Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Analyse af genekspression Ændringer i rottehippocampus Efter Deep Brain Stimulation af den forreste thalamiske Nucleus

Published: March 8, 2015 doi: 10.3791/52457
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Neurosurgery, Brigham & Women's Hospital, Harvard Medical School, 2Division of Brain Sciences, Department of Medicine, Imperial College London

Abstract

Deep Brain Stimulation (DBS) kirurgi, målrettet forskellige områder i hjernen, som den basale ganglier, thalamus, og subthalamisk regioner, er en effektiv behandling for flere bevægelsesforstyrrelser, der ikke har reageret på medicin. Nylige fremskridt inden for DBS kirurgi er begyndt at udvide anvendelsen af ​​denne kirurgisk teknik til andre forhold så forskellige som morbid fedme, depression og obsessiv-kompulsiv sygdom. På trods af disse ekspanderende indikationer, vides der kun lidt om de underliggende fysiologiske mekanismer, som letter de gavnlige virkninger af DBS kirurgi. En metode til dette spørgsmål er at udføre genekspressionsanalyse i neuroner, der modtager den elektriske stimulation. Tidligere undersøgelser har vist, at neurogenese i rotte gyrus dentatus fremkaldes i DBS målretning af den forreste kerne af thalamus 1. DBS kirurgi målretning ATN anvendes bredt til behandling refraktær epilepsi. Det er således af meget interest for os at udforske de transkriptionelle forandringer som følge af elektrisk stimulering af ATN. I dette manuskript, beskriver vi vores metoder til stereotaktisk guidet DBS operation rettet mod ATN hos voksne Wistar rotter. Vi diskuterer også de efterfølgende trin for væv dissektion, RNA isolering, cDNA forberedelse og kvantitativ RT-PCR til måling af genekspression ændringer. Denne metode kunne anvendes og modificeres til at stimulere basalganglierne og andre regioner af hjernen almindeligt klinisk målrettede. Den genekspression undersøgelse beskrevet her antager en kandidat målgen tilgang for at opdage molekylære spillere, der kunne dirigere mekanismen for DBS.

Introduction

Historien bag udviklingen af Deep Brain Stimulation som neurokirurgisk teknik går tilbage til 1870'erne, hvor muligheden for elektrisk stimulere hjernen kredsløb blev udforsket 2. Brugen af kronisk højfrekvent stimulering som behandling for neuronale lidelser startede i 1960'erne 3. Senere i 1990'erne med fremkomsten af kronisk implantation DBS elektroder 4-6, antallet af neuronale lidelser, der blev behandlet af DBS fortsatte med at stige. Deep Brain Stimulation blev første gang brugt i USA til behandling af essentiel tremor 6. I dag operationen anvendes bredt til behandling af neuronale lidelser, der i øjeblikket uhelbredelige af farmakologisk intervention. DBS er i øjeblikket anvendes til behandling af bevægelsesforstyrrelser på Parkinsons sygdom og dystoni 7-9. Alzheimers demens, Huntingtons sygdom, epilepsi, smerte og neuropsykiatriske sygdomme, såsom depression, OCD, Tourette7; s syndrom og afhængighed er nogle af de betingelser, der er modtagelige for behandling af DBS 10-12. Mens DBS kirurgi er FDA godkendt til behandling af Parkinsons sygdom, dystoni og essentiel tremor, anvendelse af DBS til behandling af andre tilstande, der er nævnt ovenfor, er i forskellige stadier af lab og kliniske studier, der tilbyder meget løfte til patienter 13,14.

Klinisk er DBS operation udføres i to faser. Den første fase omfatter kirurgisk placering af DBS elektroderne på det målrettet anatomiske placering ved hjælp af en kombination af radiologisk positionering, CT, MR samt mikroelektrode aflæsninger for øget præcision. Det andet trin indebærer implantere en impulsgenerator i patientens øvre bryst og installere forlængerledninger fra hovedbunden til impulsgeneratoren. Baseret på den neurologiske tilstand har flere programmering ordninger for impulsgeneratoren blevet standardiseret og vil blive anvendt til at levere den ønskede spænding. Den endelige volTage er nået på en trinvis måde for at modtage den bedste kliniske respons med minimal spænding 15. Men i vores studier, i modsætning til de kroniske DBS implantater anvendes klinisk, for overskuelighedens skyld, har vi tyet til at studere en engangs-højfrekvent stimulering (1 time) i vores dyremodeller.

En del af vores gruppe forskning fokuserer på at undersøge brugen af ​​DBS kirurgi til behandling-resistent epilepsi. Stereotaktisk kirurgiske metoder, der anvender højfrekvent stimulation er blevet undersøgt af mange andre som et effektivt alternativ til behandling af medicinsk refraktær epilepsi, som udgør omkring 30% af alle tilfælde af epilepsi 10,16,17. Cerebellare stimulation målrette kortikale overflade samt de dybe cerebellare kerner er blevet anvendt i fortiden som mål til behandling af epilepsi 10,18,19. Derudover har hippocampus stimulation også været forsøgt, men med blandede resultater 20,21. Nogle af de andre undersøgteDBS mål for epilepsi omfatter cerebral cortex, thalamus, subthalamisk kerne og vagus nerve 8. Men følgende resultater fra flere studier i de seneste par år, har den forreste thalamiske kerne (ATN) vist sig som den mest almindelige DBS mål for epilepsi behandling 10,22. Baseret på viden om neuroanatomiske kredsløb og resultater fra dyremodeller, har flere undersøgelser fokuseret på den terapeutiske virkning af deep brain stimulation af ATN behandling af epilepsi 23-26. ATN er en del af det limbiske kredsløb og er placeret i området af hjernen, der påvirker hyppigheden af ​​anfald. Undersøgelser foretaget af Hamani et al., Har testet effekten af ATN-DBS i en pilocarpin-induceret epilepsi model og fandt, at den bilaterale ATN stimulation forlænget latenstider for pilocarpin-inducerede anfald og status epilepticus 24. Endvidere blev højfrekvent stimulering af ATN sig at reducere hyppigheden af ​​anfald i en pentylentetrazol (PTZ) model af epilepsy 25,27-29. Lee et al., Har rapporteret en gennemsnitlig reduktion i anfaldshyppighed med omkring 75% ved kronisk dyb brain stimulation af ATN i behandling refraktær partiel epilepsi 30.

En nylig klinisk undersøgelse af behandling-resistent epilepsi har vist lovende resultater efter DBS operation rettet mod forreste thalamiske kerne (ATN) 22. En multicenter randomiseret klinisk forsøg med 110 patienter, der gennemgik bilateral DBS for ATN til behandling ildfast epilepsi (SANTE forsøg) viste en nedgang i hyppigheden af anfald med ca. 40% 31. Resultaterne fra denne undersøgelse også antydet på en forsinket optimal antiepileptisk effekt observeret ved 2-3 måneder postoperativt. Yderligere undersøgelser af Toda et al., Bekræftede med disse resultater, hvor de demonstrerede neurogenese sker på et senere tidspunkt post DBS (dage 3-5) i dyremodeller 1. Desuden Encinas et al., Har rapporteret hippocampus neurogenesis i voksne mus gyrus dentatus efter højfrekvent stimulering af ATN 32. Tidligere undersøgelser 33-35 har rapporteret faldende hippocampus neurogenese i visse epileptiske tilfælde som kronisk FLE og en forening med læring underskud, hukommelsessvækkelse og spontane tilbagevendende motoriske anfald. Desuden var der en reduktion i neurale stamceller progenitor faktorer såsom FGF2 og IGF-1 i kronisk epileptiske hippocampus i dyremodeller 33. I betragtning af dette, interventionelle strategier såsom DBS, der viser en forøgelse af neurogenese i den tandede gyrus er spændende muligheder for forskning. Disse resultater har tilskyndet os til at udforske yderligere dybt ind i mekanismen underliggende neurogenese efter DBS behandling for epilepsi. Vi har målrettet den ATN både ensidigt (data ikke rapporteret) samt bilateralt (i repræsentative resultater) og set forhøjede neurotrofin (BDNF) udtryk i rotte gyrus dentatus. Vores cNUVÆRENDE hypotese er, at BDNF udtryk initierer en genekspression kaskade, der kulminerer i neurogenese, der oversætter til den anti-epileptiske virkning DBS kirurgi. I denne artikel præsenterer vi vores metoder til DBS kirurgi målretning ATN hos rotter efterfulgt af genekspression analyse som en attraktiv tilgang til at undersøge den mekanisme, der ligger til grund fordelene ved DBS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: Etik Statement: Alle procedurer der omtales i dette manuskript er i overensstemmelse med NIH retningslinjer for Animal Research (Guide til pleje og anvendelse af forsøgsdyr) og er godkendt af Harvard Medical School IACUC udvalg.

1. Pre-kirurgisk Forberedelse

  1. Kontroller, at alle kirurgiske instrumenter steriliseres ved enten autoklavering eller ved udrensning med antiseptisk opløsning og / eller ethanol som nødvendigt. Hvor det er muligt, brug sterilt engangsudstyr såsom skalpeller, nåle- og sprøjter.
  2. Dæk arbejdsbord med kirurgiske gardiner og sikre, at der er en bortskaffelse biologisk farligt affald til rådighed.
  3. Rotten vejes, og beregne anæstesi dosis. Brug en Ketamin / Xylazin-blanding (Ketamin 75 mg / kg og xylazin 10 mg / kg) for at bedøve rotter.
    BEMÆRK: Mellem 200-250 g er den optimale vægt for korrekt fiksering af dyret i stereotaktisk ramme samt til præcis målretning af ATN. IsoflurAne kan også anvendes som bedøve agent.
  4. Mount og sikre to sterile elektroder (steriliseret ved autoklavering eller med ethylenoxid) på elektrodeholder (figur 2), i en stereotaktisk kirurgisk ramme og med hjælp af et mikroskop (10-40X forstørrelse), inspicere spidsen af elektroden for korrekt tilpasning. Fastgør de to elektroder 3,0 mm.
    BEMÆRK: Sørg for at undgå at beskadige elektroden spids ved at trykke på hårde overflader.

2. DBS Surgery

  1. Injicer Ketamin / Xylazin mix intraperitonealt til dyret, og bekræft, at dyret har nået en kirurgisk plan anæstesi (ved at kontrollere for tå-pinch refleks, respirationsfrekvens og dybde og formelle vejrtrækning). Fjerne hår fra det område af hovedbunden, der vil blive indsnit og desinficere hovedbunden med 3 skiftende krat hver af betadin og enten alkohol eller sterilt saltvand. Sikker og placere dyret på stereotaktisk frame.
  2. Brug cirkulerende varmt vand pads at opretholde dyrets kropstemperatur på et optimalt niveau. Anvend øjet smøremiddel til dyrets øjne til at beskytte mod udtørring.
  3. Brug følgende stereotaktiske koordinater for at målrette ATN (Anterior thalamiske kerne): anterioposterior -1,6 mm, mediolateral 1,5 mm og dorsoventral 5,2 mm 1.
    BEMÆRK: De stereotaktiske koordinater er baseret på Paxinos og Watson (6 th edition) rottehjerne atlas 36.
  4. Lave et snit i hovedbunden sagittalt at afsløre kraniet. Anvendelse af et par af retraktorer sikre indsnit hovedbunden for at blotlægge kraniet. Brug sterilt saltvand til at skylle snittet. Hvis indsnit er for vådt, bruge sterile vatpinde til tørre. Find bregma og markere med en sort markør. For at vejlede placeringen af ​​burr huller, lave to mærker ved ca. 1,5 mm mediolaterally på begge sider af den sagittale sutur og 1,6 mm posteriort for Coronal sutur.
  5. Brug en håndholdt boremaskine til at Burr huller. Sørg spidsen af ​​borehullet er sterilt ved at sterilisere det med ethanol. Hold boret på omkring en 45 ° vinkel i forhold til kraniet overfladen, når der bores. Ofte skifte mellem de to burr huller for at undgå overdreven varme ved placeringen af ​​et borehul.
  6. Fortsæt boring indtil dura er udsat for. Ved hjælp af en nål med spids bøjet ligner formen af ​​en "L", fjerne knækkede stykker af knogle, der ville hindre insertion af elektroden. Vær omhyggelig med at undgå at beskadige underliggende dura og / eller hjernevæv samtidig fjerne knoglefragmenter ved hjælp af bøjet nål.
    BEMÆRK: Ved hjælp af en stump nål eller fine stumpe pincet er også en mulighed.
  7. Fastgør den dobbelte elektrode fast på roterende håndtag stereotaktisk ramme og fastsætte håndtaget i en 90 ° vinkel. Brug af justeringer i stereotaktisk ramme, placere venstre elektrode nøjagtigt over bregma.
  8. Brug af stereotaktik justeringer for mediolateral positionering, præcist flyttes venstre elektrode 1,5 mm til venstre side af bregma, således at der nu er to elektroder perfekt på linie langs den koronale sutur men indbyrdes afstand på 1,5 mm mediolaterally fra bregma.
  9. Brug af anterioposterior stereotaktiske justeringer flytte elektroderne 1,6 mm posteriort for koronale sutur.
  10. Brug dorsoventral justeringer for at sænke elektroderne til første kontrol, hvis burr huller er blevet foretaget på det rigtige sted, så elektroderne kan indsættes med lethed, uden at røre de uslebne kanter af burr huller. Hvis ja, indsætte elektroderne til en dybde på 5,2 mm fra overfladen af ​​kraniet.
  11. Forbind elektroderne via fører til en stimulator fastsat til 130 Hz, 2,5 V og 90 psek pulsewidth 1.
  12. Lever høj frekvens stimulation i en time (eller for en ønsket periode som pr forsøgsopstilling). I løbet af den stimulation, husk at sikre pRoper bedøvelse dybde regelmæssigt ved at kontrollere for fravær af tilbagetrækning fod som reaktion på en tå knivspids. Supplement anæstesi med omtrent halvdelen af ​​den oprindelige dosis, der anvendes til at inducere anæstesi. Undgå forurening af dine sterile handsker, når du tjekker bedøvelse dybde og ændre dem om nødvendigt. Udfør unilateral eller bilateral stimulation baseret på ens eksperimentelle behov. Medtag kontroller såsom lavfrekvent stimulation (for eksempel., 10 Hz) og stimulerede dyr (indsætte elektroder uden efterfølgende stimulation).
  13. Efter stimulation er færdig, skal du fjerne elektroderne omhyggeligt og suturere snittet med 3-0 suturer eller med sterile kirurgiske hæfteklammer.
  14. Indgives buprenorphin (0,05 mg / kg) subkutant som analgesi. Overvåg dyret indtil det vender tilbage til normal aktivitet og derefter returnere det til huset facilitet.
  15. Efter en nærmere fastsat periode baseret på den eksperimentelle design (for eksempel, 0, 3, 6 eller 12 timer efter DBS kirurgi), Aflive dyret med anæstesi overdosis. Efter bekræftelse af fraværet af vitale tegn, halshugge dyret.
  16. Dissekere ud hjernen ved først at fjerne huden med en saks. Skær gennem knoglen langs sagittale sutur hjælp dissektion saks. Lav to snit mere (omkring en tomme hver) gennem knoglen på begge de laterale sider. Ved hjælp af pincet løfte delvist afskåret stykke knogle fra toppen af ​​kraniet for at blotlægge hjernen.
  17. Brug fine saks eller pincet, fjerne hjernen fra kraniet og overføre til en petriskål med kold PBS på is.
    BEMÆRK: Sørg for at undgå skader på hjernen, samtidig med at de indsnit gennem knoglen.

3. Hippocampus Isolation

BEMÆRK: Udfør alle de efterfølgende trin i dette afsnit på is.

  1. Placer hjernen på en forud afkølet akryl hjerne matrix på is. Ved hjælp af et barberblad, skåret hjernen coronalt på ca. 7-8 mm fra den forreste længst edge af hjernen. Foretag en anden cut coronalt og posteriort for første snit, således at en cirka 5 mm tyk hjerne skive kan fjernes.
  2. Overfør hjernen skive til en petriskål med iskoldt PBS. Ved hjælp af barberblad, skille de to halvkugleformede sektioner og sørge for at notere hvilken halvkugle svarer til venstre og højre side hhv. Dette er især vigtigt, mens de udfører ensidige stimulationer.
  3. Med fin pincet og saks fjerne hippocampus omhyggeligt.
  4. Flash fryse hippocampus væv på tøris og opbevares i -20 ° C fryser indtil den er klar til de efterfølgende RNA ekstraktionstrin.
    BEMÆRK: langtidsopbevaring, er det tilrådeligt at lagre væv i en -80 ° C fryser.

4. RNA ekstraktion og kvantitativ PCR

  1. Sørg for, at vævet forbliver frosset på tøris indtil den er klar til homogenisering.
  2. BEMÆRK: Udfør dette trin i hætten.
    1. Der tilsættes 1 ml Tri reagens til Hippocampal væv i et 1,5 ml centrifugerør og homogeniseres ved første pipettering flere gange, indtil vævet er brudt i mindre stykker. Yderligere homogeniseres vævet ved passage gennem en sprøjte med en 25 G nål, indtil der ikke er nogen ubrudt væv synlige. Udfør homogeniseringen trin på is.
    2. Efter homogenisering af vævet, tillade cellesuspensionen henstå ved stuetemperatur i 5 minutter for at tillade cellelyse.
      BEMÆRK: Når dette punkt cellesuspensionen kan være hurtig frosset og opbevaret i -70 ° C indtil yderligere forarbejdning.
  3. Tilsæt 0,2 ml chloroform og vortexes i 20 sekunder, hvorefter opløsningen hvile ved stuetemperatur i 15 min.
  4. Centrifugeres prøverne ved 12.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C. Efter centrifugering fjernes rørene forsigtigt uden at forstyrre de tre separate lag, som vil være synlige.
    BEMÆRK: Den nederste (rød) fase indeholder proteiner, midterste overskyet fase indeholder DNA og den øverste klare fase indeholder RNA.
  5. Overfør den øverste klare fase (RNA) i et frisk 1,5 ml centrifugerør (typisk 500 pi af RNA indeholdende fase opnås). Til dette tilsættes 0,5 ml isopropanol og vortexes. Til denne tilføjelse 2-3 pi glykogen (20 mg / ml) som bærer for RNA. Lad prøven hvile på bordet ved stuetemperatur i 10 min.
  6. Centrifugeres prøven ved 12.000 x g i 1 time ved 4 ° C. Kontroller, at RNA-pelleten er synlig på bunden af ​​glasset.
  7. Supernatanten fjernes, og vaske RNA pellet ved tilsætning af 1 ml 75% ethanol (fremstillet med nuclease frit vand). Vend prøven flere gange, indtil pelleten løsner sig fra bunden af ​​røret og flyder i opløsningen. Centrifugeres opløsningen ved 12.000 xg i 10 minutter ved 4 ° C.
    BEMÆRK: pellet i 75% ethanol kan opbevares ved -20 ° C indtil yderligere skridt.
  8. Lad RNA pellet lufttørre ved at lade rørene åbne i 5 minutter ved stuetemperatur. Tag forholdsregler for at undgå over tørring af pellet, da dette kan påvirke dens opløsning i vand i det efterfølgende trin.

5. Fjernelse DNA fra RNA-fremstilling

  1. Tilføj 9 pi nukleasefrit vand til RNA pellet og sørg for, at pillen opløses, før du fortsætter ved forsigtigt vortex røret. Til dette tilsættes 1 pi 10x DNAse I buffer og 1 pi rekombinant DNase (fra DNase I kit), blandes ved forsigtigt at knipse rørene kortvarigt dreje rørene og inkuberes ved 37 ° C i et vandbad i 30 minutter.
  2. Tilsæt 2 pi DNase inaktivering reagens (fra DNase I kit) til prøven og inkuberes ved stuetemperatur i 2 minutter og blandes ofte ved forsigtigt at knipse på røret. Centrifugeres ved 12.000 xg i 10 min og overførsel ca. 10 pi af den klare supernatant til et frisk 1,5 ml centrifugerør.
  3. Mål RNA-koncentrationen ved hjælp af en NanoDrop eller spektrofotometer.

6. At gøre cDNA fra RNA

  1. Tilføj nødvendige volumen thpå indeholder 1 ug RNA og bringe det totale volumen til 8 pi ved tilsætning nuklease frit vand. Til dette tilsættes 1 pi 10 mM dNTP mix og 1 pi af tilfældige hexamerer fra Superscript First Strand Synthesis Kit. Bland forsigtigt og inkuberes ved 65 ° C i 5 minutter i enten et vandbad eller en forprogrammeret thermocycler.
  2. Foretag en forblanding indeholdende følgende reagenser: 2 pi 10x RT Buffer, 4 pi 25 M MgCl2, 2 pi 0,1 M DTT og 1 pi RNAse OUT (40 U / ul).
    BEMÆRK: Mængder givet er per reaktion ville brugeren nødt til at skalere op i henhold til ens eksperimentelle behov.
  3. Efter fjernelse af RNA indeholdende prøven fra 65 ° C, indstilles rør ved stuetemperatur i et minut. Tilføj 9 pi præmix og inkuber ved stuetemperatur i 2 min. Tilsæt 1 pi Superscript II revers transkriptase-enzym (50 U / ul), og derefter inkuberes ved stuetemperatur i 10 min.
  4. Inkuber prøverne ved 42 ° C i 50min for revers transkription forekommer.
  5. Inkuber prøverne ved 70 ° C i 15 min for at standse reaktionen.
  6. Anbring prøverne på is kortvarigt og der tilsættes 1 ul RNAseH (2 U / pl) og inkuberes ved 37 ° C i 20 minutter.
  7. Kortvarigt centrifugeres rørene ved 3000 xg for at dreje kondensat væsken ned.
    BEMÆRK: Dette er cDNA, som vil blive anvendt til kvantitativ PCR. cDNA kan lagres i -20 ° C fryseren, indtil PCR setup. cDNA kan også fortyndes med nukleasefrit vand før du fortsætter til PCR.

7. kvantitativ PCR

  1. Gør en master mix indeholder følgende reagenser (mængder angivet er per reaktion): 6,3 pi 2x Sybr Green Mix, 0,6 pi Forward Primer (10 uM), 0,6 pi Reverse Primer (10 uM) og 0,5 pi nukleasefrit vand .
    BEMÆRK: Primer design blev udført ved hjælp af 'Pick Primere' i NCBI nukleotidsekvens side for genet af interesse.
  2. Tilsæt 10 pi mastermiksens til hver brønd af en 96 vel- PCR-plade. Tilføj 2,5 pi cDNA gjort tidligere til brønden indeholder mastermiksen. Sørg for at oprette tredobbelte PCR-reaktioner for hver prøve.
  3. Efter endt tilsætning af mastermiksens og cDNA, dække PCR-plade ved hjælp af en optisk klæbeark til at forsegle brøndene. Spin pladen kortvarigt i 5 minutter ved 500 xg i en bordcentrifuge at afvikle al væsken til bunden af ​​brønden.
  4. Læg PCR-plade på en forprogrammeret RT-PCR-maskine. Brug PCR parametrene i tabel 1.
  5. Dataanalyse: Brug C t-værdier fra qPCR udgang til yderligere beregninger. Sammen med test-genet, der er nedsat PCR-reaktioner for intern kontrol gener, 18S rRNA (at sikre lige input) og β-actin (negativ kontrol). Beregn fold ændringer baseret på ΔΔCt metode 37.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

1A og 1B viser den relative ekspression af BDNF og GABRD forhold til kontrollen gen β-actin. BDNF er et neurotrophin ofte forbundet med neurobeskyttende virkninger i mange neuronale sygdomme 38-41. Det er derfor interessant at analysere ekspressionen profil BDNF som respons på stimulering af ATN som giver terapeutiske fordele til epileptiske patienter. I figur 1A, som viser genekspressionsprofilen BDNF over de angivne tidspunkter skrive DBS stimulation, BDNF opregulering observeres øjeblikkeligt (0 timer) efter DBS operation sammen med topekspression (3 gange større end ustimuleret) ved 3 timer efter stimulering. Denne observation tyder på, at øget BDNF udtryk og den deraf neuroprotektion kunne bidrage til den terapeutiske fordel for DBS. Andet gen GABRD (figur 1B) blev også undersøgt ved hjælp af qPCR metoden. GABRD er en GABA-receptor whiCH er en af de potentielle mål for design anti-epilepsi lægemidler 42. Udtrykket profil GABRD viser også forøget ekspression i de stimulerede dyr sammenlignet med ikke-stimulerede kontroldyr ved 3 timer efter DBS. I betragtning af at GABA agonister anvendes som effektive beslaglæggelse undertrykkere, er det interessant at observere forøget GABRD udtryk indlæg DBS, implicerer en mulig rolle for GABA i antiepileptisk effekt af DBS.

RT-PCR-protokol beskrevet her giver reproducerbare og kvantitative resultater, der afslører genekspressionsmønstre og de relative fold forskelle i forhold til kontroldyrene. Analysen af data foretages på følgende måde: qPCR output giver tærskelværdien C t-værdien for test-genet for hver prøve analyseret. C t-værdier opnås også for kontrol gen β-actin og 18S rRNA (input kontrol). Den ΔΔC t metode vil derefter blive anvendt til at beregne gen Expression profil ved hjælp af disse C t værdier 37. For eksempel, til at beregne ændringer genekspression for BDNF, for en given prøve, er forskellen mellem C t værdi for BDNF og 18S rRNA beregnet og er den første ΔC t. For den samme prøve, er forskellen mellem C t-værdien for β-actin og 18S rRNA beregnes for at give den anden ΔC t. Forskellen mellem de to ΔC t-værdier beregnes for at give ΔΔC t. Denne ΔΔC t værdi anvendes til at beregne 2 ^ (-ΔΔC t), hvilket giver den relative template overflod for BDNF i forhold til β-actin. Ved at plotte denne værdi på tværs af de forskellige tidspunkter siden af ​​den ikke-stimulerede kontrol, kan genekspression forandringer som følge af DBS tværs tidspunkter visualiseres. Den ovenfor beskrevne fremgangsmåde kan anvendes effektivt til at undersøge ændringer i ekspression for andre gener, som er potentielle candidates, som reagerer på DBS stimulering og til at undersøge nogle af de nedstrøms virkninger af modulering af ekspressionen af ​​disse gener.

Figur 1
Figur 1: (A) Tidsforløb analyse af BDNF-ekspression i respons på højfrekvent stimulering af ATN. Vævshøst, RNA-ekstraktion, cDNA-fremstilling og q-PCR blev udført som beskrevet i protokollen. Relative ændringer i genekspression er beregnet efter normalisering for indgang (ved at forstærke 18S rRNA) samt en kontrol gen (β-actin). C t-værdier opnået fra real-time PCR blev anvendt til at beregne ekspressionsniveauer af ΔΔ C t metode 37. De tidspunkter analyserede er 0, 3, 6 og 12 timer efter DBS stimulering. Bemærk: De valgte her tidspunkter er med hensyn til en bestemt undersøgelse, og kan ændres i henhold til den hypothesis og forsøgsplan. (B) Tidsforløb analyse af GABAA-receptor delta underenhed (GABRD) niveauer i respons på DBS ved 130 Hz rettet mod ATN. Metoder og beregninger blev udført som svarer til BDNF data.

Figur 2
Figur 2: DBS elektroder og stimulator oprettet.

PCR-cykler
Trin 1: Indledende denaturering 95 ° C 15 min
Trin 2: Denaturering 95 ° C 15 sek
Annealing 60 ° C 30 sek
Udvidelse 72 ° C 30 sek
40 cyklusser af trin 2
Bemærk: annealing temperatur varierer i overensstemmelse med
primer smeltetemperatur. Primere er typisk konstrueret
at have en optimal annealingstemperatur på 60 ° C

Tabel 1: PCR parametre.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Efter den skelsættende arbejde af Benabid et al. I at bruge deep brain stimulation til behandling af Parkinsons sygdom og essentiel tremor har DBS kirurgiske teknik blevet undersøgt med stor interesse i det seneste årti til at behandle mange neurologiske lidelser 6,10,43. DBS undersøgelser er rettet mod forskellige neuro-anatomiske områder af hjernen kredsløb i øjeblikket udføres af mange grupper til at løfte større neuronale sygdomme og er i forskellige stadier af kliniske forsøg. Stimulering af subthalamisk nucleus (STN) eller interne segment af globus pallidus (GPI) er FDA godkendt og anvendt til behandling af bevægelsesforstyrrelser i Parkinsons sygdom 10. Den SANTE kliniske forsøg har vist lovende tendenser for epileptiske patienter, der fik højfrekvent stimulering af den forreste thalamiske kerne 31. Resultater fra et fase I klinisk forsøg med bilateral forniceal stimulation har vist en forsinkelse i hastigheden af ​​kognitiv tilbagegang og en reVersal af glucose hypometabolic optagelse ses ved Alzheimers sygdom samt aktivering af hukommelseskredsløbet 8,44. Endvidere, i de seneste år neurokirurger har udført DBS forsøg til behandling af neuropsykiatriske lidelser, såsom OCD (obsessiv-kompulsiv tilstand), behandling-resistent depression, Tourettes syndrom og afhængighed 10,45-55.

Ud over de kliniske forsøg, i de seneste år har dyr kirurgi tilbudt os store muligheder for at studere de fysiologiske forandringer som følge af den kirurgiske teknik i et levende dyr, på en måde, som efterspørger charme af en in vitro-teknik. I dette manuskript, har vi drøftet de er involveret i udførelsen af ​​dyb brain stimulation kirurgi i gnavere metoder. Stereotaktisk kirurgi hos gnavere som beskrevet her kan også anvendes for potentielle søgninger DBS mål- og at afprøve effektiviteten af ​​operationen ved hjælp af sygdomsmodel dyr. En af udfordringerne for forsøgslederen hERE er at være i stand til at målrette den korrekte anatomiske locus på en reproducerbar måde. Der er især behov for en tekniker til operation, fordi kontrol for korrekt målretning er kun mulig efter stimuleringen er gjort, og dyret aflivet. Også lejlighedsvis kan man utilsigtet skade en nøgle blodkar, som kan føre til betydeligt blodtab og undertiden endda død af dyret. Desuden er behov for at dissekere ud hippocampus til yderligere biokemiske analyser begrænser muligheden for immunhistologisk kontrol for korrekt elektrode målretning i det samme dyr som kræver en intakt hjerne modellen for væv sektionering. Eventuelt kunne kontrolleres korrekt elektrode målretning på et andet dyr stimuleret på en identisk måde. Det betyder dog ikke evidens for korrekt målretning i forsøgsdyret og er en begrænsning i denne fremgangsmåde. De seneste udgivelser har forsøgt at omgå dette problem ved at foretage DBS operation med simultaneous fMRI 56. En mulig forbedring af teknikken beskrevet her kunne være en undersøgelse af virkningerne af kronisk stimulering via et implanteret stimulator i dyret. Men vi har begrænset vores analyse for en enkelt dosis (1 time) af højfrekvente stimulation som et første skridt til at forstå de forandringer som følge af DBS på celleniveau.

I betragtning af anvendelsen af ​​DBS operation for en række af neuronale lidelser, er det vigtigt, at vi ved mekanismen bag de gavnlige virkninger af DBS. Disse oplysninger er afgørende for udvikling af fremtidige forbedringer i kirurgi og også at undersøge anvendeligheden af ​​DBS til behandling af andre betingelser, der ikke er blevet undersøgt af eksperter i DBS. Desuden kan ændringer af den kirurgiske teknik skal gennemføres for at undgå bestemte skadelige bivirkninger af proceduren og til effektivt at håndtere tilbagefald af sygdommen tilstand.

En grundig mekanistisk analysis af DBS er muligt ved at undersøge genekspression ændringer induceret af DBS. Enten en kandidat gen tilgang baseret på eksisterende viden om nervebaner, der reagerer på depolariserende stimuli såsom høj frekvens stimulation, eller en global transkriptom analyse kan give vigtig indsigt i de molekylære begivenheder, der udløses af DBS. De genekspressionsanalyse teknikker (kandidat gen tilgang samt high-throughput metode) er kraftfulde værktøjer, der er nøglen til at udforske de molekylære mekanismer og cellulære ændringer i forbindelse med DBS kirurgi. Den seneste udvikling på dette område har gjort det muligt for os at få et væld af oplysninger om en række aspekter af cellulær fysiologi i meget kort tid, hvilket ikke var muligt for et par år siden. Med fremkomsten af high throughput sekventering teknologi såsom ChIPseq, er det muligt at karakterisere hele genomet placering vigtige transkriptionsfaktorer, som svarer til DBS 57,58. De seneste opdagelser forbinder ikkekodende RNA såsom microRNA med neurodegenerative sygdomme, sætte os i stand til at analysere mulige ændringer i miRNA niveauer i neuroner efter DBS ved hjælp af miRNA sekventeringsteknologi 59,60. Man kunne også undersøge mulige ændringer i epigenetiske signaturer sådan DNA-methylering og histon modifikationer som svar på DBS. På trods af de fordele, er det vigtigt at erkende nogle af begrænsningerne ved disse teknikker samt potentielle problemer, der kan opstå under analyser. En vigtig bekymring med genekspression analyser har været reproducerbarhed og tekniske fejl. Det er vigtigt, forsøgslederen noterer sig dette og planer om at have tilstrækkeligt antal gentagelser for at sikre pålidelighed. Et fælles problem med nogle af de high throughput screening undersøgelser har været vanskeligheden ved fortolkningen af ​​den enorme mængde data, der er genereret. Nogle gange bliver det vigtigt at fastslå, om de genekspression observerede ændringer skyldes den direkte virkningaf den eksperimentelle behandling eller er en nedstrøms virkning. Dette kræver som regel yderligere undersøgelser, der er designet til at løse dette problem.

Ud over de genomiske studier, vil en omfattende immunhistokemisk analyse af den spatio-temporale lokalisering af de vigtigste aktører, der reagerer på DBS og en kvantificering af ændringer i niveauet i forskellige regioner af hjernen være et stort aktiv for den fremtidige udvikling af DBS kirurgiske procedure. De kumulative resultater fra genekspression analyser samt immunhistokemiske studier kan afsløre hidtil ukendte interaktioner mellem nøglefaktorer samt vigtige molekylære begivenheder, der regulerer cellulære processer såsom neurogenese eller neurodegenerering. Identifikation af disse kritiske molekylære markører kan også gøre det muligt for fremtidige narkotika opdagelser. Sådanne fund kunne kaste lys over den generelle funktion af hjernen kredsløb, som er værdifuld information fra perspektivet af forskere, der arbejder for at forstå menneskety neuronale sygdomme. Ledelse vores fremtidige indsats på at integrere nyeste teknologiske fremskridt i klinikken, samt laboratoriet kan forventes at tilbyde os væsentlige fordele i vores kamp mod sygdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Deep Brain Stimulation Surgery
Stereotactic frame Kopf Instruments Model 900
Drill  Dremmel 7700, 7.2 V
Scalpel BD 372610
Ketamine Patterson Veterinary 07-803-6637 Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules
Xylazine Patterson Veterinary 07-808-1947
Buprenorphine Patterson Veterinary 07-850-2280 Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules
Surgical staples ConMed Corporation 8035
Sutures (3-0)  Harvard Apparatus 72-3333
Syringe (1 ml, 29 1/2 G) BD 329464 Sterile, use for Anesthesia administration intraperitoneally
Syringe (3 ml, 25 G) BD 309570 Sterile, use for Analgesia administration subcutaneously
Needles BD 305761 Sterile, use for clearing broken bone pieces from the burr holes
Ethanol Fisher Scientific S25309B Use for general sterilization 
Eye Lubricant Fisher Scientific 19-898-350
Stimulator Medtronic Model 3628
DBS electrodes Rhodes Medical Instruments, CA SNEX100x-100 mm Electrodes are platinum, concentric and bipolar
Betadine (Povidone-Iodine)  PDI S23125 Single use swabsticks, use for sterilizing the scalp before making incision 
 Brain Dissection and Hippocampal tissue isolation
Acrylic Rodent Brain Matrix Electron Microscopy Sciences 175-300 www.emsdiasum.com
Razor Blade V W R 55411-050
Guillotine Scissors Clauss 18039 For decapitation, make sure these scissors are maintained in clean and working condition
Scissors Codman Classic 34-4098 Use for removing the brain from the skull
Forceps Electron Microscopy Sciences 72957-06 Use for removing the brain from the skull and for handling during dissection
Phosphate Buffered Saline  Boston Bioproducts BM-220
 RNA Extraction and cDNA Preparation
Tri Reagent Sigma T9424 Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin
Syringe (3 ml, 25 G) BD 309570 Use for tissue homogenization
Chloroform Fisher Scientific BP1145-1 Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin
Isopropanol Fisher Scientific A416-1
Glycogen Thermo Scientific R0561
Dnase I Kit Ambion AM1906
Superscript First Strand Synthesis Kit Invitrogen 11904-018
Tabletop Microcentrifuge Eppendorf 5415D
 Quantitative PCR               
SYBR Green PCR Kit Qiagen 204143
Custom Oligos Invitrogen 10668051
PCR Plates (96 wells) Denville Scientific C18080-10
Optical Adhesive Sheets Thermo Scientific AB1170
Nuclease free Water Thermo Scientific SH30538-02
Real Time PCR Machine Applied Biosystems 7500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Toda, H., Hamani, C., Fawcett, A. P., Hutchison, W. D., Lozano, A. M. The regulation of adult rodent hippocampal neurogenesis by deep brain stimulation. Journal of. 108, 132-138 (2008).
  2. Perlmutter, J. S., Mink, J. W. Deep brain stimulation. Annual review of neuroscience. 29, 229-257 (2006).
  3. Bergstrom, M. R., Johansson, G. G., Laitinen, L. V., Sipponen, P. Electrical stimulation of the thalamic and subthalamic area in cerebral palsy. Acta physiologica Scandinavica. 67, 208-213 (1966).
  4. Benabid, A. L., et al. Chronic electrical stimulation of the ventralis intermedius nucleus of the thalamus as a treatment of movement disorders. Journal of neurosurgery. 84, 203-214 (1996).
  5. Benabid, A. L., et al. Long-term electrical inhibition of deep brain targets in movement disorders. Movement disorders : official journal of the Movement Disorder Society. 13, Suppl 3. 119-125 (1998).
  6. Benabid, A. L., et al. Long-term suppression of tremor by chronic stimulation of the ventral intermediate thalamic nucleus. Lancet. 337, 403-406 (1991).
  7. Tierney, T. S., Lozano, A. M. Surgical treatment for secondary dystonia. Movement disorders : official journal of the Movement Disorder Society. 27, 1598-1605 (2012).
  8. Tierney, T. S., Sankar, T., Lozano, A. M. Some recent trends and further promising directions in functional neurosurgery. Acta neurochirurgica. Supplement. 117, 87-92 (2013).
  9. Tierney, T. S., Sankar, T., Lozano, A. M. Deep brain stimulation emerging indications. Progress in brain research. 194, 83-95 (2011).
  10. Sankar, T., Tierney, T. S., Hamani, C. Novel applications of deep brain stimulation. Surgical neurology international. 3, S26-S33 (2012).
  11. Tierney, T. S., Vasudeva, V. S., Weir, S., Hayes, M. T. Neuromodulation for neurodegenerative conditions. Frontiers in bioscience. 5, 490-499 (2013).
  12. Mayberg, H. S., et al. Deep brain stimulation for treatment-resistant depression. Neuron. 45, 651-660 (2005).
  13. Lyons, M. K. Deep brain stimulation: current and future clinical applications. Mayo Clinic proceedings. 86, 662-672 (2011).
  14. Ch. 4. Rehabilitation in movement disorders. Lansek, R., Morris, M. E. , Cambridge University Press. 36-43 (2013).
  15. Goodwin, R., Tierney, T., Lenz, F., Anderson, W. Ch. 15. Single Neuron Studies of the Human Brain: Probing Cognition. Fried, I., Rutishauser, U., Cerf, M., Kreiman, G. 15, MIT Press. 275-293 (2014).
  16. Hauser, W. A. Epidemiology of epilepsy in children. Neurosurgery clinics of North America. 6, 419-429 (1995).
  17. Hauser, W. A. Recent developments in the epidemiology of epilepsy. Acta neurologica Scandinavica. Supplementum. 162, 17-21 (1995).
  18. Davis, R., Emmonds, S. E. Cerebellar stimulation for seizure control: 17-year study. Stereotactic and functional neurosurgery. 58, 200-208 (1992).
  19. Levy, L. F., Auchterlonie, W. C. Chronic cerebellar stimulation in the treatment of epilepsy. Epilepsia. 20, 235-245 (1979).
  20. Velasco, A. L., et al. Electrical stimulation of the hippocampal epileptic foci for seizure control: a double-blind, long-term follow-up study. Epilepsia. 48, 1895-1903 (2007).
  21. Tellez-Zenteno, J. F., McLachlan, R. S., Parrent, A., Kubu, C. S., Wiebe, S. Hippocampal electrical stimulation in mesial temporal lobe epilepsy. Neurology. 66, 1490-1494 (2006).
  22. Kerrigan, J. F., et al. Electrical stimulation of the anterior nucleus of the thalamus for the treatment of intractable epilepsy. Epilepsia. 45, 346-354 (2004).
  23. Hamani, C., et al. Deep brain stimulation of the anterior nucleus of the thalamus: effects of electrical stimulation on pilocarpine-induced seizures and status epilepticus. Epilepsy research. 78, 117-123 (2008).
  24. Hamani, C., et al. Bilateral anterior thalamic nucleus lesions and high-frequency stimulation are protective against pilocarpine-induced seizures and status epilepticus. Neurosurgery. 54, 191-195 (2004).
  25. Mirski, M. A., Rossell, L. A., Terry, J. B., Fisher, R. S. Anticonvulsant effect of anterior thalamic high frequency electrical stimulation in the rat. Epilepsy research. 28, 89-100 (1997).
  26. Mirski, M. A., Ferrendelli, J. A. Interruption of the mammillothalamic tract prevents seizures in guinea pigs. Science. 226, 72-74 (1984).
  27. Mirski, M. A., Ferrendelli, J. A. Anterior thalamic mediation of generalized pentylenetetrazol seizures. Brain research. 399, 212-223 (1986).
  28. Mirski, M. A., Ferrendelli, J. A. Interruption of the connections of the mammillary bodies protects against generalized pentylenetetrazol seizures in guinea pigs. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 7, 662-670 (1987).
  29. Mirski, M. A., McKeon, A. C., Ferrendelli, J. A. Anterior thalamus and substantia nigra: two distinct structures mediating experimental generalized seizures. Brain research. 397, 377-380 (1986).
  30. Lee, K. J., Jang, K. S., Shon, Y. M. Chronic deep brain stimulation of subthalamic and anterior thalamic nuclei for controlling refractory partial epilepsy. Acta neurochirurgica. Supplement. 99, 87-91 (2006).
  31. Fisher, R., et al. Electrical stimulation of the anterior nucleus of thalamus for treatment of refractory epilepsy. Epilepsia. 51, 899-908 (2010).
  32. Encinas, J. M., Hamani, C., Lozano, A. M., Enikolopov, G. Neurogenic hippocampal targets of deep brain stimulation. The Journal of comparative neurology. 519, 6-20 (2011).
  33. Hattiangady, B., Rao, M. S., Shetty, A. K. Chronic temporal lobe epilepsy is associated with severely declined dentate neurogenesis in the adult hippocampus. Neurobiology of disease. 17, 473-490 (2004).
  34. Kuruba, R., Hattiangady, B., Shetty, A. K. Hippocampal neurogenesis and neural stem cells in temporal lobe epilepsy. Epilepsy & behavior : E&B. 14, Suppl 1. 65-73 (2009).
  35. Hattiangady, B., Shetty, A. K. Implications of decreased hippocampal neurogenesis in chronic temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 49, Suppl 5. 26-41 (2008).
  36. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Elsevier Inc. (2007).
  37. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 22DDCT Method. METHODS. 25, 402-408 (2001).
  38. Kells, A. P., et al. AAV-mediated gene delivery of BDNF or GDNF is neuroprotective in a model of Huntington disease. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 9, 682-688 (2004).
  39. Han, B. H., Holtzman, D. M. BDNF protects the neonatal brain from hypoxic-ischemic injury in vivo via the ERK pathway. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 20, 5775-5781 (2000).
  40. Hetman, M., Kanning, K., Cavanaugh, J. E., Xia, Z. Neuroprotection by brain-derived neurotrophic factor is mediated by extracellular signal-regulated kinase and phosphatidylinositol 3-kinase. The Journal of biological chemistry. 274, 22569-22580 (1999).
  41. Stadelmann, C., et al. BDNF and gp145trkB in multiple sclerosis brain lesions: neuroprotective interactions between immune and neuronal cells. Brain : a journal of neurology. 125, 75-85 (2002).
  42. Treiman, D. M. GABAergic mechanisms in epilepsy. Epilepsia. 42, Suppl 3. 8-12 (2001).
  43. Benabid, A. L., Pollak, P., Louveau, A., Henry, S., de Rougemont, J. Combined (thalamotomy and stimulation) stereotactic surgery of the VIM thalamic nucleus for bilateral Parkinson disease. Applied neurophysiology. 50, 344-346 (1987).
  44. Laxton, A. W., et al. A phase I trial of deep brain stimulation of memory circuits in Alzheimer's disease. Annals of. 68, 521-534 (2010).
  45. Tierney, T. S., Abd-El-Barr, M. M., Stanford, A. D., Foote, K. D., Okun, M. S. Deep brain stimulation and ablation for obsessive compulsive disorder: evolution of contemporary indications, targets and techniques. The International journal of neuroscience. 124, 394-402 (2014).
  46. Kennedy, S. H., et al. Deep brain stimulation for treatment-resistant depression: follow-up after 3 to 6 years. The American journal of psychiatry. 168, 502-510 (2011).
  47. Lozano, A. M., et al. Subcallosal cingulate gyrus deep brain stimulation for treatment-resistant depression. Biological psychiatry. 64, 461-467 (2008).
  48. Ackermans, L., et al. Double-blind clinical trial of thalamic stimulation in patients with Tourette syndrome. Brain : a journal of neurology. 134, 832-844 (2011).
  49. Houeto, J. L., et al. Tourette's syndrome and deep brain stimulation. Journal of neurology, neurosurgery, and psychiatry. 76, 992-995 (2005).
  50. Maciunas, R. J., et al. Prospective randomized double-blind trial of bilateral thalamic deep brain stimulation in adults with Tourette syndrome. Journal of neurosurgery. 107, 1004-1014 (2007).
  51. Koning, P. P., Figee, M., van den Munckhof, P., Schuurman, P. R., Denys, D. Current status of deep brain stimulation for obsessive-compulsive disorder: a clinical review of different targets. Current psychiatry reports. 13, 274-282 (2011).
  52. Greenberg, B. D., et al. Deep brain stimulation of the ventral internal capsule/ventral striatum for obsessive-compulsive disorder: worldwide experience. Molecular psychiatry. 15, 64-79 (2010).
  53. Muller, U. J., et al. Successful treatment of chronic resistant alcoholism by deep brain stimulation of nucleus accumbens: first experience with three cases. Pharmacopsychiatry. 42, 288-291 (2009).
  54. Zhou, H., Xu, J., Jiang, J. Deep brain stimulation of nucleus accumbens on heroin-seeking behaviors: a case report. Biological psychiatry. 69, e41-e42 (2011).
  55. Porta, M., et al. Thalamic deep brain stimulation for treatment-refractory Tourette syndrome: two-year outcome. Neurology. 73, 1375-1380 (2009).
  56. Younce, J. R., Albaugh, D. L., Shih, Y. Y. Deep brain stimulation with simultaneous FMRI in rodents. Journal of visualized experiments : JoVE. , e51271 (2014).
  57. Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature reviews. Genetics. 10, 669-680 (2009).
  58. Valouev, A., et al. Genome-wide analysis of transcription factor binding sites based on ChIP-Seq data. Nature methods. 5, 829-834 (2008).
  59. Fiore, R., Siegel, G., Schratt, G. MicroRNA function in neuronal development, plasticity and disease. Biochimica et biophysica acta. 1779, 471-478 (2008).
  60. Hebert, S. S., De Strooper, B. Alterations of the microRNA network cause neurodegenerative disease. Trends in neurosciences. 32, 199-206 (2009).

Tags

Neuroscience anterior thalamiske kerne deep brain stimulation gyrus dentatus hippocampus epilepsi genekspression højfrekvente stimulation kvantitativ RT-PCR
Analyse af genekspression Ændringer i rottehippocampus Efter Deep Brain Stimulation af den forreste thalamiske Nucleus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Selvakumar, T., Alavian, K. N.,… More

Selvakumar, T., Alavian, K. N., Tierney, T. Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus. J. Vis. Exp. (97), e52457, doi:10.3791/52457 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter