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JoVE Journal Neuroscience
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Neuroscience

Die Analyse der Genexpression Veränderungen im Hippocampus Ratte nach Tiefenhirnstimulation des Anterior Thalamuskern

Published: March 8, 2015 doi: 10.3791/52457
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Neurosurgery, Brigham & Women's Hospital, Harvard Medical School, 2Division of Brain Sciences, Department of Medicine, Imperial College London

Abstract

Tiefen Hirnstimulation (DBS) Chirurgie, die auf die verschiedenen Regionen des Gehirns, wie der Basalganglien, Thalamus und subthalamicus Regionen ist eine wirksame Behandlung für verschiedene Bewegungsstörungen, die ausgefallen sind, um Medikamente reagieren. Die jüngsten Fortschritte auf dem Gebiet der DBS Operation begonnen hat, die Anwendung dieser OP-Technik, um andere Bedingungen so vielfältig wie krankhafte Fettsucht, Depressionen und Zwangsstörungen zu erweitern. Trotz dieser Ausweitung Hinweise, ist nur wenig über die zugrunde liegenden physiologischen Mechanismen, die wohltuende Wirkung des DBS Operation erleichtern bekannt. Ein Ansatz für diese Frage ist es, Genexpressionsanalyse in Neuronen, die elektrische Stimulation erhalten zuführen. Frühere Studien haben gezeigt, daß Neurogenese bei der Ratte Gyrus dentatus wird in DBS ausgelöst Targeting des anterioren Nucleus des Thalamus 1. DBS Operation gezielt den ATN ist weithin für die Behandlung refraktärer Epilepsie eingesetzt. Es ist daher von sehr interest für uns, um die Transkriptionsänderungen durch elektrische Stimulation der ATN induzierte erkunden. In diesem Manuskript beschreiben wir unsere Methoden für die stereotaktisch geführte DBS Operation gezielt den ATN bei erwachsenen männlichen Wistar-Ratten. Wir haben auch die nachfolgenden Schritte für Gewebedissektion, RNA-Isolierung, cDNA-Präparation und quantitative RT-PCR diskutieren zur Messung der Genexpression ändert. Dieses Verfahren könnte angewandt und für die Stimulierung der Basalganglien und andere Regionen des Gehirns allgemein klinisch gezielt modifiziert werden. Die Genexpression Studie hier beschriebenen übernimmt einen Kandidaten Zielgen Ansatz für die Entdeckung der molekularen Spieler, die Regie führen konnte den Mechanismus für die DBS.

Introduction

Die Geschichte hinter der Entwicklung der Tiefenhirnstimulation als neurochirurgische Technik stammt aus den 1870er Jahren, wenn die Möglichkeit der elektrischen Stimulation des Gehirns Schaltungen wurde 2 untersucht. Die Verwendung von chronischen Hochfrequenzstimulation zur Behandlung von neuronalen Erkrankungen begann in den 1960er Jahren 3. Später in den 1990er Jahren mit dem Aufkommen von chronischen Implantation DBS-Elektroden 4-6, die Anzahl von neuronalen Störungen, die von DBS behandelt wurden weiter zu. Tiefe Hirnstimulation wurde zum ersten Mal in den USA zur Behandlung von essentiellem Tremor 6 verwendet. Heute ist die Operation wird häufig zur neuronalen Störungen, die derzeit nicht behandelbar durch pharmakologische Intervention, zu behandeln. DBS ist derzeit zur Behandlung von Bewegungsstörungen Parkinson-Krankheit und Dystonie 7-9 behandeln. Alzheimer-Demenz, Huntington-Krankheit, Epilepsie, Schmerzen und neuropsychiatrischen Erkrankungen wie Depressionen, Zwangsstörungen, Tourette7; s Syndrom und Sucht sind einige der Bedingungen der Behandlung zugänglich durch DBS 10-12. Während DBS Operation FDA zur Behandlung von Parkinson, Dystonie und essentiellem Tremor genehmigt die Verwendung von DBS für die Behandlung von anderen oben genannten Bedingungen sind in verschiedenen Stadien der Labor- und klinischen Studien mit vielversprechend für Patienten 13,14.

Klinisch wird DBS Operation in zwei Stufen durchgeführt. Die erste Stufe beinhaltet die chirurgische Positionierung der DBS-Elektroden an der gezielten anatomischen Lage mit einer Kombination aus radiologischen Positionierung, CT, MRT sowie Mikromesswerte für eine verbesserte Präzision. Die zweite Stufe beinhaltet die Implantation eines Impulsgenerators in der oberen Brustkorb des Patienten und die Installation Verlängerungskabel von der Kopfhaut an den Impulsgenerator. Bezogen auf das neurologische Erkrankung, haben mehrere Programmiersysteme für den Pulsgenerator standardisiert und wird verwendet, um die gewünschte Spannung zu liefern. Das Endvolumentage wird stufenweise erreicht, um die besten klinischen Reaktion mit minimaler Spannung 15 zu empfangen. In unseren Studien, im Gegensatz zu den chronischen DBS Implantate klinisch verwendet wird, für die der Einfachheit halber haben wir uns dem Studium eine einmalige Hochfrequenzstimulation (1 Stunde) in unserem Tiermodell zurückgegriffen.

Ein Teil der Forschung unserer Gruppe konzentriert sich auf die Untersuchung der Verwendung von DBS Operation bei therapierefraktärer Epilepsie. Die stereotaktische chirurgische Ansätze mit Hochfrequenz-Stimulation wurde von vielen anderen als eine wirksame Möglichkeit, medizinisch refraktärer Epilepsie, die etwa 30% aller Fälle von Epilepsie 10,16,17 bildet Behandlung untersucht. Kleinhirn-Stimulation zur Förderung der kortikalen Oberfläche sowie den tiefen Kleinhirnkerne wurden in der Vergangenheit als Ziele verwendet, um Epilepsie 10,18,19 behandeln. Darüber hinaus hat Hippocampus Stimulation auch versucht worden, aber mit unterschiedlichen Ergebnissen 20,21. Einige der anderen untersuchtenDBS Ziele für Epilepsie sind die Großhirnrinde, Thalamus, Nucleus subthalamicus und Vagusnerv 8. Im Anschluss an die Ergebnisse mehrerer Studien in den letzten Jahren, die vordere Thalamuskern (ATN) hat als die häufigste DBS Ziel für Epilepsie-Behandlung 10,22 entstanden. Gestützt auf das Wissen über neuroanatomische Schaltung und Erkenntnisse aus Tiermodellen haben verschiedene Studien über die therapeutische Wirkung die tiefe Hirnstimulation der ATN bei der Behandlung von Epilepsie 23-26 konzentriert. Das ATN ist Teil des limbischen Kreis und ist in der Region des Gehirns, die Anfallshäufigkeit betrifft entfernt. Studien von Hamani et al., Haben die Wirksamkeit von ATN-DBS in einer Pilocarpin induzierten Epilepsie-Modell getestet und festgestellt, dass die bilateralen ATN Stimulation verlängerte Latenzen für Pilocarpin-induzierten Krampfanfällen und Status epilepticus 24. Darüber hinaus wurde Hochfrequenzstimulation des ATN gefunden Anfallsfrequenz in einem Pentylentetrazol (PTZ) Modell ep reduzierenilepsy 25,27-29. Lee et al., Haben eine mittlere Reduktion der Anfallshäufigkeit um etwa 75% auf chronische tiefe Hirnstimulation des ATN bei der Behandlung von refraktären partiellen Epilepsie 30 ausgewiesen.

Eine neue klinische Studie zur Behandlung refraktärer Epilepsie hat vielversprechende Ergebnisse nach DBS Operation Ausrichtung der vorderen Thalamuskern (ATN) 22 gezeigt. Eine multizentrische randomisierte Studie mit 110 Patienten, die bilaterale DBS des ATN zur Behandlung refraktärer Epilepsie (SANTE-Studie) zeigte einen Rückgang der Anfallshäufigkeit um etwa 40% 31. Die Ergebnisse aus dieser Studie deutete auch auf eine verzögerte optimale Antiepileptikum Wirkung 2-3 Monate nach der Operation beobachtet. Weitere Studien von Toda et al., Mit diesen Ergebnissen untermauert, wo sie gezeigt, Neurogenese geschieht zu einem späteren Zeitpunkt nach der DBS (Tage 3-5) im Tiermodell ein. Zusätzlich Encinas et al., Haben hippocampalen neurogene gemeldetsis in der erwachsenen Maus Gyrus dentatus nach hochfrequente Stimulation des ATN 32. Frühere Studien 33-35 haben sinkende Neurogenese in bestimmten Fällen epileptischen wie chronische Temporallappen-Epilepsie und eine Assoziation mit Lerndefiziten, Gedächtnisstörungen und spontan wiederkehrenden Motorkrampfanfälle berichtet. Weiterhin gab es eine Verringerung in der neuralen Stammzellvorläufer Faktoren wie FGF2 und IGF-1 in der chronisch epileptischen Hippocampus im Tiermodell 33. In Anbetracht dessen, interventionelle Strategien wie DBS, die eine Steigerung der Neurogenese im Gyrus dentatus zeigen, sind spannende Möglichkeiten für die Forschung. Diese Ergebnisse haben uns ermutigt, weiter tief in den zugrunde liegenden Mechanismus der Neurogenese nach DBS Behandlung für Epilepsie zu erkunden. Wir haben die ATN sowohl einseitig ausgerichtet (Daten nicht angegeben) als auch auf bilateraler Ebene (in repräsentative Ergebnisse) und gesehen erhöht Neurotrophin (BDNF) Ausdruck in den Ratten Gyrus dentatus. Unsere current Hypothese ist, dass die BDNF-Expression initiiert eine Genexpression Kaskade, in der Neurogenese gipfelt, die dem anti-epileptische Wirkung DBS Operation übersetzt. In diesem Artikel präsentieren wir unsere Methoden zur DBS Operation gezielt den ATN bei Ratten, gefolgt von Genexpressionsanalyse als attraktiver Ansatz, um die zugrunde liegende Mechanismus die Vorteile des DBS zu studieren.

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Protocol

HINWEIS: Ethik Hinweise: Alle Verfahren in diesem Manuskript beschrieben werden, werden in Übereinstimmung mit den NIH-Richtlinien für Tierforschung (Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren) und werden von der Harvard Medical School IACUC Ausschuss genehmigt.

1. Präoperative Vorbereitung

  1. Stellen Sie sicher, dass alle chirurgischen Instrumente werden entweder durch Autoklavieren oder durch Reinigung mit einer antiseptischen Lösung und / oder Ethanol bei Bedarf sterilisiert. Verwenden Sie möglichst sterile Einweg-Geräte wie Skalpelle, Nadel und Spritzen.
  2. Decken Sie die Werkbank mit OP-Abdeckungen und stellen Sie sicher, dass es ein Biohazard Entsorgung zur Verfügung.
  3. Wiegen Sie die Ratte und berechnen Anästhesie Dosis. Verwenden Sie einen Ketamin / Xylazin-Mix (Ketamin 75 mg / kg und Xylazin 10 mg / kg), um die Ratten zu betäuben.
    HINWEIS: 200-250 g ist das optimale Gewicht für eine ordnungsgemäße Befestigung des Tieres in der stereotaktischen Rahmens als auch für eine genaue Ausrichtung der ATN. Isoflurane kann auch als die betäubende Mittel verwendet werden.
  4. Aufziehen und sichern zwei sterilen Elektroden am Elektrodenhalter (durch Autoklavieren oder mit Ethylenoxid sterilisiert) (Abbildung 2) einer stereotaktischen Operations Rahmen und mit Hilfe eines Mikroskops (10-40x Vergrößerung), überprüfen Sie die Spitzen der Elektrode für die ordnungsgemäße Ausrichtung. Befestigen Sie die beiden Elektroden 3,0 mm.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, um eine Beschädigung der Elektrodenspitze durch Berühren auf harten Oberflächen.

2. DBS Chirurgie

  1. Injizieren Sie die Ketamin / Xylazin mischen intraperitoneal an das Tier, und bestätigen, dass das Tier eine chirurgische Ebene der Narkose erreicht (indem Sie für die Zehen Prise Reflex, Atemfrequenz und -tiefe und Ordnungsmäßigkeit der Atmung). Entfernen Sie Haare aus dem Bereich der Kopfhaut, die eingeschnitten wird und desinfizieren Sie die Kopfhaut mit 3 Wechsel Peelings jedem Betadin und entweder Alkohol oder steriler Kochsalzlösung. Sichern Sie und positionieren Sie das Tier auf der stereotaktischen frame.
  2. Verwenden zirkulierenden Warmwasserpolster auf Körpertemperatur des Tieres auf einem optimalen Niveau zu halten. Bewerben Auge Schmiermittel die Augen des Tieres, um vor dem Austrocknen zu schützen.
  3. Verwenden Sie die folgenden stereotaktischen Koordinaten für die Ausrichtung der ATN (Anterior Thalamuskern): anterioposterior -1,6 mm, mediolateral 1,5 mm und 5,2 mm dorsoventrale 1.
    HINWEIS: Die stereotaktischen Koordinaten werden auf der Paxinos und Watson (6. Auflage) Rattenhirnatlas 36 basiert.
  4. Einen Einschnitt in der Kopfhaut sagittal, um den Schädel zu offenbaren. Mit ein Paar von Wundhaken sichern die Kopfhaut eingeschnitten, um den Schädel freizulegen. Verwenden steriler Kochsalzlösung, um den Einschnitt zu spülen. Wenn Einschnitt zu nass, sterile Wattestäbchen trocknen. Suchen Sie die Bregma und markieren Sie mit einem schwarzen Marker. Um die Lage der Bohrlöcher von der Pfeilnaht und 1,6 mm hinter dem coron führen, stellen zwei weitere Marken auf etwa 1,5 mm mediolateral auf beiden Seitenal Naht.
  5. Verwenden Sie eine Handbohrmaschine, um die Bohrlöcher zu machen. Achten Sie darauf, die Spitze des Bohrloch ist steril durch Sterilisieren mit Ethanol. Halten Sie den Bohrer bei etwa einem Winkel von 45 ° zu der Schädeloberfläche beim Bohren. Häufig zwischen den beiden Bohrlöchern übermäßigen Wärme an der Stelle jedes Bohrloch zu vermeiden.
  6. Weiter Bohren bis die Dura freigelegt wird. Mit einer Nadel mit der Spitze gebogen ähnelt die Form eines "L", entfernen Sie alle Bruchstücke des Knochens, die das Einführen der Elektrode behindern würde. Achten Sie darauf, um eine Beschädigung der darunter liegenden Dura und / oder Hirngewebe beim Entfernen von Knochenfragmenten mit dem verbogenen Nadel.
    HINWEIS: Mit einem stumpfen Nadel oder feinem stumpfen Pinzette ist auch eine Option.
  7. Fixieren den Dual-Elektroden-Anordnung an der Drehgriff des stereotaktischen Rahmen und fixieren den Griff in einem 90 ° -Winkel. Mit den Einstellungen in der stereotaktischen Rahmen, positionieren Sie den linken Elektrode genau über dem Bregma.
  8. Mit dem Stereo-Taktik Anpassungen mediolateral Positionierung genau der linken Elektrode bewegen 1,5 mm an der linken Seite von Bregma, dass jetzt gibt es zwei Elektroden entlang der Kranznaht perfekt ausgerichtet, aber mit Abstand von 1,5 mm vom Bregma mediolateral.
  9. Mit den anterioposterior stereotaktische Anpassungen, bewegen die Elektroden 1,6 mm hinter der Kranznaht.
  10. Verwenden Sie die dorsoventrale Anpassungen, die Elektroden auf ersten Scheck zu senken, wenn die Bohrlöcher haben an der richtigen Stelle, so dass die Elektroden mit Leichtigkeit eingeführt werden gemacht, ohne sie zu berühren die Ecken und Kanten der Bohrlöcher. Wenn dem so ist, legen die Elektroden bis zu einer Tiefe von 5,2 mm von der Oberfläche des Schädels.
  11. Die Elektroden über Leitungen an einen Stimulator bei 130 Hz, 2,5 V und 90 & mgr; s Pulsbreite 1.
  12. Liefern Hochfrequenz-Stimulation für eine Stunde (oder für eine gewünschte Zeitdauer nach Versuchsaufbau). Im Verlauf der Stimulation, vergessen Sie p versichernroper Anästhesietiefe regelmäßig durch Prüfen des MKSV Rückzug in Reaktion auf eine Zehe kneifen. Ergänzen Anästhesie mit etwa der Hälfte der Initialdosis zur Narkoseeinleitung. Vermeiden Sie die Kontamination des sterilen Handschuhen bei der Überprüfung der Narkosetiefe und bei Bedarf ändern. Führen Sie ein- oder beidseitige Stimulation auf der Grundlage eines experimentellen Anforderungen. Fügen Sie Steuerelemente wie Niederfrequenzstimulation (für z. B. 10 Hz) und nicht-stimulierten Tieren (Einfügen von Elektroden ohne nachfolgende Stimulation).
  13. Nach Stimulation abgeschlossen ist, entfernen Sie die Elektroden vorsichtig und Naht der Schnitt mit 3-0 Nähten oder mit sterilen chirurgischen Klammern.
  14. Verabreichen Buprenorphin (0,05 mg / kg) subkutan als Analgesie. Überwachen Sie das Tier, bis es zur normalen Aktivität zurück und dann wieder in das Gehäuse Anlage.
  15. Nach einem festgelegten Zeitraum auf der Grundlage der experimentellen Gestaltung (zum Beispiel 0, 3, 6 oder 12 Stunden nach der Operation DBS), Einschläfern das Tier mit Narkosedosis. Nach der Bestätigung der Abwesenheit von Vitalfunktionen, enthaupten das Tier.
  16. Präparieren Sie das Gehirn, indem Sie zuerst die Haut mit einer Schere entfernen. Durch den Knochen entlang der Pfeilnaht mit Dissektion Schere geschnitten. Machen Sie zwei weitere Einschnitte (etwa einen Zentimeter pro Stück) durch den Knochen auf beiden Längsseiten. Mit einer Pinzette, heben Sie den teilweise abgetrennten Knochenstück aus der Oberseite des Schädels, das Gehirn zu schützen.
  17. Mit einer feinen Schere oder Zange, entfernen das Gehirn aus dem Schädel und übertragen in eine Petrischale mit kaltem PBS auf Eis.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, um eine Beschädigung des Gehirns zu vermeiden und gleichzeitig die Einschnitte durch den Knochen.

3. Hippocampus Isolation

HINWEIS: Führen Sie alle nachfolgenden Schritte in diesem Abschnitt auf Eis.

  1. Stellen Sie das Gehirn auf eine vorgekühlte Acrylgehirnmatrix auf Eis. Mit einer Rasierklinge, schneiden Sie das Gehirn koronal mit etwa 7-8 mm von der vorderen äußersten edge des Gehirns. Einen zweiten Schnitt koronal und hinter dem ersten Schnitt, so dass eine etwa 5 mm dicke Gehirnschnitt entfernt werden könnte.
  2. Übertragen Sie die Hirnschnitt in eine Petrischale mit eiskaltem PBS. Mit Rasierklinge, trennen die beiden halbkugelförmigen Abschnitte und kümmern uns um festzustellen, welche Hemisphäre zu den linken und rechten Seite jeweils entspricht. Dies ist besonders wichtig bei der Ausführung einseitige Stimulationen.
  3. Mit einer feinen Pinzette und Schere entfernen Hippocampus sorgfältig.
  4. Flash-frieren die Hippocampus-Gewebe auf Trockeneis und lagern in -20 ° C Gefrierschrank bis bereit für die nachfolgenden RNA-Extraktionsschritte.
    HINWEIS: Für die Langzeitlagerung ist es ratsam, um Gewebe in einem -80ºC Gefriergerät.

4. RNA-Extraktion und quantitative PCR

  1. Stellen Sie sicher, das Gewebe bleibt auf Trockeneis eingefroren, bis sie zur Homogenisierung.
  2. HINWEIS: Führen Sie diesen Schritt in der Kapuze.
    1. 1 ml Tri-Reagenz zu Hippocampal Gewebe in einem 1,5 ml Zentrifugenröhrchen geben und homogenisieren, indem es zunächst Pipettieren mehrmals, bis das Gewebe in kleinere Stücke gebrochen. Weitere Homogenisierung des Gewebes durch Durchleiten durch eine Spritze mit einer 25 G-Nadel, bis es keine ununterbrochene Gewebe sichtbar. Führen Sie die Schritte der Homogenisierung auf Eis.
    2. Nach Homogenisieren des Gewebes, damit die Zellsuspension bei Raumtemperatur für 5 Minuten stehen, um die Zelllyse zu ermöglichen.
      HINWEIS: Nach dieser Stelle die Zellsuspension kann schnell sein, eingefroren und in -70 ° C bis zur weiteren Verarbeitung gespeichert.
  3. 0,2 ml Chloroform und mischen durch Vortexen für 20 Sekunden und lassen Sie die Lösung Rest bei Raumtemperatur für 15 min.
  4. Zentrifugiere die Proben bei 12.000 g 15 min bei 4 ° C. Nach dem Zentrifugieren vorsichtig die Schläuche ohne die drei getrennten Schichten, die sichtbar sein wird stören.
    HINWEIS: Die unten (rot) Phase enthält Proteine, Mitte bewölkt Phase enthält DNA und die obere klare Phase enthält RN / A.
  5. Übertragen Sie die obere klare Phase (RNA) in ein frisches 1,5 ml Zentrifugenröhrchen (typischerweise 500 ul des RNA-Phase, die erhalten wird). Um dies zu 0,5 ml Isopropanol und durch Vortexen mischen. Dazu gibt man 2-3 ul Glycogen (20 mg / ml) als Träger für die RNA. Die Probe wird auf dem Tisch bei Raumtemperatur für 10 Minuten ruhen.
  6. Zentrifugieren Sie die Probe bei 12.000 · g für 1 Stunde bei 4 ° C. Sicherstellen, dass das RNA-Pellet an der Unterseite des Rohres sichtbar sind.
  7. Überstand verwerfen und waschen Sie die RNA-Pellet durch Zugabe von 1 ml 75% Ethanol (hergestellt mit Nuclease freies Wasser). Kehren Sie die Probe mehrmals, bis das Pellet verdrängt aus dem Boden der Röhre und schwimmt in der Lösung. Zentrifugieren der Lösung bei 12.000 g für 10 Minuten bei 4 ° C.
    HINWEIS: Die Pellet in 75% Ethanol bei -20 ° C bis zur weiteren Schritte gespeichert werden.
  8. Ermöglichen die RNA-Pellet an der Luft trocknen, indem man die Röhrchen für 5 min bei Raumtemperatur geöffnet. Nehmen Vorsichtsmaßnahme, um zu vermeiden, over Trocknen der Pellets, da dies ihrer Auflösung in Wasser in der nachfolgenden Stufe zu beeinträchtigen.

5. Entfernen von DNA aus dem RNA-Präparat

  1. In 9 ul Nuklease-freies Wasser auf die RNA-Pellet und sicherstellen, dass das Pellet wird, bevor durch vorsichtiges Vortexen das Rohr gelöst. Um dieses Add 1 ul 10x DNase I-Puffer und 1 ul rekombinante DNase (von DNase I-Kit), mischen durch vorsichtiges Ausklopfen der Rohre, Spin kurz die Röhren und bei 37 ° C in einem Wasserbad für 30 min.
  2. Add 2 ul DNase-Inaktivierung Reagenz (von DNase I-Kit) auf die Probe und bei Raumtemperatur für 2 min und oft mischen durch vorsichtiges Schwenken der Röhrchen. Zentrifuge bei 12.000 g für 10 min und Übertragung etwa 10 ul des klaren Überstands in ein frisches 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen.
  3. Messen Sie RNA-Konzentration mit einem Nanodrop oder Spektralphotometer.

6. Herstellung von cDNA aus RNA

  1. Fügen erforderliche Volumen thzumin enthält 1 ug RNA und bringt das Gesamtvolumen auf 8 & mgr; l durch Zugabe von Nuklease freiem Wasser. Um dieses Add 1 ul 10 mM dNTP Mix und 1 ul Zufallshexameren aus dem Superscript First Strand Synthesis Kit. Vorsichtig mischen und inkubieren bei 65 ° C für 5 min in entweder einem Wasserbad oder auf einen vorprogrammierten Thermocycler.
  2. Einen Vormischung, die folgenden Reagenzien: 2 ul 10x RT-Puffer, 4 ul 25 M MgCl 2, 2 & mgr; l 0,1 M DTT und 1 ul RNAse OUT (40 U / ul).
    HINWEIS: Volumes gelten pro Reaktion, würde Benutzer müssen entsprechend den eigenen experimentellen Anforderungen skalieren.
  3. Nach Entfernung des RNA-Probe, die von 65 ° C, eingestellt das Röhrchen bei Raumtemperatur für eine Minute. In 9 ul Basislösung und bei Raumtemperatur für 2 min. 1 & mgr; l Superscript II Reverse Transkriptase (50 U / ul) und dann bei Raumtemperatur inkubiert für 10 min.
  4. Inkubieren der Proben bei 42 ° C für 50min für die reverse Transkription auftritt.
  5. Die Proben bei 70 ° C inkubieren, für 15 min, um die Reaktion zu beenden.
  6. Legen Sie die Proben auf Eis kurz und fügen 1 ul RNAseH (2 U / ul) und bei 37 ° C für 20 min.
  7. Die Röhrchen bei 3000 xg kurz zentrifugieren, um Spin-Down der Kondensatflüssigkeit.
    Anmerkung: Dies ist cDNA, die für die quantitative PCR verwendet wird. cDNA kann in -20 ° C Gefrierschrank bis PCR-Setup gespeichert werden. cDNA kann auch mit Nuklease-freies Wasser, bevor Sie mit PCR verdünnt werden.

7. Quantitative PCR

  1. Geben Sie eine Master-Mix enthält die folgenden Reagenzien (Mengen gelten pro Reaktion): 6,3 ul 2x Sybr Green Mix, 0,6 ul der Forward Primer (10 uM), 0,6 ul Reverse Primer (10 uM) und 0,5 ul Nuklease freiem Wasser .
    HINWEIS: Primer Entwurf wurde unter Verwendung gemacht die "Pick-Primer 'Option im NCBI Nukleotid-Sequenz-Seite für das Gen von Interesse.
  2. Zugabe von 10 & mgr; l Mastermix in jede Vertiefung einer 96 gut PCR Platte. In 2,5 ul cDNA früher die gut mit dem Mastermix hergestellt. Achten Sie darauf, dreifacher Ausfertigung PCR-Reaktionen für jede Probe einrichten.
  3. Nach Beendigung der Zugabe von Mastermix und cDNA, umfassen die PCR-Platte mit Hilfe eines optischen Klebefolie, um die Vertiefungen abzudichten. Drehen die Platte kurz für 5 min bei 500 × g in einer Tischzentrifuge, um alle Flüssigkeit zu dem Boden des Bohrlochs zu regeln.
  4. Laden Sie die PCR-Platte auf eine vorprogrammierte RT-PCR-Maschine. Verwenden Sie die in Tabelle 1 PCR-Parameter.
  5. Datenanalyse: Verwenden Sie die C t Werte aus der qPCR-Ausgang für weitere Berechnungen. Zusammen mit dem Testgens, bis die PCR-Reaktionen für die interne Kontrollgene 18S rRNA und β-Aktin (negative Kontrolle) (auf gleiche Eingangs gewährleisten). Berechnen fachen Änderungen basierend auf ΔΔCt Verfahren 37.

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Representative Results

Die 1A und 1B zeigen die relative Expression von BDNF und GABRD relativ zum Steuer Gen β-Actin. BDNF ist ein Neurotrophin ist oft mit neuroprotektiven Wirkungen in vielen neuronalen Erkrankungen 38-41 verbunden. Es ist daher interessant, das Expressionsprofil von BDNF in Reaktion auf die Stimulation des ATN das therapeutische Vorteile zu epileptischen Patienten ergibt analysieren. In 1A, die das Genexpressionsprofil von BDNF in den angegebenen Zeitpunkten zeigt, zu schreiben DBS Stimulation, BDNF Hochregulation wird sofort (0 h) nach der DBS Operation zusammen mit der Peak-Expression (3-fach größer als die nicht-stimulierten) nach 3 h beobachtet nach Stimulation. Diese Beobachtung lässt vermuten, dass erhöhte BDNF-Expression, und die resultierende Neuroprotektion könnte zur therapeutischen Nutzen DBS beitragen. Ein weiteres Gen GABRD (1B) wurde ebenfalls unter Verwendung der qPCR Methode untersucht. GABRD ist ein GABA-Rezeptor which ist eine der möglichen Ziele für die Gestaltung Antiepilepsiedrogen 42. Das Expressionsprofil GABRD zeigt auch eine erhöhte Expression in den stimulierten Tieren im Vergleich zu den nicht-stimulierten Kontrolltiere bei 3 Stunden nach der DBS. In Anbetracht, dass GABA-Agonisten als wirksame Beschlagnahme Unterdrücker verwendet wird, ist es interessant, verbesserte GABRD Ausdruck Post DBS beobachten, implizieren eine mögliche Rolle für GABA im Antiepileptikum Wirkung von DBS.

Die hier beschriebene RT-PCR-Protokoll liefert reproduzierbare und quantitative Ergebnisse, die Genexpressionsmuster und die relativen fache Unterschiede im Vergleich zu den Kontrolltieren zu offenbaren. Die Analyse der Daten wird in der folgenden Weise durchgeführt: Der qPCR Ausgang gibt den Schwellenwert C t Wert für die Testgens für jede Probe analysiert. C t Werte sind auch für die Kontroll-Gen β-Actin und 18S rRNA (input control) erhalten. Die ΔΔC t Methode wird dann verwendet, um das Gen expr berechnenSession Profil über diese C t-Werte 37. Zum Beispiel, um die Veränderungen der Genexpression für BDNF berechnen, für eine gegebene Probe wird die Differenz zwischen dem C t Wert für BDNF und 18S rRNA berechnet und ist der erste & Dgr; t. Für die gleiche Probe wird die Differenz zwischen dem C t Wert für β-Actin und 18S rRNA berechnet, um die zweite & Dgr; C T zu ergeben. Die Differenz zwischen den beiden & Dgr; t-Werte berechnet wird, um ΔΔC t ergeben. Diese ΔΔC t Wert wird berechnet, 2 ^ (-ΔΔC t), der die relative Häufigkeit Vorlage für BDNF im Vergleich zu β-Aktin verleiht. Durch Auftragen dieser Wert in den verschiedenen Zeitpunkten neben der nicht-stimulierten Kontrolle, können Veränderungen der Genexpression durch die DBS über Zeitpunkten induziert visualisiert werden. Das oben beschriebene Verfahren effektiv verwendet werden, um Veränderungen in der Expression für andere Gene, die potenzielle Schnappschüsse sind untersuchenates, der auf DBS Stimulation sind und einige der stromabwärts Wirkungen der Modulation der Expression dieser Gene zu untersuchen.

Figur 1
Figur 1: (A) Zeitverlaufsanalyse von BDNF-Expression in Reaktion auf hochfrequente Stimulation des ATN. Gewebeernte, die RNA-Extraktion, cDNA-Herstellung und q-PCR wurden durchgeführt, wie im Protokoll erläutert. Relative Veränderungen der Genexpression werden nach Normalisierung für die Eingabe (durch Amplifizieren der 18S rRNA) sowie eine Kontroll-Gen (β-Actin) berechnet. C aus der Echtzeit-PCR erhaltenen t-Werte wurden verwendet, um die Expressionsniveaus durch die ΔΔ C t Methode 37 berechnen. Die Zeitpunkte analysiert, sind 0, 3, 6 und 12 Stunden nach der Stimulation DBS. Hinweis: Die hier gewählten Zeitpunkten sind in Bezug auf eine bestimmte Studie und wird nach dem hy ändernthese und Versuchsplan. (B) Zeitverlauf Analyse des GABA-A-Rezeptor delta-Untereinheit (GABRD) Ebenen in Reaktion auf DBS bei 130 Hz zur Förderung der ATN. Verfahren und Berechnungen wurden als ähnlich zu den BDNF Daten.

Abbildung 2
Abbildung 2: DBS-Elektroden und Stimulator einzurichten.

PCR-Zyklen
Stufe 1: Anfängliche Denaturierung 95 ° C 15 Minuten
Stufe 2: Denaturierung 95 ° C 15 Sekunden
Glühen 60 ° C 30 Sekunden
Erweiterung 72 ° C 30 sec
40 Zyklen von Schritt 2
Anmerkung: Die Glühtemperatur hängt von der
Primer Schmelztemperatur. Primer sind typischerweise so konstruiert
um eine optimale Anlagerungstemperatur von 60 ° C haben,

Tabelle 1: PCR-Parameter.

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Discussion

Nach dem Wahrzeichen Arbeit Benabid et al. Bei der Verwendung der tiefen Hirnstimulation zur Behandlung der Parkinson-Krankheit und essentiellem Tremor hat die DBS Operationstechnik mit großem Interesse den letzten zehn Jahren zu vielen neurologischen Erkrankungen 6,10,43 Behandlung untersucht. DBS Studien Targeting verschiedenen neuroanatomischen Regionen des Gehirns Schaltungen werden derzeit von vielen Gruppen durchgeführt, um wichtige neuronalen Erkrankungen ansprechen und sind in verschiedenen Phasen der klinischen Studien. Stimulation des Nucleus subthalamicus (STN) oder dem internen Segment des Globus pallidus (GPI) ist von der FDA zugelassen und in der Behandlung von Bewegungsstörungen bei Parkinson-10 verwendet. Die klinische SANTE-Studie vielversprechende Trends für epileptische Patienten, die Hochfrequenzstimulation der vorderen Thalamuskern 31 gezeigt. Ergebnisse aus einer Phase-I-Studie der bilateralen forniceal Stimulation haben eine Verzögerung in der Rate der kognitiven Verfall und Wieder gezeigtVersal der Glucose hypometabolisch Aufnahme bei Alzheimer-Krankheit zu sehen, sowie die Aktivierung der Speicherschaltung 8,44. Darüber hinaus in den letzten Jahren haben Neurochirurgen DBS-Studien zur Behandlung von neuropsychiatrischen Erkrankungen wie OCD (Zwangsstörung), behandlungsresistente Depression, Tourette-Syndrom und Sucht 10,45-55 durchgeführt.

Zusätzlich zu den klinischen Studien der vergangenen Jahre, Tierchirurgie hat uns große Chancen, um die physiologischen Veränderungen durch die OP-Technik in einem lebenden Tier induziert, in einer Weise, von keinem in vitro Technik zu studieren an. In diesem Manuskript haben wir die bei der Durchführung der tiefen Hirnstimulation Chirurgie bei Nagern beteiligt Methoden diskutiert. Die stereotaktische Chirurgie bei Nagetieren wie hier beschrieben kann auch für potentielle DBS Zielsuche verwendet werden, und zu testen, die Wirksamkeit der Operation mit Krankheitsmodelltieren. Eine der Herausforderungen für den Experimentator here ist in der Lage, den korrekten anatomischen Ort in reproduzierbarer Weise abzuzielen. Insbesondere besteht ein Bedarf für einen Fachmann für die Operation wegen Überprüfung der korrekten Ausrichtung möglich ist, erst nach der Stimulierung durchgeführt, und das Tier getötet. Auch gelegentlich, könnte man versehentlich verletzen eine Schlüsselblutgefäß, die zu erheblichen Blutverlust und manchmal sogar zum Tod des Tieres führen könnte. Darüber hinaus ist die Notwendigkeit, sezieren die Hippocampus für weitere biochemische Analyse beschränkt die Möglichkeit der immunhistologische Nachweis für die richtige Zielelektrode in der gleichen Tier, das eine intakte Hirnprobe für die Gewebeschneide erfordert. Richtige Elektroden Targeting könnte möglicherweise auf einem anderen Tier in gleicher Weise angeregt prüft werden. Dies bedeutet jedoch keine Hinweise für die richtige Ausrichtung im Versuchstier zur Verfügung und ist eine Einschränkung dieses Ansatzes. Neuere Veröffentlichungen haben versucht, dieses Problem durch die Durchführung von DBS Operation mit simultaneou umgehens fMRI 56. Eine mögliche Verbesserung der hier beschriebenen Technik konnte eine Studie über die Wirkung einer chronischen Stimulation über einen implantierten Stimulator des Tieres sein. Jedoch haben wir unsere Analyse für eine Einzeldosis (1 h) von Hochfrequenzstimulation als erster Schritt zum Verständnis der Veränderungen von DBS auf Zellebene induziert beschränkt.

In Anbetracht der Verwendung von DBS Operation für eine Vielzahl von neuronalen Störungen, ist es wichtig, da wir die zugrunde liegende Mechanismus die vorteilhaften Wirkungen der DBS. Diese Information ist von entscheidender Bedeutung für die Entwicklung von zukünftigen Verbesserungen in der Chirurgie und auch den Nutzen der DBS zur Behandlung von anderen Bedingungen, die nicht von den Experten in DBS sucht erkunden. Zusätzlich können Änderungen an der Operationstechnik durchgeführt werden, um bestimmte nachteilige Nebenwirkungen des Verfahrens zu vermeiden und wirksam mit Wiederauftreten der Krankheitszustand behandeln.

Eine eingehende mechanistische anaLyse der DBS ist durch die Untersuchung der Genexpression Veränderungen die durch DBS induzierte möglich. Entweder ein Kandidatengen-Ansatz auf der Grundlage bestehender Kenntnisse über Nervenbahnen, die auf Reize reagieren depolarisierende wie Hochfrequenzstimulation oder eine globale Transkriptom-Analyse kann wichtige Erkenntnisse über die molekularen Ereignisse, die von DBS ausgelöst geben. Die Genexpressionsanalyse-Techniken (Kandidatengenansatz sowie Hochdurchsatz-Verfahren) sind leistungsfähige Werkzeuge, Schlüssel zur Erforschung der molekularen Mechanismen und zellulären Veränderungen mit DBS Operation verbunden sind. Die jüngsten Entwicklungen in diesem Bereich haben es möglich gemacht für uns, um eine Fülle von Informationen über verschiedene Aspekte der Zellphysiologie in einer sehr kurzen Zeit, die nicht vor ein paar Jahren möglich war, zu erhalten. Mit dem Aufkommen von Hochdurchsatz-Technologien wie ChIPseq, ist es möglich, die genomweite Lage wichtiger Transkriptionsfaktoren, die an DBS 57,58 reagieren charakterisieren. Jüngste Entdeckungen verbindet nichtkodierenden RNA wie microRNA mit neurodegenerativen Erkrankungen, ermöglichen es uns, mögliche Änderungen der miRNA Ebenen in Neuronen nach der DBS mit miRNA-Sequenzierungstechnologie 59,60 analysieren. Mögliche Änderungen in der epigenetischen Signaturen wie DNA-Methylierung und Histon-Modifikationen als Reaktion auf DBS konnte untersucht werden. Trotz der Vorteile, es ist jedoch wichtig, einige der Einschränkungen dieser Techniken sowie mögliche Probleme, die bei Analysen auftreten könnten quittieren. Ein wichtiges Anliegen mit Genexpressionsanalysen wurde die Reproduzierbarkeit und technische Fehler. Es ist wichtig, dass der Experimentator nimmt dieses und beabsichtigt auf eine ausreichende Anzahl von Wiederholungen, um die Zuverlässigkeit zu gewährleisten. Ein häufiges Problem bei einigen der Hochdurchsatz-Screening-Studien war die Schwierigkeit bei der Interpretation des enormen Datenmenge, die erzeugt wird. Manchmal wird es wichtig, festzustellen, ob die Veränderungen der Genexpression beobachtet aufgrund der direkten Wirkung sindder experimentellen Behandlung oder eine nachgeschaltete Wirkung. Dies erfordert in der Regel zusätzliche Studien, die entworfen sind, um dieses Problem zu beheben.

Zusätzlich zu den genomischen Studien wird eine umfassende immunhistochemische Analyse der raum-zeitlichen Lokalisierung der wichtigsten Akteure, die DBS zu reagieren und eine Quantifizierung der Veränderungen in ihren Ebenen in verschiedenen Bereichen des Gehirns ein großer Gewinn für die künftige Entwicklung der sein DBS chirurgischen Eingriffs. Die kumulierten Ergebnisse der Genexpressionsanalysen sowie die immunhistochemischen Untersuchungen können neue Wechselwirkungen zwischen Schlüsselfaktoren sowie die wichtigsten molekularen Ereignisse, die zelluläre Prozesse wie Neurogenese und Neurodegeneration zu regulieren offenbaren. Die Identifizierung solcher kritischen molekularen Markern können auch ermöglichen zukünftige Medikament Entdeckungen. Solche Erkenntnisse könnten Licht auf die allgemeine Funktionsweise des Gehirns Schaltungen, die wertvolle Informationen aus der Sicht der Wissenschaftler, die den Menschen zu verstehen, ist Schuppeny neuronalen Erkrankungen. Regie unsere zukünftigen Anstrengungen zur Integration von neuesten technologischen Fortschritte in der Klinik gemacht sowie die Labor voraussichtlich uns wesentliche Vorteile in unserem Kampf gegen die Krankheit anzubieten.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Deep Brain Stimulation Surgery
Stereotactic frame Kopf Instruments Model 900
Drill  Dremmel 7700, 7.2 V
Scalpel BD 372610
Ketamine Patterson Veterinary 07-803-6637 Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules
Xylazine Patterson Veterinary 07-808-1947
Buprenorphine Patterson Veterinary 07-850-2280 Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules
Surgical staples ConMed Corporation 8035
Sutures (3-0)  Harvard Apparatus 72-3333
Syringe (1 ml, 29 1/2 G) BD 329464 Sterile, use for Anesthesia administration intraperitoneally
Syringe (3 ml, 25 G) BD 309570 Sterile, use for Analgesia administration subcutaneously
Needles BD 305761 Sterile, use for clearing broken bone pieces from the burr holes
Ethanol Fisher Scientific S25309B Use for general sterilization 
Eye Lubricant Fisher Scientific 19-898-350
Stimulator Medtronic Model 3628
DBS electrodes Rhodes Medical Instruments, CA SNEX100x-100 mm Electrodes are platinum, concentric and bipolar
Betadine (Povidone-Iodine)  PDI S23125 Single use swabsticks, use for sterilizing the scalp before making incision 
 Brain Dissection and Hippocampal tissue isolation
Acrylic Rodent Brain Matrix Electron Microscopy Sciences 175-300 www.emsdiasum.com
Razor Blade V W R 55411-050
Guillotine Scissors Clauss 18039 For decapitation, make sure these scissors are maintained in clean and working condition
Scissors Codman Classic 34-4098 Use for removing the brain from the skull
Forceps Electron Microscopy Sciences 72957-06 Use for removing the brain from the skull and for handling during dissection
Phosphate Buffered Saline  Boston Bioproducts BM-220
 RNA Extraction and cDNA Preparation
Tri Reagent Sigma T9424 Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin
Syringe (3 ml, 25 G) BD 309570 Use for tissue homogenization
Chloroform Fisher Scientific BP1145-1 Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin
Isopropanol Fisher Scientific A416-1
Glycogen Thermo Scientific R0561
Dnase I Kit Ambion AM1906
Superscript First Strand Synthesis Kit Invitrogen 11904-018
Tabletop Microcentrifuge Eppendorf 5415D
 Quantitative PCR               
SYBR Green PCR Kit Qiagen 204143
Custom Oligos Invitrogen 10668051
PCR Plates (96 wells) Denville Scientific C18080-10
Optical Adhesive Sheets Thermo Scientific AB1170
Nuclease free Water Thermo Scientific SH30538-02
Real Time PCR Machine Applied Biosystems 7500

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Neuroscience Ausgabe 97 vordere Thalamuskern ist die Tiefenhirnstimulation Gyrus dentatus Hippocampus Epilepsie Genexpression Hochfrequenz-Stimulation quantitative RT-PCR
Die Analyse der Genexpression Veränderungen im Hippocampus Ratte nach Tiefenhirnstimulation des Anterior Thalamuskern
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Selvakumar, T., Alavian, K. N.,… More

Selvakumar, T., Alavian, K. N., Tierney, T. Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus. J. Vis. Exp. (97), e52457, doi:10.3791/52457 (2015).

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