Summary
Bu protokol yenidoğan farelerde ve prepubertal farelerden alınan bireysel yumurtalık folikülleri gelen yumurtalıklarını kullanarak, fare yumurtalık dokusunun primer kültür / ko-kültür açıklar. kültür teknikleri yumurtalık üzerindeki dışsal ajanların etkisi soruşturma olanak veren yüksek fizyolojik bir şekilde gelişimini desteklemek ve yumurtalık foliküllerinin arasındaki etkileşimlerin.
Abstract
Memeli over yumurtalık foliküllerinin oluşur, somatik granüloza hücreleri ile çevrili tek bir oosit oluşan her folikül, bir bazal membran içinde birlikte kapalı. Folikül bir sonlu havuz mayotik tutuklama içinde oosit primordial folikül oluşturan, alçaltılmış granüloza hücreleri ile yakın dernek kurma embriyonik gelişim sırasında serilir. Tarafından veya doğumdan kısa bir süre sonra, memeli yumurtalıklar nokta itibaren büyüyen foliküler havuza köklerinin sürekli bir sürümü var hangi ilkel köklerinin kendi ömür boyu kaynağı içerir.
yumurtalık foliküllerinin kültürde yüksek fizyolojik bir şekilde artması ile, in vitro olarak geliştirilmesi için özellikle uygundur. Bu çalışma ilkel köklerini içeren tüm yenidoğan yumurtalıkların kültürünü ve bireysel over foliküllerinin kültürünü, preovu kadar bir olgunlaşmamış gelen köklerinin gelişimini destekleyen bir yöntem açıklanır, düzenleyici aşama, bundan sonra onların oosit in vitro döllenme geçmesi mümkün. Burada özetlenen çalışma yumurtalık dış bileşiklere maruz nasıl etkilendiğini belirlemek için kültür sistemlerini kullanır. Biz de büyüyen köklerinin ve ilkel köklerinin olmayan büyüyen havuz arasında gerçekleşen etkileşimlerin soruşturma sağlayan bir ko-kültür sistemi, tarif.
Introduction
Memeli yumurtalık oosit bir dişinin ömür boyu kaynağı, bir yumurtalık folikülü içinde bulunan her oluşmaktadır. foliküllerinin dinlenme de doğumdan önce oluşur, ilkel aşama: folikül havuzu kurulduktan sonra, büyüyen folikül havuza ilkel gelen köklerinin sürekli ve kademeli hareket var. Folikül büyümeye başlar gibi onlar preovulatuvar veya Graaf, sahne ulaşana kadar, onlar, birincil, ikincil, preantral ve sonra antral aşamalardan geliştirmek. Preovulatuar köklerinin sadece oosit döllenmiş ise, dönem embriyonik gelişimini desteklemek mümkün tam gelişimsel yetkinlik var.
yumurtalık uzun in vitro çok fizyolojik bir şekilde geliştirmek için bilinmektedir. Bunun nedeni içindeki olgunlaşmamış aşamada bir oosit t yoluyla (hangi onun mayoz bölünme tamamlayamadığında işaret) desteklemek için gerekli hücreleri içeren her yumurtalık folikülü olması muhtemeldirO gelişimsel yetkili aşama (hangi tamamen mayoz, gübreleme ve dönem elde edilen embriyonun gelişimi tamamlanmasına destek olabilir işaret).
in vitro over gelişme fizyolojik yapısı yumurtalık kültür tekniklerinin geniş kullanımına yol açmıştır. Sonuç olarak, in vitro yöntemler (örneğin bu polikistik over sendromu, PKOS ve), kimyasallara maruz etkilenen nasıl Yumurtalıklar / oosit incelenmesi ve aynı zamanda pratik amacı ile yumurtalık gelişimi, yumurtalık patoloji düzenlenmesi araştırmak için kullanılmıştır ilkel yumurtalık foliküllerinin gelen üreyebilen oosit elde. Insanlar dahil olmak üzere, büyük memelilerden köklerinin kullanılarak kültür teknikleri, büyük ölçüde son yıllarda 2,3 geliştirilmiş olmasına rağmen bugüne kadar, son olarak anılan yalnızca fare yumurtalık dokusu 1 kullanılarak elde edilmiştir.
Biz burada fare yumurtalık dokusu kullanılarak çeşitli kültür yöntemleri açıklanmaktadır. İlk yöntemiid tüm yenidoğan fare yumurtalıklar kullanır, ve ilkel köklerinin 4 oluşumunu ve erken gelişimini destekler. İkinci sistem preovulatuvar aşamaya geç preantral bireysel, sağlam yumurtalık köklerinin gelişimini destekler; Bu tekniği kullanarak, folikülleri tek tek kültür, ya da çift 5,6 edilebilir. Son olarak, büyüme ve ilkel yumurtalık foliküllerinin 7 arasındaki etkileşimlerin incelenmesi sağlayan bir yöntemde ilk iki tekniklerini kullanarak, bir ko-kültür sistemi tarif eder.
Bireysel sağlam yumurtalık folikül kültür ortamı analiz folikül / yumurtalık hormon üretiminin incelenmesi izin verirken folikül gelişimi, kültür süresi boyunca günlük folikül ölçümler sonucunda tespit edilmesini sağlar. Bundan başka, doku analizi histolojik / immünohistolojik analizler için veya örneğin elde etmek için daha sonraki işleme için, kültür sonunda köklerinin veya yumurtalık doku toplanması ile elde edilebilirmRNA veya protein.
Protocol
Tüm hayvan çalışmaları İngiltere İçişleri Bakanlığı tarafından lisans altında kurumsal kurallarına uygun (proje lisans numarası PPL 60/1726 ve 60/4026) yapıldı.
Not: Ev hayvanları 14 saat ışık UK yasal gerekliliklere ve 10 saat karanlık fotoperiyot uygun. Vahşi tip C57Bl6J fareler, yeşil floresan proteini (GFP), 8 ve nöronal hücreler 9 bir alt sarı floresan proteini (YFP) arada bir ifade ile Thy1 YFP farelerin her yerde ifade var Tau-GFP fareler kullanılarak hayvanlar üzerinde deney: hem transgenik çizgiler C57Bl6J arka plan üzerinde yetiştirilen bulundu.
1. Çalışma Koşulları ve Araçların hazırlanması
- Sterilizasyonu sağlamak için, bir laminar akış başlığı içinde tüm ortam hazırlama, doku diseksiyon ve kültür çalışmaları yapmak Bu ortam antibiyotik eklenmesi ihtiyacını ortadan kaldırır.
- Her zaman medya / kültür plakaları / embriyo yemekleri gelmesini sağlayınızkullanımdan önce 37 ° C fırın içinde en az 1 saat, (diseksiyon ortamı / embriyo yemekleri) veya 37 ° C,% 5 CO2 inkübatöründe (kültür ortamı ve plakalar) için.
- Bir saat için, sığır serumu albümini (BSA)% 0.1 çözeltisi içinde cam pipetler emmek ve sonra kurumaya bırakılır. Ince çekilmiş kavisli cam pipetler üretmek için, bunu gibi cam bükme, Bunsen alevinde pipetler çekin. Pipet çekilir sonra, bir cam kesici ile temiz bir kesim yapmak. Fırın yaklaşık 45 dakika boyunca 160 ° C'de sterilize edilir.
NOT: Bu cam pipetler bir mağaza yumurtalıkların ve folikülleri aktarmak için gerekli olacaktır.
Diseksiyon ve Kültür Medya 2. Hazırlık
- Diseksiyon Orta hazırlayın.
- Leibowitz L15 orta ve filtre, 3 mg / ml BSA, 0.2 mikron gözenek, 25 mm çapında bir filtre ile sterilize çözündürülür.
- Yenidoğan Yumurtalık Kültür.
- Neonatal yumurtalık kültür ortamı hazırlamak için EAC için ortamın 1 ml yapmakkültür edilecek h yumurtalık. 3 mg / α-Minimal Esansiyel Ortam ml BSA (αMEM) ve filtre, bir steril tüp içine, bir 0.2 mikron gözenek, 13 mm çapında bir filtre ile sterilize çözündürülür.
- Neonatal yumurtalık kültür plakaları hazırlamak 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğa (her bir yumurtalık) içine yenidoğan yumurtalık kültür ortamının 1 ml ekleyin. Steril saatçilik forseps kullanılarak her bir oyuğa, parlak bir yüzey yukarı ortam üstüne bir polikarbonat membran yerleştirin. UV kullanmadan önce zarları sterilize.
- Folikül Kültürü.
- Folikül kültür ortamını hazırlamak için, 1 lU / ml rekombinant insan folikül stimüle edici hormon, 5 ug / ml askorbik asit ve% 5 h / h serumu ile ek α-Minimal Esansiyel Ortam yetişkin dişi farelerden elde edilmiştir. Filtre, bir steril tüp içine, bir 0.2 mikron gözenek, 13 mm çapında bir filtre ile sterilize edilir.
- Filtre, bir steril tüp içine, bir 0.45 mikron gözenek, 25 mm çapında bir filtre içinden silikon yağı sterilize edin.
- Pla hazırlamaktes olmayan bir doku kültürü her oyuğuna folikül kültür ortamı 30 ul damlalar koyun (köklerinin her gün üzerindeki yeni satırlar halinde taşınmasını sağlamak için her bir levha yalnızca üst satır kullanılarak, 96 gözlü mikro-titre yuvarlak plaka muamele Kültür dönemi). Dikkatle orta buharlaşmasını önlemek için, sterilize silikon yağı 70 ul orta kaplaması.
- Folikül-over Co-kültür.
- Her folikül yumurtalık ko-kültür kurulmakta için orta 1 ml oluşturan, yukarıda adım 2.3.1 folikül kültürü gibi folikül yumurtalık ko-kültür için orta hazırlayın.
- , Plakalar hazırlamak için 24 oyuklu plakanın her oyuğuna orta 1 ml. Steril saatçilik forseps kullanılarak her bir oyuğa, parlak bir yüzey yukarı ortam üstüne bir Nucleopore membran yerleştirin. UV kullanmadan önce zarları sterilize.
3. Yenidoğan Over Diseksiyon ve Kültür
- Her steril cam embriyo çanak içine diseksiyon orta 1 ml yerleştirin. <li> İtlaf yenidoğan fare yavrular İngiltere Home Office yönetmeliklerine göre dekapitasyon itlaf, doğum sonrası gün 0 ile 5 yaş arası.
- İnce diseksiyon forseps bir çift kullanarak karın duvarı kaplayan cilt kavrayın ve cilt ve vücut duvarı büyük bir kesi yapmak. Tüm karın maruz böylece kesi çekerek açın. Mesane genellikle bu aşamada tıkanmış ve diseksiyon kolaylaştırmak için delinmiş olabilir.
- Saatçi forseps kullanarak dışına cesareti taşıyın. Her tarafta böbrek mesane up rahim boynuzları izleyin. yumurtalık rahim üstündeki sadece böbrek altında bulunan ve bir mikroskop altında bir bulut benzeri bir yapı olarak görünecektir.
- Saatçi forseps ile yavaşça yumurtalık kavrayın ve rahim olan eki koparmaya makas kullanın. Önceden ısıtılmış diseksiyon orta içeren embriyo yemekleri içine yumurtalıkların çifti aktarın.
- Isıtmalı sta bir diseksiyon mikroskop altında yumurtalıklar ince diseksiyon yürütmekge (37 ° C). Sadece yumurtalık kalana kadar, Bursal kesesi ve fallop tüpü dahil herhangi bir aşırı malzeme uzak trim için insülin iğneleri kullanın.
- (Şekil 1A bakınız) ince çekilmiş bir bombeli cam pipet, her bir zarın üstüne bir yumurtalık kullanılarak, yukarıda adım 2.2.2'de hazırlanan bir kültür plakasının her bir oyuğuna yumurtalık aktarın. 37 ° C,% 5 CO2 kuluçka makinesi içinde kültürü.
- Ikinci günde ortamı değiştirin. Membran rahatsız etmemek için orta oyuk kenarında yer pipet: Önceden gazlanmış taze ortam için her bir ortamın% 50 alışverişi için bir pipet kullanın.
- 6 gün için kültürleri korumak.
- Kültür sonunda, orta dondurma ve düzeltmek veya gerektiği gibi, PBS kısa bir yıkamadan sonra yumurtalıklar dondurma.
- 90, histolojik analiz için dakika veya immünohistolojik analizi için 90 dakika boyunca% 10 nötr tamponlu formalin içinde için Bouin fiksatifi olarak yumurtalıkların düzeltildi. Yapış doku yerleştirerek yumurtalıklar dondurmadaha sonra protein veya mRNA çıkarımı için -70 ° C'da dondurmadan önce, 5-10 dakika boyunca kuru buz tüp yerleştirerek bir polipropilen tüpü.
4. Folikül Diseksiyon ve Kültür
- 19-23 günlük dişi fareler itlaf ve yumurtalıklar izole. Herhangi bir kesi yapmadan önce% 70 etanol ile kürk ıslatın. Künt uçlu forseps kullanarak cilt sıkın ve cilt ve vücut duvarı hem nüfuz, diseksiyon makas ile karın büyük bir kesi yapmak.
- Diseksiyon araçları bir ince kümesi kullanılarak yolumdan gut taşıyın ve rahim bulun. Her tarafta böbrek altında bulunan yumurtalık rahim izleyin.
- Yavaşça saatçi forseps bir çift kullanarak yumurtalık açgözlü, ince diseksiyon makas ile rahim yumurtalıklar eki sever. Yumurtalık yağ yastığı çok toplama kaçının. Yumurtalıkların toplayın ve önceden ısıtılmış diseksiyon orta içeren bir embriyo yemekleri içine aktarın.
- TekrarSadece yumurtalık kalana kadar, Bursal kesesi ve fallop tüpü dahil herhangi bir aşırı malzeme uzak trim için insülin iğneleri kullanılarak yumurtalık bursa taşıyın. Kabaca insülin iğneleri kullanarak her yumurtalık yarıya.
- Dikkatle 1 ml diseksiyon ortamı içeren bireysel izle bardağa her yumurtalık yarısı transferi. Orta buharlaşmasını önlemek ve sterilite sağlamak için bir cam slayt her saat camı örtün.
- Mağaza izle gerektiği kadar 37 ° C fırında over yarılarını içeren gözlük, ancak en kısa sürede bir sonraki adımı diseksiyon yürütmek. Bir saatten fazla bu şekilde saklanan doku atın.
- Bir laminar akış başlığı içinde 37 ° C ısıtıldı mikroskop kademesine bir yumurtalık yarısı içeren transfer saat camı. Kabaca şöyle geç ön-antral folikül tespit etmek amacıyla, iki insülin iğneleri kullanılarak büyük parçalar halinde yumurtalık teşrih: Bu granüloza hücrelerinin 2-3 katmanları içeren ve çevresinde 180-200 mikron bir çapa sahip olacaktır.
- El ile herhangi bir i teşrihbir insülin iğne ve bir iğne tutucu teminat altına alınmıştır biri 30 x 0,25 mm akupunktur iğne kullanılarak dentified folikülleri. Çevredeki stroma çoğunu kaldırmak, ancak köklerinin bazal lamina zarar vermemek için dikkatli olun (Şekil 1B bakınız).
- Dikkatle önceden ısıtılmış diseksiyon orta içeren bir toplama saat camı içine disseke foliküllerini aktarmak için ince çekilmiş kavisli cam pipet kullanın. Folikülleri kaybetmemek için pipet ince kalibreli bölümünde folikülleri tutmak için dikkatli olun.
- Tedbir folikülleri doğru bir mikroskop takılan bir kalibre mercek ağı kullanarak.
- Onlar çapında 190 ± 10 mikron ölçmek yalnızca kültür için seçin folikülleri. Ayrıca kültür için tek sağlıklı, küresel folikülleri seçin; bu karanlık atretik alanlar olmadan, şeffaf olması, ve bazı bağlı teka dokusu ile birlikte, sağlam bir bazal lamina sahip olacaktır: Bu açıklamayı uymaz herhangi folikülleri atın. 1 arasında bir verimYumurtalık başına 0-15 folikül iyidir.
- Yukarıdaki adım 2.3.3 'de olduğu gibi yapılmış bir plaka oyuğuna tek folikül aktarmak için ince çekilmiş bir bombeli cam pipet kullanın. Dikkatle Kuyunun dibine (ve üst yağ bir katman içinde) içinde folikül yerleştirin. 37 ° C,% 5 CO2 kuluçka makinesi içinde kültürü.
- En fazla 6 gün süreyle kültür köklerinin her gün iyi olarak ihtiva eden taze ortam içine köklerinin ediyor.
- Yukarıdaki adım 2.3.3 plaka hazırlanmasında olduğu gibi, 96 oyuklu bir plaka içerisinde sonraki satırı hazırlayın. Dengelenmesini sağlamak için, en az bir saat için inkübatör plaka dönün. Ince çekilmiş cam pipet kullanarak, orta taze kuyulara folikülleri aktarın.
- Kültür içinde herhangi bir noktada köklerinin taze ortam içine geçmeden önce iki gün boyunca bırakılması isteniyorsa, 60 ul (yerine 30 ul), folikül kültür ortamı damlacıklarının en az her bir folikül yerleştirin.
- , Folikül büyümesi üzerine veri toplamak, bir ey kullanarak, günlük folikülleri ölçmek içinepiece şebeke bir mikroskop monte. Yağ tabakası folikül çapı ölçümleri deforme, bu yüzden set-up için kalibrasyon katsayısı çalışacaktır.
- Kültür sonunda, orta dondurma ve düzeltmek veya yukarıdaki adım 3.10 gibi, sonraki analiz için doku dondurma.
- Folikül-folikül Co-kültür.
- Kültür iki folikülleri birlikte, köklerinin arasındaki etkileşimleri araştırmak için. Kültür yukarıdaki gibi, ama bir kuyuda, temas, iki folikülleri yan yana yerleştirin.
- Olmayan bir doku kültürü her oyuğuna folikül kültür ortamında 100 ul damlalar yerleştirin sterilize silikon yağı, 100 ul ortam kaplayan, 96-çukurlu mikro-titre düz-plaka işlemden geçirildi. Yukarıdaki adım 4.13 gibi taze kuyulara folikülleri aktarmak, ancak bunun yerine her gün ortamı% 50 değiştirmek için iyi bir jel ucu kullanmayın.
- Ko-kültür içerisinde doku kaynağını belirlemek için, ko-kültür, örneğin, o için farklı bir genetik kaynaktan elde edilen her foliküllerivahşi bir fare yumurtalık ve GFP yerde ifadesi ile bir fare yumurtalıktan diğerinden ne. GFP veya YFP doku kullanıyorsanız, kültür sırasında, mümkün olduğunca ışık doku maruziyeti en aza indirmek ve daha sonra sabitleme / işlem adımlarında.
NOT: İki folikülleri tek, 'iki-folikül' birimine birlikte büyümek için normaldir (Şekil 1C bakınız).
5. Folikül-Yumurtalık Co-Kültürler
- Yukarıdaki Bölüm 3 ve 4 gibi yumurtalıklar ve folikülleri parçalara ayır.
- Yukarıdaki adım 2.4.2 'deki gibi hazırlanmış bir tabak içinde, bir zar üstüne bir yenidoğan yumurtalık yerleştirin. Dikkatle ince çekilmiş bir bombeli cam pipet kullanılarak neonatal yumurtalık bir kutup ile temas içinde tek bir folikül yerleştirin. En fazla 5 gün boyunca 37 ° C,% 5 CO2 kuluçka makinesi içinde kültürü.
- Ko-kültür içindeki doku kaynaklı ayırt çok farklı iki yumurtalıklar ve köklerinin kullanmak içinurces, örneğin, bir vahşi tipli fare, biri de GFP yerde ifade ile, bir fare, bir için.
- Yukarıdaki adım 3.8 gibi günlük orta 500 ul değiştirin, ama folikül kültür ortamı kullanılarak. Ko-kültür esnasında folikül genellikle yumurtalık (Şekil 1D) ile kapatılmış hale gelir.
- Kültür sonunda, orta dondurma ve düzeltmek veya yukarıdaki adım 3.10 gibi, sonraki analiz için doku dondurma.
6. Sabitleme, İmmünositokimya ve Yetiştirme Doku Görüntüleme
- Kültür sonunda, PBS içinde doku yıkama ve 100 ul (folikül) ya da% 10 nötr tamponlu formalin için 1 ml (yumurtalık) transferi, ve buz üzerinde 1 saat süre ile sabitleyin. 4 ° C'de 1x PBS 3 yıkamadan geçmek.
- Folikülleri üzerinde kesitler imünosito kimya, her bir göze içermesi, yıkama ya da tedaviler ile, ince çekilmiş bir bombeli cam pipet kullanılarak bir 96-çukurlu mikro-titre yuvarlak delikli bir plakanın deliklerine aktarılır.
- Ovari ile kesitler imünosito kimyaes (veya yumurtalık folikülü ko-kültürler), vibrotome kullanılarak 50 um% 4 agaroz jel ve bölümde yerleştirmek. 24 gözlü bir levhanın gözleri içine Şamandıra bölümleri bir pipet ile çıkarılması, yıkama ya da muamele maddelerinin uygulanması için.
- Görüntüleme için: Düz cam slaytlar agaroz bölümleri aktarmak ve orta montaj monte; veya transfer folikülleri (veya folikül folikül kompleksleri) kavite cam slaytlar ve montaj orta olmayan sertleşme ile monte edin. Konfokal mikroskop kullanılarak görüntü örnekleri.
Representative Results
Şekil 1 başında yumurtalıklar ve folikül görüntüleri gösterir ve kültür prosedürleri sırasında.
Şekil 2 yenidoğan yumurtalıkların temsilcisi sonuçlarını göstermektedir (burada, yenidoğan yavrular gelen yumurtalıklar) kültür sırasında üreme toksik maddelerden maruz. Yenidoğan yumurtalıklar kültür Gün 2, sisplatin veya doksorubisin ya 6 gün kültüre ve kemoterapi ilaç maruz bırakıldı. Kültür sonunda, yumurtalıklar, düzeltildi histoloji için işlenmiş, ve yumurtalıklar sonra sağlıklı ve sağlıksız over foliküllerinin 4 sayısını belirlemek için incelenmiştir. Seçenek olarak ise, erken gelişme köklerinin daha hızlı bir değerlendirmesi, oosit belirli bir floresan markörü 10 eksprese eden bir fare yumurtalık kullanılarak yumurtalık parçalarının kültüründen elde edilebilir.
Bireysel folikül kültürü sırasında, folikül gelişimi kolaylıkla Cul boyunca günlük ölçümler ile tespit edilebilirTure süresi. 3 hormon (FSH) ve luteinize edici hormon (LH), folikül uyarıcı 5 gonadotropin hormonlarının varlığında veya yokluğunda kültürlenir köklerinin büyüme temsili sonuçlarını göstermektedir.
Folikül-folikül veya folikül yumurtalık ko-kültür köklerinin arasındaki etkileşimleri araştırmak için kullanılabilir. Doku ve işleme bağlı olarak, görüntü parlak saha, floresan veya konfokal mikroskop kullanılarak elde edilebilir. Şekil 4 endotelyal ve nöronal hücreler de dahil olmak üzere folikül folikül iletişimine katılan çeşitli hücre tipleri, kontrol etmek, örneğin ko-kültürler ile ilgili görüntü temsili sonuçlarını göstermektedir 7.
Şekil 1: doğum gününde bir fare elde edilen bir yenidoğan yumurtalık (A) Photomicrograph, yerleştirilen polikarbonat membran üzerinde. Çevreleyen stromal dokusunun en uzak disseke ile (B) Photomicrograph taze ve sağlıklı over folikül disseke. (C) kültür ilerledikçe (Ci iki köklerinin arasında gelişen yakın temas gösteren kültürünün ilk üç gün içinde iki yumurtalık foliküllerinin ko-kültür fotomikrografları: kültürünün ilk gününde; Cn: kültürün ikinci gün; CIII : Kültür üçüncü gün). Spears ve ark çoğaltılmıştır. Ko-kültür preantral folikül ve neonatal yumurtalık 11 (D), Photomicrograph kültür iki gün sonra. Görüntü folikül yumurtalık tarafından kapsüle olma gösterir. Ok preantral folikülü gösterir. Dr. Federica Lopes görüntü. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
saat'in 2 "src =" / files / ftp_upload / 52.458 / 52458fig2.jpg "/>
Şekil 2: sisplatin kemoterapi ilaçlarının etkisi ve doksorubisin yenidoğan kültürlü yumurtalıklar üzerinde Sisplatin ve folikül sağlık kaybı ve folikül sayısında bir azalma hem galibiyeti doksorubisin.. (A), sisplatin; (B) Doksorubisin: (i) sağlıksız köklerinin (net) yüzdesi; ve folikül (ii) toplam sayısı her yumurtalıkta (gölgeli). Barlar + sem ifade; n = 5 tüm gruplar için, yıldız, kontrole göre önemli farklılıklar belirtmektedir (* p <0.05, ** p <0.01, *** P <0.001). Morgan ve ark çoğaltılamaz. 4
Şekil 3:. Büyüme farklı gonadotropin ortamlara maruz kalan köklerinin oranları Değerler ± SEM (her grup için n ≥16) ortalama vardır. Ok ANTRA başlangıcını gösterirTüm gonadotropin gruplarında l oluşumu. Murray ve diğerleri arasından çoğaltılmıştır. 5
Şekil 4: folikül folikül ve yumurtalık folikülü ko-kültürler Görüntüler, folikül folikül etkileşimleri gösteren (A), yeşil flüoresan proteini (GFP), folikül ve ko-kültür sonrası, vahşi tip (WT), folikül Konfokal mikrografı (. WT folikül üzerinde uzanan gösterilen GFP folikülden süreçleri ile GFP ifade beyaz burada gösterilen). (B) ko-kültür aşağıdaki GFP / WT folikül kompleksi ile kesit, WT folikül bazal lamina bitişik bitişik folikül yalan o GFP süreçleri (yeşil) gösteren. (C) Yenidoğan WT yumurtalık bir preantral GFP ifade, folikül GFP hücreleri ve hücresel süreçleri (yeşil) gösteren göç etmiş olan kültür aşağıdakiYenidoğan yumurtalık over aralarını aracılığıyla. (D), GFP / ağ folikül kompleksi endotelyal hücre belirteci CD31 (kırmızı) ekspresyonu ile gösterilen endotel hücreleri ihtiva ederler. Nöronal belirteç beta tübülinin III ifadesi ile gösterilen nöronal hücreleri içeren (E) GFP / WT folikül kompleksi (kırmızı olarak burada görmek, veya sarı gibi çift etiketli GFP ile, yeşil ise). Nöronlar YFP folikül uzanan gösteren, nöronal hücrelerin 9 bir alt kümesi: (sarı YFP) YFP sarı floresan protein arada ifade içeren bir Thy1 YFP fare folikül belirtir (F) YFP / ağ folikül kompleksi. Barlar 50 um (A, B, D), 100 um (C, E, F), 100 um (A ek), 10 um (C ek), 15 um (D ek). Campbell ve ark çoğaltılamaz. 7 Bu fi büyük halini görmek için buraya tıklayınızGüre gösterir.
Discussion
Burada, aynı zamanda, sadece erken folikül aşamaları tek tek preantral yumurtalık folikül ve iki doku kültürlerinden ihtiva eden bütün yenidoğan yumurtalık kullanarak, in vitro fare yumurtalık folikül gelişimini desteklemek için kullanılan farklı kültür sistemleri tarif etmektedir.
Yenidoğan fare yumurtalıkların Kültür erken yumurtalık gelişimi, ikincil folikül aşamasına kadar özellikle folikül gelişimi başlatılmasını desteklemektedir. Yenidoğan farelerin yaş bir dizi ilgi gelişim aşamalarında bağlı olarak, aşağıdaki kültürler için kullanılabilir. Yumurtalıklar doğmuş farelerden elde edilirse, folikül oluşumu devam ama henüz tamamlanmış olacaktır: Kültür, en azından kısmen folikül büyümesi ardından devam folikül oluşumunu destekleyecektir. Alternatif olarak, yaş dört-beş gün etrafında farelerin yumurtalıkların kullanımı ilkel ve büyüyen FOLLI daha fazla sayıda kültürü sonuçları (hangi zaman folikül oluşumu zaten tamamlandı)kartılması 12. Burada anlatılan özel bir teknik Faydalı özellikleri örneğin, serum gibi tanımlanmamış katkı maddelerinin kullanımının önüne, sadece αMEM ve BSA içeren bir çok temel bir ortam içinde daha fazla doku oksijenasyonu ve kültür izin değişken polikarbonat membran, kullanımını içerir. Bütün yumurtalıkların Kültür tür kültürlü yenidoğan yumurtalıktan 1 folikül granüloza hücre komplekslerinin diseksiyonu olarak tekniğinde bir değişiklik gerektiren sonraki gelişimi ile, ikincil folikül aşamasının ötesine gelişimini desteklemek için görünmüyor.
Folikül gelişiminin daha sonraki safhaları bunların üç-boyutlu yapıyı muhafaza etmek sureti ile kültür içinde ovülasyon öncesi aşamasına yetiştirilebilir bireysel, sağlam geç ön-antral folikülleri, kesilmesi yoluyla in vitro olarak geliştirilebilir. in vivo meydana geldiği gibi, bu kültür tekniği bozulmadan köklerinin kullanımı farklı foliküler bileşenleri arasındaki ilişkiyi korur. This kültürü sistemi gübreleme ve sonraki embriyo gelişimini destekleyen oosit elde etmek için kullanılabilir.
Üreyebilen oositler da oosit granüloza hücre kompleksleri vitro 1 'de yetiştirilen sırasında ikinci bir aşama takip burada tarif edildiği gibi çok bir başlangıç kültürü protokolü kullanılarak Yeni doğan fare yumurtalık elde edilebilir. Oldukça sık günümüzde kullanılan diğer sistemler destek sağlamak için, aljinat hidrojel olarak bir malzeme ile kapsüllenmiş olan folikül veya yumurtalık doku kültürü veya örn (bakınız örneğin, Tagler ve ark. 13). Yöntem geliştirme odak çoğu artık insanlar da dahil olmak üzere türlerin bir dizi, gelen ilkel köklerinin gelen fertilisable oosit elde uzun vadeli amacı ile, yumurtalıklar ve büyük memelilerin folikülleri için kültür teknikleri geliştirmektir.
Herhangi bir anda, memeli yumurtalıklar interactio ile, gelişim aşamalarının aralığında folikülleri ihtivaonların düzenleme etkileyen köklerinin arasında ns. Yumurtalık fonksiyonunun bu yönü tam olarak bilinmemektedir ve zor in vivo incelenmesi. Burada tarif edilen son yöntem, in vitro olarak folikül farklı aşamalarında gelişimini desteklemek için, ko-kültür sistemleri kullanmaktadır. Gerekirse, bir veya her iki doku önce ortak-kültür, in vivo veya in vitro olarak ön-işleme tabi tutulabilir. Bu gibi ko-kültür sistemleri büyüyen nasıl Örneğin, folikül-folikül etkileşimlerini incelemek için ideal bir yol sağlar, antral foliküller ilkel folikül havuzu etkileyen, zor kanıtlanmış yumurtalık biyoloji yönleri şimdiye kadar incelemek.
Dikkatli diseksiyon kazara doku hasarını önlemek için gerekli olmasına rağmen, tüm yumurtalık kültür teknikleri, oldukça basittir. Bireysel köklerinin diseksiyonu sağ aşamasında folikülleri over sağlam ve hasarsız dışarı disseke önce tekrarlanan uygulama gerektiren özel bir tekniktir. Bu kritikdikkatle bireysel folikülleri teşrih etmek, ya da diseksiyon protokolü sırasında sürekli hasar sonraki kültür döneminde folikül ölümle sonuçlanabilir. Doku kültürü tedavi plasticware kullanılırsa, folikül eklenecektir: folikül mikrotitre plakalarının kuyucuğu içine yerleştirildi yerlerde, plastik üzerinde thekal hücrelerin aşağı kaplama en aza indirmek için, sadece olmayan doku kültürü tedavi plastik kullanılması önemlidir Kuyunun taban ve yırtılması büyüdükçe. Tüm ko-kültür çalışması için dokular, birbiriyle doğrudan temas halinde yerleştirilmelidir.
folikül kültürü tekniğinde kullanım için yukarıda detaylı olarak orta fare serumu ilave edilmesini kapsar. Fetal sığır serumu ile fare serumu değiştirmek mümkündür, ancak toplu testi uygun kaynaklarını belirlemek için gerekli olan bu tür serumun sadece ara sıra partiler tam preovulatuvar aşamaya folikül gelişimini destekleyecektir. FSH Toplu testi Uluslararası Uni gibi, aynı zamanda tavsiye edilirFSH in vitro folikül büyümeye sadece kabaca korelasyonu değerlendirilir hangi ts. Folikül rüptürü rutin kültür döneminde ortaya çıkarsa, taze toplu stok askorbik asit yerine düşünün.
teknikleri, kesme mikroskop ve doku kültürü kuluçka dışında, özellikle özel ekipman gerektirmeyen bir laminar akış çeker ve iyi steril teknik kullanımı yumurtalık folikül burada açıklanan yöntemlerde olduğu gibi, antibiyotik yokluğunda kültürlenebilir izin rağmen. Bu, kültür, aşağıdaki döllenmesi için olan, özellikle oositlerde antibiyotik potansiyel zararlı etkilerini önlemek için yararlı olabilir. Steril bir ortamda çalışmak mümkün olmadığı durumlarda, bu diseksiyon ve kültür ortamı için antibiyotik eklemek için tavsiye edilir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leibowitz L15 | Invitrogen | 11415049 | |
| αMEM | Invitrogen | 22571020 | Supplied as sodium bicarbonate buffered (2,200 mg/L) |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A9418 | For dissection medium |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A3311 | For culture medium |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | For coating glass pipettes |
| Mouse serum | - | - | Collected from cardiac puncture |
| FSH | Merck Serono | Gonal F | Batch testing is often necessary. Make up stock solution of 1IU/10µl in αMEM and store at -20 °C. |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4034 | Make up stock of 5mg/ml in αMEM and store at -20 °C. |
| Silicon oil | VWR | 630064V | Dow Corning Silicone Fluid 200/50cS |
| Syringe filters (25 mm, 0.2 µm) | Greiner | 16532K | Cellulose acetate filter for filtering larger (>5 ml) volumes of medium. |
| Syringe filters (13 mm, 0.2 µm) | Iwaki | 3032-013 | Cellulose acetate filter for filtering smaller (<5 ml) volumes of medium |
| Syringe filters (25 mm, 0.45 µm) | Iwaki | 2053-025 | Cellulose acetate filter for filtering oil. |
| Sterile tubes | Greiner | 187261 | |
| 24-well plate | Greiner | 662160 | |
| 96-well round bottom plate | Iwaki | 3875-096 | Use only non-tissue culture treated plates |
| 96-well flat bottomed well | Iwaki | 3860-096 | Use only non-tissue culture treated plates |
| Whatman nucleopore membranes | Camlab | WN/110414 | Use shiny surface up, polycarbonate, 13 mm diameter, 8.0 µm pore size |
| Insulin needles | BD medical supplies | 037-7606 | 0.33 mm (29 G) + 1 ml |
| Glass embryo dishes | VWR | 720-0579 | Sterilize, then warm before use. |
| Glass pipettes | Fisher Scientific | 10209381 | BSA coated before use. |
| Gel tips | AlphaLabs | LW1103 | |
| Acupuncture needles | Acumedic LTD | 30 mm x 0.25 Type C | |
| Bouin’s fixative | Sigma Aldrich | HT10132-1L | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT5014-120ml | |
| 1.5 ml polypropylene tubes | Greiner BioOne | 616201 |
References
- Brien, M. J., Pendola, F. L., Eppig, J. J. A revised protocol for in vitro development of mouse oocytes from primordial follicles dramatically improves their developmental competence. Biol. Reprod. 68 (5), 1682-1686 (2003).
- Fortune, J. E., Yang, M. Y., Muruvi, W. The earliest stages of follicle development: follicle formation and activation. Soc. Reprod. Fertil. Suppl. 67, 203-216 (2010).
- McLaughlin, M., Kinnell, H. L., Anderson, R. A., Telfer, E. E. Inhibition of phosphatase and tensin homologue (PTEN) in human ovary in vitro results in increased activation of primordial follicles but compromises development of growing follicles. Mol. Hum. Reprod. 20 (8), 736-744 (2014).
- Morgan, S., Lopes, F., Gourley, C., Anderson, R. A., Spears, N. Cisplatin and doxorubicin induce distinct mechanisms of ovarian follicle loss; imatinib provides selective protection only against cisplatin. PLoS One. 8 (7), e70117 (2013).
- Murray, A. A., et al. Follicular growth and oocyte competence in the in vitro cultured mouse follicle: effects of gonadotrophins and steroids. Mol Hum Reprod. 14 (2), 75-83 (2008).
- Baker, S. J., Srsen, V., Lapping, R., Spears, N. Combined effect of follicle-follicle interactions and declining follicle-stimulating hormone on murine follicle health in vitro. Biol. Reprod. 65 (4), 1304-1310 (2001).
- Campbell, L., Trendell, J., Spears, N. Identification of cells migrating from the thecal layer of ovarian follicles. Cell Tissue Res. 353 (1), 189-194 (2013).
- Pratt, T., Sharp, L., Nichols, J., Price, D. J., Mason, J. O. Embryonic stem cells and transgenic mice ubiquitously expressing a tau-tagged green fluorescent protein. Dev. Biol. 228 (1), 19-28 (2000).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Maiani, E., et al. Reply to: cisplatin-induced primordial follicle oocyte killing and loss of fertility are not prevented by imatinib. Nat. Med. 18 (8), 1172-1174 (2012).
- Spears, N., Bruin, dr, Gosden, J. P., G, R. The establishment of follicular dominance in co-cultured mouse ovarian follicles. J. Reprod. Fertil. 106 (1), 1-6 (1996).
- Desmeules, P., Devine, P. J. Characterizing the ovotoxicity of cyclophosphamide metabolites on cultured mouse ovaries. Toxicol. Sc. 90 (2), 500-509 (2006).
- Tagler, D., et al. Promoting extracellular matrix remodelling via ascorbic acid enhances the survival of primary ovarian follicles encapsulated in alginate hydrogels. Biotechnol. Bioeng. 111 (7), 1417-1429 (2014).
