Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

ניתוח שינויי ביטוי הגנים בהיפוקמפוס העכברוש לאחר Deep Brain Stimulation של Anterior התלמוס הגרעין

Published: March 8, 2015 doi: 10.3791/52457

Abstract

גירוי מוחי עמוק ניתוח (DBS), מיקוד לאזורים שונים של המוח כגון גרעיני הבסיס, תלמוס, ואזורי subthalamic, הוא טיפול יעיל לכמה הפרעות תנועה שלא הגיבו לטיפול תרופתי. ההתקדמות האחרונה בתחום של ניתוחי DBS החלה להרחיב את היישום של טכניקה ניתוחית זו למצבים אחרים מגוונים כמו השמנת יתר חולנית, דיכאון והפרעת אובססיבית כפייתית. למרות סימני הרחבת אלה, מעט מאוד ידוע על המנגנונים הפיסיולוגיים הבסיסיים המאפשרים את ההשפעות המיטיבות של ניתוח DBS. גישה אחת לשאלה זו היא לבצע ניתוח ביטוי גנים בתאי עצב המקבלים גירוי החשמלי. מחקרים קודמים הראו כי neurogenesis ברכס המשונן חולדה שהושרו בDBS מיקוד של הגרעין הקדמי של התלמוס 1. ניתוח DBS מיקוד ATN נמצא בשימוש נרחב לטיפול באפילפסיה עקשן. מתבררים שהוא בעל הרבה interest לנו לחקור את שינויי תעתיק הנגרמים על ידי גירוי חשמלי ATN. בכתב היד הזה, אנו מתארים שיטות שלנו לניתוח DBS stereotactically מודרך מיקוד ATN בחולדות Wistar זכר בוגרים. כמו כן נדונונו בשלבים הבאים לנתיחה רקמה, בידוד RNA, הכנת cDNA וRT-PCR למדידת שינויי ביטוי גנים. שיטה זו יכולה להיות מיושמת ושונה לגירוי הגרעינים הבזליים ואזורים אחרים של המוח בדרך כלל ממוקדים מבחינה קלינית. מחקר ביטוי גנים המתוארים כאן מניח גישת גן מטרת מועמד לגילוי שחקנים מולקולריים שיכול לנתב את המנגנון לDBS.

Introduction

ההיסטוריה מאחורי הפיתוח של Deep Brain Stimulation כטכניקה הנוירוכירורגית שתחילתה 1870 כאשר האפשרות של גירוי חשמלי החשמלי במוח שנחקרה 2. השימוש בגירוי בתדר גבוה כרוני כטיפול בהפרעות עצביות התחיל ב -1960 3. מאוחר יותר בשנת 1990 עם כניסתו של אלקטרודות DBS השתלה כרונית 4-6, מספר ההפרעות עצביות שטופלו על ידי DBS המשיך לעלות. גירוי מוחי עמוק היה בשימוש לראשונה בארצות הברית לטיפול ברעד חיוני 6. היום הניתוח נעשה שימוש נרחב לטיפול בהפרעות עצביות שנמצאות כרגע חשוכים על ידי התערבות תרופתית. DBS משמש כיום לטיפול בהפרעות תנועה של המחלה ודיסטוניה 7-9 פרקינסון. דמנציה אלצהיימר הסוג, הדיכאון כגון מחלה, אפילפסיה, הכאב ומחלות נוירו-פסיכיאטריות של הנטינגטון, OCD, תסמונת טורט7; s תסמונת והתמכרות הן חלק מהתנאים נוחים לטיפול על ידי DBS 10-12. בזמן ניתוח DBS מאושר FDA לטיפול במחלת פרקינסון, דיסטוניה ורעד חיוני, השימוש בDBS לטיפול במצבים אחרים שהוזכרו לעיל נמצא בשלבים שונים של מעבדה ומחקרים קליניים המציעים הרבה הבטחה לחולי 13,14.

מבחינה קלינית, ניתוח DBS מתבצע בשני שלבים. בשלב הראשון מדוברים בניתוח מיצוב אלקטרודות DBS במיקום האנטומי ממוקד באמצעות שילוב של מיקום רדיולוגי, CT, MRI, כמו גם קריאות microelectrode לדיוק משופר. השלב השני כרוך בהשתלת מחולל פעימות בחזה העליון של המטופל והארכת התקנה מובילה מהקרקפת למחולל הפעימות. בהתבסס על מצב הנוירולוגים, מספר תוכניות תכנות למחולל הפעימות כבר טופל ותשמש כדי לספק את המתח הרצוי. כרך האחרוןכאחוז הוא הגיע באופן הדרגתי, כדי לקבל את התגובה הקלינית הטובה ביותר עם ​​מתח מינימאלי 15. עם זאת, במחקרים שלנו, בניגוד לשתלי DBS הכרוני בשימוש קליני, לשם פשטות, יש לנו פנו ללימודי גירוי חד פעמי בתדירות גבוהה (עבור שעה 1) במודלים של בעלי החיים שלנו.

חלק מהמחקר של הקבוצה שלנו מתמקד בחקירת השימוש בניתוחי DBS לאפילפסיה טיפול עקשן. גישות כירורגיות stereotactic באמצעות גירוי בתדר גבוה נחקרו על ידי רבים אחרים כאופציה יעילה לטיפול באפילפסיה רפואית-עקשן המהווה כ -30% מכל מקרים של אפילפסיה 10,16,17. גירוי המוח הקטן מיקוד משטח קליפת המוח, כמו גם את גרעיני המוח הקטן העמוקים שימש בעבר כמטרות לטיפול באפילפסיה 10,18,19. בנוסף, גירוי היפוקמפוס יש גם ניסה אבל עם תוצאות מעורבות 20,21. חלק מהאחר נחקרמטרות DBS לאפילפסיה כוללות קליפת המוח, התלמוס, גרעין subthalamic ועצב התועה 8. עם זאת, תוצאות ממספר מחקרים בשנים האחרונות הבאות, הגרעין הקדמי התלמוס (ATN) התפתחה כיעד DBS הנפוץ ביותר לטיפול באפילפסיה 10,22. בהתבסס על ידיעה על מעגלים וממצאים ממודלים של בעלי החיים neuroanatomical, כמה מחקרים התמקדו בהשפעה הטיפולית של גירוי מוחי העמוק של ATN בטיפול באפילפסיה 23-26. ATN הוא חלק מהמעגל הלימבית, והוא ממוקם באזור במוח שמשפיע על תדירות התקפים. מחקרים על ידי Hamani et al., בדקו את היעילות של ATN-DBS במודל אפילפסיה pilocarpine מושרה ומצאו שגירוי ATN דו-צדדי ממושך latencies להתקפים הנגרם pilocarpine וסטטוס אפילפטיקוס 24. יתר על כן, גירוי בתדר גבוה של ATN נמצא כדי להפחית את תדירות התקפים במודל pentylenetetrazol (PTZ) של epilepsy 25,27-29. Lee et al., דיווח ירידה ממוצעת בתדירות התקפים בכ -75% על גירוי מוחי עמוק כרוני של ATN בטיפול באפילפסיה חלקית עקשן 30.

מחקר קליני אחרונים על אפילפסיה טיפול עקשן הראה תוצאות מבטיחות לאחר ניתוח DBS מיקוד הגרעין הקדמי התלמוס (ATN) 22. ניסוי קליני רב-מרכזי אקראי עם 110 חולים שעברו DBS הדו-צדדי של ATN לאפילפסיה עקשן הטיפול (משפט סנטה) הצביע על ירידה בתדירות התקפים בכ -40% 31. התוצאות ממחקר זה גם רמזו על השפעה אנטי-אפילפטי אופטימלי מתעכבת נצפתה בניתוח שלאחר 2-3 חודשים. מחקרים נוספים על ידי אל Toda et., אימתו עם ממצאים אלה שבו הם הפגינו neurogenesis קורים בפוסט מאוחר יותר זמן DBS (ימים 3-5) במודלים של בעלי חיים 1. בנוסף, Encinas et al., דיווח neurogene בהיפוקמפוסsis ברכס המשונן העכבר המבוגר לאחר גירוי בתדר גבוה של ATN 32. מחקרים קודמים 33-35 דיווחו ירידת neurogenesis בהיפוקמפוס במקרי אפילפסיה מסוימות כגון אפילפסיה כרונית זמנית אונה ושיתוף עם גירעונות למידה, פגיעה בזיכרון והתקפים חוזרים ונשנים מנוע ספונטניים. כמו כן, חלה ירידה בגורמי מוליד תאי גזע עצביים כגון FGF2 וIGF-1 בהיפוקמפוס כרוני אפילפסיה במודלים של בעלי החיים 33. בהתחשב בעובדה זו, אסטרטגיות התערבותית כגון DBS שמראות הגדלת הנוירוגנזה ברכס המשונן הם אפיקים מרגשים למחקר. ממצאים אלו עודדו אותנו להמשיך ולחקור לעומק את טיפול neurogenesis פוסט-DBS הבסיסי מנגנון לאפילפסיה. יש לנו ממוקד ATN שני באופן חד צדדי (נתונים לא פורסמו), כמו גם דו-צדדי (בתוצאות נציג) וביטוי ראה neurotrophin מוגבה (BDNF) ברכס המשונן חולדה. גההשערה היא שurrent ביטוי BDNF יוזם מפל ביטוי גנים שמגיע לשיאו בneurogenesis שמתרגם להשפעה אנטי-אפילפטי של ניתוח DBS. במאמר זה, אנו מציגים את השיטות שלנו לניתוח DBS מיקוד ATN בחולדות ואחרי ניתוח ביטוי גנים כגישה אטרקטיבית ללמוד את המנגנון שבבסיס היתרונות של DBS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הצהרת אתיקה:: הערה כל הנהלים דנו בכתב היד הזה הם בהתאם להנחיות NIH למחקר בבעלי חיים (מדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה) ואושרה על ידי ועדת IACUC בית הספר לרפואה של אוניברסיטת הרווארד.

הכנת 1. טרום ניתוחית

  1. ודא כי כל מכשירי ניתוח עיקור או על ידי מעוקר או על ידי ניקוי עם פתרון ו / או אתנול חיטוי כנדרש. במידת האפשר, להשתמש בציוד חד פעמי סטרילית כמו אזמלים, מחטים ומזרקים.
  2. לכסות את שולחן העבודה עם וילונות כירורגית ולהבטיח שיש סילוק פסולת ביולוגי מסוכן זמין.
  3. לשקול את העכברוש ולחשב מינון הרדמה. השתמש בתערובת / Xylazine קטמין (קטמין 75 מ"ג / קילוגרם וXylazine 10 מ"ג / קילוגרם) כדי להרדים את החולדות.
    הערה: בין 200-250 g הוא המשקל האופטימלי לתיקון נכון של בעלי החיים במסגרת stereotactic כמו גם מיקוד מדויק של ATN. Isoflurגם Ane יכול לשמש כסוכן ההרדמה.
  4. הר ושתי אלקטרודות סטרילי מאובטחים (מעוקר על ידי מעוקר או עם אתילן אוקסיד) על בעל אלקטרודה (איור 2) של מסגרת ניתוחית stereotactic ובעזרת מיקרוסקופ (10-40X הגדלה), לבדוק את הטיפים של האלקטרודה לנכונה יישור. Secure שתי אלקטרודות 3.0 מ"מ זה מזה.
    הערה: תשמור על עצמך כדי למנוע נזק לקצה האלקטרודה ידי נגיעה על משטחים קשים.

2. ניתוח DBS

  1. להזריק קטמין / Xylazine לערבב intraperitoneally לבעלי החיים ולאשר כי בעלי החיים הגיעו מטוס של הרדמה כירורגית (על ידי בדיקת הבוהן קמצוץ רפלקס, קצב נשימה ועומק וסדירות של נשימה). הסרת שיער מאזור הקרקפת שיהיה חרותה ולחטא את הקרקפת עם 3 סקראבס לסירוגין כל אחד מבטאדין ואלכוהול או תמיסת מלח סטרילית. Secure ומקם את החיה על fram stereotacticדואר.
  2. השתמש ברפידות מים חמות במחזור כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של בעל החיים ברמה אופטימלית. החל סיכה עין בעיניו של בעל החיים כדי להגן מפני Overdrying.
  3. השתמש בקואורדינטות הבאות stereotactic למיקוד ATN (גרעין התלמוס Anterior): anterioposterior -1.6 מ"מ, מ"מ 1.5 mediolateral וdorsoventral 5.2 מ"מ 1.
    הערה: קואורדינטות stereotactic מבוססות על Paxinos ווטסון אטלס מוח חולדה (מהדורה ה -6) 36.
  4. עושה חתך בקרקפת sagittally כדי לחשוף את הגולגולת. בעזרת זוג המפשקים לאבטח את הקרקפת חרותה לחשוף את הגולגולת. השתמש בתמיסת מלח סטרילית כדי לשטוף את החתך. אם החתך הוא רטוב מדי, להשתמש צמר גפן סטרילי לייבוש. אתר את גבחת ולסמן במרקר שחור. כדי להנחות את המיקום של החורים בר, להפוך את שני סימנים יותר בכ 1.5 מ"מ mediolaterally בשני הצדדים מתפר sagittal והאחורי 1.6 מ"מ לקורוןתפר אל.
  5. השתמש בתרגיל שנערך ביד כדי להפוך את החורים בר. ודא את הקצה של החור בר הוא סטרילי על ידי עיקור זה עם אתנול. החזק את התרגיל בכ 45 מעלות זווית למשטח הגולגולת כאשר קידוח. לעתים קרובות לעבור בין שני החורים בר להימנע חום מוגזם במיקום של כל חור בר.
  6. המשך קידוח עד הדורה חשופה. באמצעות מחט עם נטיית קצהו מזכירה את הצורה של 'L', להסיר את כל שברים של עצם שחוסמים את הכניסה של האלקטרודה. תשמור על עצמך כדי למנוע נזק לרקמות הדורה ו / או מוח הבסיסי תוך הסרת ברי עצמות באמצעות המחט הכפופה.
    הערה: שימוש במחט קהה או מלקחיים בוטים קנס היא גם אופציה.
  7. תקן את ההרכבה אלקטרודה הכפולה לידית המסתובבת של מסגרת stereotactic ולתקן את הידית בזווית של 90 מעלות. שימוש בהתאמות במסגרת stereotactic, למקם את האלקטרודה עזבה בדיוק מעל גבחת.
  8. שימוש בסטריאוהתאמות טקטיקה למיצוב mediolateral, בדיוק להעביר את האלקטרודה שמאל 1.5 מ"מ בצד השמאל של גבחת כך שעכשיו יש שתי אלקטרודות מיושרות לגמרי לאורך תפר העטרה אבל במרווחים של 1.5 מ"מ mediolaterally מגבחת.
  9. שימוש בהתאמות stereotactic anterioposterior, להזיז את האלקטרודות אחורית 1.6 מ"מ לתפר העטרה.
  10. השתמש בהתאמות dorsoventral להוריד את האלקטרודות לסימון ראשון אם החורים בר נעשו במיקום הנכון באופן שיכול להיות מוכנסות אלקטרודות בקלות, בלי לגעת בקצוות הגסים של החורים בר. אם כן, הכנס את האלקטרודות לעומק של 5.2 מ"מ מפני שטח של הגולגולת.
  11. חבר את האלקטרודות באמצעות מוביל לממריץ נקבע על 130 הרץ, 2.5 V ו -90 μsec pulsewidth 1.
  12. לספק גירוי בתדר גבוה לשעה (או לתקופה רצויה של זמן לפי הגדרת ניסוי). במהלך הגירוי, לזכור כדי להבטיח pעומק הרדמה רופר באופן קבוע על ידי בדיקה על היעדריו של נסיגת רגל בתגובה לקמצוץ הבוהן. להשלים עם הרדמה כמחצית המינון הראשוני המשמש כדי לעודד הרדמה. למנוע זיהום של כפפות סטריליות שלך בעת בדיקת עומק הרדמה ולשנות אותם במידת צורך. לבצע גירוי חד-צדדי או דו-צדדי המבוסס על הצרכים של אחד ניסיוני. כוללים פקדים כגון גירוי בתדר נמוך (לדוגמה., 10 הרץ) ובעלי חיים unstimulated (החדרת אלקטרודות ללא גירוי שלאחר מכן).
  13. לאחר הגירוי נעשה, להסיר את האלקטרודות בזהירות ותפר את החתך עם 3-0 תפרים או עם סיכות כירורגי סטרילי.
  14. לנהל עצירות (0.05 מ"ג / קילוגרם) תת עורי כשיכוך כאבים. לפקח על בעלי החיים עד שהוא חוזר לפעילות רגילה ולאחר מכן להחזיר אותו למתקן הדיור.
  15. לאחר תקופת זמן מוגדרת המבוסס על עיצוב ניסיוני (לדוגמה, 0, 3, ניתוח DBS הודעה 6 או 12 שעות), להרדימו עם מנת יתר של חומרי הרדמה. לאחר אישור העדר סימנים חיוניים, לערוף את החיה.
  16. לנתח את המוח על ידי הסרת העור באמצעות מספריים הראשונים. לחתוך את העצם לאורך תפר sagittal באמצעות מספריים לנתיחה. הפוך עוד שני (על אינץ 'כל אחד) חתכים דרך העצם משני הצדדים לרוחב. בעזרת מלקחיים, להרים את פיסת העצם ניתק באופן חלקי מהחלק העליון של הגולגולת כדי לחשוף את המוח.
  17. בעזרת מספריים או מלקחיים עדינים, לעקור את המוח מהגולגולת ולהעביר לצלחת פטרי עם PBS הקר על קרח.
    הערה: הקפד להימנע מניזק למוח בעת ביצוע החתכים דרך העצם.

בידוד 3. Hippocampus

הערה: בצע את כל השלבים הבאים בסעיף זה על קרח.

  1. מניחים את המוח על מטריצת מוח אקריליק מקוררת מראש על קרח. באמצעות סכין גילוח, לחתוך את המוח coronally בכ 7-8 מ"מ מהקדמי ביותר-edge של המוח. לעשות חתך שני coronally ואחורי לחתך הראשון כך שפרוסת מוח כ 5 מ"מ עובי ניתן להסיר.
  2. להעביר את פרוסת המוח בצלחת פטרי עם PBS קר כקרח. באמצעות סכין גילוח, לנתק את שני החלקים חצי הכדור ודואג לציין שחצי כדור תואם את הצדדים שמאל וימין בהתאמה. זה חשוב במיוחד בעת ביצוע גירויים חד-צדדיים.
  3. בעזרת מלקחיים ומספריים בסדר להסיר את ההיפוקמפוס בזהירות.
  4. פלאש להקפיא את הרקמה בהיפוקמפוס בקרח יבש וחנות במקפיא C -20 ° עד מוכן לצעדי חילוץ RNA שלאחר מכן.
    הערה: לאחסון לטווח ארוך, רצוי לאחסן רקמות במקפיא C -80 °.

4. הפקת RNA וכמוני PCR

  1. ודא הרקמה נשאר קפוא על קרח יבש עד מוכן לתפעול.
  2. הערה: בצע את הצעד הזה במכסת המנוע.
    1. הוסף 1 מיליליטר של מגיב Tri לhippרקמת ocampal בצינור צנטריפוגות 1.5 מיליליטר וhomogenize אותו על ידי מספר רב של פעמים pipetting הראשון עד הרקמה שבורה לחתיכות קטנות יותר. נוסף homogenize הרקמה על ידי עובר דרך מזרק עם מחט 25 G עד אין רקמה רצופה גלויה. בצע את שלבי הומוגניזציה על קרח.
    2. לאחר שמאחד את הרקמה, מאפשר ההשעיה התא לעמוד בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות, כדי לאפשר תמוגה תא.
      הערה: לאחר שלב זה ההשעיה התא יכולה להיות מהירה קפוא ומאוחסן ב-70 ° C עד עיבוד נוסף.
  3. להוסיף 0.2 מיליליטר כלורופורם ומערבבים על ידי vortexing במשך 20 שניות ולתת לשאר הפתרון בטמפרטורת חדר למשך 15 דקות.
  4. צנטריפוגה הדגימות ב XG 12,000 במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, להסיר את הצינורות בזהירות מבלי להפריע שלוש שכבות נפרדות שתהיינה גלוי.
    הערה: בתחתית השלב (אדום) מכיל חלבונים, שלב מעונן אמצע מכיל DNA והשלב ברור העליון מכיל Rאנ-איי.
  5. מעביר את השלב ברור העליון (RNA) לתוך צינור צנטריפוגות טרי 1.5 מיליליטר (בדרך כלל 500 μl של RNA המכיל שלב מתקבל). לזה מוסיף 0.5 מיליליטר isopropanol ומערבבים על ידי vortexing. לזה יוסיף 2-3 גליקוגן μl (20 מ"ג / מיליליטר) כנישא לRNA. לאפשר המדגם לנוח על השולחן בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות.
  6. צנטריפוגה המדגם ב XG 12,000 במשך שעה 1 ב 4 מעלות צלזיוס. ודא כי גלולה RNA היא גלויה בחלק התחתון של הצינור.
  7. בטל supernatant ולשטוף את גלולה RNA על ידי הוספת 1 מיליליטר של 75% אתנול (שנעשה עם מים חופשיים nuclease). הפוך מספר רב של פעמים עד שהמדגם גלולה dislodges מהחלק התחתון של הצינור וצף בפתרון. צנטריפוגה הפתרון ב XG 12,000 במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: גלולה ב -75% אתנול ניתן לאחסן ב -20 ° C עד צעדים נוספים.
  8. לאפשר לגלולת RNA לייבוש באוויר על ידי השארת הצינורות פתוחים למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. לנקוט אמצעי זהירות כדי למנוע אובהr ייבוש גלולה שכן הדבר עלול להשפיע על פירוקה במים בשלב שלאחר מכן.

5. הסרת DNA מהכנת RNA

  1. הוסף 9 μl של מים חופשיים nuclease לגלולת RNA ולוודא גלולה נמס לפני שתמשיך בעדינות על ידי vortexing הצינור. לזה מוסיף 1 μl של 10x DNase אני הצפת ו 1 μl DNase רקומביננטי (מDNase אני ערכה), לערבב בעדינות על ידי מצליף את הצינורות, בקצרה לסובב את הצינורות ולדגור על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים למשך 30 דקות.
  2. להוסיף מגיב 2 μl איון DNase (מDNase אני ערכה) מדגם דגירה בטמפרטורת חדר למשך 2 דקות ומערבבים בעדינות לעתים קרובות על ידי מצליף את הצינורית. צנטריפוגה ב XG 12,000 עבור 10 דקות והעברה כ -10 μl של supernatant ברור לצינור צנטריפוגות טרי 1.5 מיליליטר.
  3. למדוד ריכוז RNA באמצעות nanodrop או ספקטרופוטומטר.

6. ביצוע cDNA מRNA

  1. להוסיף ה נפח הנדרשבמכיל 1 מיקרוגרם של RNA ולהביא את הנפח הכולל עד 8 μl על ידי הוספת מים חופשיים nuclease. לזה מוסיף 1 μl 10 מ"מ dNTP לערבב ו1 μl של hexamers האקראית מהקיט עילי הראשונה סטרנד הסינתזה. לערבב בעדינות ולדגור על 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות בכל אמבט מים או על thermocycler מתוכנתים מראש.
  2. הפוך premix המכיל חומרים כימיים הבאים: 2 μl של 10x RT מאגר, 4 μl של 25 M MgCl 2, 2 μl 0.1 M DTT וμl 1 של RNAse OUT (40 U / μl).
    הערה: כרכים נתונים לכל תגובה, משתמש היה צריך בהיקף של עד בהתאם לצרכים של אחד ניסיוניים.
  3. לאחר הסרת RNA המכיל מדגם מ -65 מעלות צלזיוס, להגדיר את הצינור בטמפרטורת חדר למשך דקות. הוסף פתרון premix 9 μl דגירה בטמפרטורת חדר למשך 2 דקות. הוסף 1 μl של אנזים transcriptase ההפוך עילי II (50 U / μl) ולאחר מכן דגירה בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות.
  4. דגירה הדגימות ב 42 מעלות צלזיוס במשך 50דקות לשעתוק לאחור להתרחש.
  5. דגירה הדגימות ב 70 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות כדי לסיים את התגובה.
  6. מניחים את הדגימות על קרח בקצרה ולהוסיף μl 1 RNAseH (2 U / μl) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
  7. בקצרה צנטריפוגות הצינורות ב 3000 XG לספין למטה הנוזל מעובה.
    הערה: זו cDNA שישמש לPCR כמותי. ניתן לאחסן במקפיא cDNA -20 ° C עד התקנת PCR. cDNA גם יכול להיות מדולל במים nuclease ללא לפני שתמשיך לPCR.

7. כמותי PCR

  1. ודא תערובת הורים המכילות חומרים כימיים הבאים (כרכים נתונים לכל תגובה): 6.3 μl של 2x Sybr הירוק Mix, 0.6 μl של קדימה פריימר (10 מיקרומטר), 0.6 μl של ההפוך פריימר (10 מיקרומטר) ו 0.5 μl של מים חופשיים Nuclease .
    הערה: עיצוב פריימר נעשה באמצעות 'פיק Primers' האפשרות בדף רצף נוקליאוטידים של צמח השדה לגן של עניין.
  2. להוסיף mastermix 10 μl היטב בכל צלחת PCR 96 היטב. להוסיף 2.5 μl של cDNA עשה קודם לכן הלמכיל גם mastermix. הקפד להגדיר תגובות PCR שלושה עותקים עבור כל דגימה.
  3. לאחר שסיים את התוספת של mastermix וcDNA, מכסה את צלחת ה- PCR באמצעות גיליון דבק אופטי לאטום את הבארות. ספין הצלחת בקצרה במשך 5 דקות ב XG 500 בצנטריפוגה שולחן כדי ליישב את כל הנוזל לתחתית הבאר.
  4. טען את צלחת PCR על מכונה RT-PCR מתוכנת מראש. השתמש בפרמטרי PCR הניתנים בטבלה 1.
  5. ניתוח נתונים: השתמש בערכי t C מתפוקת qPCR לחישובים נוספים. יחד עם גן הבדיקה, שהוקם PCR תגובות לגנים בקרה פנימיים, 18S rRNA (כדי להבטיח קלט שווה) וβ-אקטין (שליטה שלילית). חישוב שינויים לקפל מבוססים על שיטת ΔΔCt 37.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

האיורים 1 א ו -1 B להראות הביטוי היחסי של BDNF וGABRD ביחס לβ-אקטין גן השליטה. BDNF, neurotrophin קשור לעתים קרובות עם אפקטי neuroprotective במחלות עצביות רבות 38-41. זה מעניין, ולכן לנתח את פרופיל הביטוי של BDNF בתגובה לגירוי של ATN אשר מניב יתרונות טיפוליים לחולי אפילפסיה. באיור 1 א אשר מציג את פרופיל ביטוי גנים של BDNF על פני נקודות הזמן מצויינים לפרסם גירוי DBS, BDNF את תקנה הוא ציין באופן מיידי (0 שעה) לאחר ניתוח DBS יחד עם ביטוי השיא (3 פי יותר מunstimulated) בשעה 3 שעות לאחר גירוי. תצפית זו מצביעה על כך שביטוי BDNF משופר וneuroprotection וכתוצאה מכך יכולים לתרום לתועלת הטיפולית של DBS. GABRD גן נוסף (איור 1) נחקר גם בשיטת qPCR. GABRD הוא whi קולט GABAch הוא אחד היעדים הפוטנציאליים לעיצוב תרופות נוגדות אפילפסיה 42. פרופיל הביטוי של GABRD גם מראה ביטוי משופר בבעלי החיים מגורה בהשוואה לבעלי החיים השליטה unstimulated בהודעה DBS 3 שעות. בהתחשב בכך שאגוניסטים GABA משמשים כמדכאי תפיסה אפקטיביים, זה מעניין לראות שלאחר ביטוי GABRD המשופר DBS, לסבך את התפקיד אפשרי עבור GABA בהשפעה אנטי-אפילפטי של DBS.

פרוטוקול RT-PCR שתואר כאן מניב תוצאות לשחזור וכמותיים החושפות דפוסי ביטוי גנים וההבדלים של פי היחסי בהשוואה לבעלי החיים השליטה. ניתוח הנתונים מתבצע באופן הבא: תפוקת qPCR נותנת את ערך t C הסף לגן המבחן עבור כל דגימה נותחה. ערכי t C מתקבלים גם עבור rRNA גן השליטה β-אקטין ו18S (שליטת קלט). שיטת t ΔΔC לאחר מכן ניתן תהיה להשתמש כדי לחשב את expr הגןפרופיל ession באמצעות t C ערכים אלו 37. לדוגמא, כדי לחשב את שינויי ביטוי גנים לBDNF, למדגם נתון, ההפרש בין שווי t C לBDNF ו18S rRNA מחושב ולא ΔC הראשון. למדגם זהה, ההפרש בין שווי t C לβ-אקטין ו18S rRNA מחושב לתת t ΔC השני. ההבדל בין שני ערכי t ΔC מחושב לתת t ΔΔC. ערך t ΔΔC זה משמש לחישוב 2 ^ (t -ΔΔC) אשר נותן את שפע התבנית ביחס לBDNF בהשוואה לβ-אקטין. על ידי התוויית ערך זה על פני נקודות הזמן השונות לצד שליטת unstimulated, ניתן דמיינו את שינויי ביטוי גנים הנגרמים על ידי DBS פני נקודות זמן. השיטה שתוארה לעיל יכולה לשמש ביעילות כדי לחקור שינויים בביטוי גנים אחרים שהם כנים פוטנציאלates שמגיב לגירוי DBS ולחקור חלק מהתופעות במורד הזרם של ויסות הביטוי של גנים אלה.

איור 1
איור 1: ניתוח כמובן זמן (א) לביטוי BDNF בתגובה לגירוי בתדר הגבוה של ATN. קצירת רקמה, הפקת RNA, הכנת cDNA וq-PCR בוצעו כפי שהסבירו בפרוטוקול. שינויים יחסי בביטוי גנים מחושבים לאחר נרמול עבור קלט (על ידי הגברת 18S rRNA) וכן גן שליטה (β-אקטין). ערכי t C מתקבלים מזמן אמת PCR שמשו לחישוב רמות ביטוי בשיטת t ΔΔ C 37. זמן הנקודות ניתחו הן 0, 3, 6 ו 12 שעות גירוי DBS פוסט. הערה: נקודתי הזמן שנבחרו כאן הן ביחס למחקר מסוים, והוא נתון לשינויים בהתאם להי"דהשערה ותכנית ניסיונית. (ב) ניתוח כמובן זמן של GABA למקטע דלתא קולט (GABRD) רמות בתגובה לDBS ב 130 הרץ מיקוד ATN. שיטות וחישובים נעשו כדומה לנתונים BDNF.

איור 2
איור 2: אלקטרודות DBS וממריץ להגדיר.

מחזורי PCR
שלב 1: Denaturation הראשוני 95 ° C 15 דקות
שלב 2: Denaturation 95 ° C 15 שניות
רִכּוּך 60 ° C 30 שניות
סיומת 72 ° C 30 שניות
40 מחזורים של שלב 2
הערה: טמפרטורת חישול משתנה בהתאם ל
טמפרטורת התכת פריימר. Primers בדרך כלל מתוכנן
יש חישול בטמפרטורה אופטימלית של 60 מעלות צלזיוס

טבלה 1: פרמטרי PCR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בעקבות העבודה על ידי ציון דרך אל Benabid et. בבאמצעות גירוי מוחי עמוק לטיפול במחלות ורעד חיוני פרקינסון, הטכניקה הניתוחית DBS נחקרה בעניין רב בעשור האחרון לטיפול בהפרעות נוירולוגיות רבות 6,10,43. מחקרי DBS מיקוד אזורי נוירו-אנטומיים שונים של המערכת החשמלית במוח מבוצעים כיום על ידי קבוצות רבות כדי לטפל במחלות עצביות מרכזיות ונמצאים בשלבים שונים של ניסויים קליניים. גירוי של גרעין subthalamic (STN) או הקטע הפנימי של pallidus גלובוס (GPI) מאושר FDA ומשמש לטיפול בהפרעות תנועה במחלת פרקינסון 10. הניסוי הקליני סנטה הראה מגמות מבטיחות עבור חולי אפילפסיה קבלת גירוי בתדר גבוה של גרעין התלמוס הקדמי 31. תוצאות משלב הניסויים קליניות הראשונות של גירוי forniceal דו-צדדי הראו עיכוב בקצב ירידה הקוגניטיבית ומחדשVersal של ספיגת הגלוקוז hypometabolic ראתה במחלת האלצהיימר, כמו גם הפעלה של מעגלי זיכרון 8,44. יתר על כן, בשנים האחרונות נוירוכירורגים ערכו ניסויי DBS לטיפול בהפרעות נוירו-פסיכיאטריות כגון OCD (הפרעה אובססיבית קומפולסיבית), דיכאון עמיד לטיפול, תסמונת טורט והתמכרות 10,45-55.

בנוסף לניסויים הקליניים, בשנים האחרונות, ניתוח בעלי החיים הציע לנו הזדמנויות גדולות כדי ללמוד את השינויים הפיסיולוגיים הנגרמים על ידי הטכניקה כירורגית בחי, באופן שאין כמותו בכל טכניקה במבחנה. בכתב היד הזה, יש לנו דנו בשיטות הכרוכות בביצוע ניתוח גירוי המוחי עמוק במכרסמים. ניתוח stereotactic במכרסמים כפי שמתוארים כאן יכול לשמש גם עבור חיפושי יעד DBS פוטנציאליים ולבדוק את היעילות של ניתוח שימוש בבעלי חי מודל מחלה. אחד האתגרים עבור h הנסייןהוא פה כדי להיות מסוגל למקד את המוקד האנטומי הנכון באופן לשחזור. יש בעיקר צורך בטכנאי מיומן לניתוח, כי בדיקת המיקוד נכון אפשרית רק לאחר הגירוי נעשה ובעלי החיים מורדמים. כמו כן מדי פעם, אחד עלול לפגוע בטעות כלי דם מרכזי שעלולות להוביל לאובדן דם משמעותי ולעתים אף למותו של בעל החיים. בנוסף, הצורך לנתח את ההיפוקמפוס לאנליזה ביוכימית נוספת מגביל את האפשרות של אימות immunohistological לאלקטרודה מתאימה מיקוד באותה החיה שדורשת דגימת מוח שלמה לחתך ברקמה. מיקוד אלקטרודה מתאים אולי אפשר היה לבדוק על בעלי חיים שונים מגורה באופן זהה. עם זאת, זו אינה מספקת ראיות למיקוד נכון בבעלי חי הבדיקה והיא מגבלה של גישה זו. הפרסומים אחרונים ניסו לעקוף בעיה זו על ידי ביצוע ניתוח DBS עם simultaneouזה fMRI 56. שיפור האפשרי של הטכניקה המתוארת כאן יכול להיות מחקר על ההשפעות של גירוי כרוני באמצעות ממריץ מושתל בבעלי החיים. עם זאת, יש לנו הגבלנו את הניתוח שלנו למנה אחת (1 שעה) של גירוי בתדר גבוה כצעד הראשון להבנת השינויים הנגרמים על ידי DBS ברמה תאית.

בהתחשב בשימוש בניתוחי DBS עבור מגוון רחב של הפרעות עצביות, זה הכרחי כי אנחנו יודעים את המנגנון שבבסיס את ההשפעות המיטיבות של DBS. מידע זה הוא קריטי לפיתוח לשיפורים עתידיים בניתוח וגם לחקור את השירות של DBS לטיפול במצבים אחרים שלא נחקרו על ידי מומחים בDBS. בנוסף, ניתן ליישם שינויים בטכניקה הניתוחית, כדי למנוע תופעות לוואי מזיקות מסוימות של ההליך ולהתמודד ביעילות עם הישנות של מצב המחלה.

Ana מכניסטית מעמיקתמוגה של DBS היא אפשרית על ידי בחינת שינויי ביטוי גנים הנגרמים על ידי די בי. כך או גישת גן המועמד המבוססת על ידע הקיים על מסלולים עצביים המגיבים לגירויי depolarizing כגון גירוי בתדר גבוה, או ניתוח transcriptome גלובלי יכול לתת תובנות חשובות האירועים המולקולריים מופעלים על ידי די בי. טכניקות ניתוח ביטוי גנים (גישת גן מועמד, כמו גם שיטת תפוקה גבוהה) הן כלים רבי עוצמה, כי הם מפתח לחקר המנגנונים המולקולריים ושינויים תאיים הקשורים לניתוח DBS. ההתפתחויות האחרונות בתחום זה אפשרו לנו לקבל שפע של מידע על מספר היבטים של פיזיולוגיה סלולרית בזמן קצר מאוד, מה שלא היה אפשרי לפני כמה שנים. עם כניסתו של טכנולוגיית ריצוף תפוקה גבוהה כגון ChIPseq, אפשר לאפיין את מיקום הגנום של גורמי שעתוק חשובים שיגיבו לDBS 57,58. גילויים אחרונים המקשרים אינו-coding RNA כגון מייקרו-רנ"א במחלות ניווניות, תאפשר לנו לנתח את השינויים אפשריים ברמות מירנה בתאי עצב פוסט-DBS באמצעות טכנולוגית רצף מירנה 59,60. שינויים אפשריים בחתימות אפיגנטיים שינויי מתילציה והיסטון DNA כזה בתגובה לDBS גם יכולים להיות חוקרים. עם זאת, למרות היתרונות, חשוב להכיר, כמו גם חלק מהמגבלות של טכניקות אלה בעיות פוטנציאליות שעלולים להתעורר במהלך ניתוח. דאגה חשובה עם ביטוי גני הניתוחים הייתה דירות וטעויות טכניות. חשוב שהנסיין לוקח שטר של זה ומתכנן על שיש מספר מספיק של חזרות כדי להבטיח אמינות. בעיה נפוצה עם חלק ממחקרי הקרנת התפוקה הגבוהה הייתה הקושי בפרשנות של הכמות העצומה של נתונים שנוצר. לפעמים זה הופך להיות חשוב כדי לקבוע אם שינויי ביטוי גנים נצפו הן בשל ההשפעה הישירהשל טיפול ניסיוני או השפעה במורד הזרם. זה בדרך כלל דורש מחקרים נוספים שנועדו לטפל בבעיה זו.

בנוסף למחקרים גנומית, ניתוח immunohistochemical נרחב של לוקליזציה המרחב ובזמן של שחקני מפתח המגיבים לDBS ולכמת את השינויים ברמות שלהם באזורים השונים של המוח יהיה נכס אדיר להתפתחויות עתידיות של הליך כירורגי די בי. הממצאים מצטברים מביטוי גני מנתח, כמו גם המחקרים immunohistochemical יכולים לחשוף אינטראקציות רומן בין גורמים מרכזיים, כמו גם אירועים מולקולריים מפתח המסדירים תהליכים תאיים כגון neurogenesis או ניוון של מערכת עצבים. זיהוי סמנים מולקולריים קריטיים כזו עשויה גם לאפשר תגליות סמים עתיד. ממצאים אלה יכולים לשפוך אור על תפקודו הכללי של המערכת החשמלית במוח, שהוא מידע בעל ערך מנקודת המבט של מדענים עובדים להבין את האדםמחלות עצביות y. בימוי המאמצים שלנו בעתיד בשילוב טכנולוגי העדכניים שנעשתה במרפאת, כמו גם את המעבדה עשויה להציע לנו יתרונות משמעותיים במאבק שלנו נגד מחלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Deep Brain Stimulation Surgery
Stereotactic frame Kopf Instruments Model 900
Drill  Dremmel 7700, 7.2 V
Scalpel BD 372610
Ketamine Patterson Veterinary 07-803-6637 Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules
Xylazine Patterson Veterinary 07-808-1947
Buprenorphine Patterson Veterinary 07-850-2280 Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules
Surgical staples ConMed Corporation 8035
Sutures (3-0)  Harvard Apparatus 72-3333
Syringe (1 ml, 29 1/2 G) BD 329464 Sterile, use for Anesthesia administration intraperitoneally
Syringe (3 ml, 25 G) BD 309570 Sterile, use for Analgesia administration subcutaneously
Needles BD 305761 Sterile, use for clearing broken bone pieces from the burr holes
Ethanol Fisher Scientific S25309B Use for general sterilization 
Eye Lubricant Fisher Scientific 19-898-350
Stimulator Medtronic Model 3628
DBS electrodes Rhodes Medical Instruments, CA SNEX100x-100 mm Electrodes are platinum, concentric and bipolar
Betadine (Povidone-Iodine)  PDI S23125 Single use swabsticks, use for sterilizing the scalp before making incision 
 Brain Dissection and Hippocampal tissue isolation
Acrylic Rodent Brain Matrix Electron Microscopy Sciences 175-300 www.emsdiasum.com
Razor Blade V W R 55411-050
Guillotine Scissors Clauss 18039 For decapitation, make sure these scissors are maintained in clean and working condition
Scissors Codman Classic 34-4098 Use for removing the brain from the skull
Forceps Electron Microscopy Sciences 72957-06 Use for removing the brain from the skull and for handling during dissection
Phosphate Buffered Saline  Boston Bioproducts BM-220
 RNA Extraction and cDNA Preparation
Tri Reagent Sigma T9424 Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin
Syringe (3 ml, 25 G) BD 309570 Use for tissue homogenization
Chloroform Fisher Scientific BP1145-1 Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin
Isopropanol Fisher Scientific A416-1
Glycogen Thermo Scientific R0561
Dnase I Kit Ambion AM1906
Superscript First Strand Synthesis Kit Invitrogen 11904-018
Tabletop Microcentrifuge Eppendorf 5415D
 Quantitative PCR               
SYBR Green PCR Kit Qiagen 204143
Custom Oligos Invitrogen 10668051
PCR Plates (96 wells) Denville Scientific C18080-10
Optical Adhesive Sheets Thermo Scientific AB1170
Nuclease free Water Thermo Scientific SH30538-02
Real Time PCR Machine Applied Biosystems 7500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Toda, H., Hamani, C., Fawcett, A. P., Hutchison, W. D., Lozano, A. M. The regulation of adult rodent hippocampal neurogenesis by deep brain stimulation. Journal of. 108, 132-138 (2008).
  2. Perlmutter, J. S., Mink, J. W. Deep brain stimulation. Annual review of neuroscience. 29, 229-257 (2006).
  3. Bergstrom, M. R., Johansson, G. G., Laitinen, L. V., Sipponen, P. Electrical stimulation of the thalamic and subthalamic area in cerebral palsy. Acta physiologica Scandinavica. 67, 208-213 (1966).
  4. Benabid, A. L., et al. Chronic electrical stimulation of the ventralis intermedius nucleus of the thalamus as a treatment of movement disorders. Journal of neurosurgery. 84, 203-214 (1996).
  5. Benabid, A. L., et al. Long-term electrical inhibition of deep brain targets in movement disorders. Movement disorders : official journal of the Movement Disorder Society. 13, Suppl 3. 119-125 (1998).
  6. Benabid, A. L., et al. Long-term suppression of tremor by chronic stimulation of the ventral intermediate thalamic nucleus. Lancet. 337, 403-406 (1991).
  7. Tierney, T. S., Lozano, A. M. Surgical treatment for secondary dystonia. Movement disorders : official journal of the Movement Disorder Society. 27, 1598-1605 (2012).
  8. Tierney, T. S., Sankar, T., Lozano, A. M. Some recent trends and further promising directions in functional neurosurgery. Acta neurochirurgica. Supplement. 117, 87-92 (2013).
  9. Tierney, T. S., Sankar, T., Lozano, A. M. Deep brain stimulation emerging indications. Progress in brain research. 194, 83-95 (2011).
  10. Sankar, T., Tierney, T. S., Hamani, C. Novel applications of deep brain stimulation. Surgical neurology international. 3, S26-S33 (2012).
  11. Tierney, T. S., Vasudeva, V. S., Weir, S., Hayes, M. T. Neuromodulation for neurodegenerative conditions. Frontiers in bioscience. 5, 490-499 (2013).
  12. Mayberg, H. S., et al. Deep brain stimulation for treatment-resistant depression. Neuron. 45, 651-660 (2005).
  13. Lyons, M. K. Deep brain stimulation: current and future clinical applications. Mayo Clinic proceedings. 86, 662-672 (2011).
  14. Ch. 4. Rehabilitation in movement disorders. Lansek, R., Morris, M. E. , Cambridge University Press. 36-43 (2013).
  15. Goodwin, R., Tierney, T., Lenz, F., Anderson, W. Ch. 15. Single Neuron Studies of the Human Brain: Probing Cognition. Fried, I., Rutishauser, U., Cerf, M., Kreiman, G. 15, MIT Press. 275-293 (2014).
  16. Hauser, W. A. Epidemiology of epilepsy in children. Neurosurgery clinics of North America. 6, 419-429 (1995).
  17. Hauser, W. A. Recent developments in the epidemiology of epilepsy. Acta neurologica Scandinavica. Supplementum. 162, 17-21 (1995).
  18. Davis, R., Emmonds, S. E. Cerebellar stimulation for seizure control: 17-year study. Stereotactic and functional neurosurgery. 58, 200-208 (1992).
  19. Levy, L. F., Auchterlonie, W. C. Chronic cerebellar stimulation in the treatment of epilepsy. Epilepsia. 20, 235-245 (1979).
  20. Velasco, A. L., et al. Electrical stimulation of the hippocampal epileptic foci for seizure control: a double-blind, long-term follow-up study. Epilepsia. 48, 1895-1903 (2007).
  21. Tellez-Zenteno, J. F., McLachlan, R. S., Parrent, A., Kubu, C. S., Wiebe, S. Hippocampal electrical stimulation in mesial temporal lobe epilepsy. Neurology. 66, 1490-1494 (2006).
  22. Kerrigan, J. F., et al. Electrical stimulation of the anterior nucleus of the thalamus for the treatment of intractable epilepsy. Epilepsia. 45, 346-354 (2004).
  23. Hamani, C., et al. Deep brain stimulation of the anterior nucleus of the thalamus: effects of electrical stimulation on pilocarpine-induced seizures and status epilepticus. Epilepsy research. 78, 117-123 (2008).
  24. Hamani, C., et al. Bilateral anterior thalamic nucleus lesions and high-frequency stimulation are protective against pilocarpine-induced seizures and status epilepticus. Neurosurgery. 54, 191-195 (2004).
  25. Mirski, M. A., Rossell, L. A., Terry, J. B., Fisher, R. S. Anticonvulsant effect of anterior thalamic high frequency electrical stimulation in the rat. Epilepsy research. 28, 89-100 (1997).
  26. Mirski, M. A., Ferrendelli, J. A. Interruption of the mammillothalamic tract prevents seizures in guinea pigs. Science. 226, 72-74 (1984).
  27. Mirski, M. A., Ferrendelli, J. A. Anterior thalamic mediation of generalized pentylenetetrazol seizures. Brain research. 399, 212-223 (1986).
  28. Mirski, M. A., Ferrendelli, J. A. Interruption of the connections of the mammillary bodies protects against generalized pentylenetetrazol seizures in guinea pigs. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 7, 662-670 (1987).
  29. Mirski, M. A., McKeon, A. C., Ferrendelli, J. A. Anterior thalamus and substantia nigra: two distinct structures mediating experimental generalized seizures. Brain research. 397, 377-380 (1986).
  30. Lee, K. J., Jang, K. S., Shon, Y. M. Chronic deep brain stimulation of subthalamic and anterior thalamic nuclei for controlling refractory partial epilepsy. Acta neurochirurgica. Supplement. 99, 87-91 (2006).
  31. Fisher, R., et al. Electrical stimulation of the anterior nucleus of thalamus for treatment of refractory epilepsy. Epilepsia. 51, 899-908 (2010).
  32. Encinas, J. M., Hamani, C., Lozano, A. M., Enikolopov, G. Neurogenic hippocampal targets of deep brain stimulation. The Journal of comparative neurology. 519, 6-20 (2011).
  33. Hattiangady, B., Rao, M. S., Shetty, A. K. Chronic temporal lobe epilepsy is associated with severely declined dentate neurogenesis in the adult hippocampus. Neurobiology of disease. 17, 473-490 (2004).
  34. Kuruba, R., Hattiangady, B., Shetty, A. K. Hippocampal neurogenesis and neural stem cells in temporal lobe epilepsy. Epilepsy & behavior : E&B. 14, Suppl 1. 65-73 (2009).
  35. Hattiangady, B., Shetty, A. K. Implications of decreased hippocampal neurogenesis in chronic temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 49, Suppl 5. 26-41 (2008).
  36. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Elsevier Inc. (2007).
  37. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 22DDCT Method. METHODS. 25, 402-408 (2001).
  38. Kells, A. P., et al. AAV-mediated gene delivery of BDNF or GDNF is neuroprotective in a model of Huntington disease. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 9, 682-688 (2004).
  39. Han, B. H., Holtzman, D. M. BDNF protects the neonatal brain from hypoxic-ischemic injury in vivo via the ERK pathway. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 20, 5775-5781 (2000).
  40. Hetman, M., Kanning, K., Cavanaugh, J. E., Xia, Z. Neuroprotection by brain-derived neurotrophic factor is mediated by extracellular signal-regulated kinase and phosphatidylinositol 3-kinase. The Journal of biological chemistry. 274, 22569-22580 (1999).
  41. Stadelmann, C., et al. BDNF and gp145trkB in multiple sclerosis brain lesions: neuroprotective interactions between immune and neuronal cells. Brain : a journal of neurology. 125, 75-85 (2002).
  42. Treiman, D. M. GABAergic mechanisms in epilepsy. Epilepsia. 42, Suppl 3. 8-12 (2001).
  43. Benabid, A. L., Pollak, P., Louveau, A., Henry, S., de Rougemont, J. Combined (thalamotomy and stimulation) stereotactic surgery of the VIM thalamic nucleus for bilateral Parkinson disease. Applied neurophysiology. 50, 344-346 (1987).
  44. Laxton, A. W., et al. A phase I trial of deep brain stimulation of memory circuits in Alzheimer's disease. Annals of. 68, 521-534 (2010).
  45. Tierney, T. S., Abd-El-Barr, M. M., Stanford, A. D., Foote, K. D., Okun, M. S. Deep brain stimulation and ablation for obsessive compulsive disorder: evolution of contemporary indications, targets and techniques. The International journal of neuroscience. 124, 394-402 (2014).
  46. Kennedy, S. H., et al. Deep brain stimulation for treatment-resistant depression: follow-up after 3 to 6 years. The American journal of psychiatry. 168, 502-510 (2011).
  47. Lozano, A. M., et al. Subcallosal cingulate gyrus deep brain stimulation for treatment-resistant depression. Biological psychiatry. 64, 461-467 (2008).
  48. Ackermans, L., et al. Double-blind clinical trial of thalamic stimulation in patients with Tourette syndrome. Brain : a journal of neurology. 134, 832-844 (2011).
  49. Houeto, J. L., et al. Tourette's syndrome and deep brain stimulation. Journal of neurology, neurosurgery, and psychiatry. 76, 992-995 (2005).
  50. Maciunas, R. J., et al. Prospective randomized double-blind trial of bilateral thalamic deep brain stimulation in adults with Tourette syndrome. Journal of neurosurgery. 107, 1004-1014 (2007).
  51. Koning, P. P., Figee, M., van den Munckhof, P., Schuurman, P. R., Denys, D. Current status of deep brain stimulation for obsessive-compulsive disorder: a clinical review of different targets. Current psychiatry reports. 13, 274-282 (2011).
  52. Greenberg, B. D., et al. Deep brain stimulation of the ventral internal capsule/ventral striatum for obsessive-compulsive disorder: worldwide experience. Molecular psychiatry. 15, 64-79 (2010).
  53. Muller, U. J., et al. Successful treatment of chronic resistant alcoholism by deep brain stimulation of nucleus accumbens: first experience with three cases. Pharmacopsychiatry. 42, 288-291 (2009).
  54. Zhou, H., Xu, J., Jiang, J. Deep brain stimulation of nucleus accumbens on heroin-seeking behaviors: a case report. Biological psychiatry. 69, e41-e42 (2011).
  55. Porta, M., et al. Thalamic deep brain stimulation for treatment-refractory Tourette syndrome: two-year outcome. Neurology. 73, 1375-1380 (2009).
  56. Younce, J. R., Albaugh, D. L., Shih, Y. Y. Deep brain stimulation with simultaneous FMRI in rodents. Journal of visualized experiments : JoVE. , e51271 (2014).
  57. Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature reviews. Genetics. 10, 669-680 (2009).
  58. Valouev, A., et al. Genome-wide analysis of transcription factor binding sites based on ChIP-Seq data. Nature methods. 5, 829-834 (2008).
  59. Fiore, R., Siegel, G., Schratt, G. MicroRNA function in neuronal development, plasticity and disease. Biochimica et biophysica acta. 1779, 471-478 (2008).
  60. Hebert, S. S., De Strooper, B. Alterations of the microRNA network cause neurodegenerative disease. Trends in neurosciences. 32, 199-206 (2009).

Tags

Neuroscience גיליון 97 גרעין התלמוס קדמי גירוי מוחי עמוק gyrus המשונן ההיפוקמפוס אפילפסיה ביטוי גנים גירוי בתדר גבוה RT-PCR
ניתוח שינויי ביטוי הגנים בהיפוקמפוס העכברוש לאחר Deep Brain Stimulation של Anterior התלמוס הגרעין
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Selvakumar, T., Alavian, K. N.,More

Selvakumar, T., Alavian, K. N., Tierney, T. Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus. J. Vis. Exp. (97), e52457, doi:10.3791/52457 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter