Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

تحليل التغييرات التعبير الجيني في الفئران الحصين بعد ديب تحفيز الدماغ الأمامي من مهادي نواة

Published: March 8, 2015 doi: 10.3791/52457
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Neurosurgery, Brigham & Women's Hospital, Harvard Medical School, 2Division of Brain Sciences, Department of Medicine, Imperial College London

Abstract

التحفيز العميق للدماغ (DBS) جراحة، واستهداف مناطق مختلفة من الدماغ مثل العقد القاعدية، المهاد، والمناطق تحت المهاد، هو علاج فعال لعدة اضطرابات الحركة التي فشلت في الاستجابة للدواء. وقد بدأ التقدم الأخير في مجال جراحة DBS إلى توسيع نطاق تطبيق هذه التقنية الجراحية لظروف أخرى متنوعة مثل السمنة المرضية، والاكتئاب والوسواس القهري. وعلى الرغم من هذه المؤشرات التوسع، لا يعرف الكثير عن الآليات الفسيولوجية الأساسية التي تسهل التأثيرات المفيدة لعملية جراحية DBS. نهج واحد على هذا السؤال هو لإجراء تحليل التعبير الجيني في الخلايا العصبية التي تستقبل التحفيز الكهربائي. وقد أظهرت الدراسات السابقة وأثار ذلك تكوين الخلايا العصبية في التلفيف المسنن الفئران في DBS استهداف نواة الأمامية من المهاد 1. وتستخدم عملية جراحية DBS استهداف ATN على نطاق واسع لعلاج الصرع المقاوم. وبالتالي، من ينتيريس الكثيرر بالنسبة لنا لاستكشاف التغيرات النسخي الناجمة عن تحفيز كهربائيا ATN. في هذا المخطوط، وصفنا منهجيات لدينا لهدايته stereotactically جراحة DBS استهداف ATN في البالغين فئران ويستار الذكور. نحن أيضا مناقشة الخطوات اللاحقة للتشريح الأنسجة والعزلة RNA، وإعداد [كدنا والكمي RT-PCR لقياس التغيرات في التعبير الجيني. هذه الطريقة يمكن تطبيقها وتعديلها لتحفيز العقد القاعدية ومناطق أخرى من الدماغ شيوعا المستهدفة سريريا. دراسة التعبير الجيني هو موضح هنا تفترض نهجا الجين المستهدف مرشح لاكتشاف اللاعبين الجزيئية التي يمكن توجيه آلية لDBS.

Introduction

التاريخ وراء تطوير تحفيز الدماغ العميق كأسلوب جراحة الأعصاب يعود إلى 1870s في حين استكشاف إمكانية تحفيز كهربائيا الدوائر الدماغ 2. بدأ استخدام التحفيز عالية التردد المزمن كعلاج لاضطرابات العصبية في 1960s 3. في وقت لاحق في 1990s مع ظهور زرع المزمن DBS أقطاب 4-6، واصل عدد من الاضطرابات العصبية التي كانت تعامل من قبل DBS في الزيادة. وقد استخدم تحفيز الدماغ العميق لأول مرة في الولايات المتحدة لعلاج الهزة الضروري 6. اليوم يتم استخدام الجراحة على نطاق واسع لعلاج الاضطرابات العصبية التي هي غير قابل للعلاج عن طريق التدخل الدوائي حاليا. يستخدم DBS حاليا لعلاج اضطرابات الحركة من مرض باركنسون وخلل التوتر 7-9. الزهايمر نوع الخرف، مرض هنتنغتون، والصرع، وآلام والأمراض العصبية والنفسية مثل الاكتئاب، والوسواس القهري، توريت7؛ ق متلازمة والإدمان هي بعض الشروط قابلة للعلاج بواسطة DBS 10-12. بينما عملية جراحية DBS وافقت ادارة الاغذية والعقاقير لعلاج مرض باركنسون، خلل التوتر والهزة الأساسية، واستخدام DBS لعلاج الحالات الأخرى المذكورة أعلاه هي في مراحل مختلفة من المختبر والدراسات السريرية التي تقدم الكثير من الأمل للمرضى 13،14.

سريريا، يتم إجراء عملية جراحية DBS على مرحلتين. المرحلة الأولى تتضمن لتحديد المواقع جراحيا الأقطاب DBS في الموقع التشريحي المستهدف باستخدام مزيج من المواقع الإشعاعي، CT، MRI، وكذلك قراءات مسرى مكروي لتعزيز دقة. المرحلة الثانية تتضمن زرع مولد النبض في صدر المريض العلوي وتركيب تمديد يؤدي من فروة الرأس إلى مولد النبض. استنادا إلى حالة عصبية، والعديد من المخططات البرمجة للمولد النبض تم موحدة وسيتم استخدامها لتقديم الجهد المطلوب. في المجلد النهائييتم التوصل المئوية بطريقة تدريجية بحيث الحصول على أفضل استجابة سريرية مع الحد الأدنى من الجهد 15. ومع ذلك، في دراساتنا، على عكس يزرع DBS المزمنة المستخدمة سريريا، من أجل البساطة، ونحن لجأت إلى دراسة لمرة واحدة التحفيز عالية التردد (لمدة 1 ساعة) في النماذج الحيوانية لدينا.

ويركز الجزء من البحث مجموعتنا على التحقيق في استخدام جراحة DBS لعلاج الصرع المعالجة الحرارية. النهج الجراحية المجسم باستخدام التحفيز الترددات العالية قد تم استكشافها من قبل العديد من الآخرين كخيار فعال لعلاج الصرع طبيا الحرارية التي تشكل حوالي 30٪ من جميع حالات الصرع 10،16،17. التحفيز الدماغي استهداف السطح القشري وكذلك نواة المخيخ العميقة التي استخدمت في الماضي كأهداف لعلاج الصرع 10،18،19. وبالإضافة إلى ذلك، كما تم حاول تحفيز الحصين ولكن مع نتائج متفاوتة 20،21. بعض الآخر التحقيقوتشمل أهداف DBS لعلاج الصرع قشرة الدماغ، المهاد، نواة تحت المهاد والعصب المبهم 8. ومع ذلك، في أعقاب نتائج العديد من الدراسات في السنوات القليلة الماضية، النواة المهادية الأمامية (ATN) برز كهدف DBS الأكثر شيوعا لعلاج الصرع 10،22. على أساس المعرفة حول الدوائر تشريحي عصبي والنتائج من النماذج الحيوانية، وقد ركزت العديد من الدراسات على تأثير علاجي من التحفيز العميق للدماغ من ATN في علاج الصرع 23-26. وATN هو جزء من الدائرة الحوفي، ويقع في منطقة من الدماغ الذي يؤثر على وتيرة مصادرة. الدراسات التي حماني وآخرون، لقد اختبرت فعالية ATN-DBS في بيلوكاربين الناجم عن نموذج الصرع ووجد أن التحفيز ATN الثنائي الإختفاء عن المضبوطات التي يسببها بيلوكاربين وصرعية وضع 24 لفترات طويلة. وعلاوة على ذلك، تم العثور على التحفيز الترددات العالية من ATN للحد من وتيرة مصادرة في نموذج بنتيلين تترازول (PTZ) من الجيش الشعبيilepsy 25،27-29. وذكرت لي وآخرون، انخفاض متوسط ​​في وتيرة مصادرة بنحو 75٪ على التحفيز العميق للمخ المزمن من ATN في علاج الصرع الجزئي صهر 30.

وقد أظهرت دراسة سريرية حديثة حول الصرع المعالجة الحرارية نتائج واعدة بعد الجراحة DBS استهداف النواة المهادية الأمامية (ATN) 22. تجربة سريرية عشوائية متعددة المراكز مع 110 المرضى الذين يخضعون DBS الثنائي من ATN لعلاج الصرع المقاوم (SANTE محاكمة) تدل على وجود انخفاض في وتيرة الاستيلاء عليها ما يقرب من 40٪ 31. ألمح النتائج من هذه الدراسة أيضا على أفضل تأثير مضاد للصرع تأخر لوحظ في 2-3 أشهر بعد الجراحة. مزيد من الدراسات قبل تودا وآخرون، تؤكده مع هذه النتائج حيث أظهرت تكوين الخلايا العصبية يحدث في وقت آخر في وقت لاحق DBS (أيام 3-5) في النماذج الحيوانية 1. وبالإضافة إلى ذلك، إنسيناس وآخرون، وأفادت neurogene الحصينجهاز الأمن والمخابرات في الماوس الكبار التلفيف المسنن بعد التحفيز الترددات العالية من ATN 32. وأفادت الدراسات السابقة 33-35 انخفاض تكوين الخلايا العصبية قرن آمون في بعض الحالات الصرع مثل الصرع المزمن الفص الصدغي وجود علاقة مع عجز التعلم، وضعف الذاكرة وعفوية المضبوطات السيارات المتكررة. وعلاوة على ذلك، كان هناك انخفاض في العوامل السلف الخلايا الجذعية العصبية مثل FGF2 وIGF-1 في قرن آمون صرع مزمنة في النماذج الحيوانية 33. النظر في هذا، والاستراتيجيات التدخلية مثل DBS التي تظهر زيادة من تكوين الخلايا العصبية في التلفيف المسنن هي السبل مثيرة للأبحاث. وقد شجعت هذه النتائج لنا لاستكشاف المزيد عميقا في الآلية الكامنة وراء العلاج تكوين الخلايا العصبية بعد DBS لعلاج الصرع. لقد استهدفت ATN على حد سواء من جانب واحد (البيانات لم تبلغ)، وكذلك على المستوى الثنائي (في نتائج تمثيلية) وينظر neurotrophin مرتفعة (BDNF) التعبير في التلفيف المسنن الفئران. لدينا جurrent الفرضية هي أن عامل التغذية العصبية التعبير يبدأ تعبير سلسلة الجين الذي يبلغ ذروته في تكوين الخلايا العصبية التي تترجم إلى تأثير مضاد للصرع من عملية جراحية DBS. في هذه الورقة، نقدم طرقنا لعملية جراحية DBS استهداف ATN في الفئران تليها تحليل التعبير الجيني كنهج جذابة لدراسة الآلية الكامنة وراء فوائد DBS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

بيان الأخلاق: ملاحظة: جميع الإجراءات التي تمت مناقشتها في هذه المخطوطة هي في فقا للمبادئ التوجيهية NIH للبحوث الحيوان (دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية) وتمت الموافقة من قبل لجنة IACUC كلية الطب في جامعة هارفارد.

1. إعداد ما قبل العمليات الجراحية

  1. تأكد من أن جميع الأدوات الجراحية يتم تعقيم إما عن طريق التعقيم أو التطهير بمحلول مطهر و / أو الايثانول حسب الضرورة. حيثما كان ذلك ممكنا، واستخدام معدات معقمة القابل للتصرف مثل المشارط وإبر والمحاقن.
  2. تغطية طاولة العمل مع الستائر الجراحية والتأكد من أن هناك التخلص من النفايات واقية المتاحة.
  3. وزن الفئران وحساب جرعة التخدير. استخدام مزيج / زيلازين الكيتامين (الكيتامين 75 ملغ / كغ وزيلازين 10 ملغ / كلغ) لتخدير الفئران.
    ملاحظة: بين 200-250 جرام هو الوزن الأمثل لتحديد المناسب للحيوان في إطار المجسم فضلا عن استهداف دقيق للATN. Isoflurويمكن أيضا أن تستخدم انو كوكيل التخدير.
  4. جبل وآمنة قطبين معقمة (تعقيمها بواسطة التعقيم أو مع أكسيد الإيثيلين) على حامل القطب (الشكل 2) من إطار الجراحي المجسم وبمساعدة المجهر (10-40X التكبير) والإطلاع على نصائح من القطب لالسليم المحاذاة. تأمين القطبين 3.0 ملم على حدة.
    ملاحظة: احرص على تفادي تلف طرف القطب عن طريق لمس على الأسطح الصلبة.

2. DBS جراحة

  1. حقن الكيتامين / زيلازين مزيج البريتونى للحيوان وتأكيد أن هذا الحيوان قد وصلت إلى الطائرة من التخدير الجراحي (عن طريق التحقق من منعكس إصبع القدم قرصة، معدل التنفس وعمق وانتظام التنفس). إزالة الشعر من منطقة فروة الرأس التي سيتم قطعي وتطهير فروة الرأس مع 3 الدعك بالتناوب كل من بتدين وإما الكحول أو ملحي معقم. تأمين ووضع الحيوان على فرام المجسمه.
  2. استخدام منصات تداول المياه الدافئة للحفاظ على درجة حرارة جسم الحيوان على المستوى الأمثل. تطبيق مواد التشحيم العين لعيون الحيوان للحماية من overdrying.
  3. استخدام الإحداثيات التالية المجسم لاستهداف ATN (الأمامي النواة المهادية): anterioposterior -1.6 ملم، 1.5 ملم الناصف الوحشي وظهري بطني 5.2 مم 1.
    ملاحظة: تعتمد الإحداثيات المجسم على Paxinos واتسون (6 عشر طبعة) الفئران أطلس الدماغ 36.
  4. إجراء شق في فروة الرأس sagittally للكشف عن الجمجمة. باستخدام زوج من الكامشات تأمين فروة الرأس قطعي لفضح الجمجمة. استخدام محلول ملحي معقم لطرد شق. إذا شق رطبة جدا، استخدم قطعة قطن معقمة لتجف. تحديد موقع bregma ووضع علامة مع علامة سوداء. لتوجيه الموقف من الثقوب لدغ، وجعل اثنين من أكثر علامات في حوالي 1.5 ملم mediolaterally على كلا الجانبين من الدرز السهمي و 1.6 ملم الخلفي إلى كورونآل خياطة.
  5. استخدام الحفر باليد لجعل الثقوب لدغ. تأكد من غيض من ثقب لدغ معقم بواسطة تعقيم مع الايثانول. عقد الحفر في حوالي 45 درجة زاوية على سطح الجمجمة عند الحفر. التبديل في كثير من الأحيان بين الثقوب لدغ اثنين لتجنب الحرارة المفرطة في الموقع من أي ثقب لدغ.
  6. تواصل الحفر حتى يتعرض الجافية. باستخدام إبرة مع عازمة طرفها تشبه على شكل "L '، وإزالة أي القطع المكسورة من العظام التي من شأنها عرقلة الإدراج من القطب. الحرص على تجنب إتلاف الجافية و / أو الدماغ الأنسجة الكامنة في حين إزالة شظايا العظام باستخدام إبرة عازمة.
    ملاحظة: استخدام إبرة أضعفت أو ملقط حادة الجميلة هي أيضا خيار.
  7. إصلاح التجمع القطب المزدوج إلى مقبض الدورية للإطار المجسم وإصلاح مقبض بزاوية 90 درجة. باستخدام التعديلات في إطار المجسم، ضع القطب غادر بالضبط فوق bregma.
  8. باستخدام ستيريوتعديلات تكتيكية لتحديد المواقع الناصف الوحشي، وتحديدا تحرك القطب الأيسر 1.5 ملم إلى الجانب الأيسر من bregma مثل أن الآن هناك قطبين المنحازة تماما على طول الدرز الإكليلي ولكن بصرف النظر متباعدة في 1.5 ملم mediolaterally من bregma.
  9. باستخدام تعديلات المجسم anterioposterior، نقل الأقطاب 1.6 ملم الخلفي إلى الدرز الإكليلي.
  10. استخدام التعديلات ظهري بطني لخفض الأقطاب إلى الاختيار الأول إذا تم إجراء ثقوب لدغ في الموقع الصحيح بحيث الأقطاب يمكن إدراج بكل سهولة، دون لمس حواف خشنة من الثقوب لدغ. إذا كان الأمر كذلك، إدراج الأقطاب على عمق 5.2 مم من سطح الجمجمة.
  11. قم بتوصيل أقطاب كهربائية عن طريق يؤدي إلى التحفيز والتشجيع وضعت في 130 هرتز، 2.5 V و 90 μsec pulsewidth 1.
  12. تقديم التحفيز عالية التردد لمدة ساعة (أو لفترة من الوقت المطلوب وفقا الإعداد التجريبية). خلال التحفيز، تذكر أن أؤكد صعمق مخدر روبر بانتظام عن طريق التحقق من عدم وجود انسحاب القدم ردا على قرصة أخمص قدميه. تكملة التخدير مع ما يقرب من نصف الجرعة الأولية المستخدمة للحث على التخدير. تجنب التلوث من القفازات المعقمة الخاصة بك عند التحقق من عمق التخدير وتغييرها إذا لزم الأمر. أداء التحفيز من جانب واحد أو ثنائية على أساس الاحتياجات المرء التجريبية. وتشمل الضوابط مثل التحفيز التردد المنخفض (لعلى سبيل المثال.، 10 هرتز) والحيوانات unstimulated (إدخال أقطاب كهربائية مع عدم وجود التحفيز لاحق).
  13. بعد أن يتم التحفيز، وإزالة الأقطاب بعناية وخياطة الجرح مع الغرز 3-0 أو مع الدبابيس الجراحية المعقمة.
  14. إدارة البوبرينورفين (0.05 ملغ / كلغ) تحت الجلد كما التسكين. مراقبة الحيوانات حتى يعود إلى النشاط العادي ومن ثم إعادته إلى منشأة سكنية.
  15. بعد فترة معينة من الزمن على أساس التصميم التجريبي (على سبيل المثال ل، 0، 3، 6 أو 12 ساعة بعد الجراحة DBS)، الموت ببطء الحيوان مع التخدير جرعة زائدة. بعد التأكد من عدم وجود العلامات الحيوية، قطع رأس الحيوان.
  16. تشريح خارج الدماغ عن طريق إزالة أول الجلد باستخدام المقص. قطع طريق العظام على طول الدرز السهمي باستخدام مقص تشريح. جعل اثنين من أكثر الشقوق (عن شبر واحد لكل منهما) من خلال العظام على كلا الجانبين الجانبية. باستخدام ملقط، ورفع قطعة قطعت جزئيا من العظم من الجزء العلوي من الجمجمة لفضح الدماغ.
  17. باستخدام مقص غرامة أو ملقط، طرد الدماغ من الجمجمة ونقل إلى طبق بتري مع برنامج تلفزيوني الباردة على الجليد.
    ملاحظة: احرص على تفادي تلف في خلايا المخ في حين جعل شقوق من خلال العظام.

3. الحصين عزل

ملاحظة: تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة في هذا القسم على الجليد.

  1. وضع الدماغ على مصفوفة الدماغ الاكريليك تبريد مسبقا على الجليد. باستخدام شفرة حلاقة، وقطع الدماغ coronally في حوالي 7-8 ملم من الأمامي أقصى إدجنرال الكتريك من الدماغ. اجراء خفض الثاني coronally والخلفي للأول خطوة من نوعها بحيث يمكن إزالة شريحة الدماغ حوالي 5 مم.
  2. نقل شريحة الدماغ على طبق بتري مع برنامج تلفزيوني الجليد الباردة. باستخدام شفرة حلاقة، قطع القسمين نصف كروية ورعاية الإشارة إلى نصف الكرة الأرضية الذي يتوافق مع الجانبين الأيسر والأيمن على التوالي. هذا مهم بشكل خاص أثناء أداء التحفيز من جانب واحد.
  3. باستخدام ملقط غرامة ومقص إزالة الحصين بعناية.
  4. فلاش تجميد الأنسجة قرن آمون على الثلج الجاف وتخزينها في الثلاجة -20 درجة مئوية لتصبح جاهزة للخطوات استخراج الحمض النووي الريبي لاحقة.
    ملاحظة: للتخزين على المدى الطويل، فإنه من المستحسن لتخزين الأنسجة في -80 ° C الفريزر.

4. استخراج الحمض النووي الريبي والكمية PCR

  1. تأكد من الأنسجة مجمدة في الجليد الجاف لتصبح جاهزة للالتجانس.
  2. ملاحظة: إجراء هذه الخطوة في غطاء محرك السيارة.
    1. إضافة 1 مل من ثلاثي كاشف لهيبالأنسجة ocampal في أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل والتجانس عليه من قبل pipetting الأول عدة مرات حتى يتم كسر الأنسجة في أجزاء أصغر. وعلاوة على ذلك تجانس الأنسجة عن طريق تمرير من خلال حقنة بإبرة G 25 حتى لا الأنسجة دون انقطاع مرئية. تنفيذ الخطوات التجانس على الجليد.
    2. بعد المجانسة الأنسجة، والسماح للتعليق خلية للوقوف في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق للسماح للتحلل الخلية.
      ملاحظة: بعد هذه النقطة تعليق الخلية يمكن أن تكون سريعة المجمدة وتخزينها في -70 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة.
  3. إضافة 0.2 مل الكلوروفورم ومزيج من قبل vortexing لمدة 20 ثانية، وترك بقية الحل في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
  4. أجهزة الطرد المركزي العينات في 12،000 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. بعد الطرد المركزي، وإزالة الأنابيب بعناية من دون إزعاج طبقات منفصلة الثلاث التي سوف تكون مرئية.
    ملاحظة: (الأحمر) المرحلة السفلي يحتوي على البروتينات، والمرحلة المتوسطة غائم تحتوي على الحمض النووي وأعلى مرحلة واضحة تحتوي RNA.
  5. نقل المرحلة واضحة العليا (RNA) الى الطازجة 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي (عادة 500 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي التي تحتوي على مرحلة يتم الحصول عليها). لهذا إضافة 0.5 مل الأيزوبروبانول ومزيج من قبل vortexing. إلى هذه الوظيفة 2-3 الجليكوجين ميكرولتر (20 ملغ / مل) باعتبارها الناقل للRNA. السماح للعينة للراحة على الطاولة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
  6. الطرد المركزي العينة في 12،000 x ج لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية. تأكد من أن بيليه RNA مرئيا في الجزء السفلي من الأنبوب.
  7. تجاهل طاف ويغسل بيليه RNA عن طريق إضافة 1 مل من الايثانول 75٪ (مع المياه مجانا نوكلياز). عكس العينة عدة مرات حتى يزيح بيليه من أسفل الأنبوب ويعوم في الحل. أجهزة الطرد المركزي الحل في 12،000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: بيليه في 75٪ من الإيثانول يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية حتى المزيد من الخطوات.
  8. السماح للبيليه RNA إلى الهواء الجاف من خلال ترك الأنابيب مفتوحة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. اتخاذ الاحتياطات اللازمة لتجنب اوفهص تجفيف بيليه لأن ذلك قد يؤثر على انحلاله في الماء في خطوة لاحقة.

5. إزالة الحمض النووي من إعداد RNA

  1. إضافة 9 ميكرولتر من المياه مجانا نوكلياز لبيليه RNA وتأكد من حل بيليه قبل الشروع قبل vortexing بلطف الأنبوب. لهذا إضافة 1 ميكرولتر من 10X الدناز أنا العازلة و 1 ميكرولتر الدناز المؤتلف (من الدناز I عدة)، مزيج من قبل عبها بلطف الأنابيب، لفترة وجيزة تدور الأنابيب واحتضان عند 37 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 30 دقيقة.
  2. إضافة 2 ميكرولتر الدناز تعطيل كاشف (من الدناز I عدة) لعينة ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة وتخلط في كثير من الأحيان عبها بلطف الأنبوب. الطرد المركزي في 12،000 x ج لمدة 10 دقيقة ونقل ما يقرب من 10 ميكرولتر من طاف واضح إلى الطازجة 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي.
  3. قياس تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام معمل NanoDrop أو معمل.

6. جعل [كدنا من RNA

  1. إضافة عشر حجم المطلوبةفي تحتوي على 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي وجلب الحجم الإجمالي إلى 8 ميكرولتر بإضافة الماء مجانا نوكلياز. لهذا إضافة 1 ميكرولتر 10 ملي dNTP مزيج 1 ميكرولتر من hexamers عشوائي من عدة مرتفع الأولى ستراند التجميعي. بلطف خلط واحتضان عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في أي حمام مائي أو على thermocycler مبرمجة مسبقا.
  2. جعل الخلطة الجاهزة التي تحتوي على الكواشف التالية: 2 ميكرولتر من 10X RT العازلة، 4 ميكرولتر من 25 M MgCl 2، 2 ميكرولتر من 0.1 M DTT و 1 ميكرولتر من ريبونوكلياز OUT (40 U / ميكرولتر).
    ملاحظة: وبالنظر إلى الكميات هي في رد الفعل، من شأنه أن يحتاج المستخدم لزيادة وفقا لاحتياجات التجريبية واحد.
  3. بعد إزالة RNA يحتوي على عينة من 65 درجة مئوية، ووضع أنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة. إضافة 9 ميكرولتر حل الخلطة الجاهزة واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة. إضافة 1 ميكرولتر من مرتفع II إنزيم النسخ العكسي (50 U / ميكرولتر)، ثم يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
  4. احتضان العينات عند 42 درجة مئوية لمدة 50دقيقة للالنسخ العكسي تحدث.
  5. احتضان العينات عند 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لإنهاء رد فعل.
  6. وضع العينات على الجليد لفترة وجيزة وإضافة 1 ميكرولتر RNAseH (2 U / ميكرولتر) واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  7. لفترة وجيزة الطرد المركزي الأنابيب في 3،000 x ج لتدور باستمرار السائل المكثفات.
    ملاحظة: هذا هو [كدنا التي سيتم استخدامها لالكمي PCR. [كدنا يمكن تخزينها في الثلاجة -20 درجة مئوية حتى إعداد PCR. ويمكن أيضا أن تضعف [كدنا مع المياه مجانا نوكلياز قبل الشروع في PCR.

7. الكمي PCR

  1. جعل مزيج الرئيسي الذي يحتوي على الكواشف التالية (مجلدات معينة هم في رد الفعل): 6.3 ميكرولتر من 2X SYBR الأخضر ميكس، 0.6 ميكرولتر من الأمام التمهيدي (10 ميكرون)، 0.6 ميكرولتر من عكس التمهيدي (10 ميكرون) و 0.5 ميكرولتر من المياه nuclease مجانا .
    ملاحظة: تم تصميم التمهيدي باستخدام الخيار في الصفحة تسلسل النوكليوتيدات NCBI في "الاشعال اختيار" لهذا الجين من الفائدة.
  2. إضافة 10 ميكرولتر mastermix إلى كل بئر من 96 لوحة جيدا PCR. إضافة 2.5 ميكرولتر من [كدنا حققها في وقت سابق إلى البئر تحتوي على mastermix. تأكد من تعيين ما يصل ردود الفعل PCR ثلاث نسخ لكل عينة.
  3. بعد الانتهاء من إضافة mastermix وكدنا]، وتغطي لوحة PCR باستخدام ورقة لاصقة البصرية لاغلاق الآبار. تدور لوحة لفترة وجيزة لمدة 5 دقائق في 500 x ج في جهاز للطرد المركزي الطاولة لتسوية كل السائل إلى قاع البئر.
  4. تحميل لوحة PCR على آلة RT-PCR مبرمجة مسبقا. استخدام المعلمات PCR الواردة في الجدول 1.
  5. تحليل البيانات: استخدم القيم C ر من إخراج QPCR لمزيد من العمليات الحسابية. جنبا إلى جنب مع الجين الاختبار، وإعداد ردود الفعل PCR لجينات الرقابة الداخلية، 18S الرنا الريباسي (لضمان مدخلات المساواة) وβ-الأكتين (المراقبة السلبية). حساب التغيرات أضعاف على أساس طريقة ΔΔCt 37.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الأرقام 1A و 1B تظهر التعبير النسبي للعامل التغذية العصبية وGABRD نسبة إلى السيطرة الجين β-الأكتين. عامل التغذية العصبية، وكثيرا ما يرتبط في neurotrophin مع آثار اعصاب في العديد من الأمراض العصبية 38-41. ولذلك فمن المثير للاهتمام أن تحليل الشخصية التعبير عن BDNF ردا على التحفيز من ATN التي ينتج الفوائد العلاجية لمرضى الصرع. في الشكل 1A مما يدل على الشخصية التعبير الجيني للعامل التغذية العصبية في جميع أنحاء أشار نقاط في الوقت الرد على التحفيز DBS، عامل التغذية العصبية لوحظ يصل التنظيم فورا (0 ساعة) بعد عملية جراحية DBS جنبا إلى جنب مع التعبير الذروة (3 أضعاف أكبر من unstimulated) في 3 ساعات التحفيز آخر. هذه الملاحظة تشير إلى أن تعزيز تعبير عامل التغذية العصبية والعصبية الناتجة يمكن أن تساهم في فوائد علاجية من DBS. تم التحقيق آخر GABRD الجين (الشكل 1B) أيضا باستخدام طريقة QPCR. GABRD هو مبادرة الخوذ البيضاء GABA المستقبلةالفصل هو واحد من الاهداف المحتملة لتصميم العقاقير المضادة للصرع 42. الملف الشخصى التعبير عن GABRD يظهر أيضا تعزيز التعبير في الحيوانات حفز بالمقارنة مع الحيوانات السيطرة unstimulated في DBS آخر 3 ساعة. وبالنظر إلى أن يتم استخدام منبهات GABA كما المكثفات الاستيلاء فعالة، فمن المثير للاهتمام أن نلاحظ تعزيز GABRD آخر التعبير DBS، تورط دور محتمل للGABA في تأثير مضاد للصرع من DBS.

بروتوكول RT-PCR هو موضح هنا تؤدي إلى نتائج قابلة للتكرار والكمية التي تكشف الجين أنماط التعبير والاختلافات النسبية أضعاف بالمقارنة مع الحيوانات السيطرة. يتم تنفيذ تحليل البيانات بالطريقة التالية: ناتج QPCR يعطي عتبة C ر قيمة لهذا الجين اختبار لكل عينة تم تحليلها. ويتم الحصول على C القيم ر أيضا لمراقبة الجينات β-الأكتين و18S الرنا الريباسي (مراقبة المدخلات). وبعد ذلك يتم استخدام طريقة ر ΔΔC لحساب EXPR الجينالملف الشخصي ession استخدام هذه C ر قيم 37. على سبيل المثال، لحساب التغيرات في التعبير الجيني للعامل التغذية العصبية، لعينة معينة، ويتم احتساب الفرق بين C ر قيمة للعامل التغذية العصبية و18S الرنا الريباسي وهو أول ΔC ر. لنفس العينة، يتم احتساب الفرق بين C ر قيمة β-الأكتين و18S الرنا الريباسي لإعطاء ΔC ر الثاني. ويتم احتساب الفرق بين القيمتين ΔC ر إعطاء ΔΔC ر. يتم استخدام هذه القيمة ر ΔΔC لحساب 2 ^ (-ΔΔC ر) الذي يعطي وفرة قالب النسبية للعامل التغذية العصبية مقارنة β-الأكتين. بواسطة بالتآمر هذه القيمة عبر مختلف نقاط الوقت إلى جانب السيطرة unstimulated، يتغير التعبير الجيني الناجم عن DBS عبر نقاط الوقت يمكن تصور. ويمكن استخدام الطريقة الموصوفة أعلاه بشكل فعال لتحقيق تغييرات في التعبير عن الجينات الأخرى التي هي صريحة المحتملةآتش التي تستجيب لتحفيز DBS والتحقيق في بعض الآثار المصب من تحوير التعبير عن هذه الجينات.

الشكل (1)
الشكل 1: تحليل بالطبع (A) وقت BDNF التعبير في الاستجابة لتحفيز وتيرة عالية من ATN. وأجريت حصاد الأنسجة، واستخراج الحمض النووي الريبي، وإعداد [كدنا و q-PCR كما هو موضح في البروتوكول. يتم احتساب التغيرات النسبية في التعبير الجيني بعد تطبيع لإدخال (عن طريق تضخيم 18S الرنا الريباسي)، وكذلك الجين التحكم (β-الأكتين). واستخدمت القيم ر C تم الحصول عليها من الوقت الحقيقي PCR لحساب مستويات التعبير من قبل ΔΔ C ر 37 طريقة. لنقاط الوقت تحليلها هي 0 و 3 و 6 و 12 ساعة آخر DBS التحفيز. ملاحظة: timepoints التي تم اختيارها هنا هي مع الاحترام لدراسة معينة وغير قابلة للتغيير وفقا لHYالفرضية وخطة التجريبية. (ب) الوقت تحليل مسار GABA A فرعية دلتا مستقبلات (GABRD) مستويات ردا على DBS في 130 هرتز استهداف ATN. وقد أجريت الأساليب والعمليات الحسابية كما مشابهة لبيانات عامل التغذية العصبية.

الشكل 2
الشكل 2: أقطاب DBS ومشجعا اقامة.

دورات PCR
المرحلة 1: تمسخ الأولي 95 ° C 15 دقيقة
المرحلة 2: تمسخ 95 ° C 15 ثانية
الصلب 60 ° C 30 ثانية
تمديد 72 ° C 30 ثانية
40 دورات من الخطوة 2
ملاحظة: درجة الحرارة الصلب تختلف وفقا ل
درجة حرارة انصهار التمهيدي. صممت الاشعال عادة
أن يكون لها درجة حرارة الصلب المثلى ل60 ° C

الجدول 1: PCR معلمات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

بعد عمل معلما قبل Benabid وآخرون في استخدام التحفيز العميق للمخ لعلاج المرض والهزة الضروري باركنسون، وقد تم التحقيق في تقنية جراحية DBS باهتمام كبير خلال العقد الماضي لعلاج العديد من الاضطرابات العصبية 6،10،43. يتم إجراء دراسات DBS التي تستهدف مختلف المناطق العصبية التشريحية للدوائر الدماغ حاليا من قبل العديد من الجماعات لمعالجة الأمراض العصبية الرئيسية وهي في مراحل مختلفة من التجارب السريرية. التحفيز للنواة تحت المهاد (STN) أو جزء الداخلي من الشاحبة جلوبس (GPI) وافقت ادارة الاغذية والعقاقير، واستخدمت في علاج اضطرابات الحركة في مرض باركنسون 10. وقد أظهرت التجارب السريرية SANTE اتجاهات واعدة لمرضى الصرع تلقي التحفيز تيرة عالية من النواة المهادية الأمامية 31. النتائج من المرحلة الأولى من التجارب السريرية التحفيز forniceal الثنائي أظهرت تأخير في معدل التدهور المعرفي وإعادةversal من امتصاص الجلوكوز hypometabolic ينظر في مرض الزهايمر، فضلا عن تفعيل دوائر الذاكرة 8،44. وعلاوة على ذلك، أجرى جراحو الأعصاب في السنوات الأخيرة تجارب DBS لعلاج الاضطرابات العصبية والنفسية مثل الوسواس القهري (الوسواس القهري)، والاكتئاب المقاوم للعلاج، متلازمة توريت والإدمان 10،45-55.

وبالإضافة إلى التجارب السريرية، على مدى السنوات القليلة الماضية، وقد قدم لنا جراحة الحيوان فرصا كبيرة لدراسة التغيرات الفسيولوجية الناجمة عن تقنية جراحية في الحيوانات الحية، بطريقة لم يسبق لها مثيل من قبل أي تقنية في المختبر. في هذه المخطوطة، وقد ناقشنا الطرق تشارك في أداء جراحة تحفيز الدماغ العميق في القوارض. ويمكن أيضا أن تستخدم جراحة المجسم في القوارض كما هو موضح هنا لاحتمال تفتيش الهدف DBS ولاختبار فعالية الجراحة باستخدام الحيوانات نموذج المرض. واحدة من التحديات التي تواجه المجرب حيحرث هو أن تكون قادرة على استهداف موضع تشريحي الصحيح بطريقة استنساخه. هناك حاجة خاصة لفني المهرة لعملية جراحية بسبب التحقق من الاستهداف الصحيح هو ممكن فقط بعد الانتهاء من التحفيز والحيوان الموت الرحيم. أيضا في بعض الأحيان، يمكن للمرء أن تجرح بطريق الخطأ الأوعية الدموية الرئيسية التي يمكن أن تؤدي إلى فقدان الدم كبيرة وأحيانا حتى موت الحيوان. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الحاجة لتشريح خارج الحصين لمزيد من التحليل الكيميائي الحيوي يحد من إمكانية التحقق immunohistological عن القطب السليم الاستهداف في نفس الحيوان الذي يتطلب وجود عينة الدماغ سليمة لباجتزاء الأنسجة. ربما يمكن أن يتم التحقق السليم استهداف الكهربائي على حيوان مختلف حفز بطريقة متطابقة. ومع ذلك، هذا لا توفر أدلة على استهداف السليم في اختبار الحيوانية ووجود قيود على هذا النهج. وقد حاول المنشورات الحديثة للتحايل على هذه المشكلة عن طريق إجراء عملية جراحية DBS مع simultaneouليالي الرنين المغناطيسي الوظيفي 56. واحد تحسن محتمل للتقنية وصفها هنا يمكن أن تكون دراسة عن آثار التحفيز المزمن عن طريق مشجعا المزروع في الحيوان. ومع ذلك، لدينا محدودة تحليلنا لجرعة واحدة (1 ساعة) من التحفيز عالية التردد كخطوة أولى لفهم التغيرات التي تحدثها DBS على المستوى الخلوي.

النظر في استخدام جراحة DBS لمجموعة متنوعة من الاضطرابات العصبية، فمن الضروري أن نعرف الآلية الكامنة وراء الآثار المفيدة للDBS. هذه المعلومات أمر بالغ الأهمية لتطوير التحسينات المستقبلية في الجراحة وأيضا لاستكشاف فائدة DBS كعلاج للشروط الأخرى التي لم يتم التحقيق فيها من قبل خبراء في DBS. وبالإضافة إلى ذلك، تعديلات على تقنية جراحية يمكن تنفيذها لتجنب بعض الآثار الجانبية الضارة للإجراءات وللتعامل بفعالية مع تكرار حالة المرض.

متعمقة الآلية آناتحلل من DBS من الممكن من خلال دراسة التغيرات في التعبير الجيني الناجم عن DBS. إما نهج الجين مرشح بناء على المعلومات الموجودة عن مسارات العصبية التي تستجيب لإزالة إستقطاب المنبهات مثل التحفيز عالية التردد، أو تحليل Transcriptome على الصعيد العالمي يمكن أن تعطي معلومات هامة في الأحداث الجزيئية الناجمة عن DBS. تقنيات تحليل التعبير الجيني (نهج الجين مرشح وكذلك طريقة الإنتاجية العالية) هي أدوات قوية التي هي المفتاح لاستكشاف الآليات الجزيئية والخلوية التغييرات المرتبطة جراحة DBS. وقد جعلت التطورات الأخيرة في هذا المجال من الممكن بالنسبة لنا للحصول على ثروة من المعلومات حول عدة جوانب الفيزيولوجيا الخلوية في وقت قصير جدا، والتي لم يكن ممكنا قبل بضع سنوات. مع ظهور عالية الإنتاجية تكنولوجيا التسلسل مثل ChIPseq، فمن الممكن لتوصيف الموقع على نطاق الجينوم من عوامل النسخ الهامة التي تستجيب لDBS 57،58. الاكتشافات الحديثة التي تربط بين غير-coding RNA مثل الرنا الميكروي مع أمراض الاعصاب، تمكننا من تحليل التغيرات المحتملة في مستويات ميرنا في الخلايا العصبية بعد DBS باستخدام ميرنا تكنولوجيا التسلسل 59،60. يمكن أيضا استكشاف التغيرات المحتملة في التوقيعات جينية مثل هذا مثيلة الحمض النووي وهيستون التعديلات استجابة لDBS. ومع ذلك، على الرغم من المزايا، من المهم أن نعترف بعض القيود المفروضة على هذه التقنيات، فضلا عن المشاكل المحتملة التي قد تنشأ خلال التحليلات. وكان مصدر قلق كبير مع التعبير الجيني التحليلات استنساخ وأخطاء فنية. من المهم أن المجرب يأخذ علما بهذا وتخطط على وجود عدد كاف من التكرار لضمان موثوقية. وثمة مشكلة مشتركة مع بعض الدراسات فحص إنتاجية عالية صعوبة في تفسير كم هائل من البيانات التي يتم إنشاؤها. في بعض الأحيان يصبح من المهم تحديد ما إذا كانت التغييرات التعبير الجيني لوحظت هي نتيجة لتأثير مباشرمن العلاج التجريبي أو هو تأثير المصب. وهذا يتطلب عادة الدراسات الإضافية التي تم تصميمها لمعالجة هذه المسألة.

بالإضافة إلى الدراسات الجينومية، وتحليل المناعى واسعة من توطين المكانية والزمانية من اللاعبين الرئيسيين التي تستجيب للDBS وتحديد الكميات من التغييرات في مستويات لها في مناطق مختلفة من الدماغ يكون مكسبا كبيرا للتطورات المستقبلية لل DBS إجراء العمليات الجراحية. النتائج التراكمية من التعبير الجيني تحليلات فضلا عن أن الدراسات تكشف عن التفاعلات المناعية جديدة بين العوامل الرئيسية وكذلك الأحداث الجزيئية الرئيسية التي تنظم العمليات الخلوية مثل تكوين الخلايا العصبية أو التنكس العصبي. قد تحديد هذه الواسمات الجزيئية الحيوية أيضا تمكين الاكتشافات المخدرات في المستقبل. هذه النتائج يمكن أن تلقي الضوء على سير العام للدوائر الدماغ، وهي معلومات قيمة من وجهة نظر العلماء الذين يعملون على فهم الرجلالأمراض العصبية ذ. توجيه جهودنا المستقبلية على دمج أحدث التطورات التكنولوجية التي في العيادة وكذلك المختبر من المرجح أن تقدم لنا مزايا كبيرة في كفاحنا ضد المرض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Deep Brain Stimulation Surgery
Stereotactic frame Kopf Instruments Model 900
Drill  Dremmel 7700, 7.2 V
Scalpel BD 372610
Ketamine Patterson Veterinary 07-803-6637 Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules
Xylazine Patterson Veterinary 07-808-1947
Buprenorphine Patterson Veterinary 07-850-2280 Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules
Surgical staples ConMed Corporation 8035
Sutures (3-0)  Harvard Apparatus 72-3333
Syringe (1 ml, 29 1/2 G) BD 329464 Sterile, use for Anesthesia administration intraperitoneally
Syringe (3 ml, 25 G) BD 309570 Sterile, use for Analgesia administration subcutaneously
Needles BD 305761 Sterile, use for clearing broken bone pieces from the burr holes
Ethanol Fisher Scientific S25309B Use for general sterilization 
Eye Lubricant Fisher Scientific 19-898-350
Stimulator Medtronic Model 3628
DBS electrodes Rhodes Medical Instruments, CA SNEX100x-100 mm Electrodes are platinum, concentric and bipolar
Betadine (Povidone-Iodine)  PDI S23125 Single use swabsticks, use for sterilizing the scalp before making incision 
 Brain Dissection and Hippocampal tissue isolation
Acrylic Rodent Brain Matrix Electron Microscopy Sciences 175-300 www.emsdiasum.com
Razor Blade V W R 55411-050
Guillotine Scissors Clauss 18039 For decapitation, make sure these scissors are maintained in clean and working condition
Scissors Codman Classic 34-4098 Use for removing the brain from the skull
Forceps Electron Microscopy Sciences 72957-06 Use for removing the brain from the skull and for handling during dissection
Phosphate Buffered Saline  Boston Bioproducts BM-220
 RNA Extraction and cDNA Preparation
Tri Reagent Sigma T9424 Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin
Syringe (3 ml, 25 G) BD 309570 Use for tissue homogenization
Chloroform Fisher Scientific BP1145-1 Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin
Isopropanol Fisher Scientific A416-1
Glycogen Thermo Scientific R0561
Dnase I Kit Ambion AM1906
Superscript First Strand Synthesis Kit Invitrogen 11904-018
Tabletop Microcentrifuge Eppendorf 5415D
 Quantitative PCR               
SYBR Green PCR Kit Qiagen 204143
Custom Oligos Invitrogen 10668051
PCR Plates (96 wells) Denville Scientific C18080-10
Optical Adhesive Sheets Thermo Scientific AB1170
Nuclease free Water Thermo Scientific SH30538-02
Real Time PCR Machine Applied Biosystems 7500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Toda, H., Hamani, C., Fawcett, A. P., Hutchison, W. D., Lozano, A. M. The regulation of adult rodent hippocampal neurogenesis by deep brain stimulation. Journal of. 108, 132-138 (2008).
  2. Perlmutter, J. S., Mink, J. W. Deep brain stimulation. Annual review of neuroscience. 29, 229-257 (2006).
  3. Bergstrom, M. R., Johansson, G. G., Laitinen, L. V., Sipponen, P. Electrical stimulation of the thalamic and subthalamic area in cerebral palsy. Acta physiologica Scandinavica. 67, 208-213 (1966).
  4. Benabid, A. L., et al. Chronic electrical stimulation of the ventralis intermedius nucleus of the thalamus as a treatment of movement disorders. Journal of neurosurgery. 84, 203-214 (1996).
  5. Benabid, A. L., et al. Long-term electrical inhibition of deep brain targets in movement disorders. Movement disorders : official journal of the Movement Disorder Society. 13, Suppl 3. 119-125 (1998).
  6. Benabid, A. L., et al. Long-term suppression of tremor by chronic stimulation of the ventral intermediate thalamic nucleus. Lancet. 337, 403-406 (1991).
  7. Tierney, T. S., Lozano, A. M. Surgical treatment for secondary dystonia. Movement disorders : official journal of the Movement Disorder Society. 27, 1598-1605 (2012).
  8. Tierney, T. S., Sankar, T., Lozano, A. M. Some recent trends and further promising directions in functional neurosurgery. Acta neurochirurgica. Supplement. 117, 87-92 (2013).
  9. Tierney, T. S., Sankar, T., Lozano, A. M. Deep brain stimulation emerging indications. Progress in brain research. 194, 83-95 (2011).
  10. Sankar, T., Tierney, T. S., Hamani, C. Novel applications of deep brain stimulation. Surgical neurology international. 3, S26-S33 (2012).
  11. Tierney, T. S., Vasudeva, V. S., Weir, S., Hayes, M. T. Neuromodulation for neurodegenerative conditions. Frontiers in bioscience. 5, 490-499 (2013).
  12. Mayberg, H. S., et al. Deep brain stimulation for treatment-resistant depression. Neuron. 45, 651-660 (2005).
  13. Lyons, M. K. Deep brain stimulation: current and future clinical applications. Mayo Clinic proceedings. 86, 662-672 (2011).
  14. Ch. 4. Rehabilitation in movement disorders. Lansek, R., Morris, M. E. , Cambridge University Press. 36-43 (2013).
  15. Goodwin, R., Tierney, T., Lenz, F., Anderson, W. Ch. 15. Single Neuron Studies of the Human Brain: Probing Cognition. Fried, I., Rutishauser, U., Cerf, M., Kreiman, G. 15, MIT Press. 275-293 (2014).
  16. Hauser, W. A. Epidemiology of epilepsy in children. Neurosurgery clinics of North America. 6, 419-429 (1995).
  17. Hauser, W. A. Recent developments in the epidemiology of epilepsy. Acta neurologica Scandinavica. Supplementum. 162, 17-21 (1995).
  18. Davis, R., Emmonds, S. E. Cerebellar stimulation for seizure control: 17-year study. Stereotactic and functional neurosurgery. 58, 200-208 (1992).
  19. Levy, L. F., Auchterlonie, W. C. Chronic cerebellar stimulation in the treatment of epilepsy. Epilepsia. 20, 235-245 (1979).
  20. Velasco, A. L., et al. Electrical stimulation of the hippocampal epileptic foci for seizure control: a double-blind, long-term follow-up study. Epilepsia. 48, 1895-1903 (2007).
  21. Tellez-Zenteno, J. F., McLachlan, R. S., Parrent, A., Kubu, C. S., Wiebe, S. Hippocampal electrical stimulation in mesial temporal lobe epilepsy. Neurology. 66, 1490-1494 (2006).
  22. Kerrigan, J. F., et al. Electrical stimulation of the anterior nucleus of the thalamus for the treatment of intractable epilepsy. Epilepsia. 45, 346-354 (2004).
  23. Hamani, C., et al. Deep brain stimulation of the anterior nucleus of the thalamus: effects of electrical stimulation on pilocarpine-induced seizures and status epilepticus. Epilepsy research. 78, 117-123 (2008).
  24. Hamani, C., et al. Bilateral anterior thalamic nucleus lesions and high-frequency stimulation are protective against pilocarpine-induced seizures and status epilepticus. Neurosurgery. 54, 191-195 (2004).
  25. Mirski, M. A., Rossell, L. A., Terry, J. B., Fisher, R. S. Anticonvulsant effect of anterior thalamic high frequency electrical stimulation in the rat. Epilepsy research. 28, 89-100 (1997).
  26. Mirski, M. A., Ferrendelli, J. A. Interruption of the mammillothalamic tract prevents seizures in guinea pigs. Science. 226, 72-74 (1984).
  27. Mirski, M. A., Ferrendelli, J. A. Anterior thalamic mediation of generalized pentylenetetrazol seizures. Brain research. 399, 212-223 (1986).
  28. Mirski, M. A., Ferrendelli, J. A. Interruption of the connections of the mammillary bodies protects against generalized pentylenetetrazol seizures in guinea pigs. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 7, 662-670 (1987).
  29. Mirski, M. A., McKeon, A. C., Ferrendelli, J. A. Anterior thalamus and substantia nigra: two distinct structures mediating experimental generalized seizures. Brain research. 397, 377-380 (1986).
  30. Lee, K. J., Jang, K. S., Shon, Y. M. Chronic deep brain stimulation of subthalamic and anterior thalamic nuclei for controlling refractory partial epilepsy. Acta neurochirurgica. Supplement. 99, 87-91 (2006).
  31. Fisher, R., et al. Electrical stimulation of the anterior nucleus of thalamus for treatment of refractory epilepsy. Epilepsia. 51, 899-908 (2010).
  32. Encinas, J. M., Hamani, C., Lozano, A. M., Enikolopov, G. Neurogenic hippocampal targets of deep brain stimulation. The Journal of comparative neurology. 519, 6-20 (2011).
  33. Hattiangady, B., Rao, M. S., Shetty, A. K. Chronic temporal lobe epilepsy is associated with severely declined dentate neurogenesis in the adult hippocampus. Neurobiology of disease. 17, 473-490 (2004).
  34. Kuruba, R., Hattiangady, B., Shetty, A. K. Hippocampal neurogenesis and neural stem cells in temporal lobe epilepsy. Epilepsy & behavior : E&B. 14, Suppl 1. 65-73 (2009).
  35. Hattiangady, B., Shetty, A. K. Implications of decreased hippocampal neurogenesis in chronic temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 49, Suppl 5. 26-41 (2008).
  36. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Elsevier Inc. (2007).
  37. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 22DDCT Method. METHODS. 25, 402-408 (2001).
  38. Kells, A. P., et al. AAV-mediated gene delivery of BDNF or GDNF is neuroprotective in a model of Huntington disease. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 9, 682-688 (2004).
  39. Han, B. H., Holtzman, D. M. BDNF protects the neonatal brain from hypoxic-ischemic injury in vivo via the ERK pathway. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 20, 5775-5781 (2000).
  40. Hetman, M., Kanning, K., Cavanaugh, J. E., Xia, Z. Neuroprotection by brain-derived neurotrophic factor is mediated by extracellular signal-regulated kinase and phosphatidylinositol 3-kinase. The Journal of biological chemistry. 274, 22569-22580 (1999).
  41. Stadelmann, C., et al. BDNF and gp145trkB in multiple sclerosis brain lesions: neuroprotective interactions between immune and neuronal cells. Brain : a journal of neurology. 125, 75-85 (2002).
  42. Treiman, D. M. GABAergic mechanisms in epilepsy. Epilepsia. 42, Suppl 3. 8-12 (2001).
  43. Benabid, A. L., Pollak, P., Louveau, A., Henry, S., de Rougemont, J. Combined (thalamotomy and stimulation) stereotactic surgery of the VIM thalamic nucleus for bilateral Parkinson disease. Applied neurophysiology. 50, 344-346 (1987).
  44. Laxton, A. W., et al. A phase I trial of deep brain stimulation of memory circuits in Alzheimer's disease. Annals of. 68, 521-534 (2010).
  45. Tierney, T. S., Abd-El-Barr, M. M., Stanford, A. D., Foote, K. D., Okun, M. S. Deep brain stimulation and ablation for obsessive compulsive disorder: evolution of contemporary indications, targets and techniques. The International journal of neuroscience. 124, 394-402 (2014).
  46. Kennedy, S. H., et al. Deep brain stimulation for treatment-resistant depression: follow-up after 3 to 6 years. The American journal of psychiatry. 168, 502-510 (2011).
  47. Lozano, A. M., et al. Subcallosal cingulate gyrus deep brain stimulation for treatment-resistant depression. Biological psychiatry. 64, 461-467 (2008).
  48. Ackermans, L., et al. Double-blind clinical trial of thalamic stimulation in patients with Tourette syndrome. Brain : a journal of neurology. 134, 832-844 (2011).
  49. Houeto, J. L., et al. Tourette's syndrome and deep brain stimulation. Journal of neurology, neurosurgery, and psychiatry. 76, 992-995 (2005).
  50. Maciunas, R. J., et al. Prospective randomized double-blind trial of bilateral thalamic deep brain stimulation in adults with Tourette syndrome. Journal of neurosurgery. 107, 1004-1014 (2007).
  51. Koning, P. P., Figee, M., van den Munckhof, P., Schuurman, P. R., Denys, D. Current status of deep brain stimulation for obsessive-compulsive disorder: a clinical review of different targets. Current psychiatry reports. 13, 274-282 (2011).
  52. Greenberg, B. D., et al. Deep brain stimulation of the ventral internal capsule/ventral striatum for obsessive-compulsive disorder: worldwide experience. Molecular psychiatry. 15, 64-79 (2010).
  53. Muller, U. J., et al. Successful treatment of chronic resistant alcoholism by deep brain stimulation of nucleus accumbens: first experience with three cases. Pharmacopsychiatry. 42, 288-291 (2009).
  54. Zhou, H., Xu, J., Jiang, J. Deep brain stimulation of nucleus accumbens on heroin-seeking behaviors: a case report. Biological psychiatry. 69, e41-e42 (2011).
  55. Porta, M., et al. Thalamic deep brain stimulation for treatment-refractory Tourette syndrome: two-year outcome. Neurology. 73, 1375-1380 (2009).
  56. Younce, J. R., Albaugh, D. L., Shih, Y. Y. Deep brain stimulation with simultaneous FMRI in rodents. Journal of visualized experiments : JoVE. , e51271 (2014).
  57. Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature reviews. Genetics. 10, 669-680 (2009).
  58. Valouev, A., et al. Genome-wide analysis of transcription factor binding sites based on ChIP-Seq data. Nature methods. 5, 829-834 (2008).
  59. Fiore, R., Siegel, G., Schratt, G. MicroRNA function in neuronal development, plasticity and disease. Biochimica et biophysica acta. 1779, 471-478 (2008).
  60. Hebert, S. S., De Strooper, B. Alterations of the microRNA network cause neurodegenerative disease. Trends in neurosciences. 32, 199-206 (2009).

Tags

علم الأعصاب، العدد 97، النواة المهادية الأمامية، والتحفيز العميق للدماغ، التلفيف المسنن، الحصين، والصرع، والتعبير الجيني، وتحفيز عالية التردد، الكمي RT-PCR
تحليل التغييرات التعبير الجيني في الفئران الحصين بعد ديب تحفيز الدماغ الأمامي من مهادي نواة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Selvakumar, T., Alavian, K. N.,… More

Selvakumar, T., Alavian, K. N., Tierney, T. Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus. J. Vis. Exp. (97), e52457, doi:10.3791/52457 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter