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Neuroscience

पूर्वकाल thalamic नाभिक की गहरी मस्तिष्क उत्तेजना के बाद चूहा हिप्पोकैम्पस में जीन एक्सप्रेशन परिवर्तनों का विश्लेषण

Published: March 8, 2015 doi: 10.3791/52457

Abstract

गहरी मस्तिष्क उत्तेजना (डीबीएस) सर्जरी, ऐसे बेसल ganglia, चेतक, और सबथैलेमिक क्षेत्रों के रूप में मस्तिष्क के विभिन्न क्षेत्रों को लक्षित करने, दवा के लिए प्रतिक्रिया करने में विफल रहा है कि कई आंदोलन विकारों के लिए एक प्रभावी उपचार है। डीबीएस सर्जरी के क्षेत्र में हाल की प्रगति रुग्ण मोटापा, अवसाद और जुनूनी बाध्यकारी विकार के रूप में के रूप में विविध अन्य शर्तों के लिए इस सर्जरी तकनीक के आवेदन का विस्तार करने के लिए शुरू हो गया है। इन के विस्तार के संकेत के बावजूद, थोड़ा डीबीएस सर्जरी के लाभदायक प्रभाव की सुविधा है कि अंतर्निहित शारीरिक तंत्र के बारे में जाना जाता है। इस सवाल का एक दृष्टिकोण बिजली की उत्तेजना को प्राप्त है कि न्यूरॉन्स में जीन की अभिव्यक्ति विश्लेषण करने के लिए है। पिछले अध्ययनों चूहे दांतेदार गाइरस में है कि न्यूरोजेनेसिस चेतक एक के पूर्वकाल नाभिक की लक्षित कर डीबीएस में हासिल कर रहा है पता चला है। एटीएन को लक्षित डीबीएस सर्जरी उपचार आग रोक मिर्गी के लिए व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाता है। यह इस प्रकार बहुत interes की हैहमारे लिए टी विद्युत एटीएन उत्तेजक द्वारा प्रेरित ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तन का पता लगाने के लिए। इस पांडुलिपि में, हम वयस्क पुरुष Wistar चूहों में एटीएन को लक्षित stereotactically निर्देशित डीबीएस सर्जरी के लिए हमारे तरीके का वर्णन है। हम यह भी जीन एक्सप्रेशन परिवर्तनों को मापने के लिए ऊतक विच्छेदन, आरएनए अलगाव, सीडीएनए तैयारी और मात्रात्मक आरटी पीसीआर के लिए बाद के चरणों पर चर्चा की। इस विधि को लागू किया है और आमतौर पर चिकित्सकीय लक्षित बेसल ganglia और मस्तिष्क के अन्य क्षेत्रों उत्तेजक के लिए संशोधित किया जा सकता है। यहाँ वर्णित जीन अभिव्यक्ति अध्ययन डीबीएस के लिए तंत्र का निर्देशन किया जा सकता है कि आणविक खिलाड़ियों की खोज के लिए एक उम्मीदवार लक्ष्य जीन दृष्टिकोण रखती है।

Introduction

विद्युत मस्तिष्क circuitry उत्तेजक की संभावना 2 का पता लगाया गया था जब एक तंत्रिकाशल्यक तकनीक के रूप में गहरी मस्तिष्क प्रोत्साहन के विकास के पीछे इतिहास वापस 1870 के लिए तारीखों। न्यूरोनल विकारों के लिए इलाज के रूप में पुरानी उच्च आवृत्ति उत्तेजना का उपयोग 1960 के दशक के तीन में शुरू कर दिया। बाद में पुरानी आरोपण डीबीएस इलेक्ट्रोड 4-6 के आगमन के साथ 1990 के दशक में, डीबीएस द्वारा इलाज किया गया है कि न्यूरोनल विकारों की संख्या में वृद्धि करने के लिए जारी रखा। डीप ब्रेन उत्तेजना पहले आवश्यक कंपन 6 के लिए एक इलाज के रूप में संयुक्त राज्य अमेरिका में इस्तेमाल किया गया था। आज सर्जरी वर्तमान में औषधीय हस्तक्षेप से untreatable हैं कि न्यूरोनल विकारों के इलाज के लिए व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाता है। डीबीएस वर्तमान में पार्किंसंस रोग और दुस्तानता 7-9 के आंदोलन विकारों के इलाज के लिए प्रयोग किया जाता है। अल्जाइमर प्रकार मनोभ्रंश, हंटिंग्टन रोग, मिर्गी, दर्द और neuropsychiatric रोगों जैसे अवसाद, ओसीडी, Tourette7; सिंड्रोम और लत डीबीएस 10-12 से उपचार के लिए उत्तरदायी शर्तों में से कुछ हैं। डीबीएस सर्जरी एफडीए पार्किंसंस रोग, dystonia और आवश्यक कंपन के इलाज के लिए मंजूरी दे दी है, वहीं अन्य उपरोक्त शर्तों के इलाज के लिए डीबीएस के उपयोग के रोगियों 13,14 करने के लिए बहुत वादा पेशकश प्रयोगशाला के विभिन्न चरणों और नैदानिक ​​अध्ययन में हैं।

चिकित्सकीय, डीबीएस सर्जरी दो चरणों में किया जाता है। पहले चरण शल्य चिकित्सा रेडियोलॉजिकल स्थिति के संयोजन का उपयोग लक्षित संरचनात्मक स्थान पर डीबीएस इलेक्ट्रोड स्थिति शामिल है, सीटी, एमआरआई साथ ही बढ़ाया परिशुद्धता के लिए microelectrode रीडिंग। दूसरे चरण में रोगी के सीने के ऊपरी हिस्से में एक पल्स जनरेटर दाखिल करना शामिल है और स्थापित एक्सटेंशन पल्स जनरेटर के लिए खोपड़ी से होता है। स्नायविक शर्त के आधार पर, पल्स जनरेटर के लिए कई प्रोग्रामिंग योजनाओं मानकीकृत किया गया है और वांछित वोल्टेज देने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। अंतिम वॉल्यूमकम से कम वोल्टेज 15 के साथ सबसे अच्छा नैदानिक ​​प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए इतनी के रूप में Tage एक stepwise फैशन में पहुँच जाता है। हालांकि, हमारे अध्ययन में, पुरानी डीबीएस प्रत्यारोपण के विपरीत सादगी के लिए, चिकित्सकीय इस्तेमाल किया है, हम अपने पशु मॉडल में (1 घंटे के लिए) एक बार की उच्च आवृत्ति उत्तेजना का अध्ययन करने के लिए सहारा है।

हमारे समूह के अनुसंधान के भाग के उपचार-दुर्दम्य मिर्गी के लिए डीबीएस सर्जरी के उपयोग की जांच पर केंद्रित है। उच्च आवृत्ति उत्तेजना का उपयोग कर स्टीरियोटैक्टिक शल्य दृष्टिकोण मिर्गी 10,16,17 के सभी घटनाओं के बारे में 30% का गठन किया है, जो चिकित्सकीय आग रोक मिर्गी के इलाज के लिए एक प्रभावी विकल्प के रूप में कई अन्य लोगों के द्वारा पता लगाया गया है। गहरी अनुमस्तिष्क नाभिक के रूप में के रूप में अच्छी तरह से cortical सतह को लक्षित अनुमस्तिष्क उत्तेजना मिर्गी 10,18,19 के इलाज के लिए लक्ष्य के रूप में अतीत में इस्तेमाल किया गया है। इसके अलावा, हिप्पोकैम्पस उत्तेजना भी कोशिश की, लेकिन मिश्रित परिणाम 20,21 के साथ किया गया है। अन्य में से कुछ की जांच कीमिर्गी के लिए डीबीएस लक्ष्य सेरेब्रल कॉर्टेक्स, चेतक, सबथैलेमिक नाभिक और वेगस तंत्रिका आठ शामिल हैं। हालांकि, पिछले कुछ वर्षों में कई अध्ययनों से निम्न परिणाम, पूर्वकाल thalamic नाभिक (एटीएन) मिर्गी के इलाज 10,22 के लिए सबसे आम डीबीएस लक्ष्य के रूप में उभरा है। Neuroanatomical circuitry और पशु मॉडल से निष्कर्षों के बारे में ज्ञान के आधार पर, कई अध्ययनों मिर्गी 23-26 के उपचार में एटीएन की गहरी मस्तिष्क प्रोत्साहन के उपचारात्मक प्रभाव पर ध्यान केंद्रित किया है। एटीएन लिम्बिक सर्किट का हिस्सा है और जब्ती आवृत्ति को प्रभावित करता है कि मस्तिष्क के क्षेत्र में स्थित है। द्वारा Hamani एट अल। स्टडीज, एक pilocarpine प्रेरित मिर्गी मॉडल में एटीएन-डीबीएस की प्रभावकारिता परीक्षण किया और द्विपक्षीय एटीएन उत्तेजना pilocarpine प्रेरित बरामदगी और स्थिति एपीलेप्टीकस 24 के लिए सुप्तावस्था लंबे समय तक कि मिल गया है। इसके अलावा, एटीएन के उच्च आवृत्ति उत्तेजना ईपी के pentylenetetrazol (PTZ) मॉडल में जब्ती आवृत्ति कम पाया गया था25,27-29 ilepsy। ली एट अल।, आग रोक आंशिक मिर्गी 30 के उपचार में एटीएन के जीर्ण गहरी मस्तिष्क उत्तेजना पर के बारे में 75% की जब्ती आवृत्ति में एक मतलब कमी की सूचना है।

उपचार-दुर्दम्य मिर्गी पर हाल ही में एक नैदानिक ​​अध्ययन पूर्वकाल thalamic नाभिक (एटीएन) 22 को लक्षित डीबीएस सर्जरी के बाद आशाजनक परिणाम दिखाया गया है। उपचार आग रोक मिर्गी (SANTE परीक्षण) के लिए एटीएन के द्विपक्षीय डीबीएस के दौर से गुजर 110 रोगियों के साथ एक multicenter यादृच्छिक चिकित्सीय परीक्षण लगभग 40% 31 से जब्ती आवृत्ति में एक बूंद संकेत दिया। इस अध्ययन के परिणामों से भी 2-3 महीने के बाद सर्जरी में मनाया एक देरी इष्टतम विरोधी मिरगी प्रभाव पर संकेत दिया। टोडा एट अल द्वारा आगे की पढ़ाई है।, वे पशु मॉडल एक में एक बाद में समय के बाद डीबीएस (दिनों 3-5) पर हो रहा न्यूरोजेनेसिस का प्रदर्शन किया, जहां इन निष्कर्षों के साथ पुष्टि की। इसके अलावा, Encinas एट अल।, हिप्पोकैम्पस neurogene सूचना दी हैएटीएन 32 के उच्च आवृत्ति उत्तेजना के बाद वयस्क माउस दांतेदार गाइरस में बहन। पिछले अध्ययनों 33-35 ऐसे पुरानी टेम्पोरल लोब मिर्गी और सीखने के घाटे के साथ एक संघ, स्मृति हानि और सहज बारम्बार मोटर बरामदगी के रूप में कुछ मिरगी मामलों में हिप्पोकैम्पस न्यूरोजेनेसिस गिरते सूचना दी है। इसके अलावा, इस तरह के पशु मॉडल 33 में लंबे समय से मिरगी हिप्पोकैम्पस में FGF2 और IGF-1 के रूप में तंत्रिका स्टेम सेल पूर्वज कारकों में एक कमी थी। इस ध्यान में रखते हुए, दांतेदार गाइरस में न्यूरोजेनेसिस की एक वृद्धि बताते हैं कि इस तरह के डीबीएस के रूप में हस्तक्षेप रणनीतियों अनुसंधान के लिए रोमांचक रास्ते हैं। इन निष्कर्षों को मिर्गी के लिए तंत्र अंतर्निहित न्यूरोजेनेसिस के बाद डीबीएस उपचार में आगे गहरा का पता लगाने के लिए प्रोत्साहित किया है। हम (प्रतिनिधि परिणामों में) (डेटा रिपोर्ट नहीं) के साथ-साथ द्विपक्षीय स्तर पर दोनों एकतरफा एटीएन लक्षित और चूहे दांतेदार गाइरस में देखा बुलंद neurotrophin (BDNF) अभिव्यक्ति है। हमारे गurrent परिकल्पना BDNF अभिव्यक्ति डीबीएस सर्जरी के विरोधी मिरगी प्रभाव अनुवाद करने के लिए कि न्यूरोजेनेसिस में खत्म है कि एक जीन की अभिव्यक्ति झरना शुरू की है। इस पत्र में, हम डीबीएस के लाभों के अंतर्निहित तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक आकर्षक दृष्टिकोण के रूप में जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के बाद चूहों में एटीएन को लक्षित डीबीएस सर्जरी के लिए हमारे तरीके प्रस्तुत करते हैं।

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Protocol

नोट: आचार कथन: इस पांडुलिपि में चर्चा की सभी प्रक्रियाओं (देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए गाइड) पशु अनुसंधान के लिए एनआईएच दिशा निर्देशों के अनुसार कर रहे हैं और हार्वर्ड मेडिकल स्कूल IACUC समिति द्वारा अनुमोदित कर रहे हैं।

1. पूर्व शल्य चिकित्सा की तैयारी

  1. सभी सर्जिकल उपकरणों या तो autoclaving द्वारा या आवश्यक के रूप में एंटीसेप्टिक समाधान और / या इथेनॉल के साथ सफाई द्वारा निष्फल रहे हैं कि सुनिश्चित करें। जहां संभव हो, ऐसे नलियां, सुई और सीरिंज के रूप में बाँझ डिस्पोजेबल उपकरण का उपयोग करें।
  2. शल्य पर्दे के साथ कार्यक्षेत्र कवर और उपलब्ध एक biohazard अपशिष्ट निपटान सुनिश्चित करते हैं कि।
  3. चूहे वजन और संज्ञाहरण खुराक की गणना। चूहों anesthetize करने के लिए एक Ketamine / xylazine मिश्रण (Ketamine 75 मिलीग्राम / किग्रा और xylazine 10 मिलीग्राम / किग्रा) का प्रयोग करें।
    नोट: 200-250 जी स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम में पशु के समुचित फिक्सिंग के लिए और साथ ही एटीएन की सटीक लक्ष्य-निर्धारण के लिए इष्टतम वजन के बीच। Isoflurane भी anesthetizing के एजेंट के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
  4. माउंट और सुरक्षित दो बाँझ इलेक्ट्रोड इलेक्ट्रोड धारक पर (autoclaving द्वारा या ethylene ऑक्साइड के साथ निष्फल) एक स्टीरियोटैक्टिक शल्य फ्रेम की और एक माइक्रोस्कोप (10-40X बढ़ाई) की मदद से (चित्रा 2), समुचित के लिए इलेक्ट्रोड के सुझावों का निरीक्षण संरेखण। दो इलेक्ट्रोड के अलावा 3.0 मिमी सुरक्षित।
    नोट: कठोर सतहों पर छूकर इलेक्ट्रोड टिप को नुकसान पहुँचाए से बचने के लिए ध्यान रखना।

2. डीबीएस सर्जरी

  1. Ketamine / xylazine जानवर को intraperitoneally मिश्रण और पशु (पैर की अंगुली चुटकी पलटा, सांस की दर और गहराई और साँस लेने की नियमितता के लिए जाँच के द्वारा) संज्ञाहरण के एक शल्य चिकित्सा विमान तक पहुँच गया है कि इस बात की पुष्टि इंजेक्षन। छिन्न किया जाएगा कि खोपड़ी के क्षेत्र से बालों को हटाने और प्रत्येक betadine और शराब या बाँझ खारा या तो की तीन बारी scrubs के साथ खोपड़ी कीटाणुरहित। सुरक्षित और स्टीरियोटैक्टिक फ्रैम पर जानवर की स्थितिई।
  2. एक इष्टतम स्तर पर पशु के शरीर का तापमान बनाए रखने के लिए परिसंचारी गर्म पानी पैड का प्रयोग करें। Overdrying से बचाने के लिए पशु की आँखों के लिए नेत्र स्नेहक लागू करें।
  3. Anterioposterior -1.6 मिमी, mediolateral 1.5 मिमी और 5.2 मिमी 1 dorsoventral: निम्न स्टीरियोटैक्टिक एटीएन (पूर्वकाल thalamic नाभिक) को लक्षित करने के लिए निर्देशांक का प्रयोग करें।
    नोट: स्टीरियोटैक्टिक निर्देशांक Paxinos और वाटसन (6 वें संस्करण) चूहे के मस्तिष्क एटलस 36 के आधार पर कर रहे हैं।
  4. खोपड़ी में एक चीरा sagittally खोपड़ी प्रकट करने के लिए सुनिश्चित करें। Retractors की एक जोड़ी छिन्न खोपड़ी सुरक्षित का उपयोग खोपड़ी को बेनकाब करने के लिए। चीरा फ्लश करने के लिए बाँझ खारा का प्रयोग करें। चीरा भी गीला है, तो सूखे के लिए बाँझ कपास swabs का उपयोग करें। पर्वबिन्दु जानें और एक काला मार्कर के साथ निशान। Coron को बाण के समान सिवनी और 1.6 मिमी पीछे से mediolaterally दोनों पक्षों पर लगभग 1.5 मिमी से कम दो और अधिक निशान बना है, गड़गड़ाहट छेद की स्थिति मार्गदर्शन करने के लिएअल सिवनी।
  5. गड़गड़ाहट छेद बनाने के लिए एक हाथ से आयोजित ड्रिल का प्रयोग करें। गड़गड़ाहट छेद की नोक इथेनॉल के साथ यह स्टरलाइज़ द्वारा बाँझ है सुनिश्चित करें। जब ड्रिलिंग खोपड़ी की सतह के लिए ° 45 एक के बारे में कोण पर ड्रिल पकड़ो। अक्सर पूछे जाने वाले किसी भी गड़गड़ाहट छेद के स्थान पर अत्यधिक गर्मी से बचने के लिए दो गड़गड़ाहट छेद के बीच स्विच।
  6. ड्यूरा सामने आ रहा है जब तक ड्रिलिंग जारी रखें। इसकी टिप तुला एक 'एल' के आकार जैसी साथ एक सुई का प्रयोग, इलेक्ट्रोड की प्रविष्टि में बाधा डालती है कि हड्डी के किसी भी टूटे हुए टुकड़े को हटा दें। तुला सुई का उपयोग हड्डी के टुकड़े को हटाने जबकि अंतर्निहित ड्यूरा और / या मस्तिष्क के ऊतकों को नुकसान पहुँचाए से बचने के लिए ध्यान रखना।
    नोट: एक पा सुई या ठीक कुंद संदंश का प्रयोग भी एक विकल्प है।
  7. स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम के घूर्णन संभाल करने के लिए दोहरी इलेक्ट्रोड विधानसभा फिक्स और एक 90 डिग्री के कोण पर संभाल तय कर लो। स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम में समायोजन का उपयोग करना, बिल्कुल पर्वबिन्दु के ऊपर छोड़ दिया है इलेक्ट्रोड की स्थिति।
  8. स्टीरियो का प्रयोगरणनीति समायोजन mediolateral स्थिति के लिए ठीक है अब पूरी तरह से राज्याभिषेक सिवनी साथ गठबंधन दो इलेक्ट्रोड कर रहे हैं लेकिन पर्वबिन्दु से mediolaterally 1.5 मिमी में अलग स्थान ऐसा है कि पर्वबिन्दु के बाईं ओर करने के लिए छोड़ दिया इलेक्ट्रोड 1.5 मिमी चाल है।
  9. Anterioposterior स्टीरियोटैक्टिक समायोजन का उपयोग, राज्याभिषेक सिवनी के लिए इलेक्ट्रोड 1.6 मिमी पीछे चलते हैं।
  10. गड़गड़ाहट छेद गड़गड़ाहट छेद में से किसी न किसी किनारों को छूने के बिना, इलेक्ट्रोड आसानी से डाला जा सकता है कि इस तरह के सही स्थान पर बनाया गया है, अगर पहले की जांच करने के लिए इलेक्ट्रोड को कम करने के dorsoventral समायोजन का उपयोग करें। यदि हां, तो खोपड़ी की सतह से 5.2 मिमी की गहराई तक इलेक्ट्रोड डालें।
  11. 130 हर्ट्ज पर सेट एक उत्तेजक, 2.5 वी और 90 μsec pulsewidth एक करने के लिए सुराग के माध्यम से इलेक्ट्रोड कनेक्ट करें।
  12. एक घंटे के लिए उच्च आवृत्ति उत्तेजना उद्धार (या प्रयोगात्मक सेटअप के अनुसार समय की एक वांछित अवधि के लिए)। उत्तेजना के दौरान, पी आश्वस्त करने के लिए यादनियमित रूप से एक पैर के अंगूठे चुटकी के जवाब में पैर वापसी के अभाव के लिए जाँच करके नट संवेदनाहारी गहराई। संज्ञाहरण प्रेरित करने के लिए प्रयोग किया जाता है लगभग आधा प्रारंभिक खुराक के साथ संज्ञाहरण अनुपूरक। संवेदनाहारी गहराई की जाँच जब आपके बाँझ दस्ताने के संक्रमण से बचने और यदि आवश्यक हो तो उन्हें बदल जाते हैं। एक की प्रयोगात्मक जरूरतों के आधार पर एकतरफा या द्विपक्षीय उत्तेजना प्रदर्शन। इस तरह के कम आवृत्ति उत्तेजना के रूप में नियंत्रण (उदाहरण के लिए।, 10 हर्ट्ज) और (कोई बाद में उत्तेजना के साथ इलेक्ट्रोड डालने) unstimulated जानवरों को शामिल करें।
  13. उत्तेजना बाद किया जाता है, ध्यान से इलेक्ट्रोड को हटा दें और 3-0 टांके के साथ या बाँझ शल्य स्टेपल के साथ चीरा सीवन।
  14. Subcutaneously analgesia के रूप में buprenorphine (0.05 मिलीग्राम / किग्रा) प्रशासन। यह सामान्य गतिविधि के लिए रिटर्न जब तक पशु निगरानी और फिर आवास की सुविधा के लिए यह वापसी।
  15. प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर समय का एक निर्धारित अवधि के बाद (उदाहरण के लिए, 0, 3, 6 या 12 घंटे बाद डीबीएस सर्जरी)संज्ञाहरण अधिक मात्रा के साथ पशु euthanize। महत्वपूर्ण संकेत के अभाव की पुष्टि के बाद, पशु सिर काटना।
  16. पहले कैंची का उपयोग त्वचा को हटाने के द्वारा मस्तिष्क काटना। विच्छेदन कैंची का उपयोग बाण के समान सिवनी साथ हड्डी के माध्यम से कट। दोनों पार्श्व पक्षों पर हड्डी के माध्यम से दो अधिक चीरों (एक इंच के बारे में प्रत्येक) बनाते हैं। संदंश का प्रयोग, मस्तिष्क को बेनकाब करने के लिए खोपड़ी के ऊपर से हड्डी के आंशिक रूप से कटे टुकड़े उठा।
  17. ठीक कैंची या संदंश का प्रयोग, खोपड़ी से मस्तिष्क बेदखल और बर्फ पर ठंड पीबीएस के साथ एक पेट्री डिश के लिए स्थानांतरण।
    नोट: हड्डी के माध्यम से चीरों कर रही है जबकि मस्तिष्क को नुकसान से बचने के लिए ध्यान रखना।

3. हिप्पोकैंपस अलगाव

नोट: बर्फ पर इस खंड में बाद के सभी चरणों को पूरा करें।

  1. बर्फ पर एक पूर्व ठंडा एक्रिलिक मस्तिष्क मैट्रिक्स पर मस्तिष्क रखें। एक रेजर ब्लेड का प्रयोग, पूर्वकाल सबसे एड से coronally में लगभग 7-8 मिमी मस्तिष्क में कटौतीमस्तिष्क के जीई। पहली कट करने के लिए एक दूसरे coronally कटौती और पीछे बनाओ कि इस तरह के एक लगभग 5 मिमी मोटी मस्तिष्क टुकड़ा हटाया जा सकता है।
  2. बर्फ ठंड पीबीएस के साथ एक पेट्री डिश के लिए मस्तिष्क टुकड़ा स्थानांतरण। धार का प्रयोग, दो अर्धगोल वर्गों तोड़ और क्रमशः छोड़ दिया और सही पक्षों से मेल खाती है जो गोलार्द्ध नोट करने के लिए ध्यान रखना। एकतरफा stimulations प्रदर्शन करते हुए यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है।
  3. ठीक संदंश और कैंची का प्रयोग सावधानी से हिप्पोकैम्पस को हटा दें।
  4. फ्लैश बाद शाही सेना निकासी कदम के लिए तैयार है जब तक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में सूखी बर्फ और दुकान पर हिप्पोकैम्पस ऊतक फ्रीज।
    नोट: लंबी अवधि के भंडारण के लिए, यह एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में ऊतक की दुकान करने की सलाह दी जाती है।

4. शाही सेना निष्कर्षण और मात्रात्मक पीसीआर

  1. ऊतक homogenization के लिए तैयार है जब तक सूखी बर्फ पर जमे हुए रहता है सुनिश्चित करें।
  2. नोट: हुड में इस चरण को पूरा करें।
    1. HIPP करने के लिए सप्ताह में तीन अभिकर्मक के 1 मिलीलीटर जोड़ेंऊतक छोटे टुकड़ों में टूट गया है जब तक एक 1.5 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में ocampal ऊतक और पहले से pipetting कई बार द्वारा यह homogenize। इसके अलावा दिखाई नहीं अटूट ऊतक जब तक वहाँ एक 25 जी सुई के साथ एक सिरिंज के माध्यम से गुजर द्वारा ऊतक homogenize। बर्फ पर homogenization के चरणों का प्रदर्शन।
    2. ऊतक homogenizing के बाद, सेल अनुमति देने के लिए सेल निलंबन 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर खड़े करने की अनुमति देते हैं।
      नोट: इस बिंदु के बाद सेल निलंबन जमे हुए और आगे की प्रक्रिया जब तक -70 डिग्री सेल्सियस में संग्रहीत जल्दी हो सकता है।
  3. 0.2 मिलीलीटर क्लोरोफॉर्म जोड़ें और 20 सेकंड के लिए vortexing द्वारा मिश्रण और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर समाधान आराम करते हैं।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 12,000 XG पर नमूने अपकेंद्रित्र। Centrifugation के बाद, दिखाई देगा कि तीन अलग-अलग परतों परेशान बिना ध्यान से ट्यूबों को हटा दें।
    नोट: नीचे (लाल) चरण प्रोटीन होता है, मध्यम बादल छाए रहेंगे चरण डीएनए होता है और शीर्ष स्पष्ट चरण आर होता हैएनए।
  5. एक ताजा 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में शीर्ष स्पष्ट चरण (आरएनए) स्थानांतरण (आमतौर चरण युक्त शाही सेना के 500 μl प्राप्त किया जाता है)। इस 0.5 मिलीलीटर isopropanol जोड़ने और vortexing द्वारा मिश्रण। इस शाही सेना के लिए वाहक के रूप में 2-3 μl ग्लाइकोजन (20 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ें। नमूना 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मेज पर आराम करने की अनुमति दें।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 12,000 XG पर नमूना अपकेंद्रित्र। शाही सेना गोली ट्यूब के नीचे दिखाई दे रहा है कि सुनिश्चित करें।
  7. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 75% इथेनॉल के 1 मिलीलीटर जोड़कर आरएनए गोली धोने (nuclease मुफ्त पानी के साथ बनाया)। गोली ट्यूब के नीचे से dislodges और समाधान में तैरता तक नमूना कई बार पलटना। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 12,000 XG पर समाधान अपकेंद्रित्र।
    नोट: 75% इथेनॉल में गोली आगे कदम तक -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है।
  8. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए खुला ट्यूबों को छोड़ कर शुष्क हवा की शाही सेना गोली की अनुमति दें। Ove से बचने के लिए एहतियात रखनाइस बाद के चरण में पानी में उसके विघटन प्रभावित हो सकता है के रूप में गोली सुखाने आर।

5. आरएनए तैयारी से डीएनए निकाल रहा है

  1. आरएनए गोली nuclease मुफ्त पानी के 9 μl जोड़ें और गोली धीरे ट्यूब vortexing से आगे बढ़ने से पहले भंग कर रहा है सुनिश्चित करें। इस 10x DNase मैं बफर के 1 μl और 1 μl (DNase मैं किट से) पुनः संयोजक DNase जोड़ने के लिए, संक्षेप में, धीरे ट्यूब flicking द्वारा मिश्रण ट्यूब स्पिन और 30 मिनट के लिए एक पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  2. नमूने के लिए (DNase मैं किट से) 2 μl DNase निष्क्रियता अभिकर्मक जोड़ें और 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं और धीरे ट्यूब flicking द्वारा अक्सर मिश्रण। एक ताजा 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब करने के लिए 10 मिनट और स्पष्ट सतह पर तैरनेवाला के लगभग 10 μl हस्तांतरण के लिए 12,000 XG पर अपकेंद्रित्र।
  3. एक NanoDrop या स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग आरएनए एकाग्रता उपाय।

6. शाही सेना से सीडीएनए बनाना

  1. अपेक्षित मात्रा वें जोड़ेंशाही सेना के एक माइक्रोग्राम प्रति होता है और nuclease मुफ्त पानी जोड़कर 8 μl के लिए कुल मात्रा लाने पर। यह करने के लिए एक μl 10 मिमी dNTP मिश्रण और सुपरस्क्रिप्ट पहले Strand संश्लेषण किट से यादृच्छिक hexamers की एक μl जोड़ें। धीरे मिश्रण है और या तो एक नहाने के पानी में या एक पूर्व क्रमादेशित thermocycler पर 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  2. 10x आरटी बफर, 25 एम 2 MgCl, 0.1 एम डीटीटी के 2 μl और RNase बाहर की एक μl (40 यू / μl) के 4 μl के 2 μl: निम्न अभिकर्मकों युक्त Premix बनाओ।
    नोट: दी वॉल्यूम प्रतिक्रिया प्रति कर रहे हैं, तो उपयोगकर्ता एक की प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुसार पैमाने पर करने की आवश्यकता होगी।
  3. 65 डिग्री सेल्सियस से नमूना युक्त शाही सेना हटाने के बाद, एक मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूब निर्धारित किया है। 9 μl Premix समाधान जोड़ें और 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं। सुपरस्क्रिप्ट द्वितीय रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस एंजाइम की एक μl (50 यू / μl) जोड़ें और फिर 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
  4. 50 के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर नमूने सेतेन्यूनतम रिवर्स प्रतिलेखन उत्पन्न करने के लिए।
  5. 15 मिनट की प्रतिक्रिया को समाप्त करने के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर नमूने सेते हैं।
  6. बर्फ पर नमूने संक्षिप्त प्लेस और एक μl RNAseH (2 यू / μl) जोड़ने के लिए और 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  7. संक्षेप में घनीभूत तरल नीचे स्पिन करने के लिए 3000 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र।
    नोट: यह मात्रात्मक पीसीआर के लिए इस्तेमाल किया जाएगा कि सीडीएनए है। सीडीएनए पीसीआर सेटअप जब तक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में संग्रहित किया जा सकता है। सीडीएनए भी पीसीआर को आगे बढ़ने से पहले nuclease मुफ्त पानी से पतला किया जा सकता है।

7. मात्रात्मक पीसीआर

  1. निम्नलिखित अभिकर्मकों युक्त एक मास्टर मिश्रण (दी संस्करणों प्रतिक्रिया प्रति) कर रहे हैं बनाओ: 2x Sybr ग्रीन मिक्स के 6.3 μl, आगे प्राइमर (10 माइक्रोन) के 0.6 μl, रिवर्स प्राइमर (10 माइक्रोन) के 0.6 μl और Nuclease मुफ्त पानी के 0.5 μl ।
    नोट: प्रथम डिजाइन का उपयोग किया गया था हित के जीन के लिए एन सी बी आई के न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम पेज में विकल्प 'प्राइमर उठाओ'।
  2. एक 96 अच्छी तरह से पीसीआर थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 10 μl mastermix जोड़ें। पहले अच्छी तरह से mastermix युक्त करने के लिए बनाया सीडीएनए के 2.5 μl जोड़ें। प्रत्येक नमूने के लिए तीन प्रतियों पीसीआर प्रतिक्रियाओं सेट करने के लिए सुनिश्चित करें।
  3. Mastermix और सीडीएनए के अलावा पूरा करने के बाद, कुओं सील करने के लिए एक ऑप्टिकल चिपकने वाला पत्रक का उपयोग कर पीसीआर थाली को कवर किया। अच्छी तरह से नीचे तक सभी तरल व्यवस्थित करने के लिए एक tabletop अपकेंद्रित्र में 500 XG पर 5 मिनट के लिए संक्षिप्त थाली स्पिन।
  4. एक पूर्व क्रमादेशित आरटी पीसीआर मशीन पर पीसीआर प्लेट लोड करें। तालिका 1 में प्रदान की पीसीआर मापदंडों का उपयोग करें।
  5. डेटा विश्लेषण: आगे की गणना के लिए qPCR के उत्पादन से सी टी मूल्यों का प्रयोग करें। आंतरिक नियंत्रण जीनों के लिए पीसीआर प्रतिक्रियाओं की स्थापना परीक्षण जीन, के साथ साथ, 18S rRNA और β-actin (नकारात्मक नियंत्रण) (बराबर इनपुट सुनिश्चित करने के लिए)। ΔΔCt विधि 37 के आधार पर गुना परिवर्तन की गणना।

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Representative Results

आंकड़े 1 ए और 1 बी नियंत्रण जीन β-actin के लिए BDNF और GABRD रिश्तेदार के रिश्तेदार अभिव्यक्ति दिखा। BDNF, एक neurotrophin अक्सर कई न्यूरोनल रोगों 38-41 में न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव के साथ जुड़ा हुआ है। यह मिरगी रोगियों को चिकित्सीय लाभ अर्जित करता है जो एटीएन की उत्तेजना के जवाब में BDNF की अभिव्यक्ति प्रोफाइल विश्लेषण करने के लिए इसलिए दिलचस्प है। बताए गए समय-अंक के पार BDNF के जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल से पता चलता है, जो चित्र 1A में डीबीएस उत्तेजना पोस्ट, BDNF अप-विनियमन 3 घंटा में (unstimulated से गुना अधिक से अधिक 3) शिखर अभिव्यक्ति के साथ-साथ डीबीएस सर्जरी के बाद तुरंत (0 घंटा) मनाया जाता है पोस्ट उत्तेजना। इस अवलोकन बढ़ाया BDNF अभिव्यक्ति और जिसके परिणामस्वरूप neuroprotection डीबीएस की चिकित्सीय लाभ के लिए योगदान कर सकता है कि पता चलता है। एक अन्य जीन GABRD (चित्रा 1 बी) भी qPCR विधि का उपयोग कर जांच की गई। GABRD एक GABA रिसेप्टर whi हैCH-विरोधी मिरगी दवाओं 42 डिजाइनिंग के लिए संभावित ठिकानों में से एक है। GABRD की अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल भी तीन घंटे बाद डीबीएस में unstimulated नियंत्रण पशुओं की तुलना में प्रेरित पशुओं में बढ़ाया अभिव्यक्ति से पता चलता है। गाबा एगोनिस्ट प्रभावी जब्ती दमन के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं कि ध्यान में रखते हुए, यह डीबीएस के विरोधी मिरगी प्रभाव में गाबा के लिए एक संभावित भूमिका implicating, बढ़ाया GABRD अभिव्यक्ति पद डीबीएस निरीक्षण करने के लिए दिलचस्प है।

यहाँ वर्णित आरटी पीसीआर प्रोटोकॉल जीन अभिव्यक्ति पैटर्न और नियंत्रण पशुओं की तुलना में रिश्तेदार गुना मतभेद प्रकट कि प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और मात्रात्मक परिणाम अर्जित करता है। डेटा विश्लेषण निम्नलिखित तरीके से किया जाता है: qPCR के उत्पादन का विश्लेषण प्रत्येक नमूने के लिए परीक्षण जीन के लिए दहलीज सी टी मूल्य देता है। सी टी मूल्यों भी नियंत्रण जीन β-actin और 18S rRNA (इनपुट नियंत्रण) के लिए प्राप्त कर रहे हैं। ΔΔC टी विधि तो जीन expr गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगाइन सी टी का उपयोग कर ession प्रोफाइल 37 मूल्यों। उदाहरण के लिए, किसी नमूने के लिए, BDNF और 18S rRNA के लिए सी टी मूल्य के बीच अंतर की गणना की और पहली ΔC टी है, BDNF के लिए जीन की अभिव्यक्ति में परिवर्तन की गणना करने के लिए। एक ही नमूने के लिए, β-actin और 18S rRNA के लिए सी टी मूल्य के बीच अंतर दूसरा ΔC टी देने के लिए गणना की है। दो ΔC टी मूल्यों के बीच का अंतर ΔΔC टी देने के लिए गणना की है। इस ΔΔC टी मूल्य β-actin की तुलना में BDNF के लिए रिश्तेदार टेम्पलेट बहुतायत देता है, जो 2 ^ (-ΔΔC टी) की गणना करने के लिए प्रयोग किया जाता है। Unstimulated नियंत्रण के साथ-साथ विभिन्न समय अंक भर में इस मूल्य साजिश रचने के द्वारा, समय-अंक के पार डीबीएस द्वारा प्रेरित जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन देखे जा सकते हैं। ऊपर वर्णित विधि संभावित खरा हैं जो अन्य जीनों की अभिव्यक्ति में परिवर्तन की जांच करने के लिए प्रभावी ढंग से इस्तेमाल किया जा सकता हैडीबीएस उत्तेजना के लिए उत्तरदायी होते हैं और इन जीनों की अभिव्यक्ति के नियमन के बहाव के प्रभाव से कुछ जांच करने के लिए कि ates।

चित्र 1
चित्रा 1: एटीएन के उच्च आवृत्ति उत्तेजना के जवाब में BDNF अभिव्यक्ति की (ए) समय बेशक विश्लेषण। प्रोटोकॉल के रूप में समझाया ऊतक कटाई, शाही सेना निष्कर्षण, सीडीएनए तैयारी और क्यू पीसीआर प्रदर्शन किया गया। जीन अभिव्यक्ति में रिश्तेदार परिवर्तन के रूप में अच्छी तरह के रूप में एक नियंत्रण जीन (β-actin) (18S rRNA amplifying द्वारा) इनपुट के लिए सामान्य बनाने के बाद गणना कर रहे हैं। वास्तविक समय पीसीआर से प्राप्त सी टी मूल्यों ΔΔ सी टी विधि 37 से अभिव्यक्ति के स्तर की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया। विश्लेषण किया समय अंक 0, 3, 6 और 12 घंटे बाद डीबीएस उत्तेजना हैं। यहां चयनित timepoints के एक विशेष अध्ययन के लिए सम्मान के साथ कर रहे हैं और हरियाणा के अनुसार परिवर्तन के अधीन है: नोटpothesis और प्रायोगिक योजना है। (बी) GABA एक रिसेप्टर डेल्टा सबयूनिट (GABRD) एटीएन को लक्षित 130 हर्ट्ज पर डीबीएस के जवाब में स्तरों के समय के पाठ्यक्रम विश्लेषण। तरीके और गणना BDNF डेटा के लिए इसी तरह के रूप में किया गया था।

चित्र 2
चित्रा 2: डीबीएस इलेक्ट्रोड और उत्तेजक की स्थापना की।

पीसीआर चक्र
चरण 1: प्रारंभिक विकृतीकरण 95 डिग्री सेल्सियस 15 मिनट
चरण 2: विकृतीकरण 95 डिग्री सेल्सियस 15 सेकंड
एनीलिंग 60 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड
एक्सटेंशन 72 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड
चरण 2 के 40 चक्र
नोट: annealing तापमान के अनुसार बदलता रहता है
प्राइमर पिघलने के तापमान। प्राइमर आम तौर पर डिजाइन कर रहे हैं
60 डिग्री सेल्सियस के एक इष्टतम annealing तापमान है करने के लिए

तालिका 1: पीसीआर पैरामीटर।

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Discussion

Benabid एट अल द्वारा मील का पत्थर काम के बाद। पार्किंसंस रोग और आवश्यक कंपन के इलाज के लिए गहरी मस्तिष्क की उत्तेजना का उपयोग करने में, डीबीएस सर्जरी तकनीक कई स्नायविक विकारों 6,10,43 के इलाज के लिए पिछले एक दशक में बहुत रुचि के साथ जांच की गई है। मस्तिष्क circuitry के विभिन्न न्यूरो संरचनात्मक क्षेत्रों को लक्षित करने डीबीएस पढ़ाई वर्तमान में प्रमुख न्यूरोनल रोगों से निपटने के लिए कई समूहों द्वारा प्रदर्शन किया और क्लिनिकल परीक्षण के विभिन्न चरणों में हैं। सबथैलेमिक नाभिक (एसटीएन) या ग्लोबस पैलिडस (जीपीआई) की आंतरिक खंड की उत्तेजना एफडीए को मंजूरी दे दी और पार्किंसंस रोग 10 में आंदोलन विकारों के उपचार में प्रयोग किया जाता है। SANTE चिकित्सीय परीक्षण पूर्वकाल thalamic नाभिक 31 के उच्च आवृत्ति उत्तेजना प्राप्त मिरगी रोगियों के लिए होनहार प्रवृत्तियों दिखाया गया है। एक चरण के परिणाम से मैं द्विपक्षीय forniceal उत्तेजना का चिकित्सीय परीक्षण संज्ञानात्मक गिरावट और फिर से एक की दर में देरी से पता चला हैस्मृति circuitry के 8,44 के सक्रियण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अल्जाइमर रोग में देखा ग्लूकोज hypometabolic तेज की Versal। इसके अलावा, हाल के वर्षों में न्यूरो सर्जन ऐसे ओसीडी (जुनूनी बाध्यकारी विकार), उपचार प्रतिरोधी अवसाद, Tourette सिंड्रोम और लत 10,45-55 रूप neuropsychiatric विकारों के इलाज के लिए डीबीएस परीक्षणों का आयोजन किया है।

क्लिनिकल परीक्षण के अलावा, पिछले कुछ वर्षों में, पशु शल्य चिकित्सा के लिए हमें किसी भी इन विट्रो तकनीक द्वारा अद्वितीय एक तरह से एक जीवित जानवर में सर्जिकल तकनीक द्वारा प्रेरित शारीरिक परिवर्तन, अध्ययन करने के लिए महान अवसर की पेशकश की है। इस पांडुलिपि में, हम कृन्तकों में गहरी मस्तिष्क प्रोत्साहन सर्जरी प्रदर्शन में शामिल तरीकों पर चर्चा की है। यहाँ के रूप में वर्णित कृन्तकों में स्टीरियोटैक्टिक सर्जरी भी संभावित डीबीएस लक्ष्य खोजों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और रोग मॉडल जानवरों का उपयोग कर सर्जरी की प्रभावकारिता बाहर का परीक्षण करने के लिए। प्रयोगकर्ता घंटे के लिए चुनौतियों में से एकपहले एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीके से सही संरचनात्मक ठिकाना लक्षित करने के लिए सक्षम होने के लिए है। सही लक्ष्य-निर्धारण के लिए जाँच उत्तेजना से किया जाता है और पशु euthanized के बाद ही संभव है, क्योंकि सर्जरी के लिए एक कुशल तकनीशियन के लिए एक की जरूरत है, विशेष रूप से है। इसके अलावा कभी कभी, एक गलती से महत्वपूर्ण खून की कमी और जानवर के कभी कभी भी मौत का कारण हो सकता है जो एक कुंजी रक्त वाहिका घायल हो सकता है। इसके अलावा, आगे जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए हिप्पोकैम्पस बाहर काटना करने की जरूरत ऊतक सेक्शनिंग के लिए एक अक्षुण्ण मस्तिष्क नमूना की आवश्यकता है जो एक ही जानवर में लक्षित उचित इलेक्ट्रोड के लिए immunohistological सत्यापन करने की संभावना को सीमित करता है। उचित इलेक्ट्रोड लक्ष्यीकरण संभवतः एक समान तरीके से प्रेरित एक अलग जानवर पर जाँच की जा सकती है। हालांकि, इस परीक्षण के जानवर में उचित लक्ष्य-निर्धारण के लिए साक्ष्य उपलब्ध कराने और इस दृष्टिकोण की एक सीमा है नहीं करता है। हाल के प्रकाशनों simultaneou साथ डीबीएस सर्जरी का आयोजन करके इस समस्या को दरकिनार करने की कोशिश की हैfMRI के 56 है। यहाँ वर्णित तकनीक का एक संभावित सुधार जानवर में एक प्रत्यारोपित उत्तेजक के माध्यम से पुरानी उत्तेजना के प्रभाव पर एक अध्ययन किया जा सकता है। हालांकि, हम एक सेलुलर स्तर पर डीबीएस द्वारा प्रेरित परिवर्तन को समझने के लिए पहले कदम के रूप में उच्च आवृत्ति उत्तेजना की एक खुराक (1 घंटा) के लिए हमारे विश्लेषण सीमित है।

न्यूरोनल विकारों की एक किस्म के लिए डीबीएस सर्जरी के प्रयोग को देखते हुए, यह हम डीबीएस के लाभदायक प्रभाव अंतर्निहित तंत्र को पता है कि आवश्यक है। यह जानकारी डीबीएस में विशेषज्ञों द्वारा जांच नहीं की गई है, जो अन्य स्थितियों के लिए एक इलाज के रूप डीबीएस की उपयोगिता का पता लगाने के लिए भी सर्जरी में भविष्य में सुधार के विकास के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, सर्जिकल तकनीक के लिए संशोधन की प्रक्रिया के कुछ हानिकारक दुष्प्रभाव से बचने के लिए और प्रभावी ढंग से रोग हालत की पुनरावृत्ति से निपटने के लिए लागू किया जा सकता है।

एक में गहराई से यंत्रवत एनाडीबीएस के lysis डीबीएस द्वारा प्रेरित जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन का परीक्षण करके संभव है। या तो एक उम्मीदवार जीन दृष्टिकोण इस तरह के उच्च आवृत्ति उत्तेजना, या डीबीएस से चालू होने वाले आणविक घटनाओं में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि दे सकते हैं एक वैश्विक transcriptome विश्लेषण के रूप में उत्तेजनाओं depolarizing का जवाब है कि न्यूरोनल रास्ते के बारे में मौजूदा ज्ञान पर आधारित है। जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण तकनीक (उम्मीदवार जीन दृष्टिकोण के रूप में अच्छी तरह से उच्च throughput विधि) आणविक तंत्र और डीबीएस सर्जरी के साथ जुड़े सेलुलर परिवर्तन की खोज के लिए महत्वपूर्ण हैं कि शक्तिशाली उपकरण हैं। हमें कुछ साल पहले संभव नहीं था, जो एक बहुत ही कम समय में सेलुलर फिजियोलॉजी के कई पहलुओं के बारे में जानकारी का खजाना प्राप्त करने के लिए इस क्षेत्र में हाल के घटनाक्रम से यह संभव बना दिया है। ऐसे ChIPseq के रूप में उच्च throughput अनुक्रमण प्रौद्योगिकी के आगमन के साथ, यह डीबीएस 57,58 का जवाब है, जो महत्वपूर्ण प्रतिलेखन कारक के जीनोम चौड़ा स्थान चिह्नित करने के लिए संभव है। गैर जोड़ने हाल की खोजोंneurodegenerative रोगों के साथ इस तरह microRNA के रूप में शाही सेना -coding, miRNA अनुक्रमण प्रौद्योगिकी 59,60 का उपयोग कर न्यूरॉन्स के बाद डीबीएस में miRNA के स्तर में संभव परिवर्तनों का विश्लेषण करने के लिए सक्षम। डीबीएस के जवाब में epigenetic हस्ताक्षर ऐसे डीएनए मेथिलिकरण और हिस्टोन संशोधनों में संभव परिवर्तनों का भी पता लगाया जा सकता है। हालांकि, लाभ के बावजूद, यह इन तकनीकों की सीमाओं से कुछ के रूप में अच्छी तरह से विश्लेषण के दौरान पैदा हो सकता है कि संभावित समस्याओं को स्वीकार करने के लिए महत्वपूर्ण है। जीन की अभिव्यक्ति के साथ एक महत्वपूर्ण चिंता का विषय reproducibility और तकनीकी त्रुटियों के लिए किया गया है विश्लेषण करती है। यह प्रयोगकर्ता इस पर ध्यान लेता है और विश्वसनीयता सुनिश्चित करने के लिए repetitions की पर्याप्त संख्या होने पर योजना बना रही है कि महत्वपूर्ण है। उच्च throughput प्रदर्शन के अध्ययन से कुछ के साथ एक आम समस्या उत्पन्न होता है कि डेटा की भारी राशि की व्याख्या करने में कठिनाई हो गया है। कभी-कभी यह देखा जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन सीधा प्रभाव की वजह से कर रहे हैं कि क्या यह निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण हो जाता हैप्रयोगात्मक उपचार के बहाव के प्रभाव या है। यह आमतौर पर इस मुद्दे के समाधान के लिए तैयार कर रहे हैं कि अतिरिक्त अध्ययन की आवश्यकता है।

जीनोमिक अध्ययन करने के अलावा, डीबीएस का जवाब है कि प्रमुख खिलाड़ियों की spatio- लौकिक स्थानीयकरण और मस्तिष्क के विभिन्न क्षेत्रों में अपने स्तर में परिवर्तन का एक quantitation की एक व्यापक immunohistochemical विश्लेषण के भविष्य के विकास के लिए एक महान परिसंपत्ति होगा डीबीएस शल्य प्रक्रिया। जीन की अभिव्यक्ति से संचयी निष्कर्षों immunohistochemical पढ़ाई महत्वपूर्ण कारक के रूप में भी इस तरह के न्यूरोजेनेसिस या neurodegeneration के रूप में सेलुलर प्रक्रियाओं है कि विनियमित कुंजी आणविक घटनाओं के बीच उपन्यास बातचीत प्रकट कर सकते हैं और साथ ही विश्लेषण करती है। इस तरह के महत्वपूर्ण आणविक मार्कर की पहचान भी भविष्य दवा खोजों सक्षम हो सकता है। इस तरह के निष्कर्ष आदमी को समझने के लिए काम कर रहे वैज्ञानिकों के नजरिए से महत्वपूर्ण जानकारी है जो मस्तिष्क circuitry के सामान्य कामकाज पर प्रकाश डाला सकता हैY न्यूरोनल रोगों। नवीनतम तकनीकी क्लिनिक में की गई प्रगति के साथ ही प्रयोगशाला को एकीकृत करने पर हमारे भविष्य के प्रयासों निर्देशन रोग के खिलाफ हमारी लड़ाई में हमें पर्याप्त लाभ प्रदान करने की संभावना है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Deep Brain Stimulation Surgery
Stereotactic frame Kopf Instruments Model 900
Drill  Dremmel 7700, 7.2 V
Scalpel BD 372610
Ketamine Patterson Veterinary 07-803-6637 Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules
Xylazine Patterson Veterinary 07-808-1947
Buprenorphine Patterson Veterinary 07-850-2280 Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules
Surgical staples ConMed Corporation 8035
Sutures (3-0)  Harvard Apparatus 72-3333
Syringe (1 ml, 29 1/2 G) BD 329464 Sterile, use for Anesthesia administration intraperitoneally
Syringe (3 ml, 25 G) BD 309570 Sterile, use for Analgesia administration subcutaneously
Needles BD 305761 Sterile, use for clearing broken bone pieces from the burr holes
Ethanol Fisher Scientific S25309B Use for general sterilization 
Eye Lubricant Fisher Scientific 19-898-350
Stimulator Medtronic Model 3628
DBS electrodes Rhodes Medical Instruments, CA SNEX100x-100 mm Electrodes are platinum, concentric and bipolar
Betadine (Povidone-Iodine)  PDI S23125 Single use swabsticks, use for sterilizing the scalp before making incision 
 Brain Dissection and Hippocampal tissue isolation
Acrylic Rodent Brain Matrix Electron Microscopy Sciences 175-300 www.emsdiasum.com
Razor Blade V W R 55411-050
Guillotine Scissors Clauss 18039 For decapitation, make sure these scissors are maintained in clean and working condition
Scissors Codman Classic 34-4098 Use for removing the brain from the skull
Forceps Electron Microscopy Sciences 72957-06 Use for removing the brain from the skull and for handling during dissection
Phosphate Buffered Saline  Boston Bioproducts BM-220
 RNA Extraction and cDNA Preparation
Tri Reagent Sigma T9424 Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin
Syringe (3 ml, 25 G) BD 309570 Use for tissue homogenization
Chloroform Fisher Scientific BP1145-1 Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin
Isopropanol Fisher Scientific A416-1
Glycogen Thermo Scientific R0561
Dnase I Kit Ambion AM1906
Superscript First Strand Synthesis Kit Invitrogen 11904-018
Tabletop Microcentrifuge Eppendorf 5415D
 Quantitative PCR               
SYBR Green PCR Kit Qiagen 204143
Custom Oligos Invitrogen 10668051
PCR Plates (96 wells) Denville Scientific C18080-10
Optical Adhesive Sheets Thermo Scientific AB1170
Nuclease free Water Thermo Scientific SH30538-02
Real Time PCR Machine Applied Biosystems 7500

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 97 पूर्वकाल thalamic नाभिक गहरी मस्तिष्क उत्तेजना दांतेदार गाइरस हिप्पोकैम्पस मिर्गी जीन अभिव्यक्ति उच्च आवृत्ति उत्तेजना मात्रात्मक आरटी पीसीआर
पूर्वकाल thalamic नाभिक की गहरी मस्तिष्क उत्तेजना के बाद चूहा हिप्पोकैम्पस में जीन एक्सप्रेशन परिवर्तनों का विश्लेषण
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Selvakumar, T., Alavian, K. N.,More

Selvakumar, T., Alavian, K. N., Tierney, T. Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus. J. Vis. Exp. (97), e52457, doi:10.3791/52457 (2015).

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