Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Analyse av genuttrykk Endringer i Rat Hippocampus Etter dyp hjernestimulering av fremre talamiske Nucleus

Published: March 8, 2015 doi: 10.3791/52457
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Neurosurgery, Brigham & Women's Hospital, Harvard Medical School, 2Division of Brain Sciences, Department of Medicine, Imperial College London

Abstract

Dyp hjernestimulering (DBS) kirurgi, målretting ulike regioner av hjernen som basalgangliene, thalamus, og subthalamic regioner, er en effektiv behandling for flere bevegelsesforstyrrelser som ikke har respondert på medisinering. Nylige fremskritt innen DBS kirurgi har begynt å utvide anvendelsen av denne kirurgiske teknikken til andre forhold så forskjellige som sykelig fedme, depresjon og tvangslidelser. Til tross for disse voksende indikasjoner, lite er kjent om de underliggende fysiologiske mekanismer som letter de gunstige effektene av DBS kirurgi. En tilnærming til dette spørsmålet er genekspresjonsanalyser å utføre i nevroner som mottar elektrisk stimulering. Tidligere studier har vist at nevrogenesen i rotte dentate gyrus utløses i DBS målretting av fremre kjernen i thalamus 1. DBS kirurgi rettet mot ATN brukes mye for behandling ildfast epilepsi. Det er derfor av mye interest for oss å utforske transkripsjons endringer indusert av elektrisk stimulering av ATN. I dette manuskriptet, beskriver vi våre metoder for stereotaktisk styrt DBS kirurgi rettet mot ATN hos voksne mannlige Wistar rotter. Vi diskuterer også de påfølgende trinnene for vev disseksjon, RNA isolering, cDNA forberedelse og kvantitativ RT-PCR for å måle genuttrykk endringer. Denne metoden kan bli anvendt og modifisert for å stimulere de basale ganglier og andre områder av hjernen som vanligvis klinisk målrettet. Genuttrykket studien beskrevet her forutsetter en kandidat målgen tilnærming for å oppdage molekylære spillere som kunne dirigere mekanismen for DBS.

Introduction

Historien bak utviklingen av dyp hjernestimulering som en nevrokirurgisk teknikk dateres tilbake til 1870-tallet da muligheten for elektrisk stimulere hjernen kretser ble utforsket to. Bruken av kronisk høy frekvens stimulering som behandling for nevronale lidelser startet i 1960 tre. Senere på 1990-tallet med bruk av kronisk implantasjon DBS elektroder 4-6, fortsatte antall nevronale lidelser som ble behandlet av DBS å øke. Dyp hjernestimulering ble først brukt i USA som en behandling for essensiell tremor 6. I dag er kirurgi er brukt mye til å behandle nervelidelser som for øyeblikket er botemiddel ved farmakologisk intervensjon. DBS i dag brukes for å behandle problemer på Parkinsons sykdom og dystoni 7-9. Alzheimers type demens, Huntingtons sykdom, epilepsi, smerte og nevropsykiatriske sykdommer, slik depresjon, OCD, Tourettes7; s syndrom og avhengighet er noen av de forholdene som kan behandles ved DBS 10-12. Mens DBS kirurgi er godkjent av FDA for behandling av Parkinsons sykdom, dystoni og essensiell tremor, bruk av DBS for behandling av andre tilstander som er nevnt ovenfor er i forskjellige faser av lab og kliniske studier som gir mye løftet til pasienter 13,14.

Klinisk er DBS operasjonen utføres i to trinn. Den første fasen innebærer kirurgisk plassere DBS elektroder på målrettet anatomisk plassering ved hjelp av en kombinasjon av radiologisk posisjonering, CT, MR samt microelectrode avlesninger for økt presisjon. Det andre trinn involverer å implantere en pulsgenerator i pasientens øvre bryst og installering av skjøteledninger fra hodebunnen til pulsgeneratoren. Basert på den nevrologisk tilstand, har flere programmeringsskjemaer for pulsgeneratoren blitt standardisert og vil bli brukt for å levere den ønskede spenning. Den endelige voltage er nådd i en stegvis slik som å motta den beste klinisk respons med minimal spenning 15. Men i våre studier, i motsetning til den kroniske DBS implantater anvendes klinisk, for enkelhets skyld har vi tydd til å studere en engangs høyfrekvent stimulering (1 time) i våre dyremodeller.

En del av vår gruppe forskning fokuserer på å undersøke bruk av DBS kirurgi for behandling-refraktær epilepsi. Stereotaktisk kirurgiske tilnærminger ved hjelp av høyfrekvent stimulering har blitt utforsket av mange andre som et effektivt alternativ for å behandle medisinsk-refraktær epilepsi som utgjør ca 30% av alle tilfeller av epilepsi 10,16,17. Lillehjernen stimulering rettet kortikale overflate samt de dype cerebellare atomkjerner har blitt brukt i fortiden som mål å behandle epilepsi 10,18,19. I tillegg har hippocampus stimulering også blitt forsøkt, men med blandede resultater 20,21. Noen av de andre undersøkteDBS mål for epilepsi inkluderer hjernebarken, thalamus, subthalamic nucleus og vagus nerve 8. Men følgende resultater fra flere studier de siste årene, har den fremre thalamic kjernen (ATN) dukket opp som den mest vanlige DBS mål for epilepsi behandling 10,22. Basert på kunnskap om nevroanatomi kretser og resultatene fra dyremodeller, har flere studier rettet mot den terapeutiske effekten av dyp hjerne stimulering av ATN i behandling av epilepsi 23-26. ATN er en del av det limbiske krets og ligger i regionen av hjernen som påvirker anfallsfrekvens. Studier av Hamani et al., Har testet effekten av ATN-DBS i en pilokarpin indusert epilepsi modell og fant at bilateral ATN stimulering forlenget latenstid for pilokarpin-induserte anfall og status epilepticus 24. Videre ble høyfrekvent stimulering av ATN funnet å redusere anfallsfrekvens i en pentylentetrazol (PTZ) modell av epilepsy 25,27-29. Lee et al., Har rapportert en gjennomsnittlig reduksjon i anfallsfrekvens med om lag 75% ved kronisk dyp hjernestimulering av ATN i behandling ildfast partiell epilepsi 30.

En fersk klinisk studie på behandling-refraktær epilepsi har vist lovende resultater etter DBS kirurgi rettet mot fremre thalamic kjernen (ATN) 22. En multisenter randomisert klinisk studie med 110 pasienter som gjennomgår bilateral DBS av ATN for behandling refraktær epilepsi (SANTE rettssaken) indikerte en nedgang i anfallsfrekvens med ca 40% 31. Resultatene fra denne studien også antydet på en forsinket optimal antiepileptisk effekt observert på 2-3 måneder etter operasjonen. Videre studier av Toda et al., Bekreftet med disse funnene der de demonstrerte neurogenesis skjer på et senere tidspunkt etter DBS (dager 3-5) i dyremodeller 1. I tillegg Encinas et al., Har rapportert hippocampus neurogenesis i voksen mus dentate gyrus etter høyfrekvent stimulering av ATN 32. Tidligere studier 33-35 har rapportert fallende hippocampus neurogenesis i visse epileptiske tilfeller som kronisk tinninglappen epilepsi og en tilknytning til lærings underskudd, svekket hukommelse og spontane tilbakevendende motoriske anfall. Videre var det en reduksjon i nervestamcelle progenitor faktorer som FGF2 og IGF-1 i kronisk epileptisk hippocampus i dyremodeller 33. Vurderer dette, intervensjonsstrategier som DBS som viser en styrking av neurogenesis i dentate gyrus er spennende muligheter for forskning. Disse funnene har oppmuntret oss til å utforske videre dypt inn i mekanismen som ligger bak neurogenesis post-DBS behandling for epilepsi. Vi har målrettet ATN både ensidig (data ikke rapportert) samt bilateralt (i representative resultater) og sett forhøyet neurotrofin (BDNF) uttrykk i rotte dentate gyrus. Vår cjeldende hypotese er at BDNF uttrykk initierer en genuttrykk kaskade som kulminerer i neurogenesis som oversetter til antiepileptisk effekt av DBS kirurgi. I denne artikkelen presenterer vi våre metoder for DBS kirurgi rettet mot ATN hos rotter fulgt genekspresjonsanalyser med som en attraktiv tilnærming for å studere mekanismen bak fordelene med DBS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: Etikk Uttalelse: Alle prosedyrer diskutert i dette manuskriptet er i samsvar med NIH retningslinjer for Forsøksdyrutvalget (Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr) og er godkjent av Harvard Medical School IACUC komiteen.

1. Pre-kirurgisk Forberedelse

  1. Kontroller at alle kirurgiske instrumenter er sterilisert ved enten autoklave eller ved rensing med antiseptisk løsning og / eller etanol som nødvendig. Der det er mulig, bruker sterilt engangsutstyr som skalpeller, nål og sprøyter.
  2. Dekk arbeidsbenken med operasjonsduker og sikre at det er en farlig biologisk avfallshåndtering tilgjengelig.
  3. Vei rotte og beregne anestesi dose. Bruk en Ketamin / Xylazin mix (Ketamin 75 mg / kg og Xylazin 10 mg / kg) for å bedøve rottene.
    MERK: Mellom 200-250 g er den optimale vekt for riktig fiksering av dyret i stereotaktisk ramme samt for nøyaktig målretting av ATN. Isoflurane kan også brukes som bedøvelse middel.
  4. Mount og sikre sterile to elektroder (sterilisert ved autoklavering eller med etylenoksyd) i elektrodeholderen (figur 2) i en stereotaktisk kirurgisk ramme og ved hjelp av et mikroskop (10-40X forstørrelse), inspisere tuppen av elektroden for riktig justering. Fest de to elektroder 3,0 mm fra hverandre.
    MERK: Pass på å unngå å skade elektrodespissen ved å berøre på hardt underlag.

2. DBS Surgery

  1. Injisere Ketamin / Xylazin blande intraperitonealt til dyret og bekrefter at dyret har nådd en kirurgisk plan for anestesi (ved å se etter tå-pinch refleks, respirasjonsfrekvens og dybde og regularitet av pusting). Fjern hår fra regionen av hodebunnen som vil bli radert og desinfisere hodebunnen med tre vekslende skrubb hver av Betadine og enten alkohol eller sterilt saltvann. Sikre og plassere dyr på stereotactic frame.
  2. Bruk sirkulerende varmt vann puter for å opprettholde dyrets kroppstemperatur på et optimalt nivå. Påfør øye smøremiddel til dyrets øyne for å beskytte mot uttørring.
  3. Bruk følgende stereotaktisk koordinater for målretting ATN (Anterior thalamic nucleus): anterioposterior -1,6 mm, mediolateral 1,5 mm og dorsoventral 5,2 mm 1.
    MERK: stereotaktisk koordinatene er basert på Paxinos og Watson (6 th edition) rottehjerne atlas 36.
  4. Lage et snitt i hodebunnen sagittally å avsløre skallen. Ved hjelp av et par haker sikre radert skalp å avsløre skallen. Bruk sterilt saltvann for å skylle såret. Hvis snittet er for våt, bruke sterile vattpinner til tørk. Finn bregma og merk med en svart markør. Å lede plasseringen av Burr hull, gjør to merkene på omtrent 1,5 mm mediolaterally på begge sider fra det sagittale sutur og 1,6 mm posterior til coronal sutur.
  5. Bruk en håndholdt drill for å gjøre grad hull. Pass på at spissen av Burr hullet er steril ved sterilisering det med etanol. Hold drill på ca 45 ° vinkel til skallen overflaten ved boring. Ofte veksle mellom de to Burr hull for å unngå overdreven varme på plasseringen av noen Burr hullet.
  6. Fortsett boring inntil dura er utsatt. Ved hjelp av en nål med sin spiss bøyd ligner formen på en "L", fjern eventuelle ødelagte biter av bein som ville hindre innsetting av elektroden. Pass på å unngå å skade den underliggende dura og / eller hjernevev mens fjerne bein fragmenter med bøyd nål.
    MERK: Ved hjelp av en avstumpet nål eller fin sløv tang er også et alternativ.
  7. Fest dual elektrode forsamlingen til den roterende håndtaket på stereotaktisk ramme og fikse håndtaket på en 90 ° vinkel. Bruke justeringer i stereotaktisk ramme, plasserer den venstre elektroden akkurat over bregma.
  8. Bruker stereotaktiske justeringer for mediolateral posisjonering, nettopp flytte venstre elektroden 1,5 mm til venstre side av bregma slik at nå er det to elektroder perfekt justert langs koronale sutur men avstand fra hverandre med 1,5 mm mediolaterally fra bregma.
  9. Bruke anterioposterior stereotaktisk justeringer, flytte elektrodene 1,6 mm posteriort for koronale sutur.
  10. Bruk dorsoventral justeringer for å senke elektrodene til først sjekke om Burr hull har blitt gjort til rett sted slik at elektrodene kan settes inn med letthet, uten å berøre de skarpe kantene på graden hull. I så fall setter elektrodene til en dybde på 5,2 mm fra overflaten av skallen.
  11. Kobler elektrodene via fører til en stimulator satt til 130 Hz, 2,5 V og 90 usek pulsewidth en.
  12. Levere høy frekvens stimulering for en time (eller for en ønsket tidsperiode som per eksperimentelt oppsett). I løpet av stimuleringen, huske å sikre pRoper bedøvelse dybde regelmessig ved å sjekke for fraværet av foten tilbaketrekking som svar på en tå klype. Supplere anestesi med omtrent halvparten av startdosen som brukes for å indusere anestesi. Unngå forurensning av sterile hansker når du sjekker bedøvelse dybde og endre dem om nødvendig. Utføre unilateral eller bilateral stimulering basert på ens eksperimentelle behov. Inkluder kontroller som lavfrekvent stimulering (for f.eks., 10 Hz) og unstimulated dyr (sette inn elektroder uten påfølgende stimulering).
  13. Etter stimulering er gjort, fjerne elektrodene nøye og sy snittet med 3-0 sting eller med sterile kirurgiske stifter.
  14. Administrere buprenorfin (0,05 mg / kg) subkutant som smertelindring. Overvåke dyret før den returnerer til normal aktivitet og deretter returnere den til boliger anlegget.
  15. Etter en viss periode av gangen basert på eksperimentell design (for eksempel 0, 3, 6 eller 12 timer etter DBS kirurgi), Avlive dyret med anestesi overdose. Etter å ha bekreftet fravær av vitale tegn, halshogge dyret.
  16. Dissekere ut hjernen ved først å fjerne huden ved hjelp av en saks. Skjære gjennom bein langs sagittal sutur ved hjelp av disseksjon saks. Lag to flere snitt (om en tomme hver) gjennom benet på begge sideveggene. Bruk pinsett, løft den delvis kuttet stykke bein fra toppen av skallen for å avsløre hjernen.
  17. Ved hjelp av gode saks eller tang, løsne hjernen fra skallen og overføre til en petriskål med kald PBS på is.
    MERK: Pass på å unngå skader på hjernen mens du lager snittene gjennom benet.

3. Hippocampus Isolation

MERK: Utfør alle de påfølgende trinnene i denne delen på is.

  1. Plasser hjernen på en pre-avkjølt akrylhjernemassen på is. Ved hjelp av et barberblad, kuttet hjernen coronally på ca 7-8 mm fra anterior-mest edge av hjernen. Lag en andre kutt coronally og posterior til det første kuttet slik at en ca 5 mm tykk hjernen skive kan bli fjernet.
  2. Overføre hjernen skive til en petriskål med iskald PBS. Ved hjelp av barberblad, bryte de to halvkuleformede seksjoner og ta vare å merke seg hvilken halvkule tilsvarer venstre og høyre side hhv. Dette er spesielt viktig når du utfører ensidige stimuleringer.
  3. Ved hjelp av fin pinsett og saks fjerne hippocampus nøye.
  4. Flash fryse hippocampus vev på tørris og butikk i -20 ° C fryser til alt er klart for de påfølgende RNA ekstraksjon trinn.
    MERK: For langtidslagring, er det tilrådelig å lagre vev i en -80 ° C fryser.

4. RNA Utvinning og kvantitativ PCR

  1. Kontroller at vev forblir frosset på tørris til alt er klart for homogenisering.
  2. MERK: Utfør dette trinnet i panseret.
    1. Tilsett 1 ml Tri reagens til hippocampal vevet i en 1,5 ml sentrifugerør og homogenisere den ved første pipettering flere ganger inntil vevet brytes i mindre stykker. Ytterligere homogenisere vevet ved å passere gjennom en sprøyte med en 25 G nål til det ikke er ubrutt vev synlig. Utfør homogeniseringstrinnene på is.
    2. Etter homogenisering av vevet, at cellesuspensjonen stå ved romtemperatur i 5 min for å tillate cellelyse.
      MERK: Etter dette punktet cellesuspensjonen kan være rask frosset og lagret i -70 ° C inntil videre behandling.
  3. Tilsett 0.2 ml kloroform og bland ved virvling i 20 sek og la løsningen resten ved romtemperatur i 15 min.
  4. Sentrifuger prøvene ved 12 000 xg i 15 min ved 4 ° C. Etter sentrifugering fjerne rørene nøye uten å forstyrre de tre separate lag som vil være synlig.
    MERK: Den nedre (rød) fase inneholder proteiner, midt skyet fase inneholder DNA og toppen klare fase inneholder RNA.
  5. Overfør den øvre klare fase (RNA) i en frisk 1,5 ml sentrifugerør (typisk 500 pl av RNA-inneholdende fasen blir oppnådd). Til dette legger 0,5 ml isopropanol og bland ved virvling. Til dette legger 2-3 ul glykogen (20 mg / ml) som bærer for RNA. Tillat prøven å hvile på bordet ved romtemperatur i 10 min.
  6. Sentrifugere prøven ved 12 000 xg i 1 time ved 4 ° C. Kontroller at RNA pellet er synlig på bunnen av røret.
  7. Kast supernatanten og vask RNA pelleten ved å tilsette 1 ml av 75% etanol (laget med nuklease fritt vann). Invertere prøven flere ganger inntil pelleten løsner fra bunnen av røret og flyter i oppløsningen. Sentrifuger oppløsningen ved 12 000 xg i 10 min ved 4 ° C.
    MERK: pellet i 75% etanol kan lagres ved -20 ° C inntil ytterligere trinn.
  8. Tillat RNA pelleten lufttørke ved å la rørene åpen i 5 minutter ved romtemperatur. Ta forholdsregler for å unngå over tørking av pellets som dette kan påvirke dets oppløsning i vann i det etterfølgende trinn.

5. Fjerning DNA fra RNA Forberedelse

  1. Legg 9 mL nukleasefritt gratis vann til RNA pellet og sørge for at pellets er oppløst før du fortsetter med forsiktig virvling røret. Til dette legger en pl 10x DNase I-bufferen og 1 mL rekombinant DNase (fra DNase kit), bland forsiktig ved å sveipe rørene, kort spinne rørene og inkuber ved 37 ° C i et vannbad i 30 min.
  2. Tilsett 2 ul DNase inaktive reagens (fra DNase kit) til prøven og inkuber ved værelsetemperatur i 2 minutter og bland ofte ved forsiktig å sveipe røret. Sentrifuger ved 12000 x g i 10 min og overføring ca. 10 ul av den klare supernatant til en frisk 1,5 ml sentrifugerør.
  3. Mål RNA konsentrasjon ved hjelp av en Nanodrop eller spektrofotometer.

6. Å gjøre cDNA fra RNA

  1. Legg nødvendige volum thpå inneholder 1 ug av RNA og bringe det totale volum til 8 ul ved tilsetning av nuklease fritt vann. Til dette legger en ul 10 mM dNTP mix og en fil av tilfeldige heksamerer fra Hevet First Strand Synthesis Kit. Bland forsiktig og inkuber ved 65 ° C i 5 minutter i enten et vannbad eller på en forhåndsprogrammert termo.
  2. Foreta en forblanding inneholdende de følgende reagenser: 2 ul av 10 x RT-buffer, 4 pl av 25 M MgCl2, 2 pl 0,1 M DTT og 1 pl av RNAse OUT (40 U / ul).
    MERK: Volumene gitt er per reaksjon, vil brukeren trenger å skalere opp i henhold til ens eksperimentelle behov.
  3. Etter fjerning av RNA-inneholdende prøve fra 65 ° C, setter røret ved romtemperatur i et minutt. Legg 9 ul premix løsning og inkuber ved romtemperatur i 2 min. Tilsett 1 mL av Superscript II revers transkriptase-enzym (50 U / ul) og deretter inkubert ved romtemperatur i 10 min.
  4. Inkuber prøvene ved 42 ° C i 50min for revers transkripsjon til å forekomme.
  5. Inkuber prøvene ved 70 ° C i 15 min for å avslutte reaksjonen.
  6. Plassere prøvene på is kort og tilsett 1 ul RNaseH (2 U / pl) og inkuberes ved 37 ° C i 20 min.
  7. I korthet sentrifugere rørene ved 3000 x g for å spinne ned i kondensatvæske.
    MERK: Dette er den cDNA som skal brukes for kvantitativ PCR. cDNA kan lagres i -20 ° C fryser til PCR oppsett. cDNA kan også fortynnes med nukleasefritt gratis vann før du går videre til PCR.

7. Kvantitativ PCR

  1. Gjør en master mix inneholder følgende reagenser (volum som er oppgitt er per reaksjon): 6,3 mL av 2x SYBR Grønn Mix, 0,6 mL av Forward Primer (10 mm), 0,6 mL av Reverse Primer (10 mm) og 0,5 mL nukleasefritt gratis vann .
    MERK: Primer utformingen ble gjort ved hjelp av 'Pick Primere alternativet i NCBI sin nukleotidsekvens side for det aktuelle genet.
  2. Tilsett 10 ul Mastermix til hver brønn av en 96 godt PCR Plate. Legg 2,5 mL av cDNA gjort tidligere til brønnen inneholdende Mastermix. Sørg for å sette opp tre eksemplarer PCR reaksjoner for hver prøve.
  3. Etter fullført tilsetning av Mastermix og cDNA, dekker PCR-plate ved hjelp av et optisk klebefilm for å tette brønnen. Spinn platen et kort øyeblikk i 5 minutter ved 500 xg i en bordsentrifuge for å gjøre opp all væske til bunnen av brønnen.
  4. Installering av PCR-plate på en forhåndsprogrammert RT-PCR maskinen. Bruke PCR-parametrene som er gitt i tabell 1.
  5. Dataanalyse: Bruk C t-verdier fra qPCR utgang for videre beregninger. Sammen med test genet, satt opp PCR reaksjoner for intern kontroll gener, 18S rRNA (for å sikre lik input) og β-aktin (negativ kontroll). Beregne fold endringer basert på ΔΔCt metode 37.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figurene 1A og 1B viser den relative ekspresjon av BDNF og GABRD i forhold til kontrollgenet β-aktin. BDNF, er et neurotrofin ofte forbundet med nevrobeskyttende effekter i mange nevronale sykdommer 38-41. Det er derfor interessant å analysere ekspresjonen profilen til BDNF i respons til stimulering av ATN som gir terapeutiske fordeler til epileptiske pasienter. I figur 1A, som viser genekspresjon profilen til BDNF på tvers av de indikerte tidspunktene legge DBS stimulering, BDNF oppregulering observeres umiddelbart (0-t) etter at DBS operasjon sammen med toppen uttrykket (3 ganger større enn ustimulerte) ved 3 timers post stimulering. Denne observasjonen tyder på at BDNF forbedret ekspresjon og den resulterende neurobeskyttelse kunne bidra til den terapeutiske fordelen av DBS. Et annet gen GABRD (figur 1B) ble også undersøkt ved hjelp av metoden qPCR. GABRD er en GABA receptor WHIch er en av de potensielle mål for utforming anti-epilepsi narkotika 42. Uttrykket profilen til GABRD viser også forbedret uttrykk i de stimulerte dyr i forhold til de ustimulerte kontroll dyr på tre timer etter DBS. Tatt i betraktning at GABA agonister brukes som effektive anfallsdempere, er det interessant å observere forbedret GABRD uttrykk post DBS, impliserer en mulig rolle for GABA i den antiepileptisk effekt av DBS.

RT-PCR-protokollen som er beskrevet her gir reproduserbare og kvantitative resultater som avslører genutrykksmønster og de relative ganger forskjellen sammenlignet med kontrolldyrene. Dataanalyse blir utført på følgende måte: Den qPCR utgang gir terskel C t-verdien for test genet for hver analyserte prøve. C t-verdier er også oppnådd for kontroll genet β-aktin og 18S rRNA (inngangskontroll). Den ΔΔC t Metoden vil deretter brukes til å beregne genet expression profil ved hjelp av disse C t-verdier 37. For eksempel, for å beregne genekspresjon endringer for BDNF, for en gitt prøve blir differansen mellom C t verdi for BDNF og 18S rRNA beregnet og er den første A C t. For den samme prøven, blir differansen mellom den C-t-verdien for β-aktin og 18S rRNA beregnet til å gi den andre A C t. Forskjellen mellom de to A C t-verdiene er beregnet til å gi ΔΔC t. Denne ΔΔC t verdien brukes til å beregne to ^ (-ΔΔC t) som gir den relative mal mengde til BDNF sammenlignet β-aktin. Ved å plotte denne verdien på tvers av de forskjellige tidspunkter langs unstimulated kontroll, kan de genuttrykk endringer indusert av DBS over tidspunktene bli visualisert. Den ovenfor beskrevne fremgangsmåte kan brukes effektivt til å undersøke forandringer i ekspresjon av andre gener som er potensielle skjultater som er responsive til DBS stimulering og for å undersøke noen av de nedstrøms virkningene av å modulere ekspresjonen av disse genene.

Figur 1
Figur 1: (A) Tidsforløp analyse av BDNF-ekspresjon i respons på høy frekvens stimulering av ATN. Tissue høsting, RNA ekstraksjon, cDNA-preparat og q-PCR ble utført som beskrevet i protokollen. Relative endringer i genekspresjon er beregnet etter normal for inngang (ved amplifisering av 18S rRNA), samt en styre gen (β-aktin). C-t-verdier som oppnås fra den real-time PCR ble anvendt for å beregne uttrykket nivåer av ΔΔ C t-metoden 37. De tidspunktene analyseres er 0, 3, 6 og 12 timer etter DBS stimulering. Merk: Det valgte her tidspunkter er med hensyn til en bestemt studie, og kan endres i henhold til hypothesis og eksperimentelle plan. (B) Tid løpet analyse av GABA A reseptor delta subenheten (GABRD) nivåer i respons til DBS på 130 Hz rettet mot ATN. Metoder og beregninger ble gjort som ligner på BDNF data.

Figur 2
Figur 2: DBS elektroder og stimulator satt opp.

PCR Cycles
Trinn 1: Initial Denaturering 95 ° C 15 min
Trinn 2: Denaturering 95 ° C 15 sek
Gløding 60 ° C 30 sek
Forlengelse 72 ° C 30 sek
40 cykler av trinn 2
Merk: glødetemperaturen varierer i henhold til
primer smeltetemperatur. Primere er vanligvis utformet
til å ha en optimal glødetemperatur på 60 ° C

Tabell 1: PCR Parametere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Etter landemerke arbeid av Benabid et al. I å bruke dyp hjernestimulering for å behandle Parkinsons sykdom og essensiell tremor, har DBS kirurgiske teknikken blitt undersøkt med mye interesse det siste tiåret til å behandle mange nevrologiske lidelser 6,10,43. DBS-studier rettet mot forskjellige nevro-anatomiske regioner av hjernen kretsene er for tiden utført av mange grupper for å løse viktige neuronale sykdommer, og er i forskjellige faser av kliniske forsøk. Stimulering av subthalamic kjernen (STN), eller det innvendige segment av globus pallidus (GPI) er godkjent av FDA og brukes ved behandling av bevegelsesforstyrrelser, Parkinsons sykdom 10. Den SANTE klinisk studie har vist lovende tendenser for epileptiske pasienter som får høy frekvens stimulering av fremre thalamic kjernen 31. Resultater fra en fase I klinisk utprøving av bilateral forniceal stimulering har vist en forsinkelse i frekvensen av kognitiv svikt og en reVersal av glukose hypometabolic opptaket sett i Alzheimers sykdom samt aktivering av minnekretser 8,44. Videre, i de senere årene nevrokirurger har gjennomført DBS forsøk for behandling av nevropsykiatriske lidelser som OCD (Obsessive Compulsive Disorder), behandlingsresistent depresjon, Tourettes syndrom og avhengighet 10,45-55.

I tillegg til de kliniske studiene, i løpet av de siste årene, har dyr kirurgi tilbød oss gode muligheter til å studere de fysiologiske endringer indusert av den kirurgiske teknikken i et levende dyr, på en måte enestående av noen in vitro teknikk. I dette manuskriptet, har vi diskutert de metoder som er involvert i å utføre dyp hjernestimulering kirurgi hos gnagere. Stereo kirurgi hos gnagere som er beskrevet her kan også brukes for potensielle DBS target søkene og å teste effektiviteten av operasjonen ved hjelp av sykdomsmodell dyr. En av utfordringene for eksperimentator here er å være i stand til å målrette den riktige anatomiske locus på en reproduserbar måte. Det er spesielt et behov for en dyktig tekniker for operasjonen, fordi til korrekt målretting er bare mulig etter stimuleringen er ferdig, og dyret avlives. Også av og til, kanskje en utilsiktet skade en nøkkel blodkar som kan føre til betydelig blodtap, og noen ganger til og med død av dyret. I tillegg til behovet for å dissekere ut hippocampus for videre biokjemisk analyse begrenser muligheten for immunohistological verifikasjon for riktig elektrode målretting i samme dyr som krever en intakt hjerneprøve for vev seksjonering. Riktig elektrode målretting kunne kontrolleres på et annet dyr stimulert på samme måte. Men dette betyr ikke gi bevis for riktig målgruppe i testen dyr og er en begrensning av denne tilnærmingen. Nyere publikasjoner har forsøkt å omgå dette problemet ved å gjennomføre DBS kirurgi med simultans fMRI 56. En mulig forbedring av den teknikk som er beskrevet her kunne være en undersøkelse på effekten av kronisk stimulering via et implantert stimulator i dyret. Men vi har begrenset vår analyse for en enkelt dose (1 time) av høyfrekvent stimulering som det første skrittet for å forstå de endringer indusert av DBS på cellenivå.

Med tanke på bruk av DBS-operasjon for en rekke nerveforstyrrelser, er det viktig at vi vet mekanismen bak de gunstige virkningene av DBS. Denne informasjonen er avgjørende for å utvikle fremtidige forbedringer i kirurgi og også for å utforske nytten av DBS som behandling for andre tilstander som ikke er undersøkt av eksperter i DBS. I tillegg kan gjennomføres modifikasjoner av den kirurgiske teknikken for å unngå visse skadelige bivirkninger av fremgangsmåten, og for effektivt å håndtere tilbakefall av sykdomstilstanden.

En grundig mekanistisk analyse av DBS er mulig ved å undersøke genuttrykk endringer indusert av DBS. Enten en kandidat genet tilnærming basert på eksisterende kunnskap om nervebaner som reagerer på depolariseringsstimuli som høy frekvens stimulering, eller en global transkriptom analyse kan gi viktig innsikt i de molekylære hendelser utløst av DBS. Genuttrykksanalysen teknikker (kandidat genet tilnærming samt høy gjennomstrømming metoden) er kraftige verktøy som er nøkkelen til å utforske de molekylære mekanismer og celleforandringer forbundet med DBS kirurgi. Den siste utviklingen i dette området har gjort det mulig for oss å få et vell av informasjon om flere aspekter av mobilnettet fysiologi i en svært kort tid, som ikke var mulig for noen år siden. Med bruk av høy gjennomstrømning sekvense teknologi som ChIPseq, er det mulig å karakterisere genom-wide plasseringen av viktige transkripsjonsfaktorer som reagerer på DBS 57,58. Nylige funn knytter ikkekodende RNA som mikroRNA med nevrodegenerative sykdommer, gjør oss i stand til å analysere mulige endringer i miRNA nivåer i nevroner post-DBS bruker miRNA sekvenseringsteknologi 59,60. Mulige endringer i epigenetiske signaturer slik DNA-metylering og histonmodifikasjonene i respons til DBS kan også bli utforsket. Imidlertid, til tross for de fordeler, er det viktig å erkjenne noen av begrensningene ved disse teknikker, så vel som potensielle problemer som kan oppstå i løpet av analyser. En viktig bekymring med genuttrykk analyser har vært reproduserbarhet og tekniske feil. Det er viktig at eksperimentator tar dette til etterretning, og har planer om å ha tilstrekkelig antall repetisjoner for å sikre pålitelighet. Et vanlig problem med noen av de høye throughput screening studier har vært vanskeligheten ved tolkning av den enorme mengden data som er generert. Noen ganger blir det viktig å finne ut om de genuttrykk observerte endringene skyldes den direkte effektenav den eksperimentelle behandling eller er en nedstrøms effekt. Dette krever vanligvis flere studier som er designet for å løse dette problemet.

I tillegg til de genomiske studier, vil en omfattende immunhistokjemisk analyse av rom-tid-lokalisering av de sentrale aktørene som reagerer på DBS og en kvantifisering av endringene i sine nivåer i ulike regioner av hjernen være en stor ressurs for fremtidig utvikling av DBS kirurgisk prosedyre. De kumulative funn fra genuttrykk analyser samt immunhistokjemiske studier kan avsløre nye interaksjoner mellom sentrale faktorer samt viktige molekylære hendelser som regulerer cellulære prosesser som neurogenesis eller neurodegenerasjon. Identifisering av slike kritiske molekylære markører kan også aktivere framtidige narkotikafunn. Slike funn kan kaste lys over den generelle funksjon av hjernen krets, som er verdifull informasjon fra perspektivet til forskere som arbeider for å forstå menneskety nevronale sykdommer. Dirigere våre fremtidige innsats på å integrere nyeste teknologiske fremskritt gjort i klinikken samt laboratoriet er sannsynlig å tilby oss store fordeler i kampen mot sykdommen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Deep Brain Stimulation Surgery
Stereotactic frame Kopf Instruments Model 900
Drill  Dremmel 7700, 7.2 V
Scalpel BD 372610
Ketamine Patterson Veterinary 07-803-6637 Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules
Xylazine Patterson Veterinary 07-808-1947
Buprenorphine Patterson Veterinary 07-850-2280 Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules
Surgical staples ConMed Corporation 8035
Sutures (3-0)  Harvard Apparatus 72-3333
Syringe (1 ml, 29 1/2 G) BD 329464 Sterile, use for Anesthesia administration intraperitoneally
Syringe (3 ml, 25 G) BD 309570 Sterile, use for Analgesia administration subcutaneously
Needles BD 305761 Sterile, use for clearing broken bone pieces from the burr holes
Ethanol Fisher Scientific S25309B Use for general sterilization 
Eye Lubricant Fisher Scientific 19-898-350
Stimulator Medtronic Model 3628
DBS electrodes Rhodes Medical Instruments, CA SNEX100x-100 mm Electrodes are platinum, concentric and bipolar
Betadine (Povidone-Iodine)  PDI S23125 Single use swabsticks, use for sterilizing the scalp before making incision 
 Brain Dissection and Hippocampal tissue isolation
Acrylic Rodent Brain Matrix Electron Microscopy Sciences 175-300 www.emsdiasum.com
Razor Blade V W R 55411-050
Guillotine Scissors Clauss 18039 For decapitation, make sure these scissors are maintained in clean and working condition
Scissors Codman Classic 34-4098 Use for removing the brain from the skull
Forceps Electron Microscopy Sciences 72957-06 Use for removing the brain from the skull and for handling during dissection
Phosphate Buffered Saline  Boston Bioproducts BM-220
 RNA Extraction and cDNA Preparation
Tri Reagent Sigma T9424 Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin
Syringe (3 ml, 25 G) BD 309570 Use for tissue homogenization
Chloroform Fisher Scientific BP1145-1 Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin
Isopropanol Fisher Scientific A416-1
Glycogen Thermo Scientific R0561
Dnase I Kit Ambion AM1906
Superscript First Strand Synthesis Kit Invitrogen 11904-018
Tabletop Microcentrifuge Eppendorf 5415D
 Quantitative PCR               
SYBR Green PCR Kit Qiagen 204143
Custom Oligos Invitrogen 10668051
PCR Plates (96 wells) Denville Scientific C18080-10
Optical Adhesive Sheets Thermo Scientific AB1170
Nuclease free Water Thermo Scientific SH30538-02
Real Time PCR Machine Applied Biosystems 7500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Toda, H., Hamani, C., Fawcett, A. P., Hutchison, W. D., Lozano, A. M. The regulation of adult rodent hippocampal neurogenesis by deep brain stimulation. Journal of. 108, 132-138 (2008).
  2. Perlmutter, J. S., Mink, J. W. Deep brain stimulation. Annual review of neuroscience. 29, 229-257 (2006).
  3. Bergstrom, M. R., Johansson, G. G., Laitinen, L. V., Sipponen, P. Electrical stimulation of the thalamic and subthalamic area in cerebral palsy. Acta physiologica Scandinavica. 67, 208-213 (1966).
  4. Benabid, A. L., et al. Chronic electrical stimulation of the ventralis intermedius nucleus of the thalamus as a treatment of movement disorders. Journal of neurosurgery. 84, 203-214 (1996).
  5. Benabid, A. L., et al. Long-term electrical inhibition of deep brain targets in movement disorders. Movement disorders : official journal of the Movement Disorder Society. 13, Suppl 3. 119-125 (1998).
  6. Benabid, A. L., et al. Long-term suppression of tremor by chronic stimulation of the ventral intermediate thalamic nucleus. Lancet. 337, 403-406 (1991).
  7. Tierney, T. S., Lozano, A. M. Surgical treatment for secondary dystonia. Movement disorders : official journal of the Movement Disorder Society. 27, 1598-1605 (2012).
  8. Tierney, T. S., Sankar, T., Lozano, A. M. Some recent trends and further promising directions in functional neurosurgery. Acta neurochirurgica. Supplement. 117, 87-92 (2013).
  9. Tierney, T. S., Sankar, T., Lozano, A. M. Deep brain stimulation emerging indications. Progress in brain research. 194, 83-95 (2011).
  10. Sankar, T., Tierney, T. S., Hamani, C. Novel applications of deep brain stimulation. Surgical neurology international. 3, S26-S33 (2012).
  11. Tierney, T. S., Vasudeva, V. S., Weir, S., Hayes, M. T. Neuromodulation for neurodegenerative conditions. Frontiers in bioscience. 5, 490-499 (2013).
  12. Mayberg, H. S., et al. Deep brain stimulation for treatment-resistant depression. Neuron. 45, 651-660 (2005).
  13. Lyons, M. K. Deep brain stimulation: current and future clinical applications. Mayo Clinic proceedings. 86, 662-672 (2011).
  14. Ch. 4. Rehabilitation in movement disorders. Lansek, R., Morris, M. E. , Cambridge University Press. 36-43 (2013).
  15. Goodwin, R., Tierney, T., Lenz, F., Anderson, W. Ch. 15. Single Neuron Studies of the Human Brain: Probing Cognition. Fried, I., Rutishauser, U., Cerf, M., Kreiman, G. 15, MIT Press. 275-293 (2014).
  16. Hauser, W. A. Epidemiology of epilepsy in children. Neurosurgery clinics of North America. 6, 419-429 (1995).
  17. Hauser, W. A. Recent developments in the epidemiology of epilepsy. Acta neurologica Scandinavica. Supplementum. 162, 17-21 (1995).
  18. Davis, R., Emmonds, S. E. Cerebellar stimulation for seizure control: 17-year study. Stereotactic and functional neurosurgery. 58, 200-208 (1992).
  19. Levy, L. F., Auchterlonie, W. C. Chronic cerebellar stimulation in the treatment of epilepsy. Epilepsia. 20, 235-245 (1979).
  20. Velasco, A. L., et al. Electrical stimulation of the hippocampal epileptic foci for seizure control: a double-blind, long-term follow-up study. Epilepsia. 48, 1895-1903 (2007).
  21. Tellez-Zenteno, J. F., McLachlan, R. S., Parrent, A., Kubu, C. S., Wiebe, S. Hippocampal electrical stimulation in mesial temporal lobe epilepsy. Neurology. 66, 1490-1494 (2006).
  22. Kerrigan, J. F., et al. Electrical stimulation of the anterior nucleus of the thalamus for the treatment of intractable epilepsy. Epilepsia. 45, 346-354 (2004).
  23. Hamani, C., et al. Deep brain stimulation of the anterior nucleus of the thalamus: effects of electrical stimulation on pilocarpine-induced seizures and status epilepticus. Epilepsy research. 78, 117-123 (2008).
  24. Hamani, C., et al. Bilateral anterior thalamic nucleus lesions and high-frequency stimulation are protective against pilocarpine-induced seizures and status epilepticus. Neurosurgery. 54, 191-195 (2004).
  25. Mirski, M. A., Rossell, L. A., Terry, J. B., Fisher, R. S. Anticonvulsant effect of anterior thalamic high frequency electrical stimulation in the rat. Epilepsy research. 28, 89-100 (1997).
  26. Mirski, M. A., Ferrendelli, J. A. Interruption of the mammillothalamic tract prevents seizures in guinea pigs. Science. 226, 72-74 (1984).
  27. Mirski, M. A., Ferrendelli, J. A. Anterior thalamic mediation of generalized pentylenetetrazol seizures. Brain research. 399, 212-223 (1986).
  28. Mirski, M. A., Ferrendelli, J. A. Interruption of the connections of the mammillary bodies protects against generalized pentylenetetrazol seizures in guinea pigs. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 7, 662-670 (1987).
  29. Mirski, M. A., McKeon, A. C., Ferrendelli, J. A. Anterior thalamus and substantia nigra: two distinct structures mediating experimental generalized seizures. Brain research. 397, 377-380 (1986).
  30. Lee, K. J., Jang, K. S., Shon, Y. M. Chronic deep brain stimulation of subthalamic and anterior thalamic nuclei for controlling refractory partial epilepsy. Acta neurochirurgica. Supplement. 99, 87-91 (2006).
  31. Fisher, R., et al. Electrical stimulation of the anterior nucleus of thalamus for treatment of refractory epilepsy. Epilepsia. 51, 899-908 (2010).
  32. Encinas, J. M., Hamani, C., Lozano, A. M., Enikolopov, G. Neurogenic hippocampal targets of deep brain stimulation. The Journal of comparative neurology. 519, 6-20 (2011).
  33. Hattiangady, B., Rao, M. S., Shetty, A. K. Chronic temporal lobe epilepsy is associated with severely declined dentate neurogenesis in the adult hippocampus. Neurobiology of disease. 17, 473-490 (2004).
  34. Kuruba, R., Hattiangady, B., Shetty, A. K. Hippocampal neurogenesis and neural stem cells in temporal lobe epilepsy. Epilepsy & behavior : E&B. 14, Suppl 1. 65-73 (2009).
  35. Hattiangady, B., Shetty, A. K. Implications of decreased hippocampal neurogenesis in chronic temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 49, Suppl 5. 26-41 (2008).
  36. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Elsevier Inc. (2007).
  37. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 22DDCT Method. METHODS. 25, 402-408 (2001).
  38. Kells, A. P., et al. AAV-mediated gene delivery of BDNF or GDNF is neuroprotective in a model of Huntington disease. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 9, 682-688 (2004).
  39. Han, B. H., Holtzman, D. M. BDNF protects the neonatal brain from hypoxic-ischemic injury in vivo via the ERK pathway. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 20, 5775-5781 (2000).
  40. Hetman, M., Kanning, K., Cavanaugh, J. E., Xia, Z. Neuroprotection by brain-derived neurotrophic factor is mediated by extracellular signal-regulated kinase and phosphatidylinositol 3-kinase. The Journal of biological chemistry. 274, 22569-22580 (1999).
  41. Stadelmann, C., et al. BDNF and gp145trkB in multiple sclerosis brain lesions: neuroprotective interactions between immune and neuronal cells. Brain : a journal of neurology. 125, 75-85 (2002).
  42. Treiman, D. M. GABAergic mechanisms in epilepsy. Epilepsia. 42, Suppl 3. 8-12 (2001).
  43. Benabid, A. L., Pollak, P., Louveau, A., Henry, S., de Rougemont, J. Combined (thalamotomy and stimulation) stereotactic surgery of the VIM thalamic nucleus for bilateral Parkinson disease. Applied neurophysiology. 50, 344-346 (1987).
  44. Laxton, A. W., et al. A phase I trial of deep brain stimulation of memory circuits in Alzheimer's disease. Annals of. 68, 521-534 (2010).
  45. Tierney, T. S., Abd-El-Barr, M. M., Stanford, A. D., Foote, K. D., Okun, M. S. Deep brain stimulation and ablation for obsessive compulsive disorder: evolution of contemporary indications, targets and techniques. The International journal of neuroscience. 124, 394-402 (2014).
  46. Kennedy, S. H., et al. Deep brain stimulation for treatment-resistant depression: follow-up after 3 to 6 years. The American journal of psychiatry. 168, 502-510 (2011).
  47. Lozano, A. M., et al. Subcallosal cingulate gyrus deep brain stimulation for treatment-resistant depression. Biological psychiatry. 64, 461-467 (2008).
  48. Ackermans, L., et al. Double-blind clinical trial of thalamic stimulation in patients with Tourette syndrome. Brain : a journal of neurology. 134, 832-844 (2011).
  49. Houeto, J. L., et al. Tourette's syndrome and deep brain stimulation. Journal of neurology, neurosurgery, and psychiatry. 76, 992-995 (2005).
  50. Maciunas, R. J., et al. Prospective randomized double-blind trial of bilateral thalamic deep brain stimulation in adults with Tourette syndrome. Journal of neurosurgery. 107, 1004-1014 (2007).
  51. Koning, P. P., Figee, M., van den Munckhof, P., Schuurman, P. R., Denys, D. Current status of deep brain stimulation for obsessive-compulsive disorder: a clinical review of different targets. Current psychiatry reports. 13, 274-282 (2011).
  52. Greenberg, B. D., et al. Deep brain stimulation of the ventral internal capsule/ventral striatum for obsessive-compulsive disorder: worldwide experience. Molecular psychiatry. 15, 64-79 (2010).
  53. Muller, U. J., et al. Successful treatment of chronic resistant alcoholism by deep brain stimulation of nucleus accumbens: first experience with three cases. Pharmacopsychiatry. 42, 288-291 (2009).
  54. Zhou, H., Xu, J., Jiang, J. Deep brain stimulation of nucleus accumbens on heroin-seeking behaviors: a case report. Biological psychiatry. 69, e41-e42 (2011).
  55. Porta, M., et al. Thalamic deep brain stimulation for treatment-refractory Tourette syndrome: two-year outcome. Neurology. 73, 1375-1380 (2009).
  56. Younce, J. R., Albaugh, D. L., Shih, Y. Y. Deep brain stimulation with simultaneous FMRI in rodents. Journal of visualized experiments : JoVE. , e51271 (2014).
  57. Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature reviews. Genetics. 10, 669-680 (2009).
  58. Valouev, A., et al. Genome-wide analysis of transcription factor binding sites based on ChIP-Seq data. Nature methods. 5, 829-834 (2008).
  59. Fiore, R., Siegel, G., Schratt, G. MicroRNA function in neuronal development, plasticity and disease. Biochimica et biophysica acta. 1779, 471-478 (2008).
  60. Hebert, S. S., De Strooper, B. Alterations of the microRNA network cause neurodegenerative disease. Trends in neurosciences. 32, 199-206 (2009).

Tags

Nevrovitenskap anterior thalamic kjernen dyp hjernestimulering dentate gyrus hippocampus epilepsi genekspresjon høyfrekvente stimulering kvantitativ RT-PCR
Analyse av genuttrykk Endringer i Rat Hippocampus Etter dyp hjernestimulering av fremre talamiske Nucleus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Selvakumar, T., Alavian, K. N.,… More

Selvakumar, T., Alavian, K. N., Tierney, T. Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus. J. Vis. Exp. (97), e52457, doi:10.3791/52457 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter