Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Análise das Alterações Gene expressão no Rat Hippocampus Após Estimulação Cerebral Profunda do Anterior Thalamic Nucleus

Published: March 8, 2015 doi: 10.3791/52457
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Neurosurgery, Brigham & Women's Hospital, Harvard Medical School, 2Division of Brain Sciences, Department of Medicine, Imperial College London

Abstract

A estimulação cerebral profunda (DBS) cirurgia, tendo como alvo várias regiões do cérebro, como os gânglios basais, tálamo e regiões subtalâmico, é um tratamento eficaz para vários distúrbios de movimento que não conseguiram responder à medicação. Os progressos recentes no campo da cirurgia DBS começou a alargar a aplicação desta técnica cirúrgica para outras condições tão diversas como obesidade mórbida, depressão e transtorno obsessivo compulsivo. Apesar dessas indicações em expansão, pouco se sabe sobre os mecanismos fisiológicos subjacentes que facilitam os efeitos benéficos da cirurgia DBS. Uma abordagem a esta questão é a realização de análise de expressão gênica em neurônios que recebem a estimulação elétrica. Estudos anteriores demonstraram que a neurogénese no giro dentado de ratos é induzida em DBS segmentação do núcleo anterior do tálamo 1. Cirurgia DBS visando a ATN é amplamente utilizado para o tratamento da epilepsia refratária. É, portanto, de muito interest para nós para explorar as mudanças de transcrição induzidos ao estimular eletricamente o ATN. Neste artigo, são apresentadas as nossas metodologias para estereotaxicamente-guiada cirurgia DBS visando a ATN em ratos Wistar machos adultos. Discutimos também as etapas subseqüentes para dissecção dos tecidos, o isolamento do RNA, a preparação de cDNA e RT-PCR quantitativo para medir as mudanças de expressão gênica. Este método pode ser aplicado e modificado para estimular os gânglios da base e em outras regiões do cérebro normalmente clinicamente alvo. O estudo de expressão gênica descrito aqui assume uma abordagem gene alvo candidato para descobrir jogadores moleculares que poderiam ser direcionando o mecanismo para DBS.

Introduction

A história por trás do desenvolvimento de estimulação profunda do cérebro como uma técnica neurocirúrgica remonta à década de 1870, quando a possibilidade de estimular eletricamente o circuito cerebral foi explorada 2. O uso da estimulação de alta frequência crônica como tratamento para distúrbios neuronais começou na década de 1960 3. Mais tarde, na década de 1990, com o advento de eléctrodos de implantação crónica de DBS 4-6, o número de distúrbios neuronais que foram tratados por DBS continuou a aumentar. A estimulação cerebral profunda foi usado pela primeira vez nos Estados Unidos como um tratamento para o tremor essencial 6. Hoje, a cirurgia é amplamente utilizado para tratar desordens neuronais que estão actualmente tratável por intervenção farmacológica. DBS é actualmente utilizado para o tratamento de perturbações do movimento da doença de Parkinson e distonia 7-9. Demência de tipo Alzheimer, doença, epilepsia, dor e doenças neuropsiquiátricas tal depressão de Huntington, OCD, Tourette7; s síndrome e vício são algumas das condições passíveis de tratamento por DBS 10-12. Enquanto a cirurgia DBS é aprovado pela FDA para o tratamento da doença de Parkinson, a distonia e tremor essencial, a utilização de DBS para o tratamento de outras condições mencionadas acima estão em vários estágios de laboratório e estudos clínicos que oferecem a promessa muito doentes 13,14.

Clinicamente, a cirurgia de DBS é realizada em duas fases. A primeira etapa envolve a posicionar os eléctrodos cirurgicamente DBS na localização anatómica alvejado usando uma combinação de posicionamento radiológico, CT, MRI, bem como leituras microeléctrodos para maior precisão. A segunda fase envolve a implantação de um gerador de impulsos no peito do paciente e a instalação de extensões do couro cabeludo para o gerador de impulsos. Com base na condição neurológica, vários esquemas de programação para o gerador de impulsos foram padronizados e irá ser utilizado para entregar a tensão desejada. A final, voltagem é atingida de forma gradual, de modo a receber a melhor resposta clínica com o mínimo de tensão 15. No entanto, nos nossos estudos, ao contrário dos implantes DBS crónicas utilizado clinicamente, por uma questão de simplicidade, que recorreram a estudar um tempo de estimulação de alta frequência (durante 1 hora) nos modelos animais.

Parte da pesquisa do nosso grupo concentra-se em investigar o uso da cirurgia DBS para a epilepsia refratária ao tratamento. Abordagens cirúrgicas estereotáxica, com auxílio de estimulação de alta frequência tem sido explorado por muitos outros como uma opção eficaz para tratar a epilepsia clinicamente refratária, que constitui cerca de 30% de todas as incidências de epilepsia 10,16,17. Estimulação cerebelar direccionamento da superfície cortical bem como os núcleos profundos do cerebelo têm sido utilizados no passado como alvos para o tratamento de epilepsia 10,18,19. Além disso, a estimulação hipocampo também foi tentado, mas com resultados mistos 20,21. Alguns dos outros investigadaMetas DBS para a epilepsia incluem o córtex cerebral, tálamo, núcleo subtalâmico e nervo vago 8. No entanto, após os resultados de vários estudos nos últimos anos, o núcleo talâmico anterior (ATN) emergiu como o alvo mais comum DBS para o tratamento da epilepsia 10,22. Com base nos conhecimentos sobre circuitos neuroanatomical e resultados de modelos animais, vários estudos têm-se centrado sobre o efeito terapêutico de estimulação cerebral profunda da ATN no tratamento de epilepsia 23-26. A ATN é parte do circuito límbico e está localizado na região do cérebro que afeta a frequência de crises. Estudos por Hamani et al., Testaram a eficácia da NTA-DBS em um modelo de epilepsia induzida por pilocarpina e descobriu que a estimulação bilateral ATN latências para convulsões induzidas por pilocarpina e estado de mal epiléptico 24 prolongada. Além disso, a alta estimulação da ATN frequência foi encontrada para reduzir a freqüência de crises em um modelo de pentilenotetrazol (PTZ) de epilepsy 25,27-29. Lee et al., Relataram uma redução média da frequência de crises por cerca de 75% em cima da estimulação cerebral profunda crônica da ATN no tratamento da epilepsia refratária parcial 30.

Um recente estudo clínico sobre a epilepsia refratária ao tratamento tem mostrado resultados promissores após a cirurgia DBS visando o núcleo talâmico anterior (ATN) 22. Um ensaio clínico multicêntrico, randomizado, com 110 pacientes submetidos a DBS bilateral da ATN para o tratamento de epilepsia refratária (trial SANTE) indicaram uma queda na frequência de crises por cerca de 40% 31. Os resultados deste estudo também sugeriu em um efeito anti-epiléptico ideal atrasado observado em 2-3 meses após a cirurgia. Estudos adicionais por Toda et al., Corroborado com estes resultados, onde eles demonstraram neurogênese acontecendo em um momento pós tarde DBS (dias 3-5) em modelos animais 1. Além disso, Encinas et al., Relataram neurogène hipocamposis no giro denteado do rato adulto, após a estimulação da ATN 32 de alta freqüência. Estudos anteriores 33-35 relataram declínio neurogênese em certos casos de epilepsia, como a epilepsia crônica do lobo temporal e uma associação com déficits de aprendizagem, perda de memória e espontâneas convulsões motoras recorrentes. Além disso, houve uma redução nos factores de células estaminais progenitoras neurais, tais como o FGF2 e de IGF-1 no hipocampo cronicamente epiléptico em modelos animais 33. Considerando isso, estratégias de intervenção, tais como DBS que mostram um aumento da neurogênese no giro dentado são caminhos interessantes para a pesquisa. Estes resultados têm nos encorajado a explorar mais profundamente o mecanismo subjacente tratamento neurogênese pós-DBS para a epilepsia. Temos como alvo a ATN tanto unilateral (dados não publicados), bem como a nível bilateral (em resultados representativos) e neurotrofina elevado visto (BDNF) expressão no giro dentado de ratos. Nosso current hipótese é que a expressão de BDNF inicia uma cascata de expressão do gene que culmina na neurogénese que traduz o efeito anti-epiléptico de cirurgia de DBS. Neste artigo, apresentamos os nossos métodos de cirurgia DBS visando a ATN em ratos, seguido de análise de expressão gênica como uma abordagem atraente para estudar o mecanismo subjacente aos benefícios do DBS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Declaração de Ética: NOTA: Todos os procedimentos descritos neste manuscrito estão em conformidade com as diretrizes do NIH para Pesquisa Animal (Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório) e são aprovados pelo Comitê IACUC Escola de Medicina de Harvard.

Preparação 1. Pré-cirúrgica

  1. Certifique-se de que todos os instrumentos cirúrgicos são esterilizados por autoclave ou seja pela limpeza com a solução e / ou etanol anti-séptico, conforme necessário. Sempre que possível, use o material descartável estéril como bisturis, agulhas e seringas.
  2. Cobrir a bancada de trabalho com campos cirúrgicos e garantir que não é uma eliminação de resíduos perigosos disponível.
  3. Pesa-se o rato e calcular a dose de anestesia. Utilize uma mistura de cetamina / xilazina (cetamina 75 mg / kg de xilazina e 10 mg / kg) para anestesiar os ratos.
    NOTA: entre 200-250 g é o peso ideal para a fixação adequada do animal na moldura estereotáxica, bem como para direccionamento preciso da ATN. Isoflurane também pode ser utilizado como o agente de anestesia.
  4. A montagem e dois eléctrodos estéreis seguras (esterilizado em autoclave ou com óxido de etileno) sobre o suporte do eléctrodo (Figura 2) de um quadro estereotáctico e cirúrgico com o auxílio de um microscópio (ampliação de 10-40X), inspeccionar as pontas do eléctrodo para adequada alinhamento. Prenda os dois eletrodos de 3,0 milímetros de distância.
    NOTA: Tenha cuidado para não danificar a ponta do eletrodo por tocar em superfícies duras.

2. DBS Cirurgia

  1. Injectar a ketamina / xilazina misturar intraperitoneal para o animal e confirmar que o animal chegou a um plano cirúrgico de anestesia (marcando para o reflexo toe-pitada, freqüência respiratória e profundidade e regularidade da respiração). Remover os pêlos da região do couro cabeludo, que vai ser objecto de incisão e desinfectar o couro cabeludo com 3 esfrega alternadas de cada betadine e álcool ou soro fisiológico estéril. Seguros e posicionar o animal no fram estereotáxicae.
  2. Use circulam almofadas de água quente para manter a temperatura do corpo do animal em um nível ideal. Aplique lubrificante ocular para os olhos do animal para proteger contra o ressecamento.
  3. Use as seguintes coordenadas estereotáxica para direccionar a ATN (Anterior núcleo talâmico): anterioposterior -1,6 mm, 1,5 mm e mediolateral dorsoventral 5,2 milímetros 1.
    NOTA: As coordenadas estereotáxicas são baseadas no Paxinos e Watson (6 th edition) atlas cerebral de rato 36.
  4. Realizar uma incisão no escalpe sagital para revelar o crânio. Utilizando um par de afastadores proteger o couro cabeludo incisão para expor o crânio. Use soro fisiológico estéril para lavar a incisão. Se a incisão é muito úmido, use cotonetes estéreis para secar. Localize o bregma e marcar com um marcador preto. Para orientar a posição dos furos de rebarba, tornar mais duas marcas em aproximadamente 1,5 mm mediolaterally em ambos os lados da sutura sagital e 1,6 mm posterior ao coronai sutura.
  5. Use uma broca de mão para fazer os furos Burr. Certifique-se a ponta do orifício de trepanação é estéril, esterilizando-o com etanol. Segure a furadeira em cerca de um ângulo de 45 ° para a superfície do crânio quando a perfuração. Alterna com freqüência entre os dois orifícios da rebarba para evitar o calor excessivo no local de qualquer orifício de trepanação.
  6. Continuar até perfuração da dura-máter está exposta. Usando uma agulha com a ponta dobrada lembrando a forma de um 'L', remova quaisquer pedaços de osso que possa dificultar a inserção do eletrodo. Tome cuidado para não danificar a dura e / ou tecido cerebral subjacente ao remover fragmentos de ossos utilizando a agulha torta.
    NOTA: Usando uma agulha embotada ou pinça sem corte finas também é uma opção.
  7. Fixar o conjunto de eléctrodo duplo para a pega rotativa da moldura estereotáxica e fixar a pega a um ângulo de 90 °. Usando os ajustes no quadro estereotáxico, posicione o eletrodo à esquerda exatamente acima do bregma.
  8. Usando o aparelho de somajustes táticos para posicionamento mediolateral, mover precisamente o eléctrodo de 1,5 mm a esquerda do lado esquerdo da bregma de tal modo que agora existem dois eléctrodos perfeitamente alinhadas ao longo da sutura coronária mas espaçadas em 1,5 milímetros mediolaterally do bregma.
  9. Usando os ajustes estereotaxia anterioposterior, mova os eletrodos 1,6 milímetros posterior à sutura coronal.
  10. Use os ajustes dorsoventrais para diminuir os eletrodos para primeiro verificar se os furos burr foram feitas no local certo de tal modo que os eletrodos podem ser inseridos com facilidade, sem tocar as arestas dos furos Burr. Se assim for, inserir os eléctrodos a uma profundidade de 5,2 mm a partir da superfície do crânio.
  11. Conecte-se os eletrodos através leva a um estimulador fixado em 130 Hz, 2,5 V e 90 ms pulsewidth 1.
  12. Proporcionar alta frequência de estimulação durante uma hora (ou durante um período de tempo desejado conforme a configuração experimental). Durante o curso da estimulação, p lembrar assegurarprofundidade anestésica roper regularmente, verificando a ausência de retirada da pata em resposta a uma pitada dedo do pé. Suplemento anestesia com aproximadamente metade da dose inicial utilizada para induzir a anestesia. Evitar a contaminação de suas luvas estéreis durante a verificação da profundidade anestésica e alterá-las se necessário. Realizar estimulação unilateral ou bilateral com base nas necessidades experimentais de um. Incluir controles, como a baixa freqüência de estimulação (por ex., 10 Hz) e animais não estimuladas (inserindo eletrodos sem estimulação subsequente).
  13. Após a estimulação estiver pronto, retire os eletrodos com cuidado e suturar a incisão com 3-0 ou com grampos cirúrgicos estéreis.
  14. Administrar buprenorfina (0,05 mg / kg) por via subcutânea, a analgesia. Monitorar o animal até que ele retorne à atividade normal e, em seguida, devolvê-lo à instalação de alojamento.
  15. Depois de um período de tempo definido com base no design experimental (por exemplo: 0, 3, 6 ou 12 horas após a cirurgia DBS), Eutanásia do animal com anestesia overdose. Depois de confirmar a ausência de sinais vitais, decapitar o animal.
  16. Dissecar o cérebro, primeiro removendo a pele com uma tesoura. Cortar o osso ao longo da sutura sagital usando tesouras de dissecação. Faça mais duas incisões (cerca de um centímetro cada) através do osso em ambos os lados laterais. Usando fórceps, levantar a peça cortada parcialmente de osso a partir do topo do crânio para expor o cérebro.
  17. Usando uma tesoura fina ou fórceps, desalojar o cérebro do crânio e transferir para uma placa de Petri com PBS frio no gelo.
    NOTA: Tome cuidado para evitar danos ao cérebro ao fazer as incisões através do osso.

3. Hippocampus Isolation

NOTA: Faça todos os passos subsequentes nesta seção no gelo.

  1. Coloque o cérebro em uma matriz de acrílico cérebro pré-resfriado em gelo. Usando uma lâmina de barbear, cortar o cérebro coronally em cerca de 7-8 mm do anterior mais-edge do cérebro. Faça um segundo corte coronal e posterior ao primeiro corte de tal forma que uma fatia do cérebro cerca de 5 mm de espessura pode ser removido.
  2. Transferir a fatia de cérebro para uma placa de Petri com PBS gelado. Usando lâmina de barbear, cortar as duas seções hemisféricas e tomar o cuidado de observar qual hemisfério corresponde aos lados esquerdo e direito, respectivamente. Isto é especialmente importante durante a execução de estímulos unilaterais.
  3. Usando uma pinça fina e tesouras remover o hipocampo cuidadosamente.
  4. O Flash congelar o tecido do hipocampo em gelo seco e armazenar em freezer -20 ° C até que esteja pronto para as etapas de extração de RNA subsequentes.
    NOTA: Para o armazenamento a longo prazo, é aconselhável armazenar amostras de tecido em um congelador a -80 ° C.

4. Extração de RNA e PCR quantitativa

  1. Certifique-se que o tecido permanece congelado em gelo seco até que esteja pronto para a homogeneização.
  2. NOTA: Execute esta etapa no capô.
    1. Adicionar 1 ml de reagente Tri para Hippocampal tecido num tubo de centrífuga de 1,5 ml, e homogeneizar por pipetagem primeira várias vezes até que o tecido está dividido em peças mais pequenas. Além disso homogeneizar o tecido passando através de uma seringa com uma agulha de 25 G até que não há tecido ininterrupta visível. Execute as etapas de homogeneização no gelo.
    2. Após a homogeneização do tecido, permite a suspensão de células em repouso à temperatura ambiente durante 5 min para permitir a lise celular.
      NOTA: Findo este período a suspensão celular pode ser rapidamente congeladas e armazenadas em -70 ° C até posterior processamento.
  3. Adicionar 0,2 ml de clorofórmio e misturar em vortex durante 20 segundos e deixar a solução restante à temperatura ambiente durante 15 min.
  4. Centrifuga-se as amostras a 12.000 xg durante 15 min a 4 ° C. Após a centrifugação, remover os tubos com cuidado, sem perturbar as três camadas separadas que serão visíveis.
    NOTA: A fase inferior (vermelho) contém proteínas, fase nublado meio contém DNA eo topo fase clara contém RN / D.
  5. Transferir a fase superior clara (ARN) em 1,5 ml de um novo tubo de centrífuga (tipicamente 500 ul da fase contendo ARN é obtido). Para este adicionar 0,5 ml isopropanol e misture por vórtex. Para este adicionar 2-3 ul de glicogénio (20 mg / ml) como o veículo para o RNA. Deixar a amostra para descansar sobre a mesa à temperatura ambiente durante 10 min.
  6. Centrifuga-se a amostra a 12.000 xg durante 1 hora a 4 ° C. Certifique-se de que o sedimento de ARN é visível na parte inferior do tubo.
  7. Descartar o sobrenadante e lavar o sedimento de ARN por adição de 1 ml de etanol a 75% (feito com água livre de nuclease). Inverta a amostra várias vezes até que o sedimento que se desprende da parte inferior do tubo e flutua na solução. Centrifuga-se a solução a 12000 xg durante 10 min a 4 ° C.
    NOTA: O sedimento em etanol a 75% pode ser armazenado a -20 ° C até serem medidas adicionais.
  8. Permitir que o sedimento de ARN para ar seco, deixando os tubos abertos para 5 min à temperatura ambiente. Tome precauções para evitar over secagem do sedimento como esta pode afectar a sua dissolução em água no passo subsequente.

5. Remover DNA a partir da preparação RNA

  1. Adicionar 9 mL de água livre de nuclease ao sedimento RNA e certifique-se o pellet é dissolvido antes de prosseguir em vortex suavemente o tubo. Para este adicionar 1 ml de Tampão de 10x ADNase I e 1 ul de ADNase recombinante (a partir de ADNase I kit), misturar sacudindo suavemente os tubos, giram brevemente os tubos e incubar a 37 ° C em banho-maria durante 30 min.
  2. Adicionar 2 mL de reagente de inactivação de DNase (a partir de ADNase I kit) para a amostra e incubar à temperatura ambiente durante 2 min e misturar frequentemente sacudindo suavemente o tubo. Centrifugar a 12.000 xg durante 10 min e transferência aproximadamente 10 ul de sobrenadante límpido para um novo tubo de centrífuga de 1,5 ml.
  3. Medir a concentração de ARN utilizando um espectrofotómetro ou NanoDrop.

6. Fazendo ADNc a partir de ARN

  1. Adicionar th volume necessárioem contém 1 mg de RNA e levar o volume total de 8 mL por adição de água livre de nuclease. Para isso, adicione 1 mL 10 mM dNTP misturar e 1 ml de hexâmeros aleatórios do Kit sobrescrito First Strand Synthesis. Misturar suavemente e incuba-se a 65 ° C durante 5 min em qualquer um banho de água ou em um termociclador pré-programado.
  2. Fazer uma pré-mistura contendo os seguintes reagentes: 2 ul de Tampão 10 x RT, 4 mL de 25 M de MgCl2, 2 ul de DTT 0,1 M e 1 uL de RNAse FORA (40 U / ul).
    NOTA: Os volumes indicados são por reação, o usuário precisaria escalar de acordo com sua necessidades experimentais.
  3. Após a remoção da amostra contendo ARN de 65 ° C, ajustar o tubo à temperatura ambiente durante um minuto. Adicionar a solução de pré-mistura 9 ul e incubar à temperatura ambiente durante 2 min. Adicionar 1 ml de enzima transcriptase reversa Superscript II (50 U / ul) e, em seguida incubar à temperatura ambiente durante 10 min.
  4. Incubar as amostras a 42 ° C durante 50min para a transcrição inversa ocorra.
  5. Incubar as amostras a 70 ° C durante 15 minutos para terminar a reacção.
  6. Coloque as amostras em gelo e brevemente adicionar 1 ul ARNaseH (2 U / ul) e incubar a 37 ° C durante 20 min.
  7. Resumidamente centrifugar os tubos a 3000 xg de girar o líquido condensado.
    NOTA: Este é o ADNc que será utilizada para a PCR quantitativa. cDNA pode ser armazenado no congelador a -20 ° C até que a configuração de PCR. cDNA também pode ser diluído com água isenta de nuclease antes de prosseguir para a PCR.

7. PCR quantitativa

  1. Faça uma mistura mestre contendo os seguintes reagentes (volumes indicados são por reacção): 6,3 l de 2x Sybr Mix Verde, 0,6 l de Adiante Primer (10 mM), 0,6 l de primer reverso (10 mM) e 0,5 mL de água livre de nuclease .
    NOTA: Projeto Primer foi feito usando o 'Escolha Primers "opção em página sequência de nucleotídeos do NCBI para o gene de interesse.
  2. Adicionar 10 ul mastermix a cada poço de uma placa de PCR de 96 bem. Adicionar 2,5 uL de ADNc feitas anteriormente para o poço que contém o mastermix. Certifique-se de criar reações de PCR em triplicado para cada amostra.
  3. Depois de se completar a adição de mastermix e ADNc, cobrir a placa de PCR, utilizando uma folha adesiva óptica para vedar os poços. Girar a placa brevemente durante 5 min a 500 xg numa centrifugadora de bancada para resolver tudo o líquido para o fundo do poço.
  4. Carregue a placa de PCR numa máquina de RT-PCR pré-programado. Use os parâmetros de PCR previstas na Tabela 1.
  5. A análise dos dados: Use os valores C t da saída qPCR para outros cálculos. Junto com o gene teste, criado reações de PCR para os genes de controlo interno, 18S rRNA (para garantir a igualdade de entrada) e β-actina (controle negativo). Calcule mudanças vezes com base no método de ΔΔCt 37.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

As Figuras 1A e 1B mostram a expressão relativa de BDNF e GABRD em relação ao controlo do gene da β-actina. BDNF, uma neurotrofina é freqüentemente associada com efeitos neuroprotetores em muitas doenças neuronais 38-41. Por isso, é interessante analisar o perfil de BDNF expressão em resposta à estimulação da ATN que rende benefícios terapêuticos para doentes epilépticos. Na Figura 1A, que mostra o perfil de expressão gênica de BDNF entre os pontos temporais indicados postar estimulação DBS, BDNF-regulação é observado imediatamente (0 h) após a cirurgia DBS juntamente com a expressão de pico (3 vezes maior do que não estimulada) a 3 hr estimulação post. Esta observação sugere que a expressão aumentada de BDNF e a neuroprotecção resultante pode contribuir para o benefício terapêutico do DBS. Outra GABRD gene (Figura 1B) também foi investigado usando o método qPCR. GABRD é um receptor de GABA branch é um dos potenciais alvos para a concepção de medicamentos anti-epilépticos 42. O perfil de expressão GABRD também mostra a expressão aumentada em animais estimulados em comparação aos animais de controlo não estimuladas em 3 hr pós DBS. Considerando-se que os agonistas GABA são usados ​​como supressores apreensão eficazes, é interessante observar reforçada GABRD expressão pós DBS, implicando um possível papel para GABA no efeito anti-epiléptico de DBS.

O protocolo de RT-PCR descrito aqui produz resultados reprodutíveis e quantitativos que revelam padrões de expressão gênica e as diferenças dobra relativa em comparação com os animais do grupo controle. A análise de dados é realizada da seguinte maneira: A produção de qPCR dá o valor limiar T C para o gene de teste para cada amostra analisada. Valores C T também são obtidos para o gene controle β-actina e 18S rRNA (controle de entrada). O método ΔΔC t vai então ser utilizada para calcular a expr geneperfil essão usando esses C t valoriza 37. Por exemplo, para calcular as alterações da expressão do gene para o BDNF, para uma dada amostra, a diferença entre o valor C T para o BDNF e o 18S ARNr é calculado e representa a primeira ôc t. Para a mesma amostra, a diferença entre o valor C T para β-actina e 18S rRNA é calculado para obter a segunda ôc t. A diferença entre os dois valores ôc t é calculado para obter ΔΔC t. Este valor t ΔΔC é usado para calcular a 2 ^ (-ΔΔC t) que dá a abundância relativa de modelo para o BDNF em comparação com β-actina. Ao traçar esse valor entre os diferentes pontos de tempo ao lado do controlo não estimulado, as mudanças de expressão de genes induzidos por DBS através de pontos de tempo pode ser visualizada. O método acima descrito pode ser utilizado eficazmente para investigar mudanças na expressão de outros genes que são potencial cândidoates que respondem à estimulação DBS e para investigar alguns dos efeitos a jusante de modular a expressão destes genes.

Figura 1
Figura 1: análise de curso (A) Tempo de expressão do BDNF em resposta à estimulação da ATN alta frequência. A colheita de tecido, extracção do ARN, ADNc e preparação q-PCR foram realizadas como se explicou no protocolo. Mudanças relativas de expressão do gene são calculadas após normalização para a entrada (por amplificar 18S ARNr), bem como um gene de controlo (β-actina). Valores de C T obtidos a partir do PCR em tempo real foram usadas para calcular os níveis de expressão pelo método ΔΔ C 37 t. O prazo-pontos analisados ​​são de 0, 3, 6 e 12 horas após DBS estimulação. Nota: Os instantes selecionados aqui são com relação a um estudo particular e está sujeita a alterações de acordo com o HYpothesis e plano experimental. (B) Curso de Análise de Tempo de GABA A subunidade delta receptor (GABRD) níveis de resposta às DBS a 130 Hz visando a ATN. Métodos e cálculos foram feitos como semelhantes aos dados de BDNF.

Figura 2
Figura 2: eletrodos DBS e estimulador de configurar.

PCR Cycles
Fase 1: A desnaturação inicial 95 ° C 15 min
Fase 2: A desnaturação 95 ° C 15 seg
Recozimento 60 ° C 30 seg
Extensão 72 ° C 30 seg
40 ciclos de Passo 2
Nota: A temperatura de emparelhamento varia de acordo com o
temperatura de fusão do iniciador. Primers são normalmente concebidos
para ter uma temperatura de recozimento óptima de 60 ° C

Tabela 1: Parâmetros de PCR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Após o trabalho de Marco por Benabid et al. Em usar estimulação cerebral profunda para tratar a doença de Parkinson e tremor essencial, a técnica cirúrgica DBS foi investigado com muito interesse ao longo da última década para tratar vários distúrbios neurológicos 6,10,43. DBS estudos que visam várias regiões neuro-anatômica dos circuitos cerebrais são atualmente realizados por vários grupos para abordar as principais doenças neuronais e estão em várias fases de ensaios clínicos. A estimulação do núcleo subtalâmico (STN) ou o segmento interno do globo pálido (GPI) está aprovado pela FDA e utilizado no tratamento de perturbações do movimento na doença de Parkinson 10. O ensaio clínico SANTE mostrou tendências promissoras para pacientes epilépticos que receberam alta estimulação do núcleo talâmico anterior 31 frequência. Os resultados de um ensaio clínico de fase I de estimulação forniceal bilateral mostraram um atraso na velocidade de declínio cognitivo e uma reversal da captação de glicose hipometab�ico visto na doença de Alzheimer, bem como a activação do circuito de memória 8,44. Além disso, nos últimos anos neurocirurgiões realizaram ensaios DBS para o tratamento de distúrbios neuropsiquiátricos, como TOC (Transtorno Obsessivo Compulsivo), depressão resistente ao tratamento, a síndrome de Tourette e dependência 10,45-55.

Para além dos ensaios clínicos, ao longo dos últimos anos, a cirurgia de animais nos ofereceu grandes oportunidades para estudar as alterações fisiológicas induzidas pela técnica cirúrgica em um animal vivo, de uma forma sem precedentes por qualquer técnica in vitro. Neste manuscrito, nós discutimos os métodos envolvidos na realização de cirurgia de estimulação cerebral profunda em roedores. Cirurgia estereotáxica em roedores, como aqui descritos também podem ser utilizados para pesquisas alvo potenciais DBS e para testar a eficácia da cirurgia utilizando modelos animais da doença. Um dos desafios para o experimentador here é para ser capaz de atingir o locus anatómico correcta de uma maneira reprodutível. Há especialmente a necessidade de um técnico qualificado para a cirurgia, porque a verificação de direcionamento correto só é possível após a estimulação é feita e se o animal sacrificados. Além disso, ocasionalmente, pode ferir acidentalmente um vaso sanguíneo chave que poderia levar à perda significativa de sangue e às vezes até mesmo a morte do animal. Além disso, a necessidade de dissecar o hipocampo para posterior análise bioquímica limita a possibilidade de verificação imuno eléctrodo para direccionamento correcto no mesmo animal que requer um espécime do cérebro intacto para o corte do tecido. Segmentação adequada eletrodo poderia ser verificada em um animal diferente estimulado de forma idêntica. No entanto, este não apresenta quaisquer elementos para direccionamento correcto no animal de teste e é uma limitação desta abordagem. Publicações recentes têm tentado contornar este problema através da realização de cirurgia DBS com simultaneous fMRI 56. Uma melhoria possível da técnica descrita aqui pode ser um estudo sobre os efeitos da estimulação crónica através de um estimulador implantado no animal. No entanto, limitamos nossas análises para uma dose única (1 hr) de estimulação de alta frequência como o primeiro passo para a compreensão das alterações induzidas pelo DBS a um nível celular.

Considerando-se a utilização de cirurgia de DBS para uma variedade de distúrbios neuronais, é essencial que sabemos que o mecanismo envolvido nos efeitos benéficos do DBS. Esta informação é fundamental para o desenvolvimento de futuras melhorias na cirurgia e também para explorar a utilidade do DBS como um tratamento para outras condições que não foram investigadas por especialistas em DBS. Além disso, modificações na técnica cirúrgica pode ser implementada para evitar certos efeitos colaterais deletérios do procedimento e para lidar efetivamente com a recorrência da condição de doença.

Um mecanicista ana em profundidadelise de DBS é possível examinando as alterações de expressão de gene induzida por DBS. Ou uma abordagem gene candidato com base no conhecimento existente sobre vias neuronais que respondem a despolarização estímulos, como a estimulação de alta frequência, ou uma análise de transcriptoma global pode dar importantes insights sobre os eventos moleculares desencadeados por DBS. As técnicas de análise de expressão gênica (abordagem gene candidato, bem como método de alto rendimento) são ferramentas poderosas que são fundamentais para explorar os mecanismos moleculares e alterações celulares associados com a cirurgia DBS. Os recentes desenvolvimentos nesta área tornaram possível para nós para obter uma riqueza de informações sobre vários aspectos da fisiologia celular em um tempo muito curto, o que não era possível há alguns anos atrás. Com o advento da tecnologia de sequenciação de elevado rendimento, tais como ChIPseq, é possível caracterizar o local de factores de transcrição importantes, que respondem a DBS 57,58 todo o genoma. Recentes descobertas que ligam não-coding RNA como microRNA com doenças neurodegenerativas, permitir-nos de analisar possíveis mudanças nos níveis de miRNA em neurônios pós-DBS usando miRNA tecnologia de sequenciamento 59,60. Possíveis mudanças nas assinaturas epigenéticos de metilação e histonas modificações tais DNA em resposta a DBS também pode ser explorado. No entanto, apesar das vantagens, é importante reconhecer algumas das limitações destas técnicas, bem como problemas potenciais que podem surgir durante a análise. Uma preocupação importante com a expressão do gene análises tem sido a reprodutibilidade e erros técnicos. É importante que o pesquisador toma nota desta e planeja ter número adequado de repetições para garantir a confiabilidade. Um problema comum com alguns dos estudos de rastreio de alto rendimento tem sido a dificuldade na interpretação da enorme quantidade de dados que é gerado. Por vezes, torna-se importante determinar se as alterações de expressão de genes são observadas, devido ao efeito directodo tratamento experimental ou um efeito a jusante. Isso geralmente requer estudos adicionais que são projetados para resolver esta questão.

Além dos estudos genômicos, uma extensa análise imuno-histoquímica da localização espaço-temporal dos principais jogadores que respondem a DBS e uma quantificação das alterações em seus níveis em várias regiões do cérebro será um grande trunfo para a evolução futura do procedimento cirúrgico DBS. Os resultados cumulativos decorrentes da expressão gênica análises, bem como os estudos de imuno-histoquímica pode revelar novas interações entre fatores-chave, bem como eventos moleculares fundamentais que regulam processos celulares como neurogênese ou neurodegeneração. A identificação de tais marcadores moleculares críticos podem também permitir futuras descobertas de drogas. Tais resultados poderiam lançar luz sobre o funcionamento geral dos circuitos cerebrais, o que é uma informação valiosa a partir da perspectiva dos cientistas que trabalham para compreender o homemdoenças neuronais y. Direção nossos futuros esforços na integração de avanços tecnológicos mais recentes feitas na clínica, bem como o laboratório é provável que nos oferecem vantagens substanciais na nossa luta contra a doença.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Deep Brain Stimulation Surgery
Stereotactic frame Kopf Instruments Model 900
Drill  Dremmel 7700, 7.2 V
Scalpel BD 372610
Ketamine Patterson Veterinary 07-803-6637 Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules
Xylazine Patterson Veterinary 07-808-1947
Buprenorphine Patterson Veterinary 07-850-2280 Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules
Surgical staples ConMed Corporation 8035
Sutures (3-0)  Harvard Apparatus 72-3333
Syringe (1 ml, 29 1/2 G) BD 329464 Sterile, use for Anesthesia administration intraperitoneally
Syringe (3 ml, 25 G) BD 309570 Sterile, use for Analgesia administration subcutaneously
Needles BD 305761 Sterile, use for clearing broken bone pieces from the burr holes
Ethanol Fisher Scientific S25309B Use for general sterilization 
Eye Lubricant Fisher Scientific 19-898-350
Stimulator Medtronic Model 3628
DBS electrodes Rhodes Medical Instruments, CA SNEX100x-100 mm Electrodes are platinum, concentric and bipolar
Betadine (Povidone-Iodine)  PDI S23125 Single use swabsticks, use for sterilizing the scalp before making incision 
 Brain Dissection and Hippocampal tissue isolation
Acrylic Rodent Brain Matrix Electron Microscopy Sciences 175-300 www.emsdiasum.com
Razor Blade V W R 55411-050
Guillotine Scissors Clauss 18039 For decapitation, make sure these scissors are maintained in clean and working condition
Scissors Codman Classic 34-4098 Use for removing the brain from the skull
Forceps Electron Microscopy Sciences 72957-06 Use for removing the brain from the skull and for handling during dissection
Phosphate Buffered Saline  Boston Bioproducts BM-220
 RNA Extraction and cDNA Preparation
Tri Reagent Sigma T9424 Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin
Syringe (3 ml, 25 G) BD 309570 Use for tissue homogenization
Chloroform Fisher Scientific BP1145-1 Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin
Isopropanol Fisher Scientific A416-1
Glycogen Thermo Scientific R0561
Dnase I Kit Ambion AM1906
Superscript First Strand Synthesis Kit Invitrogen 11904-018
Tabletop Microcentrifuge Eppendorf 5415D
 Quantitative PCR               
SYBR Green PCR Kit Qiagen 204143
Custom Oligos Invitrogen 10668051
PCR Plates (96 wells) Denville Scientific C18080-10
Optical Adhesive Sheets Thermo Scientific AB1170
Nuclease free Water Thermo Scientific SH30538-02
Real Time PCR Machine Applied Biosystems 7500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Toda, H., Hamani, C., Fawcett, A. P., Hutchison, W. D., Lozano, A. M. The regulation of adult rodent hippocampal neurogenesis by deep brain stimulation. Journal of. 108, 132-138 (2008).
  2. Perlmutter, J. S., Mink, J. W. Deep brain stimulation. Annual review of neuroscience. 29, 229-257 (2006).
  3. Bergstrom, M. R., Johansson, G. G., Laitinen, L. V., Sipponen, P. Electrical stimulation of the thalamic and subthalamic area in cerebral palsy. Acta physiologica Scandinavica. 67, 208-213 (1966).
  4. Benabid, A. L., et al. Chronic electrical stimulation of the ventralis intermedius nucleus of the thalamus as a treatment of movement disorders. Journal of neurosurgery. 84, 203-214 (1996).
  5. Benabid, A. L., et al. Long-term electrical inhibition of deep brain targets in movement disorders. Movement disorders : official journal of the Movement Disorder Society. 13, Suppl 3. 119-125 (1998).
  6. Benabid, A. L., et al. Long-term suppression of tremor by chronic stimulation of the ventral intermediate thalamic nucleus. Lancet. 337, 403-406 (1991).
  7. Tierney, T. S., Lozano, A. M. Surgical treatment for secondary dystonia. Movement disorders : official journal of the Movement Disorder Society. 27, 1598-1605 (2012).
  8. Tierney, T. S., Sankar, T., Lozano, A. M. Some recent trends and further promising directions in functional neurosurgery. Acta neurochirurgica. Supplement. 117, 87-92 (2013).
  9. Tierney, T. S., Sankar, T., Lozano, A. M. Deep brain stimulation emerging indications. Progress in brain research. 194, 83-95 (2011).
  10. Sankar, T., Tierney, T. S., Hamani, C. Novel applications of deep brain stimulation. Surgical neurology international. 3, S26-S33 (2012).
  11. Tierney, T. S., Vasudeva, V. S., Weir, S., Hayes, M. T. Neuromodulation for neurodegenerative conditions. Frontiers in bioscience. 5, 490-499 (2013).
  12. Mayberg, H. S., et al. Deep brain stimulation for treatment-resistant depression. Neuron. 45, 651-660 (2005).
  13. Lyons, M. K. Deep brain stimulation: current and future clinical applications. Mayo Clinic proceedings. 86, 662-672 (2011).
  14. Ch. 4. Rehabilitation in movement disorders. Lansek, R., Morris, M. E. , Cambridge University Press. 36-43 (2013).
  15. Goodwin, R., Tierney, T., Lenz, F., Anderson, W. Ch. 15. Single Neuron Studies of the Human Brain: Probing Cognition. Fried, I., Rutishauser, U., Cerf, M., Kreiman, G. 15, MIT Press. 275-293 (2014).
  16. Hauser, W. A. Epidemiology of epilepsy in children. Neurosurgery clinics of North America. 6, 419-429 (1995).
  17. Hauser, W. A. Recent developments in the epidemiology of epilepsy. Acta neurologica Scandinavica. Supplementum. 162, 17-21 (1995).
  18. Davis, R., Emmonds, S. E. Cerebellar stimulation for seizure control: 17-year study. Stereotactic and functional neurosurgery. 58, 200-208 (1992).
  19. Levy, L. F., Auchterlonie, W. C. Chronic cerebellar stimulation in the treatment of epilepsy. Epilepsia. 20, 235-245 (1979).
  20. Velasco, A. L., et al. Electrical stimulation of the hippocampal epileptic foci for seizure control: a double-blind, long-term follow-up study. Epilepsia. 48, 1895-1903 (2007).
  21. Tellez-Zenteno, J. F., McLachlan, R. S., Parrent, A., Kubu, C. S., Wiebe, S. Hippocampal electrical stimulation in mesial temporal lobe epilepsy. Neurology. 66, 1490-1494 (2006).
  22. Kerrigan, J. F., et al. Electrical stimulation of the anterior nucleus of the thalamus for the treatment of intractable epilepsy. Epilepsia. 45, 346-354 (2004).
  23. Hamani, C., et al. Deep brain stimulation of the anterior nucleus of the thalamus: effects of electrical stimulation on pilocarpine-induced seizures and status epilepticus. Epilepsy research. 78, 117-123 (2008).
  24. Hamani, C., et al. Bilateral anterior thalamic nucleus lesions and high-frequency stimulation are protective against pilocarpine-induced seizures and status epilepticus. Neurosurgery. 54, 191-195 (2004).
  25. Mirski, M. A., Rossell, L. A., Terry, J. B., Fisher, R. S. Anticonvulsant effect of anterior thalamic high frequency electrical stimulation in the rat. Epilepsy research. 28, 89-100 (1997).
  26. Mirski, M. A., Ferrendelli, J. A. Interruption of the mammillothalamic tract prevents seizures in guinea pigs. Science. 226, 72-74 (1984).
  27. Mirski, M. A., Ferrendelli, J. A. Anterior thalamic mediation of generalized pentylenetetrazol seizures. Brain research. 399, 212-223 (1986).
  28. Mirski, M. A., Ferrendelli, J. A. Interruption of the connections of the mammillary bodies protects against generalized pentylenetetrazol seizures in guinea pigs. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 7, 662-670 (1987).
  29. Mirski, M. A., McKeon, A. C., Ferrendelli, J. A. Anterior thalamus and substantia nigra: two distinct structures mediating experimental generalized seizures. Brain research. 397, 377-380 (1986).
  30. Lee, K. J., Jang, K. S., Shon, Y. M. Chronic deep brain stimulation of subthalamic and anterior thalamic nuclei for controlling refractory partial epilepsy. Acta neurochirurgica. Supplement. 99, 87-91 (2006).
  31. Fisher, R., et al. Electrical stimulation of the anterior nucleus of thalamus for treatment of refractory epilepsy. Epilepsia. 51, 899-908 (2010).
  32. Encinas, J. M., Hamani, C., Lozano, A. M., Enikolopov, G. Neurogenic hippocampal targets of deep brain stimulation. The Journal of comparative neurology. 519, 6-20 (2011).
  33. Hattiangady, B., Rao, M. S., Shetty, A. K. Chronic temporal lobe epilepsy is associated with severely declined dentate neurogenesis in the adult hippocampus. Neurobiology of disease. 17, 473-490 (2004).
  34. Kuruba, R., Hattiangady, B., Shetty, A. K. Hippocampal neurogenesis and neural stem cells in temporal lobe epilepsy. Epilepsy & behavior : E&B. 14, Suppl 1. 65-73 (2009).
  35. Hattiangady, B., Shetty, A. K. Implications of decreased hippocampal neurogenesis in chronic temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 49, Suppl 5. 26-41 (2008).
  36. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Elsevier Inc. (2007).
  37. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 22DDCT Method. METHODS. 25, 402-408 (2001).
  38. Kells, A. P., et al. AAV-mediated gene delivery of BDNF or GDNF is neuroprotective in a model of Huntington disease. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 9, 682-688 (2004).
  39. Han, B. H., Holtzman, D. M. BDNF protects the neonatal brain from hypoxic-ischemic injury in vivo via the ERK pathway. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 20, 5775-5781 (2000).
  40. Hetman, M., Kanning, K., Cavanaugh, J. E., Xia, Z. Neuroprotection by brain-derived neurotrophic factor is mediated by extracellular signal-regulated kinase and phosphatidylinositol 3-kinase. The Journal of biological chemistry. 274, 22569-22580 (1999).
  41. Stadelmann, C., et al. BDNF and gp145trkB in multiple sclerosis brain lesions: neuroprotective interactions between immune and neuronal cells. Brain : a journal of neurology. 125, 75-85 (2002).
  42. Treiman, D. M. GABAergic mechanisms in epilepsy. Epilepsia. 42, Suppl 3. 8-12 (2001).
  43. Benabid, A. L., Pollak, P., Louveau, A., Henry, S., de Rougemont, J. Combined (thalamotomy and stimulation) stereotactic surgery of the VIM thalamic nucleus for bilateral Parkinson disease. Applied neurophysiology. 50, 344-346 (1987).
  44. Laxton, A. W., et al. A phase I trial of deep brain stimulation of memory circuits in Alzheimer's disease. Annals of. 68, 521-534 (2010).
  45. Tierney, T. S., Abd-El-Barr, M. M., Stanford, A. D., Foote, K. D., Okun, M. S. Deep brain stimulation and ablation for obsessive compulsive disorder: evolution of contemporary indications, targets and techniques. The International journal of neuroscience. 124, 394-402 (2014).
  46. Kennedy, S. H., et al. Deep brain stimulation for treatment-resistant depression: follow-up after 3 to 6 years. The American journal of psychiatry. 168, 502-510 (2011).
  47. Lozano, A. M., et al. Subcallosal cingulate gyrus deep brain stimulation for treatment-resistant depression. Biological psychiatry. 64, 461-467 (2008).
  48. Ackermans, L., et al. Double-blind clinical trial of thalamic stimulation in patients with Tourette syndrome. Brain : a journal of neurology. 134, 832-844 (2011).
  49. Houeto, J. L., et al. Tourette's syndrome and deep brain stimulation. Journal of neurology, neurosurgery, and psychiatry. 76, 992-995 (2005).
  50. Maciunas, R. J., et al. Prospective randomized double-blind trial of bilateral thalamic deep brain stimulation in adults with Tourette syndrome. Journal of neurosurgery. 107, 1004-1014 (2007).
  51. Koning, P. P., Figee, M., van den Munckhof, P., Schuurman, P. R., Denys, D. Current status of deep brain stimulation for obsessive-compulsive disorder: a clinical review of different targets. Current psychiatry reports. 13, 274-282 (2011).
  52. Greenberg, B. D., et al. Deep brain stimulation of the ventral internal capsule/ventral striatum for obsessive-compulsive disorder: worldwide experience. Molecular psychiatry. 15, 64-79 (2010).
  53. Muller, U. J., et al. Successful treatment of chronic resistant alcoholism by deep brain stimulation of nucleus accumbens: first experience with three cases. Pharmacopsychiatry. 42, 288-291 (2009).
  54. Zhou, H., Xu, J., Jiang, J. Deep brain stimulation of nucleus accumbens on heroin-seeking behaviors: a case report. Biological psychiatry. 69, e41-e42 (2011).
  55. Porta, M., et al. Thalamic deep brain stimulation for treatment-refractory Tourette syndrome: two-year outcome. Neurology. 73, 1375-1380 (2009).
  56. Younce, J. R., Albaugh, D. L., Shih, Y. Y. Deep brain stimulation with simultaneous FMRI in rodents. Journal of visualized experiments : JoVE. , e51271 (2014).
  57. Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature reviews. Genetics. 10, 669-680 (2009).
  58. Valouev, A., et al. Genome-wide analysis of transcription factor binding sites based on ChIP-Seq data. Nature methods. 5, 829-834 (2008).
  59. Fiore, R., Siegel, G., Schratt, G. MicroRNA function in neuronal development, plasticity and disease. Biochimica et biophysica acta. 1779, 471-478 (2008).
  60. Hebert, S. S., De Strooper, B. Alterations of the microRNA network cause neurodegenerative disease. Trends in neurosciences. 32, 199-206 (2009).

Tags

Neuroscience Edição 97 núcleo talâmico anterior estimulação cerebral profunda giro dentado hipocampo a epilepsia a expressão do gene a estimulação de alta frequência RT-PCR quantitativo
Análise das Alterações Gene expressão no Rat Hippocampus Após Estimulação Cerebral Profunda do Anterior Thalamic Nucleus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Selvakumar, T., Alavian, K. N.,… More

Selvakumar, T., Alavian, K. N., Tierney, T. Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus. J. Vis. Exp. (97), e52457, doi:10.3791/52457 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter