Summary
Denne protokol beskriver den primære kultur / co-kultur af muse ovarievæv hjælp ovarier fra neonatale mus og individuelle ovariefollikler fra præpubertale mus. De dyrkningsteknikker støtte udviklingen i en yderst fysiologisk måde tillader undersøgelse af virkningen af ydre midler på æggestokkene, og interaktioner mellem ovariefollikler.
Abstract
Pattedyr æggestok er sammensat af ovariefollikler, hver follikel bestående af en enkelt oocyt omgivet af somatiske granulosaceller, lukket sammen inden for en basalmembran. Et endeligt pulje af follikler er fastsat under fosterudviklingen, når oocytter i meiotisk anholdelse danner et tæt samarbejde med flade granulosaceller, danner primordiale follikler. Ved eller kort tid efter fødslen, mammale æggestokke indeholder deres levetid forsyning af primordiale follikler, fra hvilket punkt og fremefter der er en stabil frigivelse af follikler i den voksende follikulært pool.
Ovariet er særlig modtagelig for udvikling in vitro med follikler vokser i en yderst fysiologisk måde i kultur. Dette arbejde beskriver kultur af hele neonatale æggestokke indeholder primordiale follikler, og kulturen af individuelle ovariefollikler, en fremgangsmåde, der kan understøtte udviklingen af follikler fra et umodent igennem til preovumæssige fase, hvorefter deres oocyter er i stand til at undergå fertilisering in vitro. Arbejdet beskrevet her anvender dyrkningssystemer at bestemme, hvordan æggestokkene påvirkes ved udsættelse for eksterne forbindelser. Vi beskriver også en co-kultur system, som gør det muligt undersøgelse af samspil, der opstår mellem voksende follikler og den ikke-voksende pulje af primordiale follikler.
Introduction
Pattedyr æggestok består af en kvindelig levetid levering af oocytter, hver indeholdt i en ovariefollikel. De follikler dannes før fødslen ved hvile, primordial stadium: når follicle pool er etableret, er der en kontinuerlig og gradvis bevægelse af follikler fra ur i den voksende follicle pool. Som follikler begynder at vokse, de udvikler gennem de primære, sekundære, preantral og derefter antrale etaper, indtil de når preovulatory eller Graafsk, scene. Kun oocytter fra præovulatoriske follikler har fuld udviklingsmæssige kompetencer, kunne støtte fosterudviklingen til udtryk, hvis befrugtede.
Ovariet har længe været kendt for at udvikle sig i en yderst fysiologisk måde in vitro. Dette vil sandsynligvis være på grund af hver ovariefollikel indeholder i det cellerne, der er nødvendige for at støtte en oocyt fra umodne stadium (hvorefter det ikke er i stand til at afslutte sin meiotiske deling) igennem til than udviklingsmæssigt kompetente trin (på hvilket tidspunkt det fuldt ud kan støtte færdiggørelsen af meiosen, befrugtning og udvikling af det resulterende embryo til termin).
Den fysiologiske natur æggestok udvikling in vitro har ført til den udbredte anvendelse af ovarie dyrkningsteknikker. Derfor har in vitro-metoder blevet anvendt til at undersøge reguleringen af æggestokkene udvikling, ovarie patologi (fx, at af polycystisk ovariesyndrom, PCOS), undersøgelse af, hvordan æggestokke / oocyter påvirkes af udsættelse for kemikalier, og også med den praktiske formål opnåelse fertilizable oocytter fra primordiale ovariefollikler. Hidtil har det sidste opnået kun bruger musen ovarievæv 1, selv om kultur teknikker, der anvender hårsække fra store pattedyr, herunder mennesker, i høj grad har forbedret i de seneste år 2,3.
Vi beskriver her flere dyrkningsmetoder anvendelse af muse ovarievæv. Den første method bruger hele neonatale mus æggestokke, og støtter dannelsen og tidlig udvikling af primordiale follikler 4. Det andet system understøtter væksten af individuelle, intakte ovariefollikler fra slutningen preantral til den præovulatoriske fase; ved hjælp af denne teknik kan follikler dyrkes enkeltvis eller parvis 5,6. Endelig beskriver vi et co-dyrkningssystem, der kombinerer de to første teknikker i en fremgangsmåde, der tillader undersøgelse af samspillet mellem stigende og primordiale ovariefollikler 7.
Kultur af individuelle intakte ovariefollikler tillader follikelvæksten skal bestemmes fra daglige follicle målinger i kultur periode, mens medium analyse tillader undersøgelse af follikelstimulerende / æggestok hormon produktion. Yderligere væv analyser kan opnås ved en samling af follikler eller ovarievæv i slutningen af kultur, til histologisk / immunohistologiske analyser eller til efterfølgende bearbejdning for eksempel for at opnåmRNA eller proteiner.
Protocol
Alle dyr blev udført i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer på licens af det britiske indenrigsministerium (projekt licensnummer PPL 60/1726 og 60/4026).
Bemærk: Hus dyr i overensstemmelse med britiske lovkrav i en 14 timers lys og 10 timers mørke fotoperiode. Udføre eksperimenter på dyr under anvendelse af vildtype C57BL6J mus, Tau-GFP-mus, der har allestedsnærværende ekspression af grønt fluorescerende protein (GFP) 8 og Thy1-YFP mus med lejlighedsvis ekspression af gult fluorescerende protein (YFP) i en delmængde af neuronceller 9: både transgene linjer blev avlet på en C57BL6J baggrund.
1. Arbejdsvilkårene og forberedelse af instrumenter
- Udfør alt forberedelse medier, væv dissektioner og kultur arbejde i en laminær strømning for at sikre sterilitet: dette undgår kravet om tilsætning af antibiotika til mediet.
- Tillad altid medier / dyrkningsplader / embryo retter i ligevægti mindst 1 time i en 37 ° C ovn (dissektionsmedium / embryo retter) eller 37 ° C, 5% CO 2-inkubator (dyrkningsmedium og plader), før brug.
- Soak glas pipetter i 0,1% opløsning af bovint serumalbumin (BSA) i omkring en time, og derefter lad det tørre. Træk pipetter i flammen fra en bunsenbrænder, bøjning glasset som du gør det, for at fremstille fint trukket buet glas pipetter. Efter pipetten trækkes, gør et rent snit med et glas cutter. Oven sterilisere ved 160 ° C i ca. 45 min.
BEMÆRK: et lager af disse glaspipetter vil være behov for at overføre æggestokke og hårsække.
2. Fremstilling af Dissektion og Kultur Medier
- Forbered dissektionsmedium.
- Opløs 3 mg / ml BSA i Leibowitz L15 medium og Filtersteriliser gennem et 0,2 um pore, 25 mm diameter filter.
- Neonatal ovarie Culture.
- For at forberede medium for neonatal æggestok kultur, gør 1 ml medium til each æggestok, der dyrkes. Opløs 3 mg / ml BSA i α-Minimal Essential Media (aMEM) og filtreres sterilisere gennem et 0,2 um pore, 13 mm diameter filter i et sterilt rør.
- For at fremstille plader til neonatal æggestok kultur, tilsættes 1 ml af neonatal ovarie dyrkningsmedium i hver brønd (en æggestok per brønd) af en 24-brønds plade. Brug sterile urmager pincet, placeres en polycarbonatmembran på toppen af mediet i hver brønd, skinnende overflade op. UV sterilisere membranerne før brug.
- Follikelstimulerende Culture.
- For at forberede medium for follicle kultur, supplement α-Minimal Essential Media med 1 IU / ml rekombinant humant follikelstimulerende hormon, 5 ug / ml ascorbinsyre og 5% v / v serum opnået fra voksne hunmus. Filtersteriliser gennem en 0,2 um pore, 13 mm diameter filter i et sterilt rør.
- Filtersteriliser silikoneolie gennem en diameter filter 0,45 um pore, 25 mm, i et sterilt rør.
- For at forberede plaTES, anbringes 30 pi dråber af follikelstimulerende dyrkningsmedium i hver brønd i en ikke-vævskulturbehandlet 96-brønds mikrotiter runde brønde, der kun bruger den øverste række af hver plade (for at tillade follikler skal flyttes til nye rækker hver dag over dyrkningsperioden). Overlay forsigtigt medium med 70 pi steriliseret silikoneolie for at forhindre medium fordampning.
- Follikelstimulerende æggestok Co-kultur.
- Forbered medium for follikel-æggestok co-kultur som for follikel kultur i trin 2.3.1 ovenfor, udgør 1 ml medium for hver follikel-æggestok co-kultur ved at blive oprettet.
- For at fremstille plader, tilsættes 1 ml medium i hver brønd i en 24-brønds plade. Brug sterile urmager pincet, placeres en Nucleopore membran oven af mediet i hver brønd, skinnende overflade op. UV sterilisere membranerne før brug.
3. Neonatal Ovary Dissektion og Kultur
- Placer 1 ml dissektion medium i hver sterile glas embryo fad. <li> Udsaetterdyr neonatale mus unger alderen postnatal dag 0 og 5, udsætning ved halshugning efter britiske indenrigsministerium regler.
- Tag fat i huden, der dækker den abdominale væg med et par fine dissektion pincet og gøre et stort snit i huden og kroppen væg. Træk åbne snittet så hele underlivet er udsat for. Blæren er normalt engorged på dette stadium og kan punkteres at gøre dissektion lettere.
- Flyt modet af vejen ved hjælp af urmager pincet. Følg uterine horn fra blæren op til nyren på hver side. Ovariet er placeret lige under nyrerne på toppen af livmoderen og vises som en sky-lignende struktur under et dissektionsmikroskop.
- Tag fat i æggestokkene forsigtigt med urmager pincet, og bruge en saks til at bryde sin tilknytning til livmoderen. Overfør parret af æggestokke i embryo skåle indeholdende foropvarmet dissektionsmedium.
- Udfør fine dissektion af æggestokkene under en dissektion mikroskop på en opvarmet staGE (37 ° C). Udnytte insulin nåle til at trimme væk bursal sac og eventuelt overskydende materiale, herunder æggelederen, indtil kun æggestokkene tilbage.
- Overfør hver æggestok i brønden af en kultur plade fremstillet i trin 2.2.2 ovenfor, ved anvendelse af en fint trukket buet glas pipette, en æggestok på toppen af hver membran (se figur 1A). Kultur i en 37 ° C, 5% CO 2-inkubator.
- Skift medium hver anden dag. Brug en pipette til at udveksle 50% af mediet i hver brønd for pre-gasset frisk medium: sted pipettespidsen på kanten af brønden medium for at undgå at forstyrre membranen.
- Oprethold kulturer i op til 6 dage.
- Ved afslutningen af kulturen, fryse medium og fastsætte eller fryse æggestokkene efter en kort vask i PBS, som krævet.
- Fix æggestokke i Bouins fiksativ i 90 min til histologisk analyse eller i 10% neutral bufret formalin i 90 minutter til immunhistologisk analyse. Snap fryse ovarier ved at placere væv iet polypropylenrør, placere røret i tøris i 5-10 minutter før frysning ved -70 ° C til efterfølgende protein eller mRNA ekstraktion.
4. Follikelstimulerende Dissektion og Kultur
- Frasortering 19-23 dage gamle hunmus og isolere æggestokkene. Fugt pelsen med 70% ethanol, inden der eventuelt indsnit. Klem huden ved hjælp af stumpendede pincet og gøre et stort snit i maven med dissektion saks, trænger gennem både huden og kropsvæggen.
- Flyt tarmen af vejen ved hjælp af en finere sæt dissektion instrumenter og find livmoderen. Følg livmoderen til æggestokkene, som er placeret under nyrerne på hver side.
- Forsigtigt gribe æggestokkene hjælp af et par urmager pincet, adskille æggestokkene fastgørelse til livmoderen med fine dissektion saks. Undgå at indsamle for meget af æggestokkene fedt pad. Saml æggestokkene og overføres til et foster skåle indeholdende forvarmet dissektion medium.
- Reflytte æggestokkene bursa hjælp insulin nåle til at trimme væk bursal sac og eventuelt overskydende materiale, herunder æggelederen, indtil kun æggestokkene tilbage. Groft halvere hver æggestok hjælp insulin nåle.
- Overføre forsigtigt hver æggestok halvdel i et individ urglas indeholdende 1 ml dissektion medium. Dæk hver urglas med en glasplade for at forhindre fordampning af medium og for at sikre sterilitet.
- Store urglas indeholdende ovarieceller halvdele i en 37 ° C ovn indtil brug, men udfører det næste dissektion trin så hurtigt som muligt. Kassér væv opbevares på denne måde i mere end en time.
- Transfer urglas indeholdende en æggestok halvt til et 37 ° C opvarmet mikroskop fase i en laminær strømning. Groft dissekere ovarie i store stykker under anvendelse af to insulin nåle, med henblik på at identificere slutningen af præ-antrale follikler som følger: disse vil indeholde 2-3 lag granulosaceller og har en diameter på omkring 180-200 um.
- Manuelt dissekere enhver identified follikler ved hjælp af en insulin nål og en 30 x 0,25 mm akupunkturnål, der er fastgjort i en nåleholder. Vær omhyggelig med at fjerne det meste af det omgivende stroma, men undgå at beskadige den basale lamina af follikler (se figur 1B).
- Brug en fint tegnet buet glas pipette til omhyggeligt overføre dissekerede follikler i et indsamle urglas indeholdende forvarmet dissektion medium. Vær omhyggelig med at holde follikler i den tynde kaliber afsnit af pipette at undgå at miste hårsække.
- Mål follikler nøjagtigt ved hjælp af en kalibreret okular gradnet monteret i et dissektionsmikroskop.
- Vælg hårsække for kultur, hvis de måler 190 ± 10 um i diameter. Yderligere kun vælge sunde, sfæriske hårsække til kultur; disse vil være gennemsigtig, uden mørke atretiske områder, og har en intakt basal lamina, sammen med nogle vedhæftet thecal væv: kassere hårsække, der ikke passer denne beskrivelse. Et udbytte på mellem 10-15 follikler pr æggestok er god.
- Brug en fint tegnet buet glas pipette til at overføre en enkelt follikel i brønden af en plade, der består som i trin 2.3.3 ovenfor. Placer forsigtigt follicle i bunden af brønden (og ikke i den øvre olielag). Kultur i en 37 ° C, 5% CO 2-inkubator.
- Kultur follikler i op til 6 dage, bevæger follikler i en brønd indeholdende frisk medium hver dag.
- Forbered den næste række i 96 brønde som forberedelse plade i trin 2.3.3 ovenfor. Retur plade til inkubatoren i mindst en time, at der opnås ligevægt. Overfør follikler i frisk brønde i medium ved anvendelse af en fint trukket glas pipette.
- Hvis på noget tidspunkt i kulturen follikler skal efterlades i to dage før flytning i frisk medium, placere hver follikel i et minimum af 60 pi (snarere end 30 pi) dråber af follikelstimulerende dyrkningsmedium.
- At indsamle data om follikelvæksten, måle follikler dagligt, ved hjælp af en eyepiece stregglasset monteret i et dissektionsmikroskop. Olien lag vil fordreje målinger af hårsækken diameter, så arbejde ud Kalibreringskoefficienten for opsætningen.
- Ved afslutningen af kulturen, fryse medium og fastsætte eller fryse væv til efterfølgende analyse, som i trin 3.10 ovenfor.
- Follikelstimulerende follicle Co-kultur.
- Kultur to follikler sammen, til at undersøge samspillet mellem hårsække. Kultur som ovenfor, men placere to follikler side-by-side, kontakt, i en brønd.
- Placer 100 dråber af follikelstimulerende dyrkningsmedium pi i hver brønd i en ikke-vævskulturbehandlet 96-brønds mikrotiter flat-brønds plade, overlejring medium med 100 pi steriliseret silikoneolie. Overfør ikke follikler i frisk brønde som i trin 4.13 ovenfor, men i stedet bruge en fin gel tip til at ændre 50% af mediet hver anden dag.
- For at identificere væv oprindelse i co-kultur, co-kultur follikler hver fra en anden genetisk kilde, for eksempel one fra æggestokken en vildtype mus, og den anden fra ovariet af en mus med allestedsnærværende ekspression af GFP. Hvis anvendelse af GFP eller YFP væv minimere eksponering af væv for lys så meget som muligt, under dyrkning, og gennem fiksering / bearbejdningstrin derefter.
BEMÆRK: Det er normalt, at de to follikler til at vokse sammen til en enkelt, "to-follikel" enhed (se figur 1C).
5. follikelstimulerende Æggestok co-kulturer
- Dissekere æggestokke og hårsække som i afsnit 3 og 4 ovenfor.
- Placer en neonatal æggestok på toppen af en membran, i en plade fremstillet som i trin 2.4.2 ovenfor. Placer forsigtigt en enkelt follikel i kontakt med den ene pol af neonatal æggestok, ved hjælp af et fint trukket buet glas pipette. Kultur i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator i op til 5 dage.
- For at kunne skelne mellem vævet oprindelse i co-kultur, brug æggestokke og hårsække fra to forskellige, såurces, for eksempel en fra en vildtype mus, og en fra en mus med allestedsnærværende ekspression af GFP.
- Erstat 500 pi medium dagligt som i trin 3.8 ovenfor, men ved anvendelse af follikelstimulerende dyrkningsmedium. Under co-kultur, ofte folliklen bliver indkapslet af ovariet (figur 1D).
- Ved afslutningen af kulturen, fryse medium og fastsætte eller fryse væv til efterfølgende analyse, som i trin 3.10 ovenfor.
6. Fiksering, Immuncytokemi og Imaging af dyrkede væv
- Ved udgangen af kultur vaskes væv i PBS og overføres til 100 pi (follikel) eller 1 ml (ovarie) 10% neutral bufret formalin og reparere i 1 time på is. Flyt gennem 3 vaske med 1x PBS ved 4 ° C.
- For immunocytokemi på follikler, overførsel mellem brøndene i en 96-brønds mikrotiterplade runde brønde under anvendelse af en fint trukket buet glas pipette med hver brønd indeholder forskellige vaske eller behandlinger.
- For immuncytokemi på Ovaries (eller ovarie-follicle co-kulturer), integrere i 4% agarosegel og sektion på 50 um under anvendelse af en vibrotome. Float sektioner i brøndene i en 24-brønds plade til at anvende vask eller behandlinger, fjernelse med en pipette.
- For billeddannelse: overføre agarose sektioner til flade objektglas og montering med montering medium; eller overføre follikler (eller follikelstimulerende follicle komplekser) til hulrum objektglas og montering med ikke-hærdende montering medium. Billede prøver vha et konfokalt mikroskop.
Representative Results
Figur 1 viser billeder af ovarier og follikler i begyndelsen af og under, kultur procedurerne for.
Figur 2 viser repræsentative resultater af neonatale ovarier (her æggestokke fra nyfødte unger) udsat for reproduktive giftstoffer under kultur. Neonatale ovarier blev dyrket i 6 dage, og udsat for en kemoterapi stof, enten cisplatin eller doxorubicin, på dag 2 i kultur. Ved afslutningen af kulturen, blev ovarier faste, forarbejdet til histologi og æggestokke derefter undersøgt for at bestemme antallet af sunde og usunde ovariefollikler 4. Alternativt kan der opnås en hurtigere vurdering af tidlige voksende follikler fra kulturen af æggestokkene fragmenter ved hjælp af ovarier fra en mus, der udtrykker en oocyt-specifik fluorescerende markør 10.
Under dyrkningen af de enkelte follikler kan follikelvæksten let fastslås ved daglige målinger under cultur periode. 3 viser repræsentative resultater af væksten af follikler dyrket i nærvær eller fravær af gonadotropin hormoner follikelstimulerende hormon (FSH) og luteiniserende hormon (LH) 5 Figur.
Follikelstimulerende follikel eller follikelstimulerende æggestok co-kultur kan anvendes til at undersøge interaktionen mellem follikler. Afhængigt af væv og behandling, kan billeder opnås ved anvendelse af lys-felt, fluorescens eller konfokale mikroskoper. Figur 4 viser repræsentative resultater af billeder fra disse co-kulturer, undersøge forskellige celletyper involveret i hårsækken-follikel kommunikation, herunder endotel og neuronale celler 7.
Figur 1: (A) mikrofotografi af en neonatal æggestok opnået fra en mus på dagen for fødslen, som er tilføjet på en polycarbonatmembran. (B) mikrofotografi af frisk dissekeret sund ovariefollikel, med de fleste af omgivende stromale væv dissekeret væk. (C) mikrofotografier af co-kultur af to ovariefollikler i de første tre dage af kultur, og viser den tætte kontakt, der udvikler mellem de to follikler den kultur provenuet (CI: første dag i kultur Cii: andendagen af kultur; CIII : tredje dag i kultur). Gengivet fra Spears et al. 11 (D) mikrofotografi af samdyrket preantral hårsækken og neonatal æggestok efter to dages dyrkning. Billedet viser folliklen bliver indkapslet af æggestokkene. Pil viser preantral follicle. Billede fra Dr. Federica Lopes. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
gur 2 "src =" / files / ftp_upload / 52458 / 52458fig2.jpg "/>
Figur 2: Effekt af kemoterapi narkotika cisplatin og doxorubicin på neonatale dyrkede æggestokke Cisplatin og doxorubicin både føre til tab af hårsækken sundhed og en reduktion i follicle numre.. (A) Cisplatin; (B) doxorubicin: (i) Procentdel af usunde follikler (slet); og (ii) det samlede antal follikler (skraveret) i hver æggestok. Bars betegne middelværdi + SEM; n = 5 for alle grupper, stjerner angiver signifikante forskelle i forhold til kontrol (* p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001). Gengivet fra Morgan et al. 4
Figur 3:. Vækstrater på follikler udsættes for forskellige gonadotropin miljøer Værdier er middel ± SEM (n ≥16 for hver gruppe). Pilen angiver starten af antral dannelse i alle gonadotropin grupper. Gengivet fra Murray et al. 5
Figur 4: Billeder fra follikel-follicle og ovarie-follicle co-kulturer, der viser follikelstimulerende follicle interaktioner (A) Konfokal mikrografi af et grønt fluorescerende protein (GFP) follicle og en vildtype (WT) follicle efter co-kultur (. GFP-ekspression her vist i hvidt), med processer fra GFP follicle vist strækker sig over WT follicle. (B) Snit gennem en GFP / WT follicle komplekset efter co-kultur, der viser at GFP processer (grøn) fra tilstødende follicle ligger tilstødende til den basale lamina af WT follicle. (C) Neonatal WT æggestok efter kultur med en pre-antral GFP-udtrykkende follicle, der viser, at GFP-celler og cellulære processer (grøn) har migreretgennem æggestokkene interstitum af neonatal æggestok. (D) GFP / WT follicle kompleks indeholdende endothelceller, der er vist ved ekspression af endotelcelle markør CD31 (rød). (E) GFP / WT follicle kompleks indeholdende neuronale celler, der er vist ved ekspression af neuronal markør beta tubulin III (se her som rød eller gul, hvis dobbelt mærket med GFP, grøn). (F) YFP / WT follicle kompleks, hvor YFP refererer til follicle fra en Thy1-YFP mus, der har lejlighedsvis ekspression af gult fluorescerende protein (YFP: gul) i en delmængde af neuronale celler 9, viser, at neuroner strækker sig fra YFP follicle. Bars 50 um (A, B, D), 100 um (C, E, F), 100 um (indsat i A), 10 um (indsat i C), 15 um (indsat i D). Gengivet fra Campbell et al. 7. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Vi beskriver her forskellige dyrkningssystemer, der kan udnyttes til at støtte udviklingen af mus ovariefollikler in vitro, ved anvendelse af hele neonatale æggestokke, der kun indeholder de tidligste follicle stadier, individuelle preantral ovariefollikler og også co-kulturer af de to væv.
Kultur af neonatal mus æggestokke understøtter tidlig æggestokkene udvikling, især follikelvæksten initiering op til den sekundære follikel fase. En række alderen neonatale mus kan anvendes til disse kulturer, afhængigt af de udviklingsmæssige stadier af interesse. Hvis æggestokkene opnås fra nyfødte mus, vil follikel dannelse være på vej, men endnu ikke afsluttet: kultur vil i det mindste delvist understøtte fortsat follicle dannelse efterfulgt af follicle vækst. Alternativt brug af ovarier fra mus omkring fire til fem dage gamle (på hvilket tidspunkt follicle dannelse er allerede komplet) resulterer i kultur af et større antal oprindelige og voksende Follikel 12. Fordelagtige aspekter af den specifikke teknik der er beskrevet her omfatter anvendelse af flydende polycarbonatmembraner, som tillader større iltning af vævet, og kultur i en meget basisk medium bestående af kun aMEM og BSA, undgå brug af udefinerede additiver, såsom serum. Kultur af hele æggestokke synes ikke at understøtte udviklingen ud over det sekundære follikel scenen, med efterfølgende udvikling kræver en ændring i teknik, såsom dissektion af follikelstimulerende granulosa celle-komplekser fra den dyrkede neonatale æggestok 1.
Senere stadier af follikeludvikling kan udvikles in vitro ved at dissekere ud individ, intakte sene præ-antrale follikler, som kan dyrkes til preovulatory etape i kultur og samtidig opretholde deres tredimensionelle struktur. Anvendelse af intakte follikler for denne kultur teknik opretholder forholdet mellem de forskellige follikulære komponenter forekommer in vivo. Thikan anvendes kultur for at opnå oocytter, der kan understøtte befrugtning og efterfølgende fosterudvikling.
Fertilizable oocytter kan også opnås fra muse neonatale æggestokkene under anvendelse af en indledende kultur protokol meget som her beskrevet, efterfulgt af en anden fase, i hvilken oocyt-granulosa celle-komplekser dyrkes in vitro 1. Andre systemer, der anvendes temmelig ofte i dag kulturen af follikler eller ovarievæv, der er indkapslet i et materiale, såsom alginat hydrogel, at yde støtte (se for eksempel Tagler et al. 13). En stor del af fokus i metodeudvikling nu er at forbedre kultur teknikker til æggestokke og hårsække af større pattedyr, med det langsigtede formål at opnå fertilisable oocytter fra primordiale follikler fra en række arter, herunder mennesker.
Til enhver tid, pattedyr æggestokke indeholder hårsække på en afstand af udviklingsstadier, med interactions mellem hårsække påvirker deres regulering. Dette aspekt af ovariefunktion er dårligt forstået og vanskeligt at undersøge in vivo. Den endelige metode er beskrevet her anvender co-dyrkningssystemer til støtte for udviklingen af forskellige stadier af follikler i vitro. Hvis det er nødvendigt, en eller begge væv kan forbehandles in vivo eller in vitro forud for co-kultur. Co-dyrkningssystemer som denne giver en ideel måde til at gennemgå follikelstimulerende follicle interaktioner, for eksempel hvordan dyrkning, antrale follikler påvirker oprindelige follicle pool, aspekter af æggestokkene biologi, der har vist svært indtil nu undersøge.
Hele ovarie kultur teknikker er forholdsvis ligetil, selvom omhyggelig dissektion er nødvendig for at undgå utilsigtet vævsskade. Dissektion af individuelle follikler er en specialiseret teknik, der kræver gentagne praksis før follikler på det rigtige tidspunkt kan dissekeres ud fra æggestokken intakt og ubeskadiget. Det er afgørendeat dissekere ud individuelle hårsække omhyggeligt, eller skade under dissektion protokol kan resultere i hårsækken død under den efterfølgende kultur periode. Hvis follikler er placeret direkte i brønd mikrotiterplader, er det vigtigt kun at anvende ikke-vævskultur behandlede plast, for at minimere udpladning ned af thecal celler på plasten: hvis der anvendes vævskulturbehandlet plastvarer vil folliklerne tillægger bunden af brønden og brud som de vokser. For alle co-kultur arbejde, skal væv anbringes i direkte kontakt med hinanden.
Mediet beskrevet ovenfor til anvendelse i follicle kultur teknik omfatter tilsætning af museserum. Det er muligt at udskifte museserum med føtalt bovint serum, men kun lejlighedsvis partier af sådanne sera vil fuldt ud støtte follikeludvikling til den præovulatoriske fase med batch-prøvning for at identificere egnede kilder. Batch-test af FSH er også tilrådeligt, da den internationale Units hvorved FSH vurderes korrelat kun groft til follikelvæksten in vitro. Hvis der opstår follicle brud rutinemæssigt under dyrkningsperioden, overveje stock ascorbinsyre udskifte den med en frisk batch.
Teknikkerne ikke kræver særligt specialiseret udstyr, bortset dissekere mikroskoper og vævskultur inkubatorer, selvom anvendelse af en laminar strøm-hætte og god steril teknik tillader ovariefollikler skal dyrkes i fravær af antibiotika, som i de her beskrevne metoder. Dette kan være nyttigt for at undgå enhver potentiel skadelig virkning af antibiotika på oocytter, især hvis de skal blive befrugtet efter kultur. Hvis det ikke er muligt at arbejde i et sterilt miljø, er det tilrådeligt at tilsætte antibiotika til dissektion og dyrkningsmedier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leibowitz L15 | Invitrogen | 11415049 | |
| αMEM | Invitrogen | 22571020 | Supplied as sodium bicarbonate buffered (2,200 mg/L) |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A9418 | For dissection medium |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A3311 | For culture medium |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | For coating glass pipettes |
| Mouse serum | - | - | Collected from cardiac puncture |
| FSH | Merck Serono | Gonal F | Batch testing is often necessary. Make up stock solution of 1IU/10µl in αMEM and store at -20 °C. |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4034 | Make up stock of 5mg/ml in αMEM and store at -20 °C. |
| Silicon oil | VWR | 630064V | Dow Corning Silicone Fluid 200/50cS |
| Syringe filters (25 mm, 0.2 µm) | Greiner | 16532K | Cellulose acetate filter for filtering larger (>5 ml) volumes of medium. |
| Syringe filters (13 mm, 0.2 µm) | Iwaki | 3032-013 | Cellulose acetate filter for filtering smaller (<5 ml) volumes of medium |
| Syringe filters (25 mm, 0.45 µm) | Iwaki | 2053-025 | Cellulose acetate filter for filtering oil. |
| Sterile tubes | Greiner | 187261 | |
| 24-well plate | Greiner | 662160 | |
| 96-well round bottom plate | Iwaki | 3875-096 | Use only non-tissue culture treated plates |
| 96-well flat bottomed well | Iwaki | 3860-096 | Use only non-tissue culture treated plates |
| Whatman nucleopore membranes | Camlab | WN/110414 | Use shiny surface up, polycarbonate, 13 mm diameter, 8.0 µm pore size |
| Insulin needles | BD medical supplies | 037-7606 | 0.33 mm (29 G) + 1 ml |
| Glass embryo dishes | VWR | 720-0579 | Sterilize, then warm before use. |
| Glass pipettes | Fisher Scientific | 10209381 | BSA coated before use. |
| Gel tips | AlphaLabs | LW1103 | |
| Acupuncture needles | Acumedic LTD | 30 mm x 0.25 Type C | |
| Bouin’s fixative | Sigma Aldrich | HT10132-1L | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT5014-120ml | |
| 1.5 ml polypropylene tubes | Greiner BioOne | 616201 |
References
- Brien, M. J., Pendola, F. L., Eppig, J. J. A revised protocol for in vitro development of mouse oocytes from primordial follicles dramatically improves their developmental competence. Biol. Reprod. 68 (5), 1682-1686 (2003).
- Fortune, J. E., Yang, M. Y., Muruvi, W. The earliest stages of follicle development: follicle formation and activation. Soc. Reprod. Fertil. Suppl. 67, 203-216 (2010).
- McLaughlin, M., Kinnell, H. L., Anderson, R. A., Telfer, E. E. Inhibition of phosphatase and tensin homologue (PTEN) in human ovary in vitro results in increased activation of primordial follicles but compromises development of growing follicles. Mol. Hum. Reprod. 20 (8), 736-744 (2014).
- Morgan, S., Lopes, F., Gourley, C., Anderson, R. A., Spears, N. Cisplatin and doxorubicin induce distinct mechanisms of ovarian follicle loss; imatinib provides selective protection only against cisplatin. PLoS One. 8 (7), e70117 (2013).
- Murray, A. A., et al. Follicular growth and oocyte competence in the in vitro cultured mouse follicle: effects of gonadotrophins and steroids. Mol Hum Reprod. 14 (2), 75-83 (2008).
- Baker, S. J., Srsen, V., Lapping, R., Spears, N. Combined effect of follicle-follicle interactions and declining follicle-stimulating hormone on murine follicle health in vitro. Biol. Reprod. 65 (4), 1304-1310 (2001).
- Campbell, L., Trendell, J., Spears, N. Identification of cells migrating from the thecal layer of ovarian follicles. Cell Tissue Res. 353 (1), 189-194 (2013).
- Pratt, T., Sharp, L., Nichols, J., Price, D. J., Mason, J. O. Embryonic stem cells and transgenic mice ubiquitously expressing a tau-tagged green fluorescent protein. Dev. Biol. 228 (1), 19-28 (2000).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Maiani, E., et al. Reply to: cisplatin-induced primordial follicle oocyte killing and loss of fertility are not prevented by imatinib. Nat. Med. 18 (8), 1172-1174 (2012).
- Spears, N., Bruin, dr, Gosden, J. P., G, R. The establishment of follicular dominance in co-cultured mouse ovarian follicles. J. Reprod. Fertil. 106 (1), 1-6 (1996).
- Desmeules, P., Devine, P. J. Characterizing the ovotoxicity of cyclophosphamide metabolites on cultured mouse ovaries. Toxicol. Sc. 90 (2), 500-509 (2006).
- Tagler, D., et al. Promoting extracellular matrix remodelling via ascorbic acid enhances the survival of primary ovarian follicles encapsulated in alginate hydrogels. Biotechnol. Bioeng. 111 (7), 1417-1429 (2014).
