Abstract
植物为基础的系统被认为是用于生产重组蛋白作为其证据充分的电位为柔性，低成本生产高质量的，生物活性的产品的结果的有价值的平台。
在这项研究中，我们比较了在传统的发酵罐系的细胞培养物（细菌和昆虫）与基于植物的表达系统，无论是瞬时和稳定的靶人重组蛋白的表达。
每个平台，我们所描述的设置，优化和生产过程的长度，最终产品的质量和产量，我们评估了临时的生产成本，具体为所选靶重组蛋白质。
总的来说，我们的结果表明，细菌是不适合用于生产目标蛋白的，由于其不溶性包涵体内积累。另一方面，基于植物的系统是通用的平台吨帽允许生产所选蛋白质在较低的成本比杆状病毒/昆虫细胞系统。尤其是，稳定的转基因系显示最高产量的终产物和瞬时表达的植物最快流程开发。然而，并非所有的重组蛋白可受益于基于植物的系统中，但最好的生产平台应凭经验用逐案的方式来确定，如这里所述。
Protocol
1.构建表达载体
- 商业重组克隆系统：
- 扩增全长的靶基因（hGAD65mut）用合适的引物，允许在该基因的5'末端加入一个CACC夹具如前所述2的序列。
- 1的摩尔比插入物：载体和1μl的通过组装在6微升的总体积的反应中，使用1.5克隆凝胶纯化的扩增产物，根据定向克隆试剂盒的规格，在输入向量（拓扑异构酶结合的）盐溶液（0.2M NaCl和0.01的MgCl 2）。孵育在室温下5分钟（RT）。
- 变换整个反应进化学感受态根据定向克隆试剂盒的规格和屏幕获得的菌落通过菌落PCR 3，使用M13正向和反向引物的大肠杆菌细胞包括在定向克隆试剂盒。从PO隔离质粒根据质粒DNA制备试剂盒的规格和序列插入用M13正向和反向引物，以确保不存在突变3的sitive菌落。
- 使用所获得的进入克隆通过拉姆达重组酶克隆酶II酶（LR）与特定的目标矢量进行重组反应：为在细菌细胞的重组蛋白质的表达与pDEST17（产生pDEST17.G65mut），在植物中（瞬时或稳定）与pK7WG2 （产生pK7WG2.G65mut），在杆状病毒/昆虫细胞系统与线性化病毒DNA（产生Baculo.G65mut）4。组装的反应中，根据克隆酶试剂盒的规格，用100ng入门载体，150纳克目标矢量和2μl酶混合物中的10微升的最终体积。孵育混合物在RT搅拌1小时。
- 改造重组产物进化学感受态根据克隆酶试剂盒规格大肠杆菌细胞。通过PCR 3的屏幕获得的菌落
- 使用商用的DNA小量制备试剂盒分离质粒DNA并确认目标序列的存在通过PCR 3，使用在先前步骤中所描述的相同的特定的引物组合。
- 使用所得PCR阳性质粒转化不同靶生物，取决于如在以下步骤中所述选择用于重组蛋白质表达的平台上。
- MagnICON系统5-7：
- 克隆靶基因的3'-模块pICH31070，如先前详细描述的7，得到pICH31070.G65mut。使用以下具体反应周期：30分钟在37℃，5分钟，在50℃，然后用5分钟在80℃。
2.重组蛋白表达
- 细菌细胞系统：
- 转换成pDEST17.G65mut E.大肠杆菌 BL21（DE3）用标准技术和筛选菌落生长在含有氨苄青霉素（100微克/毫升）的LB培养基，通过菌落PCR，使用下列转基因特异性引电感受态细胞：5'-CTGGTGCCAAGTGGCTCAGA-3'和5' -CACACGCCGGCAGCAGGT-3'，用58℃的退火温度和20秒的延伸时间。执行与在管的塑料尖端溶解细菌细胞后在20微升的总体积PCR反应。
- 在3ml含氨苄青霉素（100微克/毫升）的LB培养基过夜接种单个菌落，在37℃。
- 稀释的细菌培养1：100在100毫升的新鲜LB培养基中（含ampicill在），并孵育在37℃下进行1-6小时，直到最终的OD 600为0.8。
- 通过加入isopropil-β-D-1-tiogalattopiranoside（IPTG）中的1mM的最终浓度诱导重组蛋白质表达并孵育培养在37℃下剧烈振荡3小时。
- 通过离心收集细胞，在4000×g离心20分钟，并用细菌沉淀用于蛋白质提取（步骤3.1.1.1）。
- 杆状病毒/昆虫细胞系统：
- 种子草地夜蛾 （的Sf9）细胞到6孔板（8×10 5个细胞每孔），并用2ml无补充Grace昆虫培养基洗两次。
- 卸下并更换介质逐滴加入转染混合物（5微升LR重组反应，6微升Celfectin液和200微升非补充Grace的昆虫培养基）。
- 孵育板在27℃5小时。
- 删除并用2ml新鲜SF-9替换转染混合物00培养基，补充有10％胎牛血清，10μg/ ml的庆大霉素和100μM更昔洛韦选择重组杆状病毒的克隆。
- 培养96小时，在27°C后，收集介质（V1病毒原料），离心机在4000 XG到4℃，除去细胞和大的杂物和存储在黑暗中。
- 种子1×10 6个Sf9昆虫细胞每井在2.5ml SF-900含有10％胎牛血清，10μg/ ml的庆大霉素和100μM更昔洛韦和感染在每100微升V1股票的良好介质。
- 孵育细胞3天，在27℃。
- 收集并在4000×g的离心机中。
- 存储上清液（V2高滴度的股票），在4℃。
- 种子1×10 6个Sf9昆虫细胞每井在2.5ml SF-900含有10％胎牛血清，10μg/ ml的庆大霉素和100μM更昔洛韦和感染用25微升V2库存中每一井平台。
- 孵育细胞3天，在27℃。
- 收集的细胞通过离心机在4000×g离心，用昆虫细胞沉淀用于蛋白质提取（步骤3.1.2。1）。
- 本氏烟草瞬时表达系统：
- 成长N.本生植物在温室中，在自然光中的温度范围18-23℃。对于农杆菌感染使用4-5周龄的植物。
- 保持在一个气候室agroinfected植物在22℃，13小时昼/ 11小时夜的光周期。
- 商业重组克隆系统：
- 引入pK7WG2.G65mut在根癌农杆菌菌株EHA105电感受态细胞如前所述8和筛选菌落，2后生长在LB培养基中含有利福平（50微克/毫升），链霉素（300微克/毫升）和壮观霉素（100微克/毫升）使用下列转基因特异的引物温育天在28℃，通过菌落PCR 8：5'-CATGGTGGAGCACGACACGCT-3＆＃8217;和5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3'，用58℃的退火温度和50秒的延伸时间。进行在20微升的总体积PCR反应。
- 在28℃接种细菌在30ml的LB培养基中含有利福平（50微克/毫升），链霉素（300微克/毫升）和壮观霉素（100微克/毫升）两天的。
- 收集细菌离心4000 xg离心20分钟，重悬沉淀在10ml浸润缓冲液（10mM MES，10mM的MgCl 2的，100μM的乙酰丁香酮，pH值5.6）。测量的OD 600值，然后将其稀释在相同的缓冲液调节到0.9。
注意：需要的浸润3 N.总体积本生植物为30毫升 - 使用2.5ml的针注射器渗入土壤杆菌悬浮液中N.叶本生 。小心缓慢地注入叶板与从注射器的悬浮液中。打入3扩充升单株屋檐和使用三个工厂为一式三份。
注：为健康和安全原因穿在渗透过程保护眼睛。 - 收集农杆菌渗入叶后2天感染（dpi）的并冷冻在液氮中。商店的植物组织在-80℃下。
- MagnICON系统：
- 引入MagnICON矢量- 5'模块（pICH20111），3'模块（pICH31070.G65mut），以及整合模块（pICH14011） -中A.农杆菌使用标准技术GV3101菌株。筛选菌落，生长在含LB培养基50微克/毫升利福平和使用特异性引物对每个矢量适当的载体中特异性的抗生素（50μg/ ml的羧苄青霉素用于pICH20111和pICH14011，50微克/毫升卡那霉素用于pICH31070），通过菌落PCR。
- 分别接种三A.癌农杆菌菌株在5ml LB培养基中含有50微克/毫升利福平和适当的载体特异性抗生素和动摇一夜之间在28°C。
- 粒料过夜细菌培养物通过离心在4000×g离心20分钟，并重新悬浮在它们两卷的10mM MES（pH为5.5）和10mM 硫酸镁的初始细菌培养物。
- 混合含有三个矢量细菌悬浮液的等体积，并使用该悬浮液的混合为N的注射器浸润叶本生 。渗透每个三厂展开的叶片。
- 收集农杆菌渗入叶在4 dpi和冷冻在液氮中。
- 商店的植物组织在-80℃下。
- 烟草稳定表达系统：
- 成长和维护N.的组培苗烟草 （ 变种SR1。）在固体植物培养基（4.4 g / L的Murashige和Skoog -质谱-介质包括维生素，30g / L的蔗糖，pH值5.8，第7克/升的植物琼脂）在受控条件下在气候室中于25 ℃，16小时/ 8小时白天/ NIGHT制度。
- 启动A的预培养农杆菌 EHA105含有该表达载体pK7WG2.G65mut在5ml用合适的抗生素的液体的YEB培养基（利福平50微克/毫升，链霉素300微克/毫升，大观霉素100微克/毫升），并在定轨振荡器组生长过夜，在28℃下在200rpm。
- 使用预培养1毫升接种在YEB培养基加上抗生素50ml的农杆菌培养物（利福平50微克/毫升，链霉素300微克/毫升，大观霉素100微克/毫升），并生长24小时，直到所述细菌培养是饱和（OD 600值0.5〜1.0）。
- 收集细菌离心4000 xg离心20分钟，重悬沉淀在50ml液体植物培养基。重复此步骤两次，以彻底去除抗生素。
- 就拿第一健康完全展开的叶片排出体外烟草植物和切成大约为1平方厘米。
- 转让叶件到深培养皿含有细菌悬液并在黑暗中保留20分钟。
- 起停牌删除叶片，吸干在无菌滤纸上。
- 放置叶片与正面侧（上叶表面）上的固体植物培养基含有1.0微克/毫升6-苄氨基嘌呤（BAP）和0.1微克/毫升萘乙酸（NAA）和孵育板两天在气候室中在受控条件（25℃，16小时日/ 8小时夜间）。
- 转印叶片上的固体培养基（含1.0微克/毫升的BAP，0.1微克/毫升的NAA，500微克/ ml的头孢噻肟，100微克/毫升卡那霉素）与背面（叶的下表面）中与介质接触。
- 孵育平板2-3周，在气候室中于25℃下用16小时/ 8小时白天/黑夜制度以诱导枝条形成。继代培养，每2周通过转移叶植食固体植物培养基含有1.0微克/毫升BAP，0.1微克/毫升NAA，500微克/ ml的头孢噻肟和100微克/毫升卡那霉素。
- 当枝条似乎它们转移到含有固体培养基含500微克/ ml的头孢噻肟和100微克/毫升卡那霉素以诱导根的形成Magenta盒。孵育小植株以16小时昼/ 8小时夜晚光周期在25℃下进行1-2周。
- 当根形式，在温室中的植物转移到土壤中。
- 收集一块叶每个工厂和分离基因组DNA与商业套件。
- 检测转基因通过特异性PCR的存在。使用下列转基因特异性引物使用30纳克基因组DNA为模板进行PCR扩增的：5'-CTGGTGCCAAGTGGCTCAGA-3'和5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3'，用58℃的退火温度和20秒的延伸时间。进行在50微升的总体积PCR反应。
- 在Tris-乙酸-EDTA（TAE）缓冲液的1％琼脂糖凝胶（40毫Tr的分析通过电泳的220碱基对产物是，20毫乙酸，和1mM EDTA）。
- 选择含有靶基因的转基因植物。
- 收集一个叶片从每个选定的转基因植物，并立即冷冻在液氮中。
- 制备总蛋白提取物从植物的叶组织（步骤3.1.3），并如先前所述2来选择最佳的重组蛋白表达的烟草植物用western印迹分析测试每个样品。
- 选择表现最好的植物袋鲜花盛开，防止交叉授粉前。
- 开花，果实成熟和种子干燥后，收集袋。
- 从谷壳分离的种子，并将其储存在干燥的房间，在控制温度（20-24℃）。
- 播下干燥种子，以产生第二代转基因植物，并随后选择性能最佳的植物是自花传粉。
- 重复在步骤2.4.19-2.4.21用于后续世代中描述的相同的过程。
3，重组蛋白表达的分析
- 总蛋白的提取：
- 细菌细胞：
- 如在步骤2.1.5所述，在Tris缓冲盐水的一半培养体积重悬细菌细胞沉淀，收集（TBS - 2毫摩尔Tris /盐酸，500mM的NaCl）中pH 7.4的补充有1mM的phenylmethanesulfonylfluoride（PMSF）。
- 声处理重悬细胞沉淀三次40秒以一半的功率，同时保持样品在冰上。
- 澄清的溶胞产物离心以14000×g离心20分钟，在4℃。
- 转移上清液至一个干净的管中并在-80℃下单独储存既上清液和沉淀。
- 溶解包涵体，收集在沉淀，在TBS pH为8.0，在室温下剧烈振荡培养过夜补充有6M尿素的一半细胞裂解物体积。
- 离心以10,000 xg离心在室温下25分钟，并在一个干净的收集上清管。
- 同时存储上清，沉淀在-80℃。
- 昆虫细胞：
- 洗感染的昆虫细胞沉淀，如在步骤2.2.12中描述，用1ml磷酸盐缓冲盐水的收集（PBS - 137 mM氯化钠，2.7 mM的氯化钾，10毫的Na 2 HPO 4，1.8毫KH 2 PO 4）pH为7.4。
- 重悬的细胞在200μl的裂解缓冲液（20mM的Tris /盐酸pH为8.0，0.5M氯化钠，3mM的β巯基乙醇和1％吐温20）和在冰上孵育30分钟。
- 离心机溶解细胞以14000×g离心20分钟，在4℃。
- 收集可溶性部分并储存在-80℃并弃沉淀。
- 植物叶片组织：
- 研磨N.本生或N.使用研钵和杵烟草组织以细粉末在液氮中。
- 均质在300微升提取缓冲地面组织的100毫克（40毫摩尔的Hepes pH值7.9，5mM的DTT，1.5％CHAPS），增刊emented用3微升的蛋白酶抑制剂和解冻的冰。
注意：植物组织重量（克）之间的选择比来缓冲体积（ml）为1：3。 - 离心提取液以30,000×g离心30分钟，在4℃。
- 在一个干净的管中并储存在-80℃下收集上清液。
- 细菌细胞：
- 考马斯亮蓝染色凝胶：
- 制备适当稀释的总蛋白提取物（ 例如，2微升的植物提取物，5微升的细菌和昆虫提取物），以10微升的提取缓冲液的终体积，并添加5微升的3×样品缓冲液（1.5M的Tris /盐酸pH值6.8，3％SDS，15％甘油，4％β巯基乙醇）至最终浓度1倍。
- 煮沸样品10分钟。
- 分离的蛋白通过10％SDS-PAGE。
- 电泳后，在考马斯溶液A（0.05％亮蓝R-250，25％异丙醇，10％乙酸）中在微波炉中存在大约两分钟热度凝胶s直至沸点。
- 冷却凝胶至室温下轻轻摇动。
- 弃考马斯亮蓝染色溶液A.
- 通过加热在考马斯溶液B存在脱色凝胶（0.05％亮蓝R-250，25％异丙醇），C（0.002％亮蓝R-250，10％乙酸）和D（10％乙酸）每次按照相同的协议进行染色。
- 最后加热步骤与溶液D后，留下凝胶脱色直到背景清晰9。
- Western blot分析：
- 电泳后，转移在室温下分离使用标准技术，用4％的乳块的蛋白质到硝酸纤维素膜在PBS pH 7.4的1小时。
- 过夜孵育印迹在4℃或4小时，在室温下，在含有1针对靶蛋白的兔一抗封闭溶液：10,000和补充有0.1％Tween-20的。
- 经过一抗标签ING，用封闭溶液含有0.1％Tween-20洗涤膜3次，每次5分钟。
- 孵育与辣根过氧化物酶（HRP）偶联物的抗兔抗体以1：10,000 1.5小时。
- 洗膜为每个用PBS-T 5分钟5次（PBS中补充有0.1％吐温20）。
- 过程中使用的化学发光过氧化物酶底物免疫印迹。
- 放射免疫测定法（RIA）：
- 允许试剂（抗血清，示踪和蛋白A琼脂糖）达到室温和吸管20微升蛋白提取物样品和标准在不同浓度的（从市售的重组hGAD65的300-2,400纳克/毫升）成12×75mm的聚苯乙烯管中。
- 加入20微升抗血清，准备稀释1:30从T1D病人的血浆，血清。
- 添加50μl的示踪剂（125-I-GAD65）的孵育2小时，在室温下进行。设置与示踪剂的管只以估计总活性。
- 加入50微升蛋白A琼脂糖和孵育1小时，在室温下进行。
- 分配1ml冷的PBS缓冲液到每个管中，并离心以1500 xg离心在4℃下进行30分钟。
- 倒出管除去上清液和吸收残留的液体上轻轻拍打管吸水纸。
- 测量通过在γ计数器计数1分钟免疫沉淀的放射活性在所有管中。
- 剧情在数比例与总活性校准的结合率（B / T％），建立标准曲线，和读取样品浓度GAD关闭校准曲线10。
注：限制区域应该被设计用于存储，处理和处置的放射性物质。
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Representative Results
实验设计为靶重组蛋白在不同的生产系统中的异源表达在这里被描述。第一焦点是通过建立最佳条件对靶蛋白的每个系统中表达所述的建立的不同的平台。
靶蛋白，hGAD65mut的表达，诱导式三份大肠杆菌大肠杆菌文化。下列3小时的表达，在37℃，细菌细胞通过离心收集并通过超声处理裂解。离心步骤后，可溶性蛋白从不溶包涵体分离和初步分析表明，hGAD65mut在不溶性包涵体prevalently累积（数据未显示）。重组蛋白溶解作用需要使用尿素6男，其中，其强大的性能变性，干扰RIA的分析，使hGAD65mut不可能适当量化。几种策略已被烯报道用于限制包涵体的形成，其包括在低温下生长11的微生物细胞。将培养物在15°C和20°C，以及重组蛋白表达的诱导在相同的温度下。 如图1A所示 ，hGAD65mut的增溶产生在两个温度下，再次要求脲（泳道S2）。因此，低的温度下在该实验中不阻止hGAD65mut从形成不溶性聚集体。
包含hGAD65mut序列（Baculo.G65mut）杆状病毒载体表达的粘附的Sf9细胞培养。准备V1和V2高滴度的股票和表现最好的感染条件设置为从5-50微升评估不同病毒的库存量。 如图1B所示 ，最优的病毒原料体积被确定为25微升，得到11.8±0.8微克每毫升培养基中的重组蛋白，如评估用RIA分析（ 表1）。
下面渗透，agroinfected N的时间进程分析本生叶片进行在两个瞬时表达系统。对于pK7WG2为基础的系统，叶样品在1-5范围dpi的每日汇集，总可溶性蛋白（TSP）的提取和TSP等量通过免疫印迹（ 图1C）进行分析。此分析强调靶重组蛋白的最大累积达到2 dpi的。因此，将叶子收集2 dpi和蛋白提取物用RIA测定的重组蛋白的积累，这表明平均67.8微克/克FLW（鲜重叶， 表1）进行分析。重组蛋白质表达水平，使用这种系统，可进一步提高，通过共浸润的叶子与转录后基因沉默（PTGS）的像P19或HC临12抑制剂。
该同一时间过程检测，进行与N.叶本生与agroinfected的MagnICON向量：病叶收集了免疫印迹分析1-8 dpi和等量TSP的。这一分析表明，最大的重组蛋白的积累得到4分辨率（ 图1D），具有78.8微克/克FLW（ 表1）重组蛋白质的平均累积，作为评价用RIA。
hGAD65mut在转基因烟草植株中的表达已有报道12，显示出重组蛋白水平之间独立转化系显著变化。表现最好的hGAD65mut T1转基因植物是自交和衍生植物（T2）进行了分析，再次选择表现最好的之一。此过程重复几代开发一种均质生产平台，检查在每一代的性能用RIA，直到没有进一步的改进是获得（数据未示出）。在图1E中 ，T5的转基因植物的代表性免疫印迹报道，其中的重组蛋白质的产量的同质性是显而易见的。 如图1F中，平均hGAD65mut收率来自T2上升到T6，在选择过程中达到99.1微克/克FLW（ 表1）和，水平，所述表达水平的标准偏差下降。
图1：平台设置设置的最适合于各平台hGAD65mut表达的条件。 （A）E.大肠杆菌诱导表达的平台。细菌细胞生长在15℃或20℃。 上部面板 ，hGAD65mut的细胞提取物中免疫印迹（每泳道2微克，TSP）。 更低的面板 ，加载控制用考马斯染色。 ñ.C。 =阴性对照，用含有氯霉素抗性基因的pDEST17载体的细菌细胞; T：总样本; S1：上清液超声和离心后; S2和P：上清液（1）和粒料（2）溶解于含脲缓冲液中的样品离心后。 （B）杆状病毒/昆虫细胞的平台。以下病毒的库存量进行了测试：5，25和50微升上层面板 ，hGAD65mut的细胞提取物免疫印迹（每通道5微克TSP） 下盘 ，装载控制用考马斯染色。 NC =阴性对照，未转化的昆虫细胞的提取物。 （C）瞬时表达N.使用pK7WG2载体本生植物。样品每天收集，1-5 DPI（泳道1-5）。 上面板 ，hGAD65mut在叶提取物免疫印迹（每通道2.5微克TSP）， 下板 ，加载控制染色用考，那里的大亚基Rubisco酶是显而易见的。 NC =阴性对照，植物渗透与pK7WG2载体携带绿色荧光蛋白标记基因。 （D）瞬时表达N.使用MagnICON载体本生植物。样品每天收集，1-8 DPI（泳道1-8）。 上面板 ，hGAD65mut在叶提取物免疫印迹（每通道5微克TSP）， 下板 ，加载控制染色用考哪里的Rubisco的大亚基是显而易见的。 NC =阴性对照，植物渗透仅与pICH20111 5'-模块和pICH14011整合模块。数字表示分子量标记的kDa的。 PC =阳性对照，15纳克在杆状病毒/昆虫细胞系统产生的商业hGAD65的。 （E）的稳定表达的N.烟草植物。叶样品来自不同的T5植物（泳道1-11）搜集。上游面板，hGAD65mut在叶提取物免疫印迹（每通道5微克TSP）。较低的面板，装载控制染色瓦特第i个考。 NC =阴性对照，野生型植物。数字表示分子量标记的kDa的。 PC =阳性对照，15纳克在杆状病毒/昆虫细胞系统产生的商业hGAD65的。 （F）稳定表达的N.烟草植物。 hGAD65mut积累了源自几代箱线图的表示表现最佳的报告为RIA数据计算微克/克FLW hGAD65mut T1转基因烟草植株。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 系统 | [hGAD65mut]（微克/毫升） | [hGAD65mut] |
| 杆状病毒/昆虫 | 117.5±7.7 | 11.8±0.8微克/毫升培养基 |
| Transien吨 | 22.6±0.9 | 67.8±2.7微克/克FLW |
| MagnICON | 26.3±5.9 | 78.8±17.8微克/克FLW |
| 精英T6 | 33.0±3.8 | 99.1±11.3微克/克FLW |
表1：hGAD65mut产生hGAD65mut产量在不同的平台 -发酵罐系（杆状病毒/昆虫）和基于植物的（pK7WG2-和MagnICON在烟草本塞姆氏中和普通烟草精英T6）。第二列 - 蛋白质提取物hGAD65mut浓度（微克/毫升）。第三列 - 在新鲜叶重（微克/克FLW）的用于植物为基础的平台，并在细胞培养基中（微克/毫升），用于发酵罐的平台hGAD65mut内容。
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Discussion
在这项研究中三个不同的平台上进行了比较重组人蛋白的表达：细菌细胞，杆状病毒/昆虫细胞和植物。 （ - MagnICON和pK7WG2基础-稳定的即瞬态）的植物为基础的平台是通过利用三个广泛使用的表达技术的进一步探索。选择用于该实验中，hGAD65mut，靶蛋白已在不同的系统13先前已经表示，它的生产和功能是很容易检测和可测量14。
细菌细胞不是一种有效的生产平台，因为hGAD65mut形成包涵体，即使在低温条件下生长，因此需要费力的增溶和再折叠，以实现其天然构象。事实上，该平台对复杂的重组蛋白的表达的主要失效是最终产品的正确构象。
该杆状病毒/昆虫细胞介导的平台高表达的免疫活性的重组蛋白的，但这种表达系统的主要限制是培养基的成本高，生长昆虫细胞必需的。据估计，1克hGAD65mut的总生产成本可能达到700欧元这个生产平台（考虑到9升昆虫细胞培养基的需要）。这种表达平台的进一步限制是无菌培养的昆虫细胞的，这需要以无菌操作技能的人员的需要。以确保有效的重组蛋白的积累的两个关键参数必须在该表达系统中仔细控制：用于感染细胞的病毒的库存量和病毒感染的时间。此外，洗涤剂，用于总可溶性蛋白提取Sf9昆虫细胞，大大影响了重组蛋白溶解作用。
植物为基础的系统是最有利的platfoRM表示hGAD65mut：植物造的重组蛋白的免疫反应，并以高水平的叶组织中积累。比较不同植物为基础的表达系统中，最高产率在稳定转化的烟草植物（ 表1），并分别实现，如果考虑到烟草的总生物量相比为N.本生 ，用于瞬时表达，烟草的整体更高的生产效率是显而易见的。然而，稳定的转化的烟草植物的平台的主要限制是必需的集式系统的，这在我们的研究用了20个月的时间。事实上，一个纯合线应该被选择用于重组蛋白质表达的同质性和它可能需要重复自交周期，从表达线最高的T1开始。特别是，当所选择的T1承担转基因性状的多于一个的拷贝，育种计划可能需要长达3年。
瞬时表达系统所提供的优点快速倍增因转化和表达和设定了表达平台之间的短间隔需要4天。然而，基于植物的瞬时系统的一个限制是，它们的自动化是难以实现的在实验室规模的，除非使用专用高档设备农业渗透。因此，在这里不能执行使用暂态为基础的系统的适当的计算用于大规模生产hGAD65的。另一方面，我们推测，用T6稳定烟草线总生产成本，为1克重组蛋白可以被计算以小于5欧元（考虑土壤用于生长60烟草植物）。以确保有效地农杆菌渗入和蛋白质生产的几个关键参数应当仔细控制（植物发育阶段，生长和农杆菌浸润状态）时，如先前报道15。此外，对于每一个表达实验的特定时间 - 过程分析应进行选择，其允许重组蛋白的积累量最高的dpi的。
这里所讨论的例子可以被认为是证明性的原则，案例研究，即突出了一些植物为基础的生产比传统系统的独特优势。特别是，烟草转基因品系均匀表达该重组蛋白质可以被认为是用于大规模生产重组蛋白的所需要的大批量的宝贵的平台。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast extract | Sigma | Y1333 | |
| Tryptone | Formedium | TRP03 | |
| Agar Bacteriological Grade | Applichem | A0949 | |
| Sf-900 II SFM medium | Gibco | 10902-088 | |
| Grace’s Insect Medium, unsupplemented | Gibco | 11595-030 | |
| Cellfectin II Reagent | Invitrogen | 10362-100 | |
| MS medium including vitamins | Duchefa Biochemie | M0222 | |
| Sucrose | Duchefa Biochemie | S0809 | |
| Plant agar | Duchefa Biochemie | P1001 | |
| Ampicillin sodium | Duchefa Biochemie | A0104 | Toxic |
| Gentamycin sulphate | Duchefa Biochemie | G0124 | Toxic |
| Ganciclovir | Invitrogen | I2562-023 | |
| Carbenicillin disodium | Duchefa Biochemie | C0109 | Toxic |
| Kanamycin sulfate | Sigma | K4000 | Toxic |
| Rifampicin | Duchefa Biochemie | R0146 | Toxic – 25 mg/ml stock in DMSO |
| Streptomycin sulfate | Duchefa Biochemie | S0148 | Toxic |
| Spectinomycin dihydrochloride | Duchefa Biochemie | S0188 | |
| IPTG (isopropil-β-D-1-tiogalattopiranoside) | Sigma | I5502 | Toxic |
| MES hydrate | Sigma | M8250 | |
| MgCl2 | Biochemical | 436994U | |
| Acetosyringone | Sigma | D134406 | Toxic – 0.1 M stock in DMSO |
| Syringe (1 ml) | Terumo | ||
| MgSO4 | Fluka | 63136 | |
| BAP (6-Benzylaminopurine) | Sigma | B3408 | Toxic |
| NAA (Naphtalene acetic acid) | Duchefa Biochemie | N0903 | Irritant |
| Cefotaxime | Mylan Generics | ||
| Trizma base | Sigma | T1503 | Adjust pH with 1 N HCl to make Tris-HCl buffer |
| HCl | Sigma | H1758 | Corrosive |
| NaCl | Sigma | S3014 | 1 M stock |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791 | |
| PMSF (Phenylmethanesulfonylfluoride) | Sigma | P7626 | Corrosive, toxic |
| Urea | Sigma | U5378 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | Toxic |
| Tween-20 | Sigma | P5927 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | |
| DTT (Dithiothreitol) | Sigma | D0632 | Toxic – 1 M stock, store at -20 °C |
| CHAPS | Duchefa Biochemie | C1374 | Toxic |
| Plant protease inhibitor cocktail | Sigma | P9599 | Do not freeze/thaw too many times |
| SDS (Sodium dodecyl sulphate) | Sigma | L3771 | Flammable, toxic, corrosive – 10% stock |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Brilliant Blue R-250 | Sigma | B7920 | |
| Isopropanol | Sigma | 24137 | Flammable |
| Acetic acid | Sigma | 27221 | Corrosive |
| Anti-Glutamic acid decarboxylase 65/67 | Sigma | G5163 | Do not freeze/thaw too many times |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibody | Sigma | A6154 | Do not freeze/thaw too many times |
| Sf9 Cells | Life Technologies | 11496 | |
| BL21 Competent E. coli | New England Biolabs | C2530H | |
| Protein A Sepharose | Sigma | P2545 | |
| Cell culture plates | Sigma | CLS3516 | |
| Radio Immuno Assay kit | Techno Genetics | 12650805 | Radioactive material |
References
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