Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Анализ изменений экспрессии генов в гиппокампе крыс после глубокого мозга стимуляции передней ядра таламуса

Published: March 8, 2015 doi: 10.3791/52457
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Neurosurgery, Brigham & Women's Hospital, Harvard Medical School, 2Division of Brain Sciences, Department of Medicine, Imperial College London

Abstract

Глубокая стимуляция мозга (DBS) хирургии, целенаправленного воздействия на различные области мозга, такие как базальных ганглиев, таламуса и гипоталамических регионах, является эффективным средством для лечения ряда заболеваний опорно-двигательного которые не отвечают на лекарства. Недавний прогресс в области DBS хирургии начал распространить применение этого хирургического метода в других условий как разнообразны, как и патологическое ожирение, депрессии и обсессивно-компульсивного расстройства. Несмотря на эти расширения показаний, мало известно о лежащих в основе физиологических механизмов, которые способствуют благоприятные эффекты DBS хирургии. Один подход к этому вопросу, чтобы провести анализ экспрессии генов в нейронах, которые получают электрическую стимуляцию. Предыдущие исследования показали, что нейрогенез в зубчатой ​​извилине крысы это вызвало в DBS ориентации переднего ядра таламуса 1. DBS хирургии ориентации АТН широко используется для лечения рефрактерной эпилепсии. Таким образом, гораздо Interesт для нас, чтобы исследовать транскрипционные изменения, вызванные электрической стимуляцией АТН. В этой рукописи мы опишем наши методологии стереотаксически наведением DBS хирургии, нацеленной на ATN у взрослых самцов крыс линии Вистар. Мы также обсудим последующие шаги для рассечения тканей, выделения РНК, синтеза кДНК и количественного RT-PCR для измерения изменений экспрессии генов. Этот метод может быть применен и модифицированы для стимулирования базальных ганглиев и других областей мозга, обычно клинически целевой. Исследование экспрессии генов описаны здесь предполагает подход гена-мишени кандидата для знакомства с молекулярные игроков, которые могли бы быть направляющие механизма DBS.

Introduction

История за развитие Глубокая стимуляция мозга в нейрохирургической техники восходит к 1870, когда возможность электрической стимуляции схемы мозга была изучена 2. Использование хронической стимуляции высокой частоты как средства для лечения нервных расстройств началось в 1960-х годах 3. Затем в 1990-х годах с появлением хронической имплантации DBS электродов 4-6, количество нейронных нарушений, которые были обработаны с помощью DBS продолжает увеличиваться. Глубокая стимуляция мозга был впервые использован в США для лечения тремора 6. Сегодня хирургия широко используется для лечения нервных расстройств, которые в настоящее время не поддается лечению с помощью фармакологического вмешательства. DBS в настоящее время используется для лечения двигательных расстройств, болезни Паркинсона и дистонии 7-9. Типа деменции Альцгеймера, болезнь, эпилепсии, боли и психоневрологических заболеваний, таких депрессия Гентингтона, ОКР, синдром Туретта7, S синдром и наркомании некоторые из состояний, поддающихся лечению DBS 10-12. В то время как DBS хирургия FDA одобрен для лечения болезни Паркинсона, дистонии и эссенциальный тремор, использование DBS для лечения других условий, упомянутых выше, в различных стадиях лаборатории и клинических исследований, которые предлагают большое обещание для пациентов 13,14.

Клинически DBS операция проводится в два этапа. Первый этап включает в себя хирургическим позиционирования электродов DBS в целевой анатомической локализации с использованием комбинации радиационной позиционирования, КТ, МРТ, а также показания микроэлектродные для повышения точности. Второй этап включает в себя имплантацию генератор импульсов в верхней части грудной клетки пациента и установки удлинителей из головы к генератору импульсов. На основании неврологического состояния, несколько схем программирования для генератора импульсов были стандартизированы, и будет использоваться для доставки требуемого напряжения. Окончательный обТаге достигается ступенчато так, чтобы получить лучший клинический ответ при минимальном напряжении 15. Тем не менее, в наших исследованиях, в отличие от хронических имплантатов DBS используется в клинике, для простоты, мы прибегли к изучению одноразовый высокой частоты стимуляции (в течение 1 часа) в наших моделях животных.

Часть исследований нашей группы сосредоточена на исследовании использование DBS хирургии для лечения резистентной эпилепсии. Стереотаксические хирургические подходы с использованием высокочастотного стимуляции был исследован многими другими в качестве эффективного варианта для лечения медицинским огнеупорной эпилепсии, которая составляет около 30% всех инцидентов эпилепсии 10,16,17. Мозжечка стимуляция ориентации поверхности коры, а также глубоких мозжечка ядер были использованы в прошлом в качестве мишеней для лечения эпилепсии 10,18,19. Кроме того, гиппокамп стимуляции также пытались, но с переменным успехом 20,21. Некоторые из других исследованныхDBS цели при эпилепсии, включают в кору головного мозга, таламус, гипоталамический ядро и блуждающий нерв 8. Тем не менее, следующие результаты нескольких исследований, в последние несколько лет, передняя ядра таламуса (АТН) стала наиболее распространенной цели DBS для лечения эпилепсии 10,22. Опираясь на знания о нейроанатомической схемы и выводы из животных моделях, некоторые исследования были сосредоточены на терапевтический эффект глубокой стимуляции мозга АТН в лечении эпилепсии 23-26. АТН является частью лимбической цепи и находится в области мозга, которое поражает частоты приступов. Исследования Хамани и др., Проверили эффективность ATN-DBS в пилокарпина индуцированной эпилепсии модели и обнаружили, что двустороннее стимуляция ATN продлен задержки для пилокарпина, вызванных судорог и эпилептический статус 24. Кроме того, высокая частота стимуляции ATN приводит к снижению частоты приступов в Пентилентетразол (PTZ) модели EPilepsy 25,27-29. Ли и др., Сообщили среднее снижение частоты приступов на 75% при хронической глубокой стимуляции мозга в ATN в лечении огнеупорной парциальная эпилепсия 30.

Недавние клинические исследования по лечению резистентной эпилепсии показали многообещающие результаты после DBS хирургии, направленных на передней ядра таламуса (ATN) 22. Многоцентровое рандомизированное клиническое исследование с 110 пациентов, перенесших двустороннюю DBS в ATN для лечения огнеупорных эпилепсии (SANTE суда) показали снижение частоты приступов примерно на 40% 31. Результаты этого исследования также намекнул на задержки оптимального Противоэпилептические эффекта, наблюдаемого в 2-3 месяцев после операции. Дальнейшие исследования по Toda и др., Подтвержденные с этими выводами, где они показали, нейрогенез происходит в более позднее время поста DBS (дни 3-5) в животных моделях 1. Кроме того, Encinas и др., Сообщили гиппокампа neurogeneSIS в взрослых мышей зубчатой ​​извилине после высокочастотной стимуляции ATN 32. Предыдущие исследования 33-35 сообщали снижается гиппокампа нейрогенеза в некоторых эпилептических таких случаях, как хроническая височной эпилепсии лепестка и ассоциации с дефицитом обучения, ухудшение памяти и спонтанных периодических приступов двигателя. Кроме того, было снижение в нервных факторов стволовых клеток-предшественников, таких как FGF2 и IGF-1 в хронически эпилептического гиппокампа у животных моделей 33. Учитывая это, интервенционные стратегии, такие как DBS, которые показывают увеличение нейрогенеза в зубчатой ​​извилине захватывающие возможности для исследований. Эти данные побудили нас исследовать дальше глубоко в механизм, лежащий лечения нейрогенез после DBS эпилепсии. Мы нацелены АТН как в одностороннем порядке (данные не сообщается), а также на двусторонней основе (в представительных результатов) и видел возведен нейротрофин (BDNF) выражение в крысу зубчатой ​​извилины. Наша сомер текущего гипотеза, что выражение BDNF инициирует выражение каскад генов, кульминацией нейрогенеза, что в переводе с анти-эпилептического эффекта DBS хирургии. В этой статье мы представляем наши методы для DBS хирургии, нацеленной на ATN у крыс с последующим анализом экспрессии генов в качестве привлекательного подхода к изучению механизма, лежащего преимущества DBS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

О себе Этика:: Примечание Все процедуры, описанные в этой рукописи в соответствии с руководящими принципами NIH для исследования на животных (Руководство по уходу и использованию лабораторных животных) и утверждаются Гарвардской медицинской школы IACUC комитетом.

1. Предоперационная подготовка

  1. Убедитесь, что все хирургические инструменты стерилизуются либо в автоклаве или чистки с антисептическим раствором и / или этанол в случае необходимости. Где это возможно, использовать стерильные одноразовые оборудование, такое как скальпели, иглы и шприцы.
  2. Накройте верстак с хирургических простыней и убедитесь, что там Biohazard по удалению отходов.
  3. Взвесьте крысы и рассчитать анестезии дозу. Использование кетамина / ксилазина смесь (кетамин 75 мг / кг и Ксилазина 10 мг / кг) для обезболивания крыс.
    Примечание: Между 200-250 г является оптимальным весом для правильного фиксации животного в стереотаксической рамы, а также для точного нацеливания на ATN. IsoflurЭНА могут быть также использованы в качестве обезболивающего средства.
  4. Закрепить и зафиксировать два стерильных электроды (стерилизовать в автоклаве или окиси этилена) на держатель электрода (рис 2) стереотаксической хирургической сроки и с помощью микроскопа (10-40X увеличения), осмотрите кончики электрода для надлежащего выравнивание. Безопасный двумя электродами 3,0 мм друг от друга.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не повредить кончик электрода, нажав на твердых поверхностях.

2. DBS хирургии

  1. Вводите кетамин / Ксилазин смешать внутрибрюшинно животного и убедитесь, что животное достигло хирургического самолет анестезии (путем проверки схождения пинч рефлекса, частоту дыхания и глубины и регулярности дыхания). Удаления волос из области волосистой части головы, который будет надрезанные и дезинфицировать кожу головы 3 чередующихся кусты друг от бетадин и любой спирт или стерильным физиологическим раствором. Безопасные и позиционировать животное на стереотаксической FRAMе.
  2. Используйте оборотных теплые колодки воды для поддержания температуры тела животного на оптимальном уровне. Применить глаз смазку глаза животного для защиты от пересушивания.
  3. Используйте следующие стереотаксические координаты для ориентации АТН (передняя ядра таламуса): anterioposterior -1,6 мм, латеральная 1,5 мм и дорсовентральный 5,2 мм 1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: стереотаксической координаты на основе Paxinos и Ватсон (6-е издание) головного мозга крыс атласа 36.
  4. Сделайте надрез в коже головы в сагиттальной выявить череп. Использование пара втягивающих обеспечить врезанной головы, чтобы выставить череп. Используйте стерильного физиологического раствора, чтобы промыть разрез. Если разрез слишком влажная, используйте стерильные ватные тампоны для просушки. Найдите брегмы и пометить черным маркером. Для руководства положение заусенцев отверстия, сделать еще два марок примерно в 1,5 мм медиолатерально с обеих сторон от сагиттального шва и 1,6 мм кзади от Корональ шов.
  5. Используйте ручной дрели, чтобы сделать заусенцев отверстия. Убедитесь, что кончик заусенцев отверстие стерильно путем стерилизации его этанолом. Держите дрель около 45 ° углом к ​​поверхности черепа при бурении. Часто переключаться между двумя отверстиями заусенцев, чтобы избежать чрезмерного тепла в месте расположения любой заусенцев отверстие.
  6. Продолжить бурение до тех пор, твердая мозговая оболочка не подвергается. С помощью иглы с ее кончик изогнут, напоминающие форму на 'L', удалите все осколки кости, которые препятствуют вставку электрода. Будьте осторожны, чтобы не повредить лежащую в основе твердой мозговой и / или ткани мозга при удалении костных фрагментов с помощью изогнутого иглу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование ослабленную иглы или тонкой тупые щипцы также вариант.
  7. Закрепите двойной электродный узел с вращающимся лезвием стереотаксической рамы и закрепите ручку под углом 90 °. Использование коррективы в стереотаксической рамы, установите левую электрод точно над темени.
  8. Использование стереотактические корректировки для медиолатеральной позиционирования, точно перемещать левым электродом 1,5 мм на левой стороне темени, так что теперь существуют два электрода идеально выровнены вдоль венечного шва, но разнесены друг от друга на 1,5 мм медиолатерально от темени.
  9. Использование anterioposterior стереотаксические корректировки, перемещать электроды 1,6 мм кзади от коронарного шва.
  10. Используйте дорсовентральной корректировки снизить электроды первой проверки, если Берр отверстия были сделаны в нужном месте таким образом, что электроды могут быть вставлены с легкостью, не касаясь грубые края заусенца отверстий. Если это так, вставьте электроды на глубину 5,2 мм от поверхности черепа.
  11. Подключите электроды через приводит к стимулятора, установленного на 130 Гц, 2,5 В и 90 мкс длительности импульса 1.
  12. Обеспечивают высокую стимуляцию частот в течение часа (или в течение желаемого периода времени в соответствии с экспериментальной установки). В ходе стимуляции, помните, чтобы обеспечить рРопер глубины анестезии регулярно проверять на отсутствие выхода для ног в ответ на носка крайнем случае. Дополнение анестезии с примерно половину начальной дозы, используемой для анестезии. Избегайте загрязнения вашего стерильные перчатки при проверке глубины анестезии и при необходимости изменить их. Выполните одностороннее или двустороннее стимуляции на основе своих экспериментальных потребностей. Включить элементы управления, такие как низкая стимуляции частоты (например, для., 10 Гц) и нестимулированных животных (вставка электроды без последующего раздражения).
  13. После стимуляции сделано, снять электроды тщательно и зашить разрез 3-0 швами или с стерильных хирургических скоб.
  14. Администрирование бупренорфин (0,05 мг / кг) подкожно в качестве обезболивания. Монитор животное, пока он не вернется к нормальной деятельности, а затем вернуть его в жилищном учреждении.
  15. После определенного периода времени на основе экспериментального проектирования (например, для, 0, 3, 6 или 12 часов после DBS хирургии), Усыпить животное с анестезией передозировки. После подтверждения отсутствия жизненно важных, обезглавить животное.
  16. Рассеките из мозга, сняв предварительно кожу с помощью ножниц. Разрезать кости вдоль стреловидного шва с использованием рассечение ножницами. Сделайте еще два разреза (около дюйма каждый) через кость с обеих боковых сторон. Использование щипцов, поднимите частично отрезанную часть кости из верхней части черепа, чтобы обнажить мозг.
  17. Использование тонких ножниц или щипцов, выбить мозг из черепа и передачи в чашку Петри с холодной PBS на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы избежать повреждения мозга, делая надрезы через кость.

3. Гиппокамп Изоляция

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все последующие шаги в этом разделе на льду.

  1. Поместите мозг на предварительно охлажденного акриловой матрицы мозга на льду. Использование лезвие бритвы, вырезать мозг коронки примерно 7-8 мм от передне-самых редGE головного мозга. Сделайте второй разрез коронки и кзади от первого разреза, так что толщиной примерно 5 мм мозг ломтик могут быть удалены.
  2. Передача срез мозга в чашку Петри с ледяной PBS. Использование лезвие бритвы, разорвать два полусферических разделы и заботиться, чтобы отметить, какие полушарие отвечает левой и правой сторон соответственно. Это особенно важно при выполнении односторонних стимуляции.
  3. Использование тонких щипцов и ножниц тщательно удалить гиппокамп.
  4. Вспышка не замерзнуть ткани гиппокампа на сухом льду и хранят в -20 ° C морозильнике до готовности в течение последующих стадий экстракции РНК.
    Примечание: для длительного хранения, желательно, чтобы сохранить ткани в -80 ° C морозильнике.

4. Экстракция РНК и количественный ПЦР

  1. Убедитесь, что ткань не остается замораживали на сухом льду до готовности к гомогенизации.
  2. ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните этот шаг в капюшоне.
    1. Добавить 1 мл Tri реагента Hippocampal ткани в 1,5 мл центрифужную пробирку и гомогенизации его первой пипетирования несколько раз до тех пор, пока ткань не работает на более мелкие куски. Кроме того гомогенизации ткани при прохождении через шприц с иглой 25 G до тех пор, пока не непрерывная ткани видны. Выполните действия, гомогенизации на льду.
    2. После гомогенизации ткани, позволяют клеточную суспензию выдерживали при комнатной температуре в течение 5 мин, чтобы лизис клеток.
      Примечание: После этой точки суспензию клеток может быть быстро замораживали и хранили в -70 ° С до дальнейшей обработки.
  3. Добавить 0,2 мл хлороформа и перемешивают на вортексе в течение 20 сек, и пусть остальной раствор при комнатной температуре в течение 15 мин.
  4. Центрифуга образцов при 12000 х г в течение 15 мин при 4 ° С. После центрифугирования, удалите трубки тщательно, не нарушая три отдельные слои, которые будут видны.
    ПРИМЕЧАНИЕ: снизу (красный) фаза содержит белки, средний облачно фаза содержит ДНК и топ ясно фаза содержит RNA.
  5. Передача верхнюю прозрачную фазу (РНК) в свежем 1,5 мл центрифужную пробирку (как правило, 500 мкл РНК, содержащей фазу получают). Для этого добавьте 0,5 мл изопропанола и перемешать встряхиванием. К этому добавляют 2-3 мкл гликогена (20 мг / мл) в качестве носителя для РНК. Разрешить образец отдыхать на стол при комнатной температуре в течение 10 мин.
  6. Центрифуга образца при 12 000 х г в течение 1 ч при 4 ° С. Убедитесь, что осадок РНК видна в нижней части трубки.
  7. Жидкость над осадком сливают и промывают осадок РНК путем добавления 1 мл 75% -ного этанола (сделано с нуклеазы свободной воды). Invert образцы несколько раз до тех пор, пока осадок смещает из нижней части трубы и плавает в растворе. Центрифуга раствора при 12000 х г в течение 10 мин при 4 ° С.
    Примечание: осадок в 75% -ном этаноле можно хранить при температуре от -20 ° С до дальнейших шагов.
  8. Разрешить осадок РНК высохнуть на воздухе, оставляя трубки открыт в течение 5 мин при комнатной температуре. Принять меры предосторожности, чтобы избежать Увег сушки гранул, так как это может повлиять на его растворение в воде на последующей стадии.

5. Снятие ДНК от подготовки РНК

  1. Добавить 9 мкл нуклеазы свободной воды в осадок РНК и убедитесь, что осадок растворяют прежде чем приступить осторожно встряхивая пробирку. К этому добавляют 1 мкл 10х буфера ДНКазы I и 1 мкл рекомбинантного ДНКазы (от ДНКазы I Kit), смешать, осторожно щелкая трубки, кратко вращать трубки и инкубировать при 37 ° С на водяной бане в течение 30 мин.
  2. Добавить 2 мкл ДНКазы инактивации реагента (от ДНКазы I комплект) для образца и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 мин и смешать часто, осторожно слегка ударяя по пробирке. Центрифуга при 12000 х г в течение 10 мин и передачи приблизительно 10 мкл прозрачного супернатанта к новому 1,5 мл центрифужную пробирку.
  3. Измерьте концентрацию РНК, используя NanoDrop или спектрофотометр.

6. Создание кДНК из РНК

  1. Добавить необходимые й томна содержит 1 мкг РНК и довести общий объем до 8 мкл добавлением нуклеазы свободной воды. Для этого добавьте 1 мкл 10 мМ дНТФ перемешать и 1 мкл случайных гексамеров из комплекта Верхний First Strand синтеза. Осторожно смешать и инкубировать при 65 ° С в течение 5 мин либо в водяной бане или на заранее запрограммированных амплификаторе.
  2. Сделать премикса, содержащего следующие реагенты: 2 мкл 10х буфера RT, 4 мкл 25 М MgCl 2, 2 мкл 0,1 М ДТТ и 1 мкл РНКазы OUT (40 ед / мкл).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объемы даны на реакцию, пользователю необходимо наращивать в соответствии со своими экспериментальными потребностей.
  3. После удаления РНК, содержащую образец от 65 ° C, установить трубку при комнатной температуре в течение одной минуты. Добавить 9 мкл раствора премикса и инкубируют при комнатной температуре в течение 2 мин. Добавить 1 мкл Верхний II обратной транскриптазы (50 ед / мкл), а затем инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин.
  4. Инкубируйте образцы при 42 ° С в течение 50мин в течение обратной транскрипции происходит.
  5. Инкубируйте образцы при 70 ° С в течение 15 мин, чтобы прекратить реакцию.
  6. Поместите образцы на льду кратко и добавить 1 мкл RNAseH (2 ед / мкл) и инкубируют при 37 ° С в течение 20 мин.
  7. Кратко центрифуги трубы при 3000 мкг в спин вниз жидкий конденсат.
    Примечание: Это кДНК, которые будут использоваться для количественной ПЦР. кДНК не могут быть сохранены в -20 ° C морозильнике до установки ПЦР. кДНК может также быть разбавлен нуклеазы свободной воды, прежде чем приступить к ПЦР.

7. Количественный ПЦР

  1. Убедитесь, мастер смесь, содержащая следующие реагенты (объемы, данные являются на реакцию): 6,3 мкл 2x SYBR Green Mix, 0,6 мкл Прямой праймер (10 мкм), 0,6 мкл Обратный праймер (10 мкм) и 0,5 мкл нуклеазы свободной воды ,
    ПРИМЕЧАНИЕ: Primer дизайн осуществлен с использованием "забрать праймеров 'опцию в странице нуклеотидной последовательности NCBI для интересующего гена,
  2. Добавить 10 мкл Mastermix в каждую лунку ПЦР планшета с 96 благополучия. Добавить 2,5 мкл кДНК, сделанные ранее в скважину, содержащий Mastermix. Убедитесь в том, чтобы настроить трехкратным реакции ПЦР для каждого образца.
  3. После завершения добавления Mastermix и кДНК, покрывают пластину ПЦР с использованием оптического клейкого листа для герметизации скважины. Спин пластину кратко в течение 5 мин при 500 мкг в настольной центрифуге урегулировать все жидкости в нижней части хорошо.
  4. Загрузите пластину ПЦР на предварительно запрограммированного RT-PCR машины. Используйте параметры ПЦР, представленные в таблице 1.
  5. Анализ данных: Используйте С Т значения с выхода КПЦР для дальнейших расчетов. Наряду с геном тест, созданного ПЦР реакции генов внутреннего контроля, 18S рРНК (для обеспечения равного вход) и β-актина (отрицательный контроль). Рассчитать сгиба изменения, основанные на методе ΔΔCt 37.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Фигуры 1А и 1В показывают относительную экспрессию BDNF и GABRD по отношению к генной управления β-актина. BDNF, нейротрофин часто ассоциируется с нейропротективных эффектов во многих нервных заболеваний, 38-41. Поэтому интересно проанализировать профиля экспрессии BDNF в ответ на стимуляцию ATN, которая дает терапевтический эффект в больных эпилепсией. В фиг.1А, который показан профиль экспрессии гена BDNF через указанных временных точках прикреплять DBS стимуляции, BDNF повышающая регуляция наблюдается сразу же (0 ч) после операции DBS вместе с пиковой выражения (3 раза большей, чем без стимуляции) на 3 ч Сообщение стимуляция. Это наблюдение позволяет предположить, что усиливает экспрессию BDNF и в результате нейропротекция может способствовать терапевтической пользе DBS. Другой ген GABRD (фиг.1В), также была исследована с использованием метода КПЦР. GABRD является бее ГАМК-рецепторач является одним из потенциальных объектов для разработки анти-эпилептических препаратов 42. Профиль выражение GABRD также показывает повышенную экспрессию в стимулированных животных по сравнению с нестимулированных контрольных животных на 3 ч после DBS. Учитывая, что агонисты ГАМК используются в качестве эффективных супрессоров захват, это интересно наблюдать усиливает экспрессию после GABRD DBS, вовлекая возможную роль ГАМК в борьбе с эпилепсией эффекта DBS.

Протокол ОТ-ПЦР, описанный здесь дает воспроизводимые и количественные результаты, которые показывают характер экспрессии генов и относительные различия раза по сравнению с контрольными животными. Анализ данных выполняется следующим образом: Выход КПЦР дает значение Т пороговое C для гена испытания для каждого анализируемого образца. С Т значения получены также для контрольного гена β-актина и 18S рРНК (контроль ввода). Способ т ΔΔC будет использоваться, чтобы вычислить ген EXPRession профиль использования этих С Т значения 37. Например, для вычисления изменения экспрессии генов BDNF, для данного образца, разница между значением T C для BDNF и 18S рРНК рассчитывается и является первым & delta; C т. Для того же образца, разница между значением T C для β-актина и 18S рРНК рассчитывается с получением второго delta; C T. Разница между этими двумя значениями & delta; C т вычисляется с получением ΔΔC т. Это значение т ΔΔC используется для вычисления 2 ^ (-ΔΔC т), что дает относительное обилие шаблона для BDNF по сравнению с β-актина. Построив эту величину через различные моменты времени наряду с нестимулированных управления, изменения экспрессии генов, индуцированные DBS по временных точках могут быть визуализированы. Описанный выше способ может быть эффективно использованы для исследования изменений в экспрессии для других генов, которые являются потенциальными откровенныйАтеш, которые реагируют на DBS стимуляции и исследовать некоторые из последующих эффектов модуляции экспрессии этих генов.

Рисунок 1
Рисунок 1: (А) Время Конечно анализ экспрессии BDNF в ответ на высокие частоты стимуляции ATN. Сбор тканей, экстракции РНК, синтеза кДНК и Q-ПЦР проводили, как описано в протоколе. Относительные изменения в экспрессии генов вычисляются после нормализации для ввода (путем амплификации 18S рРНК), а также ген управления (β-актина). С Т значения, полученные от ПЦР в реальном времени были использованы для расчета уровней экспрессии по ΔΔ C T Метод 37. В моменты времени, проанализированные равны 0, 3, 6 и 12 часов после стимуляции DBS. Примечание: моменты времени, выбранные здесь по отношению к конкретной работе и могут быть изменены в соответствии с HYвится и экспериментальное план. (B) Время Конечно анализ ГАМК-рецептора дельта-субъединицы (GABRD) уровнях в ответ на DBS в 130 Гц, нацеленной на ATN. Методы и расчеты проводились, как аналогично данным BDNF.

Фиг.2
Рисунок 2: DBS электроды и стимулятор создан.

Циклы ПЦР
Стадия 1: Начальная Денатурация 95 ° С 15 мин
Этап 2: Денатурация 95 ° С 15 сек
Отжиг 60 ° С 30 сек
Расширение 72 ° С 30 сек
40 циклов Шаг 2
Примечание: температура отжига варьируется в зависимости от
Грунтовка температура плавления. Грунтовки обычно предназначены
иметь оптимальную температуру отжига 60 & deg; С

Таблица 1: ПЦР-Параметры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

После работы ориентир по Benabid и др. При помощи глубокой стимуляции мозга для лечения болезни Паркинсона и эссенциальный тремор, хирургическая техника DBS была исследована с большим интересом за последнее десятилетие для лечения многих неврологических расстройств 6,10,43. Исследования DBS направленных на решение различных нервно-анатомические регионы схемы мозга в настоящее время осуществляются многими группами для решения основных нервных заболеваний и находятся на различных стадиях клинических испытаний. Стимулирование субталамического ядра (STN) или внутренней сегмента бледного шара (GPI) является FDA одобрил и используется при лечении двигательных расстройств при болезни Паркинсона 10. Клиническое испытание САНТЕ показал перспективные направления для больных эпилепсией, получающих высокие частоты стимуляции передней ядра таламуса 31. Результаты фазы клинических испытаний двустороннего forniceal стимуляции показали задержку в размере когнитивного снижения и повторнымверсальна из глюкозы гипометаболическое поглощения видно при болезни Альцгеймера, а также активации схемы памяти 8,44. Кроме того, в последние годы нейрохирурги провели испытания DBS для лечения нервно-психических расстройств, таких как обсессивно-компульсивного расстройства (обсессивно компульсивное расстройство), резистентной к терапии депрессии, синдрома Туретта и наркомании 10,45-55.

В дополнение к клинических испытаний, в течение последних нескольких лет, животное хирургия предлагает нам большие возможности для изучения физиологических изменений, вызванных хирургической техники в живых животных, в порядке, беспрецедентные любым способом в пробирке. В этой рукописи, мы обсудили методы, участвующих в выполнении глубокой стимуляции мозга хирургии в грызунов. Стереотаксис у грызунов, как описано здесь, также могут быть использованы для поиска потенциальных целевых DBS и проверить эффективность операции с использованием модели болезни животных. Одна из проблем для экспериментатора чпрежде чем должно быть способен воздействовать на правильную анатомическую локус воспроизводимым способом. Существует особенно потребность в квалифицированным специалистом по хирургии, так как проверку правильности таргетинга можно только после стимуляции сделано и животных умерщвляли. Также иногда можно случайно повредить ключевую кровеносный сосуд, который может привести к значительной потере крови и иногда даже смерти животного. Кроме того, необходимо, чтобы рассекать из гиппокамп для дальнейшего биохимического анализа ограничивает возможности иммуногистологического проверки для правильного электрода таргетирования и того же животного, которое требует нетронутыми образца мозг для ткани срезов. Правильное нацеливание электрода могло быть проверено на различных животных вынужденного идентичным образом. Тем не менее, это не дает доказательств для правильного таргетинга в подопытного животного и ограничение этого подхода. Последние публикации пытались обойти эту проблему путем проведения DBS хирургии с simultaneouš МРТ 56. Одним из возможных совершенствование методики, описанной здесь может быть исследование о влиянии хронической стимуляции с помощью имплантированного стимулятора в животное. Тем не менее, мы ограничили анализ для однократной дозы (1 ч) высокочастотной стимуляции в качестве первого шага к пониманию изменений, вызванных DBS на клеточном уровне.

Учитывая использование DBS хирургии для различных нервных расстройств, важно, что мы знаем механизм, лежащий в основе благоприятных эффектов DBS. Эта информация имеет решающее значение для разработки будущих улучшений в хирургии, а также для изучения полезности DBS для лечения других условиях, которые не были исследованы экспертами в DBS. Кроме того, изменения в хирургической технике могут быть реализованы, чтобы избежать определенных вредных побочных эффектов порядке и эффективно бороться с рецидивом болезненного состояния.

В глубине механистический анализис DBS можно путем изучения изменений экспрессии генов, вызванные DBS. Либо подход генов-кандидатов на основе имеющихся знаний о нейронных путей, которые реагируют на деполяризующими стимулы, такие как высокочастотной стимуляции, или глобального анализа транскриптома может дать важную информацию о молекулярных событий, вызванных DBS. Методы анализа экспрессии генов (генов-кандидатов подход, а также метод с высокой пропускной способностью) являются мощными инструментами, которые являются ключевыми для изучения молекулярных механизмов и клеточные изменения, связанные с DBS хирургии. Последние разработки в этой области сделали возможным для нас, чтобы получить огромное количество информации о нескольких аспектах клеточной физиологии в течение очень короткого времени, что было невозможно еще несколько лет назад. С появлением высоких технологий секвенирования пропускной таких как ChIPseq, можно охарактеризовать генома расположение важных факторов транскрипции, которые реагируют на DBS 57,58. Недавние открытия, связывающие Non-coding РНК, таких как микроРНК с нейродегенеративных заболеваний, позволяют проанализировать возможные изменения в уровне микроРНК в нейронах после DBS с использованием микроРНК технологии последовательности 59,60. Возможные изменения в эпигенетических подписей таких метилирования ДНК и модификации гистонов в ответ на DBS также может быть изучены. Тем не менее, несмотря на все преимущества, важно признать некоторые ограничения этих методов, а также потенциальные проблемы, которые могут возникнуть в ходе анализа. Важной задачей с экспрессии генов анализ был воспроизводимость и технические ошибки. Важно, что экспериментатор принимает во внимание это и планирует на иметь достаточное количество повторений для обеспечения надежности. Общей проблемой с некоторыми из высокого скрининговых исследований была трудность в интерпретации огромного количества данных, который генерируется. Иногда это становится важным, чтобы определить, являются ли изменения экспрессии генов, наблюдаемые в результате прямого действияэкспериментальной обработки или ниже эффект. Это, как правило, требует дополнительных исследований, которые предназначены для решения этого вопроса.

В дополнение к геномных исследований, обширная иммуногистохимическое анализ пространственно-временной локализации ключевых игроков, которые отвечают на DBS и количественного определения изменений в их уровнях в различных регионах мозга будет очень полезны для будущих разработок DBS хирургическая процедура. Совокупные результаты от экспрессии генов анализа, а также иммуногистохимическое исследования могут выявить новые взаимодействия между ключевыми факторами, а также ключевые молекулярных событий, которые регулируют клеточные процессы, такие как нейрогенеза или нейродегенеративных. Идентификация таких критических молекулярных маркеров может также дать будущим открытиям наркотиков. Такие данные могут пролить свет на общем функционировании схемы мозга, которая ценную информацию с точки зрения ученых, работающих понять человекау нервных заболеваний. Направление наши будущие усилия по интеграции новейших технологических достижений, сделанных в клинике, а также лабораторию, скорее всего, предложит нам существенные преимущества в нашей борьбе против болезни.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Deep Brain Stimulation Surgery
Stereotactic frame Kopf Instruments Model 900
Drill  Dremmel 7700, 7.2 V
Scalpel BD 372610
Ketamine Patterson Veterinary 07-803-6637 Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules
Xylazine Patterson Veterinary 07-808-1947
Buprenorphine Patterson Veterinary 07-850-2280 Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules
Surgical staples ConMed Corporation 8035
Sutures (3-0)  Harvard Apparatus 72-3333
Syringe (1 ml, 29 1/2 G) BD 329464 Sterile, use for Anesthesia administration intraperitoneally
Syringe (3 ml, 25 G) BD 309570 Sterile, use for Analgesia administration subcutaneously
Needles BD 305761 Sterile, use for clearing broken bone pieces from the burr holes
Ethanol Fisher Scientific S25309B Use for general sterilization 
Eye Lubricant Fisher Scientific 19-898-350
Stimulator Medtronic Model 3628
DBS electrodes Rhodes Medical Instruments, CA SNEX100x-100 mm Electrodes are platinum, concentric and bipolar
Betadine (Povidone-Iodine)  PDI S23125 Single use swabsticks, use for sterilizing the scalp before making incision 
 Brain Dissection and Hippocampal tissue isolation
Acrylic Rodent Brain Matrix Electron Microscopy Sciences 175-300 www.emsdiasum.com
Razor Blade V W R 55411-050
Guillotine Scissors Clauss 18039 For decapitation, make sure these scissors are maintained in clean and working condition
Scissors Codman Classic 34-4098 Use for removing the brain from the skull
Forceps Electron Microscopy Sciences 72957-06 Use for removing the brain from the skull and for handling during dissection
Phosphate Buffered Saline  Boston Bioproducts BM-220
 RNA Extraction and cDNA Preparation
Tri Reagent Sigma T9424 Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin
Syringe (3 ml, 25 G) BD 309570 Use for tissue homogenization
Chloroform Fisher Scientific BP1145-1 Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin
Isopropanol Fisher Scientific A416-1
Glycogen Thermo Scientific R0561
Dnase I Kit Ambion AM1906
Superscript First Strand Synthesis Kit Invitrogen 11904-018
Tabletop Microcentrifuge Eppendorf 5415D
 Quantitative PCR               
SYBR Green PCR Kit Qiagen 204143
Custom Oligos Invitrogen 10668051
PCR Plates (96 wells) Denville Scientific C18080-10
Optical Adhesive Sheets Thermo Scientific AB1170
Nuclease free Water Thermo Scientific SH30538-02
Real Time PCR Machine Applied Biosystems 7500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Toda, H., Hamani, C., Fawcett, A. P., Hutchison, W. D., Lozano, A. M. The regulation of adult rodent hippocampal neurogenesis by deep brain stimulation. Journal of. 108, 132-138 (2008).
  2. Perlmutter, J. S., Mink, J. W. Deep brain stimulation. Annual review of neuroscience. 29, 229-257 (2006).
  3. Bergstrom, M. R., Johansson, G. G., Laitinen, L. V., Sipponen, P. Electrical stimulation of the thalamic and subthalamic area in cerebral palsy. Acta physiologica Scandinavica. 67, 208-213 (1966).
  4. Benabid, A. L., et al. Chronic electrical stimulation of the ventralis intermedius nucleus of the thalamus as a treatment of movement disorders. Journal of neurosurgery. 84, 203-214 (1996).
  5. Benabid, A. L., et al. Long-term electrical inhibition of deep brain targets in movement disorders. Movement disorders : official journal of the Movement Disorder Society. 13, Suppl 3. 119-125 (1998).
  6. Benabid, A. L., et al. Long-term suppression of tremor by chronic stimulation of the ventral intermediate thalamic nucleus. Lancet. 337, 403-406 (1991).
  7. Tierney, T. S., Lozano, A. M. Surgical treatment for secondary dystonia. Movement disorders : official journal of the Movement Disorder Society. 27, 1598-1605 (2012).
  8. Tierney, T. S., Sankar, T., Lozano, A. M. Some recent trends and further promising directions in functional neurosurgery. Acta neurochirurgica. Supplement. 117, 87-92 (2013).
  9. Tierney, T. S., Sankar, T., Lozano, A. M. Deep brain stimulation emerging indications. Progress in brain research. 194, 83-95 (2011).
  10. Sankar, T., Tierney, T. S., Hamani, C. Novel applications of deep brain stimulation. Surgical neurology international. 3, S26-S33 (2012).
  11. Tierney, T. S., Vasudeva, V. S., Weir, S., Hayes, M. T. Neuromodulation for neurodegenerative conditions. Frontiers in bioscience. 5, 490-499 (2013).
  12. Mayberg, H. S., et al. Deep brain stimulation for treatment-resistant depression. Neuron. 45, 651-660 (2005).
  13. Lyons, M. K. Deep brain stimulation: current and future clinical applications. Mayo Clinic proceedings. 86, 662-672 (2011).
  14. Ch. 4. Rehabilitation in movement disorders. Lansek, R., Morris, M. E. , Cambridge University Press. 36-43 (2013).
  15. Goodwin, R., Tierney, T., Lenz, F., Anderson, W. Ch. 15. Single Neuron Studies of the Human Brain: Probing Cognition. Fried, I., Rutishauser, U., Cerf, M., Kreiman, G. 15, MIT Press. 275-293 (2014).
  16. Hauser, W. A. Epidemiology of epilepsy in children. Neurosurgery clinics of North America. 6, 419-429 (1995).
  17. Hauser, W. A. Recent developments in the epidemiology of epilepsy. Acta neurologica Scandinavica. Supplementum. 162, 17-21 (1995).
  18. Davis, R., Emmonds, S. E. Cerebellar stimulation for seizure control: 17-year study. Stereotactic and functional neurosurgery. 58, 200-208 (1992).
  19. Levy, L. F., Auchterlonie, W. C. Chronic cerebellar stimulation in the treatment of epilepsy. Epilepsia. 20, 235-245 (1979).
  20. Velasco, A. L., et al. Electrical stimulation of the hippocampal epileptic foci for seizure control: a double-blind, long-term follow-up study. Epilepsia. 48, 1895-1903 (2007).
  21. Tellez-Zenteno, J. F., McLachlan, R. S., Parrent, A., Kubu, C. S., Wiebe, S. Hippocampal electrical stimulation in mesial temporal lobe epilepsy. Neurology. 66, 1490-1494 (2006).
  22. Kerrigan, J. F., et al. Electrical stimulation of the anterior nucleus of the thalamus for the treatment of intractable epilepsy. Epilepsia. 45, 346-354 (2004).
  23. Hamani, C., et al. Deep brain stimulation of the anterior nucleus of the thalamus: effects of electrical stimulation on pilocarpine-induced seizures and status epilepticus. Epilepsy research. 78, 117-123 (2008).
  24. Hamani, C., et al. Bilateral anterior thalamic nucleus lesions and high-frequency stimulation are protective against pilocarpine-induced seizures and status epilepticus. Neurosurgery. 54, 191-195 (2004).
  25. Mirski, M. A., Rossell, L. A., Terry, J. B., Fisher, R. S. Anticonvulsant effect of anterior thalamic high frequency electrical stimulation in the rat. Epilepsy research. 28, 89-100 (1997).
  26. Mirski, M. A., Ferrendelli, J. A. Interruption of the mammillothalamic tract prevents seizures in guinea pigs. Science. 226, 72-74 (1984).
  27. Mirski, M. A., Ferrendelli, J. A. Anterior thalamic mediation of generalized pentylenetetrazol seizures. Brain research. 399, 212-223 (1986).
  28. Mirski, M. A., Ferrendelli, J. A. Interruption of the connections of the mammillary bodies protects against generalized pentylenetetrazol seizures in guinea pigs. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 7, 662-670 (1987).
  29. Mirski, M. A., McKeon, A. C., Ferrendelli, J. A. Anterior thalamus and substantia nigra: two distinct structures mediating experimental generalized seizures. Brain research. 397, 377-380 (1986).
  30. Lee, K. J., Jang, K. S., Shon, Y. M. Chronic deep brain stimulation of subthalamic and anterior thalamic nuclei for controlling refractory partial epilepsy. Acta neurochirurgica. Supplement. 99, 87-91 (2006).
  31. Fisher, R., et al. Electrical stimulation of the anterior nucleus of thalamus for treatment of refractory epilepsy. Epilepsia. 51, 899-908 (2010).
  32. Encinas, J. M., Hamani, C., Lozano, A. M., Enikolopov, G. Neurogenic hippocampal targets of deep brain stimulation. The Journal of comparative neurology. 519, 6-20 (2011).
  33. Hattiangady, B., Rao, M. S., Shetty, A. K. Chronic temporal lobe epilepsy is associated with severely declined dentate neurogenesis in the adult hippocampus. Neurobiology of disease. 17, 473-490 (2004).
  34. Kuruba, R., Hattiangady, B., Shetty, A. K. Hippocampal neurogenesis and neural stem cells in temporal lobe epilepsy. Epilepsy & behavior : E&B. 14, Suppl 1. 65-73 (2009).
  35. Hattiangady, B., Shetty, A. K. Implications of decreased hippocampal neurogenesis in chronic temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 49, Suppl 5. 26-41 (2008).
  36. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Elsevier Inc. (2007).
  37. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 22DDCT Method. METHODS. 25, 402-408 (2001).
  38. Kells, A. P., et al. AAV-mediated gene delivery of BDNF or GDNF is neuroprotective in a model of Huntington disease. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 9, 682-688 (2004).
  39. Han, B. H., Holtzman, D. M. BDNF protects the neonatal brain from hypoxic-ischemic injury in vivo via the ERK pathway. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 20, 5775-5781 (2000).
  40. Hetman, M., Kanning, K., Cavanaugh, J. E., Xia, Z. Neuroprotection by brain-derived neurotrophic factor is mediated by extracellular signal-regulated kinase and phosphatidylinositol 3-kinase. The Journal of biological chemistry. 274, 22569-22580 (1999).
  41. Stadelmann, C., et al. BDNF and gp145trkB in multiple sclerosis brain lesions: neuroprotective interactions between immune and neuronal cells. Brain : a journal of neurology. 125, 75-85 (2002).
  42. Treiman, D. M. GABAergic mechanisms in epilepsy. Epilepsia. 42, Suppl 3. 8-12 (2001).
  43. Benabid, A. L., Pollak, P., Louveau, A., Henry, S., de Rougemont, J. Combined (thalamotomy and stimulation) stereotactic surgery of the VIM thalamic nucleus for bilateral Parkinson disease. Applied neurophysiology. 50, 344-346 (1987).
  44. Laxton, A. W., et al. A phase I trial of deep brain stimulation of memory circuits in Alzheimer's disease. Annals of. 68, 521-534 (2010).
  45. Tierney, T. S., Abd-El-Barr, M. M., Stanford, A. D., Foote, K. D., Okun, M. S. Deep brain stimulation and ablation for obsessive compulsive disorder: evolution of contemporary indications, targets and techniques. The International journal of neuroscience. 124, 394-402 (2014).
  46. Kennedy, S. H., et al. Deep brain stimulation for treatment-resistant depression: follow-up after 3 to 6 years. The American journal of psychiatry. 168, 502-510 (2011).
  47. Lozano, A. M., et al. Subcallosal cingulate gyrus deep brain stimulation for treatment-resistant depression. Biological psychiatry. 64, 461-467 (2008).
  48. Ackermans, L., et al. Double-blind clinical trial of thalamic stimulation in patients with Tourette syndrome. Brain : a journal of neurology. 134, 832-844 (2011).
  49. Houeto, J. L., et al. Tourette's syndrome and deep brain stimulation. Journal of neurology, neurosurgery, and psychiatry. 76, 992-995 (2005).
  50. Maciunas, R. J., et al. Prospective randomized double-blind trial of bilateral thalamic deep brain stimulation in adults with Tourette syndrome. Journal of neurosurgery. 107, 1004-1014 (2007).
  51. Koning, P. P., Figee, M., van den Munckhof, P., Schuurman, P. R., Denys, D. Current status of deep brain stimulation for obsessive-compulsive disorder: a clinical review of different targets. Current psychiatry reports. 13, 274-282 (2011).
  52. Greenberg, B. D., et al. Deep brain stimulation of the ventral internal capsule/ventral striatum for obsessive-compulsive disorder: worldwide experience. Molecular psychiatry. 15, 64-79 (2010).
  53. Muller, U. J., et al. Successful treatment of chronic resistant alcoholism by deep brain stimulation of nucleus accumbens: first experience with three cases. Pharmacopsychiatry. 42, 288-291 (2009).
  54. Zhou, H., Xu, J., Jiang, J. Deep brain stimulation of nucleus accumbens on heroin-seeking behaviors: a case report. Biological psychiatry. 69, e41-e42 (2011).
  55. Porta, M., et al. Thalamic deep brain stimulation for treatment-refractory Tourette syndrome: two-year outcome. Neurology. 73, 1375-1380 (2009).
  56. Younce, J. R., Albaugh, D. L., Shih, Y. Y. Deep brain stimulation with simultaneous FMRI in rodents. Journal of visualized experiments : JoVE. , e51271 (2014).
  57. Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature reviews. Genetics. 10, 669-680 (2009).
  58. Valouev, A., et al. Genome-wide analysis of transcription factor binding sites based on ChIP-Seq data. Nature methods. 5, 829-834 (2008).
  59. Fiore, R., Siegel, G., Schratt, G. MicroRNA function in neuronal development, plasticity and disease. Biochimica et biophysica acta. 1779, 471-478 (2008).
  60. Hebert, S. S., De Strooper, B. Alterations of the microRNA network cause neurodegenerative disease. Trends in neurosciences. 32, 199-206 (2009).

Tags

Neuroscience выпуск 97 передний ядра таламуса глубокая стимуляция мозга зубчатая извилина гиппокамп эпилепсия экспрессия генов высокая частота стимуляции количественный RT-PCR
Анализ изменений экспрессии генов в гиппокампе крыс после глубокого мозга стимуляции передней ядра таламуса
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Selvakumar, T., Alavian, K. N.,… More

Selvakumar, T., Alavian, K. N., Tierney, T. Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus. J. Vis. Exp. (97), e52457, doi:10.3791/52457 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter