Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Análisis de los cambios de expresión génica en la Rata Hippocampus Después de la estimulación cerebral profunda del tálamo anterior Núcleo

Published: March 8, 2015 doi: 10.3791/52457
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Neurosurgery, Brigham & Women's Hospital, Harvard Medical School, 2Division of Brain Sciences, Department of Medicine, Imperial College London

Abstract

La estimulación cerebral profunda (DBS), la cirugía, apuntando a diferentes regiones del cerebro, como los ganglios basales, el tálamo y regiones subtalámico, es un tratamiento efectivo para varios trastornos del movimiento que no han respondido a la medicación. Los recientes progresos en el campo de la cirugía de DBS ha comenzado a extender la aplicación de esta técnica quirúrgica para otras condiciones tan diversas como la obesidad mórbida, la depresión y el trastorno obsesivo compulsivo. A pesar de estas indicaciones en expansión, se sabe poco sobre los mecanismos fisiológicos subyacentes que facilitan los efectos beneficiosos de la cirugía de DBS. Un enfoque a esta pregunta es para llevar a cabo análisis de expresión génica en las neuronas que reciben la estimulación eléctrica. Estudios anteriores han demostrado que la neurogénesis en el giro dentado de la rata se provoca en DBS focalización del núcleo anterior del tálamo 1. Cirugía de DBS focalización del ATN se utiliza ampliamente para el tratamiento de la epilepsia refractaria. Por tanto, es de mucho interest para nosotros para explorar los cambios transcripcional inducidos por la estimulación eléctrica de la ATN. En este manuscrito, describimos nuestras metodologías para estereotáctica guiada por cirugía de DBS focalización del ATN en ratas Wistar macho adultas. También se discuten los pasos subsiguientes para la disección de tejidos, el aislamiento de ARN, la preparación de ADNc y RT-PCR cuantitativa para medir los cambios de expresión génica. Este método podría aplicarse y modificarse para estimular los ganglios basales y en otras regiones del cerebro comúnmente clínicamente dirigida. El estudio de la expresión génica se describe aquí asume un enfoque objetivo de genes candidato para descubrir jugadores moleculares que podrían dirigir el mecanismo para DBS.

Introduction

La historia detrás del desarrollo de la estimulación cerebral profunda como técnica neuroquirúrgica se remonta a la década de 1870 cuando la posibilidad de la estimulación eléctrica de los circuitos cerebrales se exploró 2. El uso de estimulación de alta frecuencia crónica como tratamiento para trastornos neuronales se inició en la década de 1960 3. Más tarde, en la década de 1990 con el advenimiento de la implantación crónica de DBS electrodos 4-6, el número de trastornos neuronales que fueron tratados por DBS siguió aumentando. La estimulación cerebral profunda se utilizó por primera vez en los Estados Unidos como un tratamiento para el temblor esencial 6. Hoy en día la cirugía se utiliza ampliamente para el tratamiento de trastornos neuronales que están actualmente intratables por la intervención farmacológica. DBS se utiliza actualmente para tratar los trastornos del movimiento de la enfermedad de Parkinson y la distonía 7-9. Demencia de tipo Alzheimer, la enfermedad, la epilepsia, el dolor y enfermedades neuropsiquiátricas como la depresión de Huntington, OCD, Tourette7; síndrome de adicción y s son algunas de las condiciones susceptibles de tratamiento por DBS 10-12. Si bien la cirugía DBS está aprobado por la FDA para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson, distonía y el temblor esencial, el uso de DBS para tratar otras condiciones mencionadas anteriormente están en diversas etapas de laboratorio y los estudios clínicos que ofrecen una gran promesa a los pacientes 13,14.

Clínicamente, la cirugía de DBS se realiza en dos etapas. La primera etapa consiste en la colocación de los electrodos quirúrgicamente DBS en la ubicación anatómica objetivo utilizando una combinación de posicionamiento radiológica, CT, MRI, así como lecturas de microelectrodos para mejorar la precisión. La segunda etapa consiste en la implantación de un generador de impulsos en la parte superior del pecho del paciente y la extensión de instalar conduce desde el cuero cabelludo para el generador de impulsos. Sobre la base de la condición neurológica, los esquemas de programación varios para el generador de impulsos se han estandarizado y se pueden usar para suministrar la tensión deseada. El volumen final deTage se alcanza de una manera gradual a fin de recibir la mejor respuesta clínica con un mínimo de voltaje 15. Sin embargo, en nuestros estudios, a diferencia de los implantes crónicas DBS utilizado clínicamente, en aras de la simplicidad, hemos recurrido a estudiar una estimulación de alta frecuencia de una sola vez (durante 1 hora) en nuestros modelos animales.

Parte de la investigación de nuestro grupo se centra en investigar el uso de la cirugía de DBS para la epilepsia refractaria al tratamiento. Abordajes quirúrgicos estereotácticos utilizando la estimulación de alta frecuencia ha sido explorado por muchos otros como una opción eficaz para tratar la epilepsia médicamente refractaria que constituye alrededor del 30% de todas las incidencias de la epilepsia 10,16,17. Estimulación cerebelosa la orientación de la superficie cortical, así como los núcleos cerebelares profundos se han utilizado en el pasado como dianas para tratar la epilepsia 10,18,19. Además, la estimulación del hipocampo también se ha intentado, pero con resultados mixtos 20,21. Algunos de los otros investigaronObjetivos de DBS para epilepsia incluyen la corteza cerebral, el tálamo, núcleo subtalámico y el nervio vago 8. Sin embargo, a raíz de los resultados de varios estudios en los últimos años, el núcleo talámico anterior (ATN) se ha convertido en el objetivo DBS más común para el tratamiento de la epilepsia 10,22. Sobre la base de conocimiento acerca de los circuitos neuroanatómicos y los resultados de los modelos animales, varios estudios se han centrado en el efecto terapéutico de la estimulación cerebral profunda de la ATN en el tratamiento de la epilepsia 23-26. El ATN es parte del circuito límbico y se encuentra en la región del cerebro que afecta a la frecuencia de convulsiones. Los estudios realizados por Hamani et al., Han puesto a prueba la eficacia de ATN-DBS en un modelo de epilepsia inducida por pilocarpina y encontró que la estimulación bilateral ATN latencias para las convulsiones inducidas por pilocarpina y el estado epiléptico 24 prolonga. Por otra parte, se encontró la estimulación de alta frecuencia de la ATN para reducir la frecuencia de convulsiones en un modelo pentilentetrazol (PTZ) de epilepsy 25,27-29. Lee et al., Han informado de una reducción media en la frecuencia de las convulsiones en aproximadamente un 75% a la crónica estimulación cerebral profunda de la ATN en el tratamiento de la epilepsia parcial refractaria 30.

Un estudio clínico reciente sobre la epilepsia refractaria al tratamiento ha mostrado resultados prometedores después de la cirugía de DBS dirigidas al núcleo talámico anterior (ATN) 22. Un ensayo clínico aleatorio multicéntrico con 110 pacientes sometidos a estimulación cerebral profunda bilateral del ATN para el tratamiento de la epilepsia refractaria (ensayo SANTE) indica una caída en la frecuencia de las convulsiones en aproximadamente un 40% 31. Los resultados de este estudio también dio a entender en un efecto antiepiléptico óptima retraso observado a los 2-3 meses después de la cirugía. Posteriores estudios de Toda et al., Corroboradas con estos hallazgos en la que demostraron neurogénesis ocurre en un puesto de tiempo después de DBS (días 3-5) en modelos animales 1. Además, Encinas et al., Han informado neurógena del hipocamposis en el ratón adulto giro dentado después de la estimulación de alta frecuencia de la ATN 32. Estudios previos han informado de la disminución de 33 a 35 neurogénesis del hipocampo, en algunos casos de epilepsia como la epilepsia del lóbulo temporal, crónica y una asociación con déficit de aprendizaje, trastornos de la memoria y espontáneos recurrentes crisis motoras. Además, hubo una reducción de los factores de células madre progenitoras neurales tales como FGF2 y IGF-1 en el hipocampo crónicamente epiléptico en modelos animales 33. Teniendo en cuenta esto, las estrategias intervencionistas como la DBS que muestran un aumento de la neurogénesis en el giro dentado son vías interesantes para la investigación. Estos resultados nos han animado a explorar más profundamente en el mecanismo subyacente tratamiento neurogénesis post-DBS para la epilepsia. Hemos apuntado a la ATN tanto unilaterales (datos no informados), así como de forma bilateral (en los resultados representativos) y visto neurotrofina elevada (BDNF) expresión en el giro dentado de ratas. Nuestra chipótesis urrent es que la expresión de BDNF inicia una cascada de expresión génica que culmina en la neurogénesis que se traduce en el efecto antiepiléptico de la cirugía de DBS. En este trabajo, presentamos nuestros métodos para la cirugía de DBS focalización del ATN en ratas, seguido de análisis de expresión génica como un enfoque atractivo para estudiar el mecanismo que subyace a los beneficios de la DBS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Declaración de Ética: NOTA: Todos los procedimientos discutidos en este manuscrito son de acuerdo con las directrices del NIH para la Investigación Animal (Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio) y son aprobados por el Comité CICUAL Escuela de Medicina de Harvard.

Preparación 1. Pre-quirúrgico

  1. Asegúrese de que todos los instrumentos quirúrgicos se esterilizan mediante autoclave o bien mediante la limpieza con solución y / o etanol antiséptico según sea necesario. Siempre que sea posible, utilizar equipo desechable estéril tal como bisturís, agujas y jeringas.
  2. Cubra la mesa de trabajo con paños quirúrgicos y asegúrese de que hay una eliminación de residuos de riesgo biológico disponible.
  3. Pese la rata y el cálculo de la dosis de anestesia. Use una mezcla / xilazina ketamina (ketamina 75 mg / kg y xilazina 10 mg / kg) para anestesiar a las ratas.
    NOTA: Entre 200-250 g es el peso óptimo para la fijación adecuada del animal en el marco estereotáxico, así como para la orientación precisa de la ATN. Isoflurane también se puede utilizar como el agente anestésico.
  4. Monte y dos electrodos estériles seguras (esterilizados en autoclave o con óxido de etileno) en el soporte de electrodo (Figura 2) de un bastidor quirúrgico estereotáctica y con la ayuda de un microscopio (magnificación 10-40x), inspeccionan las puntas del electrodo adecuado para alineación. Asegure los dos electrodos 3,0 mm de diferencia.
    NOTA: Tenga cuidado de no dañar la punta del electrodo tocando en superficies duras.

2. DBS Cirugía

  1. Inyectar la ketamina / xilazina mezclar intraperitoneal al animal y confirme que el animal ha alcanzado un plano quirúrgico de anestesia (comprobando el reflejo toe-pinch, la frecuencia respiratoria y la profundidad y la regularidad de la respiración). Quitar el pelo de la región del cuero cabelludo que se realiza una incisión y desinfectar el cuero cabelludo con 3 friega alternantes cada una de betadine y alcohol o solución salina estéril. Asegure y coloque el animal en el fram estereotácticae.
  2. Utilice circulan pastillas de agua caliente para mantener la temperatura corporal del animal a un nivel óptimo. Aplicar lubricante ocular para los ojos del animal para protegerlo de un secado excesivo.
  3. Utilice las siguientes coordenadas estereotácticas para dirigir la ATN (anterior núcleo talámico): anterioposterior -1,6 mm, mediolateral 1,5 mm y 5,2 mm dorsoventral 1.
    NOTA: Las coordenadas estereotáxica se basan en el Paxinos y Watson (6ª edición) rata cerebro atlas 36.
  4. Hacer una incisión en el cuero cabelludo sagital para revelar el cráneo. El uso de un par de retractores asegurar el cuero cabelludo incisión para exponer el cráneo. Use una solución salina estéril para limpiar la incisión. Si la incisión es demasiado húmedo, utilizar hisopos de algodón estériles que se seque. Busque el bregma y marcar con un marcador negro. Para guiar la posición de los orificios de trepanación, hacen dos marcas más a aproximadamente 1,5 mm mediolateral en ambos lados de la sutura sagital y 1,6 mm posterior a la coronal sutura.
  5. Use un taladro de mano para hacer los agujeros de trépano. Asegúrese de que la punta del orificio de trépano es estéril mediante la esterilización con etanol. Sostenga el taladro aproximadamente a un ángulo de 45 ° a la superficie del cráneo durante la perforación. Cambiar con frecuencia entre los dos agujeros de trépano para evitar el calor excesivo en el lugar de cualquier trepanación.
  6. Continúa la perforación hasta que se vea la duramadre. Usando una aguja con su punta doblada asemeja la forma de una "L", retire los trozos rotos de hueso que pudieran obstruir la inserción del electrodo. Tenga cuidado de no dañar la duramadre y / o tejido cerebral subyacente mientras se quita fragmentos de hueso con la aguja doblada.
    NOTA: El uso de una aguja roma o fórceps romos finas es también una opción.
  7. Fijar el conjunto de electrodo dual a la empuñadura giratoria del marco estereotáxico y fijar el mango en un ángulo de 90 °. El uso de los ajustes en el marco estereotáxico, coloque el electrodo izquierdo exactamente encima del bregma.
  8. Usando el equipo de músicaajustes táctica para posicionamiento mediolateral, se mueven con precisión el electrodo izquierdo 1,5 mm hacia el lado izquierdo de bregma de tal manera que ahora hay dos electrodos perfectamente alineadas a lo largo de la sutura coronal, pero separados en 1,5 mm mediolateral desde el bregma.
  9. Usando los ajustes estereotácticas anterioposterior, mover los electrodos 1,6 mm posterior a la sutura coronal.
  10. Utilice los ajustes dorsoventrales para bajar los electrodos a primera verificación si los agujeros de trépano se han hecho en el lugar adecuado de tal manera que los electrodos pueden insertarse con facilidad, sin tocar los bordes ásperos de las trepanaciones. Si es así, insertar los electrodos a una profundidad de 5,2 mm desde la superficie del cráneo.
  11. Conectar los electrodos a través de cables a un estimulador fijado en 130 Hz, 2,5 V y 90 microsegundos pulsewidth 1.
  12. Entregar la estimulación de alta frecuencia durante una hora (o durante un período de tiempo deseado según la configuración experimental). Durante el transcurso de la estimulación, recordar para asegurar pprofundidad de la anestesia Roper regularmente mediante la comprobación de la ausencia de retirada de la pata en respuesta a una pizca dedo del pie. Complementar la anestesia con aproximadamente la mitad de la dosis inicial utilizada para inducir la anestesia. Evite la contaminación de los guantes estériles al comprobar la profundidad anestésica y cambiarlos si es necesario. Realice la estimulación unilateral o bilateral basada en las necesidades experimentales de uno. Incluir controles tales como la estimulación de baja frecuencia (por ej., 10 Hz) y animales (sin estimular la inserción de electrodos sin estimulación posterior).
  13. Después de la estimulación se realiza, retire los electrodos con cuidado y suturar la incisión con 3-0 suturas o con grapas quirúrgicas estériles.
  14. Administrar buprenorfina (0,05 mg / kg) por vía subcutánea como analgesia. Monitorear el animal hasta que vuelve a la actividad normal y luego regresar a su centro de vivienda.
  15. Después de un período de tiempo basado en el diseño experimental (por ejemplo, 0, 3, 6 o 12 horas después de la cirugía de DBS), Sacrificar al animal con sobredosis de anestesia. Después de confirmar la ausencia de signos vitales, decapitar al animal.
  16. Diseccionar el cerebro eliminando primero la piel con unas tijeras. Cortar el hueso largo de la sutura sagital con unas tijeras de disección. Hacer dos incisiones más (alrededor de una pulgada cada una) a través del hueso en ambos lados laterales. El uso de pinzas, levante la pieza cortada parcialmente de hueso de la parte superior del cráneo para exponer el cerebro.
  17. Con unas tijeras o pinzas finas, desalojar el cerebro del cráneo y transferir a una placa de Petri con PBS frío en hielo.
    NOTA: Tenga cuidado de evitar daños en el cerebro, mientras que hacer las incisiones a través del hueso.

3. Hippocampus Aislamiento

NOTA: Realice todos los pasos posteriores de esta sección en el hielo.

  1. Coloque el cerebro en una matriz de cerebro de acrílico pre-enfriado en hielo. Utilizando una hoja de afeitar, cortar el cerebro coronal en aproximadamente 7-8 mm de la anterior-más edge del cerebro. Hacer un segundo corte coronal y posterior a la primera corte de manera que un corte de cerebro de aproximadamente 5 mm de espesor podría ser eliminado.
  2. Transferir el corte de cerebro a una placa Petri con PBS enfriado con hielo. El uso de hoja de afeitar, cortar las dos secciones semiesféricas y cuidar señalar que hemisferio corresponde a los lados izquierdo y derecho respectivamente. Esto es especialmente importante en el desempeño de estimulaciones unilaterales.
  3. Utilizando pinzas finas y tijeras eliminar el hipocampo cuidadosamente.
  4. Flash congelar el tejido del hipocampo en hielo seco y tienda en congelador a -20ºC hasta el momento de las etapas de extracción de ARN posteriores.
    NOTA: Para el almacenamiento a largo plazo, es recomendable almacenar tejido en un congelador a -80ºC.

4. La extracción de RNA y PCR cuantitativa

  1. Asegúrese de que el tejido se mantiene congelada en hielo seco hasta que esté listo para la homogeneización.
  2. NOTA: Realice este paso en la campana.
    1. Añadir 1 ml de reactivo Tri a hippocampal tejido en un tubo de centrífuga de 1,5 ml y homogeneizar por primera pipeteado varias veces hasta que el tejido se rompe en trozos más pequeños. Además homogeneizar el tejido pasando a través de una jeringa con una aguja de 25 G hasta que no haya tejido ininterrumpida visible. Realice los pasos de homogeneización en el hielo.
    2. Después de homogeneizar el tejido, permite la suspensión de células en reposo a temperatura ambiente durante 5 min para permitir la lisis celular.
      NOTA: Después de este punto, la suspensión de células puede ser rápido congelado y almacenado en -70 ° C hasta su posterior procesamiento.
  3. Añadir 0,2 ml de cloroformo y se mezcla mediante agitación con vórtex durante 20 segundos y dejar el resto solución a temperatura ambiente durante 15 min.
  4. Centrifugar las muestras a 12.000 xg durante 15 min a 4 ° C. Después de la centrifugación, quite los tubos cuidadosamente sin molestar a las tres capas separadas que serán visibles.
    NOTA: La fase inferior (rojo) contiene proteínas, fase nublado media contiene ADN y la fase clara superior contiene RN / A.
  5. Transferir la fase clara superior (ARN) en un tubo de centrífuga de 1,5 ml fresca (típicamente se obtienen 500 l de ARN que contiene la fase). Para este complemento 0,5 ml de isopropanol y mezclar mediante agitación. Para este complemento 2/3 l de glucógeno (20 mg / ml) como transportista por la ARN. Permita que la muestra para descansar sobre la mesa a temperatura ambiente durante 10 min.
  6. Centrifugar la muestra a 12.000 xg durante 1 hora a 4 ° C. Asegúrese de que el sedimento de ARN es visible en la parte inferior del tubo.
  7. Descartar el sobrenadante y lavar el sedimento de ARN mediante la adición de 1 ml de etanol al 75% (hecho con agua libre de nucleasa). Invertir la muestra varias veces hasta que el pellet se desplaza desde el fondo del tubo y flota en la solución. Centrifugar la solución a 12.000 xg durante 10 min a 4 ° C.
    NOTA: El sedimento en etanol al 75% se puede almacenar a -20 ° C hasta su posterior pasos.
  8. Permitir que el sedimento de ARN se seque al aire dejando los tubos abierta durante 5 min a temperatura ambiente. Tome precauciones para evitar over secar el pellet ya que esto podría afectar a su disolución en agua en la etapa subsiguiente.

5. Extracción de ADN de la preparación de ARN

  1. Añadir 9 l de agua libre de nucleasa al sedimento de ARN y asegúrese de que el sedimento se disuelve antes de proceder suavemente vórtex el tubo. Para esta añada 1 l de 10x ADNasa I Buffer y 1 l de DNasa recombinante (del kit DNasa I), mezclar suavemente con un movimiento rápido de los tubos, brevemente girar los tubos e incubar a 37 ° C en un baño de agua durante 30 minutos.
  2. Añadir 2 l de reactivo de inactivación de ADNasa (del kit de DNasa I) a la muestra e incubar a temperatura ambiente durante 2 min y se mezcla a menudo por agitando suavemente el tubo. Centrifugar a 12000 xg durante 10 min y la transferencia de aproximadamente 10 l del sobrenadante claro a un tubo de centrífuga de 1,5 ml frescos.
  3. Medir la concentración de ARN usando un espectrofotómetro NanoDrop o.

6. Hacer ADNc a partir de ARN

  1. Añadir º volumen requeridoen contiene 1 g de ARN y llevar el volumen total a 8 l mediante la adición de agua libre de nucleasa. Para este complemento mM dNTP 1 l 10 mezclar y 1 l de hexámeros aleatorios del kit Superíndice primer capítulo de síntesis. Mezclar suavemente y se incuba a 65 ° C durante 5 minutos, ya sea en un baño de agua o en un termociclador preprogramado.
  2. Hacer una premezcla que contiene los siguientes reactivos: 2 l de 10x tampón de RT, 4 l de 25 M de MgCl 2, 2 l de 0,1 M DTT y 1 l de ARNasa OUT (40 U / l).
    NOTA: Los volúmenes dados son por reacción, el usuario tendría que aumentar la escala de acuerdo a las necesidades experimentales de uno.
  3. Después de eliminar el ARN que contiene la muestra de 65 ° C, colocar el tubo a temperatura ambiente durante un minuto. Añadir la solución de premezcla 9 l e incubar a temperatura ambiente durante 2 min. Añadir 1 l de Superscript II enzima transcriptasa inversa (50 U / l) y luego se incuba a temperatura ambiente durante 10 min.
  4. Incubar las muestras a 42 ° C durante 50min para la transcripción inversa que se produzca.
  5. Incubar las muestras a 70 ° C durante 15 min para terminar la reacción.
  6. Colocar las muestras en hielo brevemente y añadir 1 l RNAseH (2 U / l) y se incuba a 37 ° C durante 20 minutos.
  7. Brevemente centrifugar los tubos a 3000 xg para centrifugar el líquido condensado.
    NOTA: Este es el cDNA que se utilizará para la PCR cuantitativa. cDNA puede ser almacenado en congelador a -20ºC hasta que la instalación PCR. ADNc también se puede diluir con agua libre de nucleasa antes de proceder a PCR.

7. PCR cuantitativa

  1. Hacer una mezcla maestra que contiene los siguientes reactivos (volúmenes dados son por reacción): 6,3 l de 2x SYBR Green Mix, 0,6 l de Forward Primer (10 M), 0,6 l de cebador inverso (10 M) y 0,5 l de nucleasa agua libre .
    NOTA: Primer diseño se realizó utilizando la opción en la página secuencia de nucleótidos de NCBI 'Primers Pick' para el gen de interés.
  2. Añadir 10 l de mezcla maestra a cada pocillo de una placa de 96 PCR bien. Añadir 2,5 l de cDNA hechas anteriormente al pozo que contiene la mezcla maestra. Asegúrese de configurar las reacciones de PCR por triplicado para cada muestra.
  3. Después de completar la adición de mezcla maestra y de ADNc, cubrir la placa de PCR usando una lámina adhesiva óptica para sellar los pocillos. Se centrifuga la placa brevemente durante 5 min a 500 xg en una centrífuga de mesa para resolver todo el líquido a la parte inferior del pozo.
  4. Cargar la placa de PCR en una máquina RT-PCR pre-programado. Utilice los parámetros de PCR proporcionados en la Tabla 1.
  5. Análisis de datos: Utilice los valores C t desde la salida qPCR para otros cálculos. Junto con el gen de la prueba, configurar las reacciones de PCR para los genes de control interno, 18S rRNA (para garantizar la igualdad de entrada) y β-actina (control negativo). Calcular cambios veces basadas en el método ΔΔCt 37.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figuras 1A y 1B muestran la expresión relativa de BDNF y GABRD en relación con el gen de control de β-actina. BDNF, una neurotrofina se asocia a menudo con efectos neuroprotectores en muchas enfermedades neuronales 38-41. Por tanto, es interesante analizar el perfil de expresión de BDNF en respuesta a la estimulación de la ATN que produce beneficios terapéuticos a pacientes epilépticos. En la Figura 1A que muestra el perfil de expresión génica de BDNF a través de los puntos de tiempo indicados publicar DBS estimulación, BDNF sobre regulación se observa inmediatamente (0 h) después de la cirugía de DBS junto con el pico de expresión (3 veces mayor que sin estimular) a las 3 h estimulación posterior. Esta observación sugiere que el aumento de la expresión de BDNF y la neuroprotección resultante podrían contribuir al beneficio terapéutico del DBS. Otra GABRD gen (Figura 1B) también se investigó usando el método de qPCR. GABRD es un WHI receptor GABAch es uno de los objetivos potenciales para el diseño de fármacos contra la epilepsia 42. El perfil de expresión de GABRD también muestra una mayor expresión en los animales estimulados en comparación con los animales control no estimuladas a colocar DBS 3 hr. Teniendo en cuenta que los agonistas de GABA se utilizan como supresores de convulsiones eficaces, es interesante observar mejorado posterior expresión GABRD DBS, lo que implica un posible papel de GABA en el efecto antiepiléptico de DBS.

El protocolo de RT-PCR descrito aquí produce resultados reproducibles y cuantitativos que revelan los patrones de expresión de genes y las diferencias de plegado relativa en comparación con los animales de control. El análisis de datos se realiza de la siguiente manera: La salida de qPCR da el valor umbral t C para el gen de prueba para cada muestra analizada. C t valores también se obtienen para los genes de control de β-actina y 18S rRNA (control de entrada). El método t ΔΔC se utilizará entonces para calcular la expr genperfil esión usar éstos C t valores de 37. Por ejemplo, para calcular los cambios de expresión génica para BDNF, para una muestra dada, la diferencia entre el valor t C para BDNF y 18S rRNA se calcula y es la primera? C t. Para la misma muestra, la diferencia entre el valor de t C para β-actina y 18S rRNA se calcula para dar el segundo? C t. La diferencia entre los dos valores? C t se calcula para dar ΔΔC t. Este valor t ΔΔC se utiliza para calcular 2 ^ (-ΔΔC t) que da la abundancia relativa de plantilla BDNF en comparación con β-actina. Trazando este valor a través de los diferentes puntos de tiempo junto al control no estimulado, los cambios de expresión génica inducida por DBS través de los puntos de tiempo se pueden visualizar. El método descrito anteriormente puede ser utilizado eficazmente para investigar los cambios en la expresión de otros genes que son potencial francaates que respondan a DBS estimulación e investigar algunos de los efectos aguas abajo de la modulación de la expresión de estos genes.

Figura 1
Figura 1: Análisis curso (A) Tiempo de expresión de BDNF en respuesta a la estimulación de alta frecuencia de la ATN. La recolección de tejidos, extracción de ARN, la preparación de cDNA y q-PCR se realizaron como se explica en el protocolo. Los cambios relativos en la expresión génica se calculan después de la normalización para la entrada (mediante la amplificación de 18S rRNA), así como un gen de control (β-actina). C t valores obtenidos de la PCR en tiempo real se usaron para calcular los niveles de expresión por el método t ΔΔ C 37. Los puntos de tiempo analizados son 0, 3, 6 y 12 horas después de la estimulación cerebral profunda estimulación. Nota: Los puntos de tiempo seleccionados aquí son con respecto a un estudio particular y está sujeto a cambios de acuerdo a la hyhipóte- y el plan experimental. (B) Análisis de golf Tiempo de GABA A subunidad delta del receptor (GABRD) niveles en respuesta a DBS a 130 Hz focalización del ATN. Métodos y cálculos se realizaron como similar a los datos de BDNF.

Figura 2
Figura 2: electrodos de DBS y estimulador establecieron.

Ciclos de PCR
Etapa 1: La desnaturalización inicial 95 ° C 15 min
Etapa 2: La desnaturalización 95 ° C 15 sec
Recocido 60 ° C 30 sec
Extensión 72 ° C 30 sec
40 ciclos de Paso 2
Nota: La temperatura de hibridación varía de acuerdo con la
temperatura de fusión del cebador. Los cebadores se diseñan típicamente
tener una temperatura de hibridación óptima de 60 ° C

Tabla 1: Parámetros de PCR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Siguiendo el trabajo de la señal por Benabid et al., En el uso de la estimulación cerebral profunda para tratar la enfermedad de Parkinson y temblor esencial, la técnica quirúrgica DBS ha sido investigado con mucho interés en la última década para tratar muchos trastornos neurológicos 6,10,43. Estudios DBS dirigidas a las distintas regiones neuro-anatómico de los circuitos cerebrales se realizan actualmente por muchos grupos para hacer frente a las principales enfermedades neuronales y se encuentran en distintas fases de los ensayos clínicos. La estimulación del núcleo subtalámico (STN) o el segmento interno del globus pallidus (GPI) está aprobado por la FDA y se utiliza en el tratamiento de trastornos del movimiento en la enfermedad de Parkinson 10. El ensayo clínico SANTE ha mostrado tendencias prometedoras para los pacientes epilépticos que recibieron la estimulación de alta frecuencia del núcleo talámico anterior 31. Los resultados de un ensayo clínico fase I de la estimulación bilateral forniceal han mostrado un retraso en la tasa de deterioro cognitivo y una reversal de la captación de glucosa hipometabólico visto en la enfermedad de Alzheimer así como la activación de la circuitería de la memoria 8,44. Por otra parte, en los últimos años los neurocirujanos han realizado ensayos de DBS para el tratamiento de los trastornos neuropsiquiátricos como el TOC (trastorno obsesivo compulsivo), la depresión resistente al tratamiento, el síndrome de Tourette y la adicción 10,45-55.

Además de los ensayos clínicos, en los últimos años, la cirugía de los animales nos ha ofrecido grandes oportunidades para estudiar los cambios fisiológicos inducidos por la técnica quirúrgica en un animal vivo, de una manera sin precedentes mediante cualquier técnica in vitro. En este manuscrito, hemos discutido los métodos empleados en la realización de la cirugía de estimulación cerebral profunda en los roedores. La cirugía estereotáctica en roedores como se describe aquí también podría ser usada para búsquedas de destino potenciales de DBS y para probar la eficacia de la cirugía usando modelos animales de la enfermedad. Uno de los retos para el experimentador hERE es ser capaz de dirigirse a la locus anatómica correcta de una manera reproducible. Hay especialmente una necesidad de un técnico experto para la cirugía debido a la comprobación de la orientación correcta es posible sólo después de la estimulación se realiza y el animal sacrificado. También de vez en cuando, se podría dañar accidentalmente un vaso sanguíneo clave que podría llevar a una pérdida importante de sangre y, a veces incluso la muerte del animal. Además, la necesidad de diseccionar el hipocampo para su posterior análisis bioquímico limita la posibilidad de verificación inmunohistoquímico para electrodo adecuada focalización en el mismo animal que requiere un espécimen cerebro intacto para seccionar los tejidos. Adecuada focalización electrodo posiblemente podría ser revisado en un animal diferente estimulado de manera idéntica. Sin embargo, esto no proporciona evidencia de una adecuada focalización en el animal de experimentación y es una limitación de este enfoque. Publicaciones recientes han tratado de eludir este problema mediante la realización de la cirugía de DBS con simultaneouEs fMRI 56. Una posible mejora de la técnica descrita aquí podría ser un estudio sobre los efectos de la estimulación crónica a través de un estimulador implantado en el animal. Sin embargo, hemos limitado nuestro análisis para una sola dosis (1 hr) de la estimulación de alta frecuencia como el primer paso para la comprensión de los cambios inducidos por DBS a nivel celular.

Teniendo en cuenta el uso de la cirugía DBS para una variedad de trastornos neuronales, es esencial que sabemos que el mecanismo subyacente a los efectos beneficiosos de DBS. Esta información es crítica para el desarrollo de futuras mejoras en la cirugía y también para explorar la utilidad de DBS como un tratamiento para otras enfermedades que no han sido investigados por expertos en DBS. Además, las modificaciones de la técnica quirúrgica se pueden implementar para evitar ciertos efectos secundarios perjudiciales del procedimiento y hacer frente eficazmente a la recurrencia de la condición de la enfermedad.

Un profundo mecanicista analisis de DBS es posible mediante el examen de los cambios de expresión génica inducida por DBS. O bien un enfoque de genes candidatos basada en los conocimientos existentes sobre las vías neuronales que responden a estímulos despolarizantes tales como la estimulación de alta frecuencia, o un análisis de transcriptoma mundial puede dar pistas importantes sobre los eventos moleculares desencadenados por DBS. Las técnicas de análisis de expresión génica (enfoque de genes candidatos, así como métodos de alto rendimiento) son herramientas poderosas que son clave para la exploración de los mecanismos moleculares y cambios celulares asociados con la cirugía de DBS. Los acontecimientos recientes en este campo han hecho posible para nosotros para conseguir una gran cantidad de información sobre varios aspectos de la fisiología celular en un tiempo muy corto, que no era posible hace unos años. Con el advenimiento de la tecnología de secuenciación de alto rendimiento tales como ChIPseq, es posible caracterizar la ubicación de todo el genoma de importantes factores de transcripción que responden a DBS 57,58. Los descubrimientos recientes que vinculan no-coding ARN como microARN con enfermedades neurodegenerativas, nos permitirá analizar los posibles cambios en los niveles de miRNA en las neuronas post-DBS utilizando la tecnología de secuenciación miARN 59,60. Posibles cambios en firmas epigenéticos como la metilación del ADN y las histonas modificaciones en respuesta a DBS también podrían explorarse. Sin embargo, a pesar de las ventajas, es importante reconocer algunas de las limitaciones de estas técnicas, así como los posibles problemas que puedan surgir durante el análisis. Una preocupación importante con análisis de expresión génica ha sido reproducibilidad y errores técnicos. Es importante que el experimentador toma nota de esto y planea en tener un número adecuado de repeticiones para garantizar la fiabilidad. Un problema común con algunos de los estudios de cribado de alto rendimiento ha sido la dificultad en la interpretación de la enorme cantidad de datos que se generan. A veces se hace importante determinar si los cambios de expresión génica observados son debidos al efecto directodel tratamiento experimental o es un efecto aguas abajo. Esto por lo general requiere de estudios adicionales que están diseñados para abordar esta cuestión.

Además de los estudios genómicos, un extenso análisis inmunohistoquímico de la localización espacio-temporal de los principales actores que responden a DBS y una cuantificación de los cambios en sus niveles en diversas regiones del cerebro será un gran activo para el futuro desarrollo de la procedimiento quirúrgico DBS. Los resultados acumulados de la expresión génica de análisis, así como los estudios inmunohistoquímicos pueden revelar nuevas interacciones entre los factores clave, así como los eventos moleculares claves que regulan los procesos celulares, como la neurogénesis o la neurodegeneración. La identificación de estos marcadores moleculares críticos también puede permitir futuras descubrimientos de drogas. Estos hallazgos podrían arrojar luz sobre el funcionamiento general de los circuitos cerebrales, que es una valiosa información desde la perspectiva de los científicos que trabajan para comprender al hombreenfermedades neuronales y. Dirigir nuestros esfuerzos futuros en la integración de los últimos avances tecnológicos realizados en la clínica, así como el laboratorio es probable que nos ofrecen ventajas sustanciales en la lucha contra la enfermedad.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Deep Brain Stimulation Surgery
Stereotactic frame Kopf Instruments Model 900
Drill  Dremmel 7700, 7.2 V
Scalpel BD 372610
Ketamine Patterson Veterinary 07-803-6637 Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules
Xylazine Patterson Veterinary 07-808-1947
Buprenorphine Patterson Veterinary 07-850-2280 Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules
Surgical staples ConMed Corporation 8035
Sutures (3-0)  Harvard Apparatus 72-3333
Syringe (1 ml, 29 1/2 G) BD 329464 Sterile, use for Anesthesia administration intraperitoneally
Syringe (3 ml, 25 G) BD 309570 Sterile, use for Analgesia administration subcutaneously
Needles BD 305761 Sterile, use for clearing broken bone pieces from the burr holes
Ethanol Fisher Scientific S25309B Use for general sterilization 
Eye Lubricant Fisher Scientific 19-898-350
Stimulator Medtronic Model 3628
DBS electrodes Rhodes Medical Instruments, CA SNEX100x-100 mm Electrodes are platinum, concentric and bipolar
Betadine (Povidone-Iodine)  PDI S23125 Single use swabsticks, use for sterilizing the scalp before making incision 
 Brain Dissection and Hippocampal tissue isolation
Acrylic Rodent Brain Matrix Electron Microscopy Sciences 175-300 www.emsdiasum.com
Razor Blade V W R 55411-050
Guillotine Scissors Clauss 18039 For decapitation, make sure these scissors are maintained in clean and working condition
Scissors Codman Classic 34-4098 Use for removing the brain from the skull
Forceps Electron Microscopy Sciences 72957-06 Use for removing the brain from the skull and for handling during dissection
Phosphate Buffered Saline  Boston Bioproducts BM-220
 RNA Extraction and cDNA Preparation
Tri Reagent Sigma T9424 Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin
Syringe (3 ml, 25 G) BD 309570 Use for tissue homogenization
Chloroform Fisher Scientific BP1145-1 Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin
Isopropanol Fisher Scientific A416-1
Glycogen Thermo Scientific R0561
Dnase I Kit Ambion AM1906
Superscript First Strand Synthesis Kit Invitrogen 11904-018
Tabletop Microcentrifuge Eppendorf 5415D
 Quantitative PCR               
SYBR Green PCR Kit Qiagen 204143
Custom Oligos Invitrogen 10668051
PCR Plates (96 wells) Denville Scientific C18080-10
Optical Adhesive Sheets Thermo Scientific AB1170
Nuclease free Water Thermo Scientific SH30538-02
Real Time PCR Machine Applied Biosystems 7500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Toda, H., Hamani, C., Fawcett, A. P., Hutchison, W. D., Lozano, A. M. The regulation of adult rodent hippocampal neurogenesis by deep brain stimulation. Journal of. 108, 132-138 (2008).
  2. Perlmutter, J. S., Mink, J. W. Deep brain stimulation. Annual review of neuroscience. 29, 229-257 (2006).
  3. Bergstrom, M. R., Johansson, G. G., Laitinen, L. V., Sipponen, P. Electrical stimulation of the thalamic and subthalamic area in cerebral palsy. Acta physiologica Scandinavica. 67, 208-213 (1966).
  4. Benabid, A. L., et al. Chronic electrical stimulation of the ventralis intermedius nucleus of the thalamus as a treatment of movement disorders. Journal of neurosurgery. 84, 203-214 (1996).
  5. Benabid, A. L., et al. Long-term electrical inhibition of deep brain targets in movement disorders. Movement disorders : official journal of the Movement Disorder Society. 13, Suppl 3. 119-125 (1998).
  6. Benabid, A. L., et al. Long-term suppression of tremor by chronic stimulation of the ventral intermediate thalamic nucleus. Lancet. 337, 403-406 (1991).
  7. Tierney, T. S., Lozano, A. M. Surgical treatment for secondary dystonia. Movement disorders : official journal of the Movement Disorder Society. 27, 1598-1605 (2012).
  8. Tierney, T. S., Sankar, T., Lozano, A. M. Some recent trends and further promising directions in functional neurosurgery. Acta neurochirurgica. Supplement. 117, 87-92 (2013).
  9. Tierney, T. S., Sankar, T., Lozano, A. M. Deep brain stimulation emerging indications. Progress in brain research. 194, 83-95 (2011).
  10. Sankar, T., Tierney, T. S., Hamani, C. Novel applications of deep brain stimulation. Surgical neurology international. 3, S26-S33 (2012).
  11. Tierney, T. S., Vasudeva, V. S., Weir, S., Hayes, M. T. Neuromodulation for neurodegenerative conditions. Frontiers in bioscience. 5, 490-499 (2013).
  12. Mayberg, H. S., et al. Deep brain stimulation for treatment-resistant depression. Neuron. 45, 651-660 (2005).
  13. Lyons, M. K. Deep brain stimulation: current and future clinical applications. Mayo Clinic proceedings. 86, 662-672 (2011).
  14. Ch. 4. Rehabilitation in movement disorders. Lansek, R., Morris, M. E. , Cambridge University Press. 36-43 (2013).
  15. Goodwin, R., Tierney, T., Lenz, F., Anderson, W. Ch. 15. Single Neuron Studies of the Human Brain: Probing Cognition. Fried, I., Rutishauser, U., Cerf, M., Kreiman, G. 15, MIT Press. 275-293 (2014).
  16. Hauser, W. A. Epidemiology of epilepsy in children. Neurosurgery clinics of North America. 6, 419-429 (1995).
  17. Hauser, W. A. Recent developments in the epidemiology of epilepsy. Acta neurologica Scandinavica. Supplementum. 162, 17-21 (1995).
  18. Davis, R., Emmonds, S. E. Cerebellar stimulation for seizure control: 17-year study. Stereotactic and functional neurosurgery. 58, 200-208 (1992).
  19. Levy, L. F., Auchterlonie, W. C. Chronic cerebellar stimulation in the treatment of epilepsy. Epilepsia. 20, 235-245 (1979).
  20. Velasco, A. L., et al. Electrical stimulation of the hippocampal epileptic foci for seizure control: a double-blind, long-term follow-up study. Epilepsia. 48, 1895-1903 (2007).
  21. Tellez-Zenteno, J. F., McLachlan, R. S., Parrent, A., Kubu, C. S., Wiebe, S. Hippocampal electrical stimulation in mesial temporal lobe epilepsy. Neurology. 66, 1490-1494 (2006).
  22. Kerrigan, J. F., et al. Electrical stimulation of the anterior nucleus of the thalamus for the treatment of intractable epilepsy. Epilepsia. 45, 346-354 (2004).
  23. Hamani, C., et al. Deep brain stimulation of the anterior nucleus of the thalamus: effects of electrical stimulation on pilocarpine-induced seizures and status epilepticus. Epilepsy research. 78, 117-123 (2008).
  24. Hamani, C., et al. Bilateral anterior thalamic nucleus lesions and high-frequency stimulation are protective against pilocarpine-induced seizures and status epilepticus. Neurosurgery. 54, 191-195 (2004).
  25. Mirski, M. A., Rossell, L. A., Terry, J. B., Fisher, R. S. Anticonvulsant effect of anterior thalamic high frequency electrical stimulation in the rat. Epilepsy research. 28, 89-100 (1997).
  26. Mirski, M. A., Ferrendelli, J. A. Interruption of the mammillothalamic tract prevents seizures in guinea pigs. Science. 226, 72-74 (1984).
  27. Mirski, M. A., Ferrendelli, J. A. Anterior thalamic mediation of generalized pentylenetetrazol seizures. Brain research. 399, 212-223 (1986).
  28. Mirski, M. A., Ferrendelli, J. A. Interruption of the connections of the mammillary bodies protects against generalized pentylenetetrazol seizures in guinea pigs. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 7, 662-670 (1987).
  29. Mirski, M. A., McKeon, A. C., Ferrendelli, J. A. Anterior thalamus and substantia nigra: two distinct structures mediating experimental generalized seizures. Brain research. 397, 377-380 (1986).
  30. Lee, K. J., Jang, K. S., Shon, Y. M. Chronic deep brain stimulation of subthalamic and anterior thalamic nuclei for controlling refractory partial epilepsy. Acta neurochirurgica. Supplement. 99, 87-91 (2006).
  31. Fisher, R., et al. Electrical stimulation of the anterior nucleus of thalamus for treatment of refractory epilepsy. Epilepsia. 51, 899-908 (2010).
  32. Encinas, J. M., Hamani, C., Lozano, A. M., Enikolopov, G. Neurogenic hippocampal targets of deep brain stimulation. The Journal of comparative neurology. 519, 6-20 (2011).
  33. Hattiangady, B., Rao, M. S., Shetty, A. K. Chronic temporal lobe epilepsy is associated with severely declined dentate neurogenesis in the adult hippocampus. Neurobiology of disease. 17, 473-490 (2004).
  34. Kuruba, R., Hattiangady, B., Shetty, A. K. Hippocampal neurogenesis and neural stem cells in temporal lobe epilepsy. Epilepsy & behavior : E&B. 14, Suppl 1. 65-73 (2009).
  35. Hattiangady, B., Shetty, A. K. Implications of decreased hippocampal neurogenesis in chronic temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 49, Suppl 5. 26-41 (2008).
  36. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Elsevier Inc. (2007).
  37. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 22DDCT Method. METHODS. 25, 402-408 (2001).
  38. Kells, A. P., et al. AAV-mediated gene delivery of BDNF or GDNF is neuroprotective in a model of Huntington disease. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 9, 682-688 (2004).
  39. Han, B. H., Holtzman, D. M. BDNF protects the neonatal brain from hypoxic-ischemic injury in vivo via the ERK pathway. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 20, 5775-5781 (2000).
  40. Hetman, M., Kanning, K., Cavanaugh, J. E., Xia, Z. Neuroprotection by brain-derived neurotrophic factor is mediated by extracellular signal-regulated kinase and phosphatidylinositol 3-kinase. The Journal of biological chemistry. 274, 22569-22580 (1999).
  41. Stadelmann, C., et al. BDNF and gp145trkB in multiple sclerosis brain lesions: neuroprotective interactions between immune and neuronal cells. Brain : a journal of neurology. 125, 75-85 (2002).
  42. Treiman, D. M. GABAergic mechanisms in epilepsy. Epilepsia. 42, Suppl 3. 8-12 (2001).
  43. Benabid, A. L., Pollak, P., Louveau, A., Henry, S., de Rougemont, J. Combined (thalamotomy and stimulation) stereotactic surgery of the VIM thalamic nucleus for bilateral Parkinson disease. Applied neurophysiology. 50, 344-346 (1987).
  44. Laxton, A. W., et al. A phase I trial of deep brain stimulation of memory circuits in Alzheimer's disease. Annals of. 68, 521-534 (2010).
  45. Tierney, T. S., Abd-El-Barr, M. M., Stanford, A. D., Foote, K. D., Okun, M. S. Deep brain stimulation and ablation for obsessive compulsive disorder: evolution of contemporary indications, targets and techniques. The International journal of neuroscience. 124, 394-402 (2014).
  46. Kennedy, S. H., et al. Deep brain stimulation for treatment-resistant depression: follow-up after 3 to 6 years. The American journal of psychiatry. 168, 502-510 (2011).
  47. Lozano, A. M., et al. Subcallosal cingulate gyrus deep brain stimulation for treatment-resistant depression. Biological psychiatry. 64, 461-467 (2008).
  48. Ackermans, L., et al. Double-blind clinical trial of thalamic stimulation in patients with Tourette syndrome. Brain : a journal of neurology. 134, 832-844 (2011).
  49. Houeto, J. L., et al. Tourette's syndrome and deep brain stimulation. Journal of neurology, neurosurgery, and psychiatry. 76, 992-995 (2005).
  50. Maciunas, R. J., et al. Prospective randomized double-blind trial of bilateral thalamic deep brain stimulation in adults with Tourette syndrome. Journal of neurosurgery. 107, 1004-1014 (2007).
  51. Koning, P. P., Figee, M., van den Munckhof, P., Schuurman, P. R., Denys, D. Current status of deep brain stimulation for obsessive-compulsive disorder: a clinical review of different targets. Current psychiatry reports. 13, 274-282 (2011).
  52. Greenberg, B. D., et al. Deep brain stimulation of the ventral internal capsule/ventral striatum for obsessive-compulsive disorder: worldwide experience. Molecular psychiatry. 15, 64-79 (2010).
  53. Muller, U. J., et al. Successful treatment of chronic resistant alcoholism by deep brain stimulation of nucleus accumbens: first experience with three cases. Pharmacopsychiatry. 42, 288-291 (2009).
  54. Zhou, H., Xu, J., Jiang, J. Deep brain stimulation of nucleus accumbens on heroin-seeking behaviors: a case report. Biological psychiatry. 69, e41-e42 (2011).
  55. Porta, M., et al. Thalamic deep brain stimulation for treatment-refractory Tourette syndrome: two-year outcome. Neurology. 73, 1375-1380 (2009).
  56. Younce, J. R., Albaugh, D. L., Shih, Y. Y. Deep brain stimulation with simultaneous FMRI in rodents. Journal of visualized experiments : JoVE. , e51271 (2014).
  57. Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature reviews. Genetics. 10, 669-680 (2009).
  58. Valouev, A., et al. Genome-wide analysis of transcription factor binding sites based on ChIP-Seq data. Nature methods. 5, 829-834 (2008).
  59. Fiore, R., Siegel, G., Schratt, G. MicroRNA function in neuronal development, plasticity and disease. Biochimica et biophysica acta. 1779, 471-478 (2008).
  60. Hebert, S. S., De Strooper, B. Alterations of the microRNA network cause neurodegenerative disease. Trends in neurosciences. 32, 199-206 (2009).

Tags

Neuroscience Edición 97 núcleo talámico anterior la estimulación profunda del cerebro circunvolución dentada el hipocampo la epilepsia la expresión génica la estimulación de alta frecuencia RT-PCR cuantitativa
Análisis de los cambios de expresión génica en la Rata Hippocampus Después de la estimulación cerebral profunda del tálamo anterior Núcleo
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Selvakumar, T., Alavian, K. N.,… More

Selvakumar, T., Alavian, K. N., Tierney, T. Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus. J. Vis. Exp. (97), e52457, doi:10.3791/52457 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter