förprogrammerad RT-PCR-maskin. Använd PCR-parametrarna som anges i tabell 1.
  5. Dataanalys: Använd C t-värden från qPCR utgång för ytterligare beräkningar. Tillsammans med test genen, inrättat PCR-reaktioner för intern kontroll gener, 18S rRNA (att säkerställa lika ingång) och β-aktin (negativ kontroll). Beräkna faldiga förändringar baserade på ΔΔCt metod 37.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figurerna 1A och 1B visar det relativa uttrycket av BDNF och GABRD relativt styr genen β-aktin. BDNF, är en neurotrofin ofta förknippas med nervskyddande effekter i många neuronala sjukdomar 38-41. Det är därför intressant att analysera uttrycksprofilen av BDNF som svar på stimulering av ATN vilket ger terapeutiska fördelar för patienter med epilepsi. I Figur 1A som visar genuttryck profil BDNF över de angivna tidspunkter posta DBS stimulering, BDNF uppreglering observeras omedelbart (0 h) efter DBS operation tillsammans med toppen uttrycket (3 gånger högre än ostimulerad) vid 3 tim stolpen stimulering. Denna observation antyder att förbättrad BDNF uttryck och den resulte neuroprotektion skulle kunna bidra till den terapeutiska nyttan av DBS. En annan gen GABRD (Figur 1B) undersöktes också med hjälp av qPCR metoden. GABRD är en GABA-receptor which är en av de potentiella mål för att utforma anti epilepsydroger 42. Den uttrycksprofilen för GABRD visar också förstärkt uttryck i de stimulerade djur jämfört med de ostimulerade kontrolldjur vid 3 h efter DBS. Med tanke på att GABA agonister används som effektiva beslag dämpare, är det intressant att observera förbättrad GABRD uttrycks inlägg DBS, blandar en möjlig roll för GABA i det antiepileptiska effekten av DBS.

RT-PCR-protokoll som beskrivs här ger reproducerbara och kvantitativa resultat som avslöjar genuttryck mönster och de relativa fold skillnader jämfört med kontrolldjur. Dataanalysen utförs på följande sätt: Den qPCR utsignal ger tröskel Ct-värdet för testgenen för varje analyserat prov. C t-värden erhålls också för kontroll gen β-aktin och 18S rRNA (kontroll). Den ΔΔC t Metoden kommer sedan att användas för att beräkna den gen expression profil med dessa C t värden 37. Till exempel, för att beräkna genuttryck förändringar för BDNF, för ett givet prov, är skillnaden mellan C t-värdet för BDNF och 18S rRNA beräknas och är den första AC t. För samma prov, är skillnaden mellan C t-värdet för β-aktin och 18S rRNA beräknad för att ge den andra AC t. Skillnaden mellan de två AC t-värden beräknas för att ge ΔΔC t. Denna ΔΔC t-värdet används för att beräkna 2 ^ (-ΔΔC t), som ger det relativa mall överflöd för BDNF jämfört med β-aktin. Genom att rita detta värde mellan de olika tidspunkter vid sidan av ostimulerade kontrollen kan genuttryck förändringar inducerade av DBS över tidpunkter visualiseras. Den ovan beskrivna metoden kan användas på ett effektivt sätt för att undersöka förändringar i uttryck på andra gener som är potentiell frankates som svarar på DBS-stimulering och för att undersöka några av de nedströms effekterna av modulering av uttrycket av dessa gener.

Figur 1
Figur 1: (A) Tidsförlopp analys av BDNF uttryck som svar på högfrekvent stimulering av ATN. Tissue skörd, RNA-extraktion, cDNA förberedelse och q-PCR utfördes som förklaras i protokollet. Relativa förändringar i genuttryck är beräknade efter normalisering för inmatning (genom att förstärka 18S rRNA) samt en kontroll gen (β-aktin). C t-värden som erhållits från realtids-PCR användes för att beräkna expressionsnivåer av ΔΔ C t metod 37. De tidpunkter analyseras är 0, 3, 6 och 12 timmar efter DBS stimulering. OBS: De tidpunkter som valts här är i förhållande till en viss undersökning och kan komma att ändras beroende på hymisstanken och experimentell plan. (B) Tidskursanalys av GABA A-receptorn delta subenhet (GABRD) nivåer som svar på DBS vid 130 Hz inriktning ATN. Metoder och beräkningar gjordes som liknar BDNF uppgifterna.

Figur 2
Figur 2: DBS elektroder och stimulator inrättas.

PCR-cykler
Steg 1: Initial denaturering 95 ° C 15 min
Steg 2: Denaturering 95 ° C 15 sek
Glödgning 60 ° C 30 sek
Förlängning 72 ° C 30 sek
40 cykler av steg 2
Obs: Glödgningstemperaturen varierar beroende på
primer smälttemperatur. Primers är oftast utformade
att ha en optimal hybridiseringstemperatur av 60 ° C

Tabell 1: PCR-parametrarna.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Efter landmärket arbete av Benabid et al. I att använda djup hjärnstimulering för behandling av Parkinsons sjukdom och essentiell tremor har DBS kirurgisk teknik undersökts med stort intresse under det senaste decenniet för att behandla många neurologiska sjukdomar 6,10,43. DBS studier är inriktade på olika neuro anatomiska regioner i hjärnan kretsar för närvarande utförs av många grupper att ta upp viktiga neuronala sjukdomar och är i olika stadier av kliniska prövningar. Stimulering av nucleus subthalamicus (STN) eller den interna segment av globus pallidus (GPI) är FDA godkänt och används vid behandling av rörelsestörningar vid Parkinsons sjukdom 10. Den SANTE klinisk studie har visat lovande tendenser för epileptiska patienter som får högfrekvent stimulering av främre talamisk kärnan 31. Resultat från en klinisk fas I-studie av bilaterala forniceal stimulering har visat en fördröjning i graden av kognitiv nedsättning och en reversal av glukos hypometabolic upptaget ses i Alzheimers sjukdom samt aktivering av minneskretsarna 8,44. Vidare på senare år neurokirurger har genomfört DBS prövningar för behandling av neuropsykiatriska störningar såsom OCD (Obsessive Compulsive Disorder), behandlingsresistent depression, Tourettes syndrom och missbruk 10,45-55.

Utöver de kliniska prövningarna, under de senaste åren, har djurkirurgi erbjudit oss stora möjligheter att studera de fysiologiska förändringar som induceras av den kirurgiska tekniken i ett levande djur, på ett sätt enastående genom någon in vitro teknik. I detta manuskript, har vi diskuterat de som är involverade i att utföra djup hjärnstimulering kirurgi i gnagare metoder. Stereotaktisk kirurgi hos gnagare som beskrivs här skulle också kunna användas för potentiella DBS målgrupp sökningar och för att testa effektiviteten av operationen med hjälp sjukdomsmodelldjur. En av utmaningarna för försöks here är att kunna rikta rätt anatomiskt locus på ett reproducerbart sätt. Det är särskilt ett behov av en skicklig tekniker för operation eftersom kontroll för korrekt inriktning är möjlig först efter stimuleringen sker och djuret avlivas. Också då kan man av misstag skada en nyckel blodkärl som kan leda till betydande blodförlust och ibland även djurets död. Dessutom, behovet av att dissekera ut hippocampus för vidare biokemisk analys begränsar möjligheten till immunhistologisk verifiering för korrekt elektrod inriktning på samma djur som kräver ett intakt hjärnprovet för vävnadssnittning. Korrekt elektrodinriktning skulle eventuellt kunna kontrolleras på ett annat djur stimuleras på ett identiskt sätt. Men detta inte ger belägg för korrekt inriktning hos försöksdjur och är en begränsning i detta tillvägagångssätt. Nya publikationer har försökt att kringgå detta problem genom att utföra DBS kirurgi med simultaneous fMRI 56. En möjlig förbättring av den teknik som beskrivs här skulle kunna vara en studie av effekterna av kronisk stimulering via en implanterad stimulator i djuret. Vi har dock begränsat vår analys för en enda dos (1 timme) av högfrekvent stimulering som ett första steg för att förstå förändringarna inducerade av DBS på cellnivå.

Med tanke på användningen av DBS operation för en mängd olika neuronala sjukdomar är det viktigt att vi vet mekanismen bakom de positiva effekterna av DBS. Denna information är avgörande för att utveckla framtida förbättringar i kirurgi och även att undersöka nyttan av DBS som en behandling för andra tillstånd som inte har undersökts av experter i DBS. Dessutom kan modifieringar av kirurgiska tekniken implementeras för att undvika vissa skadliga biverkningar av förfarandet och för att effektivt ta itu med återkommande sjukdomstillståndet.

En fördjupad mekanistiska analys av DBS är möjlig genom att undersöka genuttryck förändringar inducerade av DBS. Antingen en kandidat gen strategi som bygger på befintlig kunskap om nervbanorna som svarar på depolariserande stimuli såsom högfrekvent stimulering, eller en global transkriptomanalys kan ge viktiga insikter de molekylära händelser som utlöses av DBS. De genuttryck analystekniker (kandidatgen inflygnings samt hög genomströmning metod) är kraftfulla verktyg som är nyckeln till att utforska de molekylära mekanismer och cellulära förändringar i samband med DBS kirurgi. Den senaste utvecklingen inom detta område har gjort det möjligt för oss att få en mängd information om flera aspekter av cellulär fysiologi på mycket kort tid, vilket inte var möjligt för några år sedan. Med tillkomsten av hög genomströmning sekvenseringsteknologi som ChIPseq, är det möjligt att karakterisera genomet hela platsen för viktiga transkriptionsfaktorer som svarar på DBS 57,58. Nya upptäckter länka ickekodande RNA som mikroRNA med neurodegenerativa sjukdomar, ger oss möjlighet att analysera eventuella förändringar i miRNA nivåer i nervceller efter DBS med hjälp miRNA sekvenseringsteknologi 59,60. Eventuella förändringar i epigenetiska signaturer sådana DNA-metylering och Histon Ändringar som svar på DBS kan också undersökas. Trots fördelarna är det viktigt att erkänna vissa av de begränsningar av dessa tekniker samt eventuella problem som kan uppstå under analyser. En viktig fråga med genuttryck analyser har varit reproducerbarhet och tekniska fel. Det är viktigt att försöksledaren noterar detta och planerar på att ha tillräckligt antal repetitioner för att säkerställa tillförlitligheten. Ett vanligt problem med några av de hög kapacitet studier har varit svårigheten i tolkningen av den enorma mängd data som genereras. Ibland blir det viktigt att bestämma huruvida genexpressionsförändringar observerats är på grund av den direkta effektenav den experimentella behandlingen eller är en nedströmseffekt. Detta kräver oftast ytterligare studier som är utformade för att ta itu med denna fråga.

Utöver de genomiska studier, kommer en omfattande immunhistokemisk analys av den spatiotemporala lokalisering av de viktigaste aktörerna som svarar på DBS och en kvantifiering av förändringarna i deras nivåer i olika regioner i hjärnan vara en stor tillgång för den framtida utvecklingen av DBS kirurgiska proceduren. De kumulativa resultaten från genuttryck analyser samt de immunhistokemiska studier kan avslöja nya interaktioner mellan nyckelfaktorer samt viktiga molekylära händelser som reglerar cellulära processer såsom neurogenes eller neurodegeneration. Identifiering av sådana kritiska molekylära markörer kan också möjliggöra framtida drog upptäckter. Sådana fynd kunde belysa den allmänna hjärnans kretsar, som är värdefull information ur forskare som arbetar för att förstå människany neuronala sjukdomar. Styra våra framtida satsningar på att integrera senaste tekniska framsteg som gjorts på kliniken samt laboratoriet väntas erbjuda oss stora fördelar i vår kamp mot sjukdomen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Deep Brain Stimulation Surgery
Stereotactic frame Kopf Instruments Model 900
Drill  Dremmel 7700, 7.2 V
Scalpel BD 372610
Ketamine Patterson Veterinary 07-803-6637 Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules
Xylazine Patterson Veterinary 07-808-1947
Buprenorphine Patterson Veterinary 07-850-2280 Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules
Surgical staples ConMed Corporation 8035
Sutures (3-0)  Harvard Apparatus 72-3333
Syringe (1 ml, 29 1/2 G) BD 329464 Sterile, use for Anesthesia administration intraperitoneally
Syringe (3 ml, 25 G) BD 309570 Sterile, use for Analgesia administration subcutaneously
Needles BD 305761 Sterile, use for clearing broken bone pieces from the burr holes
Ethanol Fisher Scientific S25309B Use for general sterilization 
Eye Lubricant Fisher Scientific 19-898-350
Stimulator Medtronic Model 3628
DBS electrodes Rhodes Medical Instruments, CA SNEX100x-100 mm Electrodes are platinum, concentric and bipolar
Betadine (Povidone-Iodine)  PDI S23125 Single use swabsticks, use for sterilizing the scalp before making incision 
 Brain Dissection and Hippocampal tissue isolation
Acrylic Rodent Brain Matrix Electron Microscopy Sciences 175-300 www.emsdiasum.com
Razor Blade V W R 55411-050
Guillotine Scissors Clauss 18039 For decapitation, make sure these scissors are maintained in clean and working condition
Scissors Codman Classic 34-4098 Use for removing the brain from the skull
Forceps Electron Microscopy Sciences 72957-06 Use for removing the brain from the skull and for handling during dissection
Phosphate Buffered Saline  Boston Bioproducts BM-220
 RNA Extraction and cDNA Preparation
Tri Reagent Sigma T9424 Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin
Syringe (3 ml, 25 G) BD 309570 Use for tissue homogenization
Chloroform Fisher Scientific BP1145-1 Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin
Isopropanol Fisher Scientific A416-1
Glycogen Thermo Scientific R0561
Dnase I Kit Ambion AM1906
Superscript First Strand Synthesis Kit Invitrogen 11904-018
Tabletop Microcentrifuge Eppendorf 5415D
 Quantitative PCR               
SYBR Green PCR Kit Qiagen 204143
Custom Oligos Invitrogen 10668051
PCR Plates (96 wells) Denville Scientific C18080-10
Optical Adhesive Sheets Thermo Scientific AB1170
Nuclease free Water Thermo Scientific SH30538-02
Real Time PCR Machine Applied Biosystems 7500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Toda, H., Hamani, C., Fawcett, A. P., Hutchison, W. D., Lozano, A. M. The regulation of adult rodent hippocampal neurogenesis by deep brain stimulation. Journal of. 108, 132-138 (2008).
  2. Perlmutter, J. S., Mink, J. W. Deep brain stimulation. Annual review of neuroscience. 29, 229-257 (2006).
  3. Bergstrom, M. R., Johansson, G. G., Laitinen, L. V., Sipponen, P. Electrical stimulation of the thalamic and subthalamic area in cerebral palsy. Acta physiologica Scandinavica. 67, 208-213 (1966).
  4. Benabid, A. L., et al. Chronic electrical stimulation of the ventralis intermedius nucleus of the thalamus as a treatment of movement disorders. Journal of neurosurgery. 84, 203-214 (1996).
  5. Benabid, A. L., et al. Long-term electrical inhibition of deep brain targets in movement disorders. Movement disorders : official journal of the Movement Disorder Society. 13, Suppl 3. 119-125 (1998).
  6. Benabid, A. L., et al. Long-term suppression of tremor by chronic stimulation of the ventral intermediate thalamic nucleus. Lancet. 337, 403-406 (1991).
  7. Tierney, T. S., Lozano, A. M. Surgical treatment for secondary dystonia. Movement disorders : official journal of the Movement Disorder Society. 27, 1598-1605 (2012).
  8. Tierney, T. S., Sankar, T., Lozano, A. M. Some recent trends and further promising directions in functional neurosurgery. Acta neurochirurgica. Supplement. 117, 87-92 (2013).
  9. Tierney, T. S., Sankar, T., Lozano, A. M. Deep brain stimulation emerging indications. Progress in brain research. 194, 83-95 (2011).
  10. Sankar, T., Tierney, T. S., Hamani, C. Novel applications of deep brain stimulation. Surgical neurology international. 3, S26-S33 (2012).
  11. Tierney, T. S., Vasudeva, V. S., Weir, S., Hayes, M. T. Neuromodulation for neurodegenerative conditions. Frontiers in bioscience. 5, 490-499 (2013).
  12. Mayberg, H. S., et al. Deep brain stimulation for treatment-resistant depression. Neuron. 45, 651-660 (2005).
  13. Lyons, M. K. Deep brain stimulation: current and future clinical applications. Mayo Clinic proceedings. 86, 662-672 (2011).
  14. Ch. 4. Rehabilitation in movement disorders. Lansek, R., Morris, M. E. , Cambridge University Press. 36-43 (2013).
  15. Goodwin, R., Tierney, T., Lenz, F., Anderson, W. Ch. 15. Single Neuron Studies of the Human Brain: Probing Cognition. Fried, I., Rutishauser, U., Cerf, M., Kreiman, G. 15, MIT Press. 275-293 (2014).
  16. Hauser, W. A. Epidemiology of epilepsy in children. Neurosurgery clinics of North America. 6, 419-429 (1995).
  17. Hauser, W. A. Recent developments in the epidemiology of epilepsy. Acta neurologica Scandinavica. Supplementum. 162, 17-21 (1995).
  18. Davis, R., Emmonds, S. E. Cerebellar stimulation for seizure control: 17-year study. Stereotactic and functional neurosurgery. 58, 200-208 (1992).
  19. Levy, L. F., Auchterlonie, W. C. Chronic cerebellar stimulation in the treatment of epilepsy. Epilepsia. 20, 235-245 (1979).
  20. Velasco, A. L., et al. Electrical stimulation of the hippocampal epileptic foci for seizure control: a double-blind, long-term follow-up study. Epilepsia. 48, 1895-1903 (2007).
  21. Tellez-Zenteno, J. F., McLachlan, R. S., Parrent, A., Kubu, C. S., Wiebe, S. Hippocampal electrical stimulation in mesial temporal lobe epilepsy. Neurology. 66, 1490-1494 (2006).
  22. Kerrigan, J. F., et al. Electrical stimulation of the anterior nucleus of the thalamus for the treatment of intractable epilepsy. Epilepsia. 45, 346-354 (2004).
  23. Hamani, C., et al. Deep brain stimulation of the anterior nucleus of the thalamus: effects of electrical stimulation on pilocarpine-induced seizures and status epilepticus. Epilepsy research. 78, 117-123 (2008).
  24. Hamani, C., et al. Bilateral anterior thalamic nucleus lesions and high-frequency stimulation are protective against pilocarpine-induced seizures and status epilepticus. Neurosurgery. 54, 191-195 (2004).
  25. Mirski, M. A., Rossell, L. A., Terry, J. B., Fisher, R. S. Anticonvulsant effect of anterior thalamic high frequency electrical stimulation in the rat. Epilepsy research. 28, 89-100 (1997).
  26. Mirski, M. A., Ferrendelli, J. A. Interruption of the mammillothalamic tract prevents seizures in guinea pigs. Science. 226, 72-74 (1984).
  27. Mirski, M. A., Ferrendelli, J. A. Anterior thalamic mediation of generalized pentylenetetrazol seizures. Brain research. 399, 212-223 (1986).
  28. Mirski, M. A., Ferrendelli, J. A. Interruption of the connections of the mammillary bodies protects against generalized pentylenetetrazol seizures in guinea pigs. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 7, 662-670 (1987).
  29. Mirski, M. A., McKeon, A. C., Ferrendelli, J. A. Anterior thalamus and substantia nigra: two distinct structures mediating experimental generalized seizures. Brain research. 397, 377-380 (1986).
  30. Lee, K. J., Jang, K. S., Shon, Y. M. Chronic deep brain stimulation of subthalamic and anterior thalamic nuclei for controlling refractory partial epilepsy. Acta neurochirurgica. Supplement. 99, 87-91 (2006).
  31. Fisher, R., et al. Electrical stimulation of the anterior nucleus of thalamus for treatment of refractory epilepsy. Epilepsia. 51, 899-908 (2010).
  32. Encinas, J. M., Hamani, C., Lozano, A. M., Enikolopov, G. Neurogenic hippocampal targets of deep brain stimulation. The Journal of comparative neurology. 519, 6-20 (2011).
  33. Hattiangady, B., Rao, M. S., Shetty, A. K. Chronic temporal lobe epilepsy is associated with severely declined dentate neurogenesis in the adult hippocampus. Neurobiology of disease. 17, 473-490 (2004).
  34. Kuruba, R., Hattiangady, B., Shetty, A. K. Hippocampal neurogenesis and neural stem cells in temporal lobe epilepsy. Epilepsy & behavior : E&B. 14, Suppl 1. 65-73 (2009).
  35. Hattiangady, B., Shetty, A. K. Implications of decreased hippocampal neurogenesis in chronic temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 49, Suppl 5. 26-41 (2008).
  36. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Elsevier Inc. (2007).
  37. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 22DDCT Method. METHODS. 25, 402-408 (2001).
  38. Kells, A. P., et al. AAV-mediated gene delivery of BDNF or GDNF is neuroprotective in a model of Huntington disease. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 9, 682-688 (2004).
  39. Han, B. H., Holtzman, D. M. BDNF protects the neonatal brain from hypoxic-ischemic injury in vivo via the ERK pathway. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 20, 5775-5781 (2000).
  40. Hetman, M., Kanning, K., Cavanaugh, J. E., Xia, Z. Neuroprotection by brain-derived neurotrophic factor is mediated by extracellular signal-regulated kinase and phosphatidylinositol 3-kinase. The Journal of biological chemistry. 274, 22569-22580 (1999).
  41. Stadelmann, C., et al. BDNF and gp145trkB in multiple sclerosis brain lesions: neuroprotective interactions between immune and neuronal cells. Brain : a journal of neurology. 125, 75-85 (2002).
  42. Treiman, D. M. GABAergic mechanisms in epilepsy. Epilepsia. 42, Suppl 3. 8-12 (2001).
  43. Benabid, A. L., Pollak, P., Louveau, A., Henry, S., de Rougemont, J. Combined (thalamotomy and stimulation) stereotactic surgery of the VIM thalamic nucleus for bilateral Parkinson disease. Applied neurophysiology. 50, 344-346 (1987).
  44. Laxton, A. W., et al. A phase I trial of deep brain stimulation of memory circuits in Alzheimer's disease. Annals of. 68, 521-534 (2010).
  45. Tierney, T. S., Abd-El-Barr, M. M., Stanford, A. D., Foote, K. D., Okun, M. S. Deep brain stimulation and ablation for obsessive compulsive disorder: evolution of contemporary indications, targets and techniques. The International journal of neuroscience. 124, 394-402 (2014).
  46. Kennedy, S. H., et al. Deep brain stimulation for treatment-resistant depression: follow-up after 3 to 6 years. The American journal of psychiatry. 168, 502-510 (2011).
  47. Lozano, A. M., et al. Subcallosal cingulate gyrus deep brain stimulation for treatment-resistant depression. Biological psychiatry. 64, 461-467 (2008).
  48. Ackermans, L., et al. Double-blind clinical trial of thalamic stimulation in patients with Tourette syndrome. Brain : a journal of neurology. 134, 832-844 (2011).
  49. Houeto, J. L., et al. Tourette's syndrome and deep brain stimulation. Journal of neurology, neurosurgery, and psychiatry. 76, 992-995 (2005).
  50. Maciunas, R. J., et al. Prospective randomized double-blind trial of bilateral thalamic deep brain stimulation in adults with Tourette syndrome. Journal of neurosurgery. 107, 1004-1014 (2007).
  51. Koning, P. P., Figee, M., van den Munckhof, P., Schuurman, P. R., Denys, D. Current status of deep brain stimulation for obsessive-compulsive disorder: a clinical review of different targets. Current psychiatry reports. 13, 274-282 (2011).
  52. Greenberg, B. D., et al. Deep brain stimulation of the ventral internal capsule/ventral striatum for obsessive-compulsive disorder: worldwide experience. Molecular psychiatry. 15, 64-79 (2010).
  53. Muller, U. J., et al. Successful treatment of chronic resistant alcoholism by deep brain stimulation of nucleus accumbens: first experience with three cases. Pharmacopsychiatry. 42, 288-291 (2009).
  54. Zhou, H., Xu, J., Jiang, J. Deep brain stimulation of nucleus accumbens on heroin-seeking behaviors: a case report. Biological psychiatry. 69, e41-e42 (2011).
  55. Porta, M., et al. Thalamic deep brain stimulation for treatment-refractory Tourette syndrome: two-year outcome. Neurology. 73, 1375-1380 (2009).
  56. Younce, J. R., Albaugh, D. L., Shih, Y. Y. Deep brain stimulation with simultaneous FMRI in rodents. Journal of visualized experiments : JoVE. , e51271 (2014).
  57. Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature reviews. Genetics. 10, 669-680 (2009).
  58. Valouev, A., et al. Genome-wide analysis of transcription factor binding sites based on ChIP-Seq data. Nature methods. 5, 829-834 (2008).
  59. Fiore, R., Siegel, G., Schratt, G. MicroRNA function in neuronal development, plasticity and disease. Biochimica et biophysica acta. 1779, 471-478 (2008).
  60. Hebert, S. S., De Strooper, B. Alterations of the microRNA network cause neurodegenerative disease. Trends in neurosciences. 32, 199-206 (2009).

Tags

Neurovetenskap främre talamisk kärna djup hjärnstimulering gyrus dentatus hippocampus epilepsi genuttryck högfrekvent stimulering kvantitativ RT-PCR
Analys av genuttryck Förändringar i Rat Hippocampus Efter Deep Brain Stimulation av Anterior Thalamic Nucleus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Selvakumar, T., Alavian, K. N.,… More

Selvakumar, T., Alavian, K. N., Tierney, T. Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus. J. Vis. Exp. (97), e52457, doi:10.3791/52457 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter