Abstract
そのような大脳基底核、視床、及び視床下領域などの脳の様々な領域を標的脳深部刺激(DBS)手術は、薬物療法に応答しなかったいくつかの運動障害のための効果的な治療である。 DBS手術の分野における最近の進歩は、病的肥満、うつ病や強迫性障害など多様な他の条件にこの手術法の適用を拡張するために始めている。これらの拡大兆候にもかかわらず、ほとんどのDBS手術の有益な効果を促進する基盤となる生理学的メカニズムについて知られている。この問題に対する一つのアプローチは、電気刺激を受ける神経細胞における遺伝子発現解析を行うことである。以前の研究では、ラットの歯状回でその神経発生を示している視床1の前核の標的にDBSに誘発される。 ATNを標的DBS手術は、難治性てんかん治療のために広く使用されている。したがって、多くinteresのです私たちは電気的にATNを刺激することにより誘発される転写の変化を探索するためのT。本稿では、我々は、成体雄WistarラットにATNをターゲットに定位的に誘導DBSの手術のために私たちの方法論を説明します。また、遺伝子発現の変化を測定するための組織切開、RNA単離、cDNA調製および定量的RT-PCRのための後続のステップを議論する。この方法が適用され、一般的に臨床的に標的と大脳基底核および脳の他の領域を刺激するために変更することができる。ここに記載の遺伝子発現研究は、DBSのメカニズムを導くことができる分子のプレイヤーを発見するための標的候補遺伝子アプローチを想定している。
Introduction
電気的に脳回路を刺激する可能性は2を探索したときの神経外科技術として、脳深部刺激の発展の歴史は1870年代にまでさかのぼります。 1960 3で起動ニューロンの障害の治療のような慢性の高頻度刺激を使用する。その後、慢性移植DBS電極4-6の出現により1990年代に、DBSにより処理したニューロンの障害の数が増加し続けた。深部脳刺激は、最初本態性振戦6の治療薬として米国で使用された。今日、手術は現在、薬理学的介入によって治療不可能であるニューロンの障害の治療に広く使用されている。 DBSは現在、パーキンソン病およびジストニア7-9の運動障害を治療するために使用される。アルツハイマー型認知症、ハンチントン病、てんかん、痛みや神経精神疾患、うつ病、OCD、トゥーレット7;症候群と中毒はDBS 10-12による治療の影響を受けやすい条件のいくつかである。 DBS手術はFDAは、パーキンソン病、ジストニア、および本態性振戦の治療のために承認されているが、前述の他の状態を治療するためのDBSの使用は、患者13,14に多くの約束を提供する実験室の様々な段階および臨床試験である。
臨床的に、DBS手術は2段階で行われる。第一段階は、外科的に放射線位置の組み合わせを使用して、標的の解剖学的位置にDBS電極を配置することを含む、CT、MRI、ならびに強化精度化微小電極の測定値。第二段階は、患者の胸の上部にパルス発生器を注入し、パルス発生器に頭皮から延長リードを設置することを含む。神経学的状態に基づいて、パルス発生器のためのいくつかのプログラミング方式が標準化され、所望の電圧を供給するために使用される。最終巻最小の電圧15と最良の臨床応答を受信するように、モンタージュは、段階的に達成される。しかし、我々の研究では、臨床的に使用される慢性DBSインプラントとは異なり、簡単のために、私たちは、動物モデルにおいて(1時間)1回の高頻度刺激を研究に頼ってきた。
当社グループの研究の一部は、治療抵抗性てんかんのためのDBS手術の使用を研究に焦点を当てています。高周波刺激を使用して、定位外科的アプローチは、てんかん10,16,17の全発生率の約30%を構成する、医学的に難治性てんかんを治療するための効果的なオプションとして、多くの他の人が検討されている。皮質表面を標的小脳刺激ならびに深部小脳核てんかん10,18,19を治療するための標的として過去に使用されてきた。また、海馬刺激も試みたが、結果はまちまち20,21とされています。他のいくつかを調べてんかんのためのDBSターゲットは大脳皮質、視床、視床下核と迷走神経8が含まれています。しかし、過去数年間でいくつかの研究から以下の結果は、視床前核(ATN)は、てんかん治療10,22のための最も一般的なDBSターゲットとして浮上している。神経解剖学的回路および動物モデルからの所見についての知識に基づいて、いくつかの研究は、てんかんの治療における23-26 ATNの深部脳刺激の治療効果に焦点を当てている。 ATNは、辺縁系回路の一部であり、発作頻度に影響する脳の領域に位置している。によるHamani らの研究では、ピロカルピン誘発性てんかんモデルでATN-DBSの有効性をテストし、二国間のATN刺激がピロカルピン誘発性発作とてんかん重積状態24のための待ち時間を延長していることを発見した。さらに、ATNの高周波刺激はディスコグラフィのペンチレンテトラゾール(PTZ)モデルにおける発作頻度を低減することが見出された25,27-29 ilepsy。 Lee らは 、難治性部分てんかん30を治療する際にATNの慢性脳深部刺激の際に約75%の発作頻度の平均の減少を報告している。
治療難治性てんかんに関する最近の臨床研究では、視床前核(ATN)22ターゲットとDBS手術後の有望な結果を示している。治療難治性てんかん(サンテトライアル)用のATNの二国間のDBSを受けた110人の患者との多施設ランダム化臨床試験では、約40%の31による発作頻度の低下を示した。この研究からの結果はまた、手術後2〜3ヶ月で観測された遅延最適抗てんかん作用に示唆した。戸田らによるさらなる研究。、彼らは動物モデル1において、後でポストDBS(日3-5)で起こって神経発生を実証したこれらの知見と裏付け。また、Encinasのら、海馬neurogeneを報告しているATN 32の高頻度刺激後の成体マウスの歯状回におけるSIS。これまでの研究33-35は、慢性側頭葉てんかんと学習障害、記憶障害と自発的な再発性運動発作との関連など、特定のてんかんのケースで減少海馬の神経新生を報告している。さらに、このような動物モデル33における慢性てんかん海馬におけるFGF2およびIGF-1などの神経幹細胞前駆要因の減少があった。これを考慮し、歯状回における神経新生の増加を示しているようなDBSなどのインターベンショナル戦略が研究のための刺激的な道である。これらの知見は、てんかんのための神経発生後のDBS治療の基礎となるメカニズムの中にさらに深く探求する私たちを奨励しています。我々は両方の一方的に(データは報告されていない)だけでなく、左右(代表的な結果で)ATNを目標とし、ラットの歯状回における上昇ニューロトロフィン(BDNF)の発現を見てきました。私たちのCurrent仮説はBDNF発現は、DBSの手術の抗てんかん効果に変換神経新生で最高潮に達した遺伝子発現カスケードを開始するということです。本稿では、DBSの恩恵を根底にあるメカニズムを研究するための魅力的なアプローチとして、遺伝子発現解析に続いて、ラットにおいてATNをターゲットとDBSの手術のための私達の方法を提示する。
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Protocol
注:倫理に関する声明:この原稿で説明するすべての手順は動物研究(実験動物の管理と使用に関する指針)のためのNIHガイドラインに従っているとハーバード大学医学部IACUC委員会によって承認されている。
1.手術前の準備
- すべての外科器具はどちらオートクレーブによりまたは必要に応じて消毒液および/またはエタノールで洗浄することによって滅菌されていることを確認してください。可能な場合には、そのようなメス、針と注射器のような滅菌使い捨て器具を使用しています。
- 外科用ドレープでワークベンチをカバーし、利用可能なバイオハザード廃棄物処理があることを確認してください。
- ラットを秤量し、麻酔の投与量を計算する。ラットを麻酔ケタミン/キシラジン混合物(ケタミン75 mg / kgをおよびキシラジンは10mg / kg)を使用してください。
注:200〜250グラムの間では、定位フレームにおける動物の適正な固定のためだけでなく、ATNの正確な標的化のための最適な重量である。 IsoflurANEはまた、麻酔剤として使用することができる。 - マウントと固定している2つの無菌の電極の電極ホルダーの(オートクレーブによりまたはエチレンオキシドで滅菌)定位手術用フレームの顕微鏡(10-40X倍率)の助けを借りて( 図2)は 、適切な用電極の先端を検査整列。二つの電極離れて3.0ミリメートルを固定します。
注記:ハードディスクの表面に触れることによって、電極先端を損傷しないように注意してください。
2. DBS手術
- ケタミン/キシラジンを動物に腹腔内に混在させると、動物が(つま先ピンチ反射、呼吸数と深さ、呼吸の規則性をチェックすることによって)麻酔の外科的平面に到達したことを確認して注入する。切開される頭皮の領域から毛を除去し、各ベタジンとアルコールまたは滅菌生理食塩水のいずれかの3交互スクラブと頭皮を消毒する。セキュアと定位FRAMに動物を配置E。
- 最適なレベルで、動物の体温を維持するために、循環温水パッドを使用する。過剰乾燥から守るために動物の目に目の潤滑剤を適用します。
- ATN(視床前核)を標的とするために、以下の定位座標を使用します。anterioposterior -1.6ミリメートル、内外1.5ミリメートルと5.2ミリメートル1背腹。
注:定位座標は、Paxinosとワトソン(6 番目の版)ラット脳アトラス36に基づいています。 - 頭蓋骨を明らかにするために矢状頭皮に切開を行います。開創器の一対の切開頭皮を確保使用する頭蓋骨を露出させる。切開をフラッシュする滅菌生理食塩水を使用してください。切開があまりにも濡れている場合は、乾燥させるために、滅菌綿棒を使用しています。ブレグマを見つけて、黒のマーカーでマークします。コロン島の矢状縫合と1.6ミリメートルの後部からmediolaterally両側に約1.5ミリメートルで、さらに2つのマークを作る、バーホールの位置をガイドするアル縫合。
- バーホールを作るために、手持ちのドリルを使用してください。バーホールの先端がエタノールでそれを滅菌することにより滅菌されていることを確認してください。掘削時に頭蓋骨表面に対して約45°の角度でドリルを持ってください。よくあるすべてのバーホールの位置に過度の熱を避けるために、2バーホールを切り替える。
- 硬膜が露出するまでの掘削を継続。 'L'の形状に似たその先端曲がった針を用いて、電極の挿入を妨げになる骨のいずれかの破片を取り除く。曲がった針を用いて骨片を除去しながら、基礎となる硬膜および/または脳組織を損傷しないように注意してください。
注:鈍い針または罰金鈍鉗子を使用してもオプションです。 - 定位フレームの回転ハンドルにデュアル電極アセンブリを修正し、90°の角度でハンドルを固定してください。定位フレームの調整を使用して、正確にブレグマの上に残って電極を配置する。
- ステレオを使用して、正確に現在2つの電極が完全に冠状縫合に沿って整列しなくブレグマからmediolaterally 1.5mmと離隔が存在するようにブレグマの左側に1.5ミリメートル左電極を移動させる内外位置決め用戦術調整。
- anterioposterior定位の調整を使用して、冠状縫合に電極1.6ミリメートル後方に移動します。
- バーホールは電極がバーホールのラフな縁を触れることなく、簡単に挿入することができるように右の場所で行われている場合は、最初のチェックに電極を下げるために背腹調整を使用してください。その場合は、頭蓋骨の表面から5.2ミリメートルの深さに電極を挿入します。
- 130ヘルツ、2.5 V、90マイクロ秒のパルス幅1に設定された刺激にリード線を介して電極を接続します。
- 時間の高頻度刺激を送達する(または実験に従って所望の期間)。刺激の過程で、ページを保証するために覚えている定期的につま先のピンチに応答して、足の撤退がないことを確認することでローパー麻酔深度。麻酔を誘導するために使用される約半分の初期用量で麻酔を補足する。麻酔深度をチェックするとき、あなたの滅菌手袋の汚染を避けるため、必要に応じて変更します。 1の実験的なニーズに基づいて、一方的または両側刺激を実行します。このような低頻度刺激などのコントロール( 例えばため。、10ヘルツ)と(後続の刺激に電極を挿入する)刺激されていない動物が含まれる。
- 刺激が行われた後、慎重に電極を取り外し、3-0縫合糸でまたは滅菌外科ステープルで切開を縫合。
- 皮下鎮痛としてブプレノルフィン(0.05ミリグラム/ kg)を管理します。それが通常の活動に戻るまで動物を監視して、住宅施設にそれを返す。
- ( 例えば 、0,3,6、または12時間後DBS手術のための)実験計画に基づいて設定された時間後に、麻酔過剰摂取で動物を安楽死させる。バイタルサインの不在を確認した後、動物を斬る。
- 最初のハサミを用いて皮膚を削除することで脳を解剖。解剖ハサミを使って矢状縫合に沿って骨をカット。両方の側面に骨を(インチそれぞれ約)さらに2つの切開を行います。鉗子を使用して、脳を露出させるために頭蓋骨の上から骨の部分的に切断された部分を持ち上げる。
- 細かいハサミやピンセットを用いて、頭蓋骨から脳を取り除く、氷上に冷たいPBSでペトリ皿に移す。
注:骨を切開しながら脳に損傷を与えないように注意してください。
3.海馬の分離
注:氷の上にこのセクションのすべての後続のステップを実行します。
- 氷上で予め冷却したアクリル脳マトリックス上で脳を置きます。カミソリの刃を使用して、最前方edから7-8で約冠状mmの脳をカット脳のGE。約5ミリメートルの厚さの脳切片を除去することができるように最初のカットに第二冠状にカットし、後部を行います。
- 氷冷PBSでペトリ皿に脳スライスを転送します。カミソリの刃を使用して、2つの半球状のセクションを切断し、それぞれ左右両側に対応する半球に注意するように注意してください。一方的な刺激を行いながら、これは特に重要である。
- 細かい鉗子とハサミを使用すると、慎重に海馬を削除します。
- Flashは、その後のRNA抽出のステップの準備が整うまで-20℃の冷凍庫でドライアイスとストアの海馬組織を凍結する。
注:長期保存のためには、-80℃の冷凍庫内の組織を保存することをお勧めします。
4. RNA抽出および定量PCR
- 組織が均質化のための準備ができるまでドライアイス上で凍結されたままにしてください。
- 注:フード内でこの手順を実行します。
- ヒップにトライ試薬の1ミリリットルを追加します。1.5ミリリットル遠心管におけるocampal組織と組織を小さな断片に切断されるまで、第1ピペッティングにより複数回、それを均質化する。さらに目に見える無傷の組織がなくなるまで25 G針を注射器に通すことによって、組織をホモジナイズする。氷上で均質化の手順を実行します。
- 組織をホモジナイズした後、細胞溶解を可能にするために、細胞懸濁液を5分間室温で放置する。
注:この時点の後、細胞懸濁液を急速冷凍し、さらなる処理まで-70℃に格納することができる。
- 0.2ミリリットルのクロロホルムを加え、20秒間ボルテックスで混合し、15分間室温での溶液の残りをしましょう。
- 4℃で15分間12000×gでサンプルを遠心。遠心分離した後、表示されます3つの別々の層を乱すことなく、慎重にチューブを取り除く。
注:ボトム(赤)相はタンパク質を含む、中央の曇り相は、DNAが含まれており、トップの明確な相はRが含まれていますNA。 - 新鮮な1.5ミリリットルの遠心管にトップクリヤー相(RNA)を転送する(通常は相を含むRNAを500μlが得られる)。これに0.5ミリリットルのイソプロパノールを加え、ボルテックスで混和する。これにRNAの担体として2-3μlのグリコーゲンた(20mg / ml)を加える。サンプルは10分間室温でテーブルの上に物を置か。
- 4℃で1時間、12000×gでサンプルを遠心。 RNAペレットがチューブの底に表示されていることを確認してください。
- 上清を捨て、75%エタノール1mlを添加することにより、RNAペレットを洗浄(ヌクレアーゼフリー水で作られた)。ペレットがチューブの底からdislodgesと、溶液中に浮遊するまで、サンプルを複数回反転。遠心機4℃で10分間12000×gでソリューション。
NOTE:75%エタノールでペレットをさらなるステップまで-20℃で保存することができる。 - 室温で5分間開いたチューブを残すことによって空気乾燥RNAペレットを許可する。オベを避けるために予防策を取るこの後の工程で水への溶解に影響を与える可能性があるとして、ペレットを乾燥させるrを。
5. RNAの準備からDNAを削除
- RNAペレットにヌクレアーゼを含まない水の9μl加え、ペレットを静かにチューブをボルテックスして先に進む前に溶解されることを確認してください。これは10倍DNアーゼIバッファー1μlのと1μL(DNアーゼIキットから)組換えDNA分解酵素を追加するには、簡単に、優しくチューブをフリックでミックスチューブをスピンし、30分間水浴中で37℃でインキュベートする。
- サンプルに(DNアーゼIキットから)2μlのDNA分解酵素の不活性化試薬を追加し、2分間室温でインキュベートし、穏やかにチューブをフリックで頻繁に混ぜる。 10分間12000×gで遠心分離し、新鮮な1.5ミリリットル遠心管に透明な上澄みの約10μLを転送する。
- 光度計または分光光度計を用いてRNA濃度を測定します。
6. RNAからcDNAを作る
- 必要なボリューム番目の追加1μgのRNAを含有し、ヌクレアーゼフリー水を添加することによって8μlの総体積をもたらすで。これに1μlの10のdNTPミックスおよびSuperscriptファーストストランド合成キットからランダムヘキサ1μlの追加。穏やかに混合し、いずれかの水浴で、または事前にプログラムされたサーモサイクラー上で5分間65℃でインキュベートする。
- 10倍RT緩衝液2μl、25 MのMgCl 2、0.1 M DTT2μlのRNアーゼOUT(40 U /μl)を1μlの4μlの:以下の試薬 を含むプレミックスを作成します。
注:指定されたボリュームの反応ごとにあり、ユーザは、1つの実験的なニーズに応じてスケールアップする必要があります。 - 65℃からのサンプルを含むRNAを除去した後、分室温で管をセット。 9μlのプレミックス溶液を添加し、2分間室温でインキュベートする。スーパースクリプトII逆転写酵素の1μL(50 U /μl)を追加し、10分間室温でインキュベートする。
- 50 42℃でサンプルをインキュベートminで逆転写が起こるのに。
- 反応を停止し、15分間70℃でサンプルをインキュベートする。
- 簡単に氷の上にサンプルを配置し、1μlのRNアーゼH(2U /μl)を加え、20分間37℃でインキュベートする。
- 簡単に言うと凝縮液をスピンダウンする3000×gでチューブを遠心する。
注:これは、定量的PCRのために使用されるcDNAである。 cDNAは、PCRセットアップまで-20℃の冷凍庫に保存することができる。 cDNAはまた、PCRに進む前に、ヌクレアーゼを含まない水で希釈することができる。
7.定量PCR
- 2X SYBRグリーンミックスの6.3μL、フォワードプライマーの0.6μL(10μM)、リバースプライマーの0.6μL(10μM)およびヌクレアーゼを含まない水0.5μlの:以下の試薬を(与えられたボリュームが反応あたりである)を含むマスターミックスを作る。
注:プライマーの設計は、目的の遺伝子のために、NCBIのヌクレオチド配列ページの「ピックプライマー」オプションを使用して行われた。 - 96 well- PCRプレートの各ウェルに10μlのマスターミックスを追加します。以前よくマスターミックスを含むことに作製されたcDNAの2.5を添加する。各サンプルについて3回のPCR反応をセットアップしてください。
- マスターミックスとcDNAの添加が完了した後、ウェルを密封するために、光学接着シートを用いたPCRプレートをカバーする。井戸の底にすべての液体を決済する卓上遠心機で500×gで5分間簡単にプレートスピン。
- あらかじめプログラムされたRT-PCRマシンにPCRプレートをロードします。 表1に提供PCRパラメーターを使用してください。
- データ分析:さらなる計算のためのqPCR出力からC t値を使用してください。試験遺伝子に加えて、内部対照遺伝子のためのPCR反応、18S rRNAの(等しい入力を確実にする)と、βアクチン(ネガティブコントロール)を設定。 ΔΔCT法37に基づいて、倍率変化を計算します。
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Representative Results
図1A及び図1Bは、対照遺伝子βアクチンのBDNFおよびGABRDの相対発現を示す。 BDNFは、ニューロトロフィンは、多くの場合、多くの神経疾患38-41で神経保護効果と関連している。それはてんかん患者に治療上の利益をもたらすATNの刺激に応答してBDNFの発現プロファイルを分析することは興味深い。 DBS刺激ポスト示された時点にわたってBDNFの遺伝子発現プロファイルを示す図1Aに、アップレギュレーションBDNF 3時間でピーク発現(非刺激より大きく3倍)と共にDBS手術後(0時間)すぐに観察されポスト刺激。この観察は、強化されたBDNF発現し、得られた神経保護はDBSの治療的利益に寄与し得ることを示唆している。別の遺伝子GABRD( 図1B)は、定量PCR法を用いて調べた。 GABRDは、GABA受容体WHIですCHは、抗てんかん薬42を設計するための潜在的な目標の一つである。 GABRDの発現プロファイルは、3時間後にDBSに刺激されていない対照動物と比較して刺激を受けた動物での発現増強を示している。 GABAアゴニストが有効な発作抑制として使用されることを考慮すると、DBSの抗てんかん効果GABAの可能な役割が関与し、増強GABRD発現ポストDBSを観察することは興味深い。
ここで説明するRT-PCRプロトコルは、遺伝子発現パターンと対照動物と比較した相対的な倍数差を明らかに再現可能かつ定量的な結果をもたらす。データ分析は、次のように行われる:qPCRの出力を分析し、各サンプルの試験遺伝子のための閾値C tの値を与える。 C t値はまた、対照遺伝子βアクチンおよび18SのrRNA(入力制御)について得られる。 ΔΔCtの方法は、次に、遺伝子のexprを計算するために使用されるこれらのC tを用いessionプロファイルは、37値 。例えば、BDNFの遺伝子発現の変化を計算するために、与えられたサンプルについて、BDNFおよび18SのrRNAのC t値の差を算出し、第ΔCtのである。同じサンプルについて、βアクチンおよび18SのrRNAのC t値の差が第ΔCtを与えると計算される。 2ΔCt値の差がΔΔCtを与えると計算される。このΔΔCtの値は、βアクチンと比較してBDNFの相対テンプレートの存在量を与える2 ^(-ΔΔCのt)を計算するために使用される。非刺激対照と一緒に異なる時点にわたってこの値をプロットすることにより、時点にわたってDBSによって誘導される遺伝子発現の変化を可視化することができる。上述の方法は、潜在的な率直な他の遺伝子の発現における変化を調査するために効果的に使用することができるDBS刺激に応答し、これらの遺伝子の発現を調節する下流効果のいくつかを調査するためのATE。
図1:ATNの高頻度刺激に応答して、BDNFの発現(A)タイムコース分析。プロトコルで説明したように組織採取、RNA抽出、cDNA調製およびq-PCRを行った。遺伝子発現の相対的な変化は、同様に対照遺伝子(βアクチン)(18S rRNAを増幅することによって)入力を正規化した後に計算される。リアルタイムPCRから得られたC t値は、ΔΔC tの方法 37により発現レベルを計算するために使用した。分析した時点では0、3、6、12時間後のDBS刺激である。注:ここで選択した時点では特定の研究に関連しているとHYに応じて変更することがありますpothesisと実験計画。(B)GABA受容体デルタサブユニット(GABRD)ATNをターゲットに130 HzでDBSに応じたレベルの経時分析。方法および計算は、BDNFのデータと同様に行った。
図2:セットアップDBS電極および刺激装置。
PCRサイクル | |||
ステージ1: | 最初の変性 | 95°C | 15分 |
ステージ2: | 変性 | 95°C | 15秒 |
アニーリング | 60°C | 30秒 | |
延長 | 72°C | 30秒 | |
ステップ2の40サイクル | |||
注:アニーリング温度に応じて変化する | |||
プライマーの融解温度。プライマーは一般的に設計されています | |||
60°Cの最適なアニーリング温度を有するように |
表1:PCRパラメーター。
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Discussion
Benabid らによる画期的な仕事の後。パーキンソン病と本態性振戦を治療するための脳深部刺激を使用して、DBS手術法は、多くの神経疾患の6,10,43を治療するための過去10年間で多くの関心を検討されている。脳回路の様々な神経解剖学的領域を標的DBS研究は、現在、主要な神経疾患に対処するために多くのグループによって実行され、臨床試験の様々な段階にあるされている。視床下核(STN)又は淡蒼球(GPiの)の内部セグメントの刺激は、FDA承認及びパーキンソン病10に運動障害を治療するのに使用される。サンテ臨床試験は、前視床核31の高頻度刺激を受けたてんかん患者のための有望な傾向を示している。相からの結果は、私が二国間の円蓋刺激の臨床試験は、認知機能低下、再率の遅延を示しているメモリ回路8,44の活性化、ならびにアルツハイマー病に見られるグルコース代謝低下取り込みの冒頭装飾。さらに、近年では脳神経外科医は、OCD(強迫性障害)、治療抵抗性うつ病、トゥレット症候群と中毒10,45-55などの神経精神障害を治療するためのDBS試験を実施しています。
臨床試験に加えて、過去数年間にわたり、動物の手術は私たちに任意のインビトロ技術により、比類のない方法で、生きた動物に外科的手法により誘導された生理学的変化を研究するための素晴らしい機会を提供してきました。この原稿では、げっ歯類における脳深部刺激手術の実施に関与した方法を説明しました。ここで説明するようにげっ歯類における定位手術はまた、潜在的なDBSターゲット検索に使用することができ、疾患モデル動物を用いた手術の有効性をテストする。実験者の時間の課題の一つやがては、再現可能な方法で正確な解剖学的遺伝子座を標的とすることができることである。正しいターゲティングをチェックすると、刺激が行われ、動物は安楽死させた後にのみ可能であるため、手術のための熟練した技術者の必要性が特にある。また時折、人は誤って重要な血液の損失と動物の、時には死につながる可能性がキー血管を傷つける可能性があります。また、更なる生化学的分析のために、海馬を解剖する必要性は、組織切片のために無傷の脳の試料を必要と同じ動物ターゲティング適切な電極のための免疫組織学的検証の可能性を制限する。適切な電極ターゲティングは、おそらく同一の方法で刺激を受けた別の動物で確認することができた。しかし、これは、試験動物における適切なターゲティングのための証拠を提供し、この方法の制限ではありません。最近の刊行物はsimultaneouでDBS手術を行うことによってこの問題を回避しようとしたfMRIの56は、S。ここに記載されている技術の一つの可能な改善は、動物に移植された刺激装置を経由して慢性的刺激の効果に関する研究である可能性があります。しかし、我々は、細胞レベルでDBSによって誘発される変化を理解するための最初のステップとして、高頻度刺激の単回投与(1時間)のために我々の分析が限られている。
神経障害の様々なDBS手術の使用を考慮すると、我々はDBSの有益な効果の根底にあるメカニズムを知ることが不可欠である。この情報は、DBSの専門家によって調査されていない他の条件のための治療としてDBSの有用性を探るためにも手術における将来の改善を開発するために重要である。また、手術手技に対する改変は、手順の特定の有害な副作用を回避し、効果的に疾患状態の再発に対処するために実装することができる。
綿密な機械論的ANADBSの溶解は、DBSにより誘導される遺伝子発現の変化を調べることによって可能である。いずれかの候補遺伝子アプローチは、高頻度刺激、またはDBSによってトリガー分子事象に重要な洞察を与えることができ、グローバルトランスクリプトーム解析のような刺激を脱分極に応答するニューロン経路についての既存の知識に基づく。遺伝子発現分析技術(候補遺伝子アプローチ、ならびにハイスループット法)DBS手術に関連する分子機構および細胞変化を探索するための鍵である強力なツールである。この分野における最近の開発は、数年前には不可能であった、それが可能な私たちは非常に短い時間で細胞生理のいくつかの側面に関する豊富な情報を取得するために作られています。そのようなChIPseqとしてハイスループットシークエンシング技術の出現で、それはDBS 57,58に応答する重要な転写因子のゲノムワイド位置を特徴付けることが可能である。最近の発見は、非リンク神経変性疾患のようなマイクロRNAのようなRNAを-コード、miRNAのシーケンシング技術59,60を使用して、神経細胞のポスト-DBSにおけるmiRNAレベルの変化の可能性を分析するために私たちを可能にする。 DBSに応答してエピジェネティックシグニチャーDNAメチル化およびヒストン修飾における変化の可能性も検討される可能性がある。しかし、利点にもかかわらず、これらの技術のいくつかの制限ならびに分析中に発生する可能性のある潜在的な問題を認識することは重要である。遺伝子発現に重要な関心事の分析は、再現性と技術的なエラーとなっている。これは、実験者はこれのノートを取り、信頼性を確保するために、繰り返しの十分な数を有することを計画することが重要です。ハイスループットスクリーニングの研究のいくつかの共通の問題は、生成された膨大な量のデータの解釈が困難であった。場合によっては、観察遺伝子発現の変化は、直接効果によるものであるかどうかを判断することが重要となる実験的治療のまたは下流効果である。これは通常、この問題に対処するように設計されている追加の研究が必要である。
ゲノム研究に加え、脳の様々な領域でDBSに反応するのキープレーヤーの時空間的局在性とそのレベルの変化の定量の広範な免疫組織化学的分析は、将来の発展に大きな資産となるでしょうDBS手術手順。遺伝子発現からの累積的な知見は、免疫組織化学的研究は、主要な要因、ならびにそのような神経発生または神経変性などの細胞プロセスを調節する重要な分子事象間の新規の相互作用を明らかにすることができるだけでなく、分析する。そのような重要な分子マーカーの同定はまた、将来の薬物発見を可能にすることができる。このような発見は、人間を理解するために取り組んで科学者の視点から貴重な情報である脳回路の一般的な機能に光を当てることができyの神経疾患。最新の技術クリニックの進歩だけでなく、研究室を統合することで私たちの今後の取り組みを指示すると、疾患に対する我々の戦いで私たちに実質的な利点を提供する可能性がある。
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Deep Brain Stimulation Surgery | |||
Stereotactic frame | Kopf Instruments | Model 900 | |
Drill | Dremmel | 7700, 7.2 V | |
Scalpel | BD | 372610 | |
Ketamine | Patterson Veterinary | 07-803-6637 | Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules |
Xylazine | Patterson Veterinary | 07-808-1947 | |
Buprenorphine | Patterson Veterinary | 07-850-2280 | Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules |
Surgical staples | ConMed Corporation | 8035 | |
Sutures (3-0) | Harvard Apparatus | 72-3333 | |
Syringe (1 ml, 29 1/2 G) | BD | 329464 | Sterile, use for Anesthesia administration intraperitoneally |
Syringe (3 ml, 25 G) | BD | 309570 | Sterile, use for Analgesia administration subcutaneously |
Needles | BD | 305761 | Sterile, use for clearing broken bone pieces from the burr holes |
Ethanol | Fisher Scientific | S25309B | Use for general sterilization |
Eye Lubricant | Fisher Scientific | 19-898-350 | |
Stimulator | Medtronic | Model 3628 | |
DBS electrodes | Rhodes Medical Instruments, CA | SNEX100x-100 mm | Electrodes are platinum, concentric and bipolar |
Betadine (Povidone-Iodine) | PDI | S23125 | Single use swabsticks, use for sterilizing the scalp before making incision |
Brain Dissection and Hippocampal tissue isolation | |||
Acrylic Rodent Brain Matrix | Electron Microscopy Sciences | 175-300 | www.emsdiasum.com |
Razor Blade | V W R | 55411-050 | |
Guillotine Scissors | Clauss | 18039 | For decapitation, make sure these scissors are maintained in clean and working condition |
Scissors | Codman Classic | 34-4098 | Use for removing the brain from the skull |
Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72957-06 | Use for removing the brain from the skull and for handling during dissection |
Phosphate Buffered Saline | Boston Bioproducts | BM-220 | |
RNA Extraction and cDNA Preparation | |||
Tri Reagent | Sigma | T9424 | Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin |
Syringe (3 ml, 25 G) | BD | 309570 | Use for tissue homogenization |
Chloroform | Fisher Scientific | BP1145-1 | Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin |
Isopropanol | Fisher Scientific | A416-1 | |
Glycogen | Thermo Scientific | R0561 | |
Dnase I Kit | Ambion | AM1906 | |
Superscript First Strand Synthesis Kit | Invitrogen | 11904-018 | |
Tabletop Microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | |
Quantitative PCR | |||
SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 204143 | |
Custom Oligos | Invitrogen | 10668051 | |
PCR Plates (96 wells) | Denville Scientific | C18080-10 | |
Optical Adhesive Sheets | Thermo Scientific | AB1170 | |
Nuclease free Water | Thermo Scientific | SH30538-02 | |
Real Time PCR Machine | Applied Biosystems | 7500 |
References
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