Abstract
Växtbaserade system anses en värdefull plattform för produktion av rekombinanta proteiner som ett resultat av deras väldokumenterade potentialen för den flexibla, lågkostnadsproduktion av hög kvalitet, bioaktiva produkter.
I denna studie jämförde vi uttrycket av ett mål humant rekombinant protein i traditionella fermenteringsbaserade cellkulturer (bakterie- och insekts) med växtbaserade uttryckssystem, både övergående och stabila.
För varje plattform, beskrev vi set-up, optimering och längd av produktionsprocessen, den slutliga kvalitet och avkastningen och vi utvärderade preliminära produktionskostnader, som är specifika för det valda målet rekombinant protein.
Sammantaget indikerar våra resultat att bakterier är olämplig för framställning av målproteinet på grund av dess ackumulering inom olösliga inklusionskroppar. Å andra sidan, växtbaserade system är mångsidiga plattformar thatt tillåta produktionen av det valda proteinet vid lägre-kostnader än Baculovirus / insektscellsystemet. Särskilt stabila transgena linjer uppvisade den högsta utbytet av den slutliga produkten och övergående uttryckande växter den snabbaste processutveckling. Dock kan inte alla rekombinanta proteiner gynnas växtbaserade system, men det bästa produktionsplattform bör bestämmas empiriskt med en bedömning från fall till fall, som beskrivs här.
Protocol
1. Konstruktion av expressionsvektorer
- Kommersiell rekombination kloningssystem:
- Förstärk fullängdssekvensen av målgenen (hGAD65mut) med lämpliga primrar tillåter tillsatsen av en CACC klämma vid 5'-änden av genen som tidigare beskrivits 2.
- Klona den gelrenade amplifieringsprodukten, enligt riktningsklonings kit specifikationer, i ingångsvektor (topoisomeras bundna) genom hopsättning reaktionen i en total volym av 6 | il, med användning av en 1,5: 1 molförhållande insert: vektor och ett pl av saltlösning (0,2 M NaCl och 0,01 MgCl2). Inkubera under 5 min vid rumstemperatur (RT).
- Omvandla hela reaktionen i kemiskt kompetent E. coli celler enligt riktnings kloning kit specifikationer och skärm erhållna kolonier av kolonin PCR 3, med hjälp av M13 framåt och bakåt primers ingår i riktningskloningssatsen. Isolera plasmiden från en pokänslig koloni enligt plasmid DNA Preparation Kit specifikationer och sekvens skär använder M13 framåt och bakåt primers för att säkerställa frånvaron av mutationer 3.
- Använd den erhållna entryklonen att utföra rekombinationsreaktionen av Lambda Recombinase Clonase II enzym (LR) med specifika destinations vektorer: för rekombinant proteinuttryck i bakterieceller med pDEST17 (vilket ger pDEST17.G65mut), i växter (transienta eller stabila) med pK7WG2 (vilket ger pK7WG2.G65mut), i Baculovirus / insektscellsystemet med linjäriserade viralt DNA (vilket ger Baculo.G65mut) 4. Montera reaktionen enligt CLONASE kit specifikationer, med 100 ng av ingångsvektor, 150 ng av destinationsvektor och 2 | il av enzymblandningen i en slutlig volym av 10 | il. Inkubera blandningen vid RT under 1 h.
- Förvandla rekombination produkten i kemiskt kompetent E. coli celler enligt CLONASE kit specifikationer. Screen erhållna kolonier från PCR 3
- Isolera plasmid-DNA med användning av ett kommersiellt minipreparation DNA kit och bekräfta närvaron av målsekvensen genom PCR 3, med användning av samma specifika primer-kombinationer som beskrivs i föregående steg.
- Använd de erhållna PCR-positiva plasmider för att transformera olika målorganismer, beroende på plattformen väljs för uttryck av rekombinant protein, såsom beskrivs i de följande stegen.
- MagnICON systemet 5-7:
- Klona målgenen i 3'-modulen pICH31070, såsom tidigare beskrivits i detalj 7, vilket gav pICH31070.G65mut. Användföljande specifika reaktionscykel: 30 min inkubation vid 37 ° C, 5 min vid 50 ° C och därefter 5 minuter vid 80 ° C.
2. Rekombinant Protein Expression
- Bakteriell cellsystem:
- Omvandla pDEST17.G65mut in i E. coli BL21 (DE3) elektro celler genom att använda standardtekniker och avskärma kolonierna odlas på ampicillin-innehållande (100 mikrogram / ml) LB-medium med koloni-PCR med hjälp av följande transgen specifika primers: 5'-CTGGTGCCAAGTGGCTCAGA-3 "och 5" -CACACGCCGGCAGCAGGT-3 ', med en hybridiseringstemperatur på 58 ° C och en töjning tid av 20 sek. Utför PCR-reaktion i en total volym av 20 | il efter upplösning bakterieceller med en plastspets i röret.
- Inokulera en enda koloni över natten vid 37 ° C i 3 ml ampicillin-innehållande (100 pg / ml) LB-medium.
- Späd bakteriekulturen 1: 100 i 100 ml färskt LB-medium (innefattande ampicilli) och inkubera vid 37 ° C under 1-6 h tills ett slutligt OD 600 av 0,8.
- Inducera rekombinant proteinuttryck genom tillsats av isopropil-β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) till en slutlig koncentration av 1 mM och inkubera kulturen under kraftig skakning under 3 h vid 37 ° C.
- Samla cellerna genom centrifugering vid 4000 xg under 20 min och använd bakteriepelleten för proteinutvinning (steg 3.1.1.1).
- Baculovirus / insektscellsystem:
- Seed Spodoptera frugiperda (Sf9) celler i 6-brunnsplattor (8 x 10 5 celler per brunn) och tvätta två gånger med 2 ml av icke-kompletterat Graces insektsmedium.
- Ta bort och ersätt medellång droppvis med transfektion blandning (5 pl LR rekombinant reaktion, 6 pl Celfectin lösning och 200 ^ icke kompletterat Graces Insect Medium).
- Inkubera plattorna vid 27 ° C under 5 h.
- Ta bort och ersätt transfektion blandning med 2 ml färsk Sf-900-medium, kompletterat med 10% fetalt bovint serum, 10 | ig / ml gentamycin och 100 | iM ganciklovir för att välja rekombinanta Baculovirus-kloner.
- Efter inkubation under 96 h vid 27 ° C, samla medium (V1 viral stock), centrifugera vid 4000 xg för att avlägsna celler och större skräp och lagra i mörker vid 4 ° C.
- Seed 1 x 10 6 Sf9-celler per brunn i 2,5 ml Sf-900-medium innehållande 10% fetalt bovint serum, 10 | ig / ml gentamycin och 100 | iM ganciklovir och infektera med 100 pl av V1 lager i varje brunn.
- Inkubera cellerna under tre dagar vid 27 ° C.
- Samla och centrifugera medium vid 4.000 x g.
- Förvara supernatanten (V2 hög titer lager) vid 4 ° C.
- Seed 1 x 10 6 Sf9-celler per brunn i 2,5 ml Sf-900-medium innehållande 10% fetalt bovint serum, 10 | ig / ml gentamycin och 100 | iM ganciklovir och infektera med 25 pl av V2 lager i varje brunn.
- Inkubera cellerna under tre dagar vid 27 ° C.
- Samla cellerna genom centrifugera vid 4000 xg och använder insektscellpellet för proteinutvinning (steg 3.1.2. 1).
- Nicotiana benthamiana transient expressionssystem:
- Grow N. benthamiana växter i ett växthus under naturligt ljus inom temperaturområdet 18-23 ° C. För agroinfektion använda 4-5 veckor gamla anläggningar.
- Håll agroinfected växter i en klimatkammare vid 22 ° C med en 13 h-dag / 11 tim nattfotoperiod.
- Kommersiell rekombination kloningssystem:
- Introducera pK7WG2.G65mut i Agrobacterium tumefaciens stam EHA105 elektrokompetenta celler såsom beskrivits tidigare åtta och screena kolonierna, som odlas på LB-medium innehållande rifampicin (50 jig / ml), streptomycin (300 | ig / ml) och spektinomycin (100 ug / ml) efter 2 dagars inkubation vid 28 ° C, genom koloni-PCR 8 med användning av följande transgena specifika primrar: 5'-CATGGTGGAGCACGACACGCT-3 & #8217; och 5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3 ', med en hybridiseringstemperatur på 58 ° C och en töjning tid av 50 sek. Utför PCR-reaktion i en total volym av 20 | il.
- Inokulera bakterier i 30 ml LB-medium innehållande rifampicin (50 jig / ml), streptomycin (300 | ig / ml) och spektinomycin (100 ug / ml) under två dagar vid 28 ° C.
- Samla bakterier genom centrifugering vid 4000 xg under 20 min och återsuspendera pelleten i 10 ml av infiltration buffert (10 mM MES, 10 mM MgCl2, 100 pM acetosyringon, pH 5,6). Mät OD 600 värde och sedan justera den till 0,9 genom att späda i samma buffert.
OBS: den totala volymen som krävs för att infiltrera tre N. benthamiana växter är 30 ml. - Använd en 2,5 ml spruta utan nål för att infiltrera Agrobacterium suspension i N. benthamiana lämnar. Försiktigt och långsamt injicera bladpaneler med upphängningen från sprutan. Infiltrera tre expanderade ltakfot per anläggning och använda tre fabriker som tre exemplar.
OBS: för hälso- och säkerhetsskäl bära ögonskydd under infiltrationsprocessen. - Samla agroinfiltrated blad 2 dagar efter infektion (dpi) och frysa i flytande kväve. Butiksväxtvävnad vid -80 ° C.
- MagnICON System:
- Introducera MagnICON vektor - den 5 'modulen (pICH20111), 3'-modulen (pICH31070.G65mut), och integrasmodulen (pICH14011) - i A. tumefaciens GV3101-stam med användning av standardtekniker. Sikta de kolonier, som odlas på LB-medium innehållande 50 pg / ml rifampicin och lämplig vektor specifika antibiotika (50 | ig / ml karbenicillin för pICH20111 och pICH14011, 50 | ig / ml kanamycin för pICH31070), genom koloni-PCR med användning av specifika primrar för varje vektor.
- Inokulera separat de tre A. tumefaciens-stammar i 5 ml LB-medium innehållande 50 pg / ml rifampicin och lämplig vektor-specifik antibiotikaoch skaka över natten vid 28 ° C.
- Pellets natten bakteriekulturer genom centrifugering vid 4000 xg i 20 min och återsuspendera dem i två volymer av den initiala bakteriekulturen av 10 mM MES (pH 5,5) och 10 mM MgSO 4.
- Blanda lika stora volymer av bakteriella suspensioner innehållande de tre vektorerna och använd upphängnings mix för sprut infiltration av N. benthamiana lämnar. Infiltrera tre expanderade blad per planta.
- Samla agroinfiltrated blad på 4 dpi och frysa i flytande kväve.
- Butiksväxtvävnad vid -80 ° C.
- Nicotiana tabacum stabilt uttryckssystem:
- Växa och behålla in vitro plantor av N. tabacum (var Sr1.) på fast anläggning odlingsmedium (4,4 g / L Murashige och Skoog - MS - medel inklusive vitaminer, 30 g / L sackaros, pH 5,8, 7 g / L växt agar) under kontrollerade förhållanden i klimatkammare vid 25 ° C med 16 tim / 8 tim dag / niGHT regimen.
- Starta en pre-kultur av A. tumefaciens EHA105 som bar på expressionsvektorn pK7WG2.G65mut i 5 ml flytande Yeb medium med lämpliga antibiotika (rifampicin 50 | ig / ml, streptomycin 300 ^ g / ml, spektinomycin 100 | ig / ml) och växa över natten vid 28 ° C i en orbital skakapparat vid 200 varv per minut.
- Använd 1 ml av för-kulturen för att inokulera en 50 ml Agrobacterium kultur i Yeb medium plus antibiotika (rifampicin 50 | ig / ml, streptomycin 300 ^ g / ml, spektinomycin 100 | ig / ml) och växa under 24 h, tills bakteriekulturen är mättad (OD 600 värdet på 0,5-1,0).
- Samla bakterier genom centrifugering vid 4000 xg under 20 min och återsuspendera pelleten i 50 ml flytande växtodlingsmedium. Upprepa detta steg två gånger för att helt ta bort antibiotika.
- Ta första friska helt utvecklade blad från in vitro tobaksplantor och skär dem i ca 1 cm rutor.
- Transfer bladbitartill djupa petriskålar som innehåller bakteriesuspension och lämna i mörker under 20 minuter.
- Avlägsna bladbitar från fjädring och torka sedan med sterilt filterpapper.
- Placera bladbitar med adaxial sida (övre bladytan) på fasta växtodlingsmedium innehållande 1,0 ug / ml 6-bensylaminopurin (BAP) och 0,1 ^ g / ml naftalenättiksyra (NAA) och inkubera plattorna under två dagar i en klimatkammare vid ett reglerat betingelser (25 ° C, 16 h-dag / 8 h natt).
- Överföring blad bitar på fast odlingsmedium (inklusive 1,0 pg / ml BAP, 0,1 pg / ml NAA, 500 | ig / ml cefotaxim, 100 | j, g / ml kanamycin) med abaxial yta (nedre ytan av blad) i kontakt med mediet.
- Inkubera plattorna under 2-3 veckor i klimatkammare vid 25 ° C med 16 tim / 8 tim dag / natt regimen att inducera skottbildning. Subkultur var 2 veckor genom att överföra blad explants till frisk fast anläggning odlingsmedium innehållande 1,0 ug / ml BAP, 0,1 mikrogram / ml NAA, 500ug / ml cefotaxim och 100 pg / ml kanamycin.
- När skott visas överföra dem till Magenta boxar innehållande fast odlingsmedium inklusive 500 ug / ml cefotaxim och 100 pg / ml kanamycin för att inducera rotbildning. Inkubera småplantor med 16 tim dag / 8 timmar nattfotoperiod vid 25 ° C under 1-2 veckor.
- När rötterna form, byte växterna till jord i växthuset.
- Samla ett löv bit för varje anläggning och isolera genomiskt DNA med ett kommersiellt kit.
- Detektera närvaron av transgenen genom specifik PCR. Använd 30 ng av genomiskt DNA som templat för PCR-amplifiering med användning av de följande transgen specifika primrar: 5'-CTGGTGCCAAGTGGCTCAGA-3 'och 5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3', med en hybridiseringstemperatur på 58 ° C och en töjning tid av 20 sek . Utför PCR-reaktion i en total volym av 50 | il.
- Analysera 220 bp produkten genom elektrofores på 1% agarosgel i Tris-acetat-EDTA (TAE) buffert (40 mM Trär, 20 mM ättiksyra och 1 mM EDTA).
- Välj transgena växter som innehåller målgenen.
- Samla en bladbiten från var och en av den valda transgena växten och frysa i flytande kväve omedelbart.
- Förbered totala proteinextrakt från växters blad vävnad (steg 3.1.3) och testa varje prov genom western blot-analys som tidigare beskrivits 2 för att välja den bästa rekombinant protein uttrycker tobaksplantan.
- Bag blommor av den valda utför växten bäst före blomning för att förhindra korspollinering.
- Efter blomning, fruktmognad och frö torkning, samla påsar.
- Separata frön från vetet och förvara dem på ett torrt utrymme vid kontrollerad temperatur (20-24 ° C).
- Sås de torkade fröna för att producera andra generationens transgena växter och därefter välja den utför anläggningen bäst att vara självpollineras.
- Upprepa samma procedur som beskrivs i steg 2.4.19-2.4.21 för efterföljande generationer.
3. Rekombinanta Protein Expression Analyser
- Total proteinextraktion:
- Bakterieceller:
- Resuspendera bakteriecellpellet, uppsamlades såsom beskrivs i steg 2.1.5, på halva odlingsvolymen av Tris-buffrad saltlösning (TBS - 2 mM Tris / HCl, 500 mM NaCl), pH 7,4 kompletterad med 1 mM phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF).
- Sonikera suspenderas cellpellet tre gånger under 40 sekunder på halv effekt, samtidigt prov på is.
- Clarify lysatet genom centrifugering vid 14.000 xg under 20 minuter vid 4 ° C.
- Överför supernatanten till ett rent rör och lagra både supernatanten och pelleten separat vid -80 ° C.
- Solubilisera inklusionskropparna, uppsamlade i pelleten, i halv cellulära lysat volym TBS pH 8,0 kompletterad med 6 M urea genom kraftig skakning över natten vid rumstemperatur.
- Centrifugera vid 10000 xg under 25 min vid rumstemperatur och supernatanten i en renrör.
- Förvara både supernatanten och pelleten vid -80 ° C.
- Insektsceller:
- Tvätta infekterade insektscellpellet, uppsamlades såsom beskrivs i steg 2.2.12, med 1 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS - 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2 PO 4) pH 7,4.
- Resuspendera cellerna i 200 | il lysbuffert (20 mM Tris / HCl, pH 8,0, 0,5 M NaCl, 3 mM β-merkaptoetanol och 1% Tween-20) och inkubera på is under 30 min.
- Centrifugera solubiliserades celler vid 14.000 xg under 20 minuter vid 4 ° C.
- Samla lösliga fraktioner och förvara vid -80 ° C och kasta pelleten.
- Växtbladvävnad:
- Grind N. benthamiana eller N. tabacum vävnad till fint pulver i flytande kväve med användning av mortel och mortelstöt.
- Homogenisera 100 mg mark vävnad i 300 pl extraktionsbuffert (40 mM Hepes pH 7,9, 5 mM DTT, 1,5% CHAPS), supplemented med 3 | il av proteasinhibitorcocktail och tina på is.
OBS: det valda förhållandet mellan växtvävnad vikt (g) för att buffra volym (ml) är 1: 3. - Centrifugera extraktet vid 30.000 xg under 30 minuter vid 4 ° C.
- Samla supernatanten i ett rent rör och förvara vid -80 ° C.
- Bakterieceller:
- Coomassie gelfärgning:
- Bered en lämplig utspädning av det totala proteinextrakt (t.ex. 2 | il växtextrakt, 5 | il av bakterie- och insekts extrakt) till en slutlig volym av 10 | il extraktionsbuffert och tillsätt 5 pl av 3x provbuffert (1,5 M Tris / HCI pH 6,8, 3% SDS, 15% glycerol, 4% β-merkaptoetanol) till en slutlig 1x koncentration.
- Koka prover för 10 min.
- Separata proteiner genom 10% SDS-PAGE.
- Efter elektrofores värme gel i närvaro av Coomassie-lösning A (0,05% Brilliant Blue R-250, 25% isopropanol, 10% ättiksyra) i en mikrovågsugn för ca två minuterss tills kokpunkten.
- Nedkylning gel till rumstemperatur med försiktig skakning.
- Släng Coomassie färgning lösning A.
- Avfärgning gel genom upphettning i närvaro av Coomassie-lösning B (0,05% Brilliant Blue R-250, 25% isopropanol), C (0,002% Brilliant Blue R-250, 10% ättiksyra) och D (10% ättiksyra) varje gång genom att följa samma protokoll för färgning.
- Efter sista uppvärmningssteget med lösning D, lämnar gel avfärgning tills bakgrunden är klar 9.
- Western blot-analys:
- Efter elektrofores, överföring separerade proteinerna på ett nitrocellulosamembran med användning av standardtekniker och block med 4% mjölk i PBS pH 7,4 vid rumstemperatur under en timme.
- Inkubera blotten över natt vid 4 ° C eller under 4 h vid rumstemperatur i blockeringslösning innehållande kanin primär antikropp mot målproteinet vid ett: 10000 och kompletterat med 0,1% Tween-20.
- Efter primär antikropp etikettIng, tvätta membranet tre gånger under 5 min vardera med blockeringslösning innehållande 0,1% Tween-20.
- Inkubera med pepparrotsperoxidas (HRP) -conjugate anti-kaninantikropp vid 1: 10000 i 1,5 h.
- Tvätta membranet 5 gånger under 5 minuter vardera med PBS-T (PBS kompletterad med 0,1% Tween-20).
- Process western blöt med användning av den kemiluminescerande peroxidassubstrat.
- Radioimmuno assay (RIA):
- Låt reagens (antiserum, spårämne och protein A Sepharose) för att uppnå rumstemperatur och pipett 20 pl proteinextrakt prover och standarder på olika koncentrationer (från 300-2,400 ng / ml av kommersiell rekombinant hGAD65) i 12 x 75 mm polystyren rör.
- Tillsätt 20 pl antiserum, beredda späda 1:30 serumet från plasmaferes av en T1D patient.
- Lägg 50 pl av spårämne (125-I-GAD65) och inkubera i 2 h vid rumstemperatur. Ställ en tub med spårämne bara att uppskatta den totala aktiviteten.
- Lägg 50 plav protein A-Sepharose och inkubera i 1 timme vid rumstemperatur.
- Dispensera 1 ml kall PBS-buffert i varje rör och centrifugera vid 1500 xg vid 4 ° C under 30 minuter.
- Häll rören för att avlägsna supernatanten och absorbera rest vätska på läskpapper genom att försiktigt knacka röret.
- Mät immunoprecipiterade radioaktivitet i alla rör genom räkning under 1 minut i en gammaräknare.
- Tomt i log skala de bindande satser (B / T%) av kalibratorer relaterade till total aktivitet, för att fastställa standardkurvan och läs GAD koncentrationen av prover ur kalibreringskurvan 10.
OBS: Begränsad områden bör utformas för lagring, hantering och slutförvaring av radioaktivt material.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En experimentell design för den heterologa expressionen av ett mål-rekombinant protein i olika produktionssystem beskrivs här. Den första fokus var uppställningen av de olika plattformar genom fastställande av optimala betingelser för uttryck av målproteinet i respektive system.
Expressionen av målproteinet, hGAD65mut, inducerades i triplikat E. coli kulturer. Efter 3 h av expression vid 37 ° C, ades bakteriecellerna uppsamlas genom centrifugering och lyserades genom sonikering. Efter ett centrifugeringssteg, var lösliga proteiner separeras från olösliga inklusionskroppar och inledande analyser visade att hGAD65mut ackumulerade prevalently i olösliga inklusionskroppar (data ej visade). Rekombinant protein solubilisering krävde användning av urea 6 M, som för sina starka denatureringsfastigheter, stör RIA-analys, vilket gör det omöjligt en ordentlig kvantifiering av hGAD65mut. Flera strategier har varasv redovisas för att begränsa bildningen av inklusionskroppar, innefattande odling av de mikrobiella cellerna vid låg temperatur 11. Kulturerna odlades vid 15 ° C och 20 ° C, och rekombinant proteinexpression inducerades vid samma temperaturer. Såsom visas i figur 1A, solubilisering av hGAD65mut produceras vid båda temperaturerna, återigen kräver urea (banorna S2). Således behöver låga temperaturer i detta experiment inte hindra hGAD65mut från att bilda olösliga aggregat.
Baculovirus vektorer innehållande hGAD65mut sekvensen (Baculo.G65mut) uttrycktes i adherenta Sf9 cellkulturer. V1 och V2 hög titer lagren framställdes och de mest effektiva infektionsförhållanden sattes upp utvärdera olika viruslagervolymer 5-50 pl. Såsom visas i figur 1B, var den optimala virusstamvolym identifierad som 25 | il, vilket gav 11,8 ± 0,8 | ig av rekombinant protein per ml odlingsmedium, såsom utvärderats genom RIAanalys (tabell 1).
Efter infiltration, tidsförloppet analys av agroinfected N. benthamiana blad utfördes i de två transienta expressionssystem. För pK7WG2 baserade systemet, var bladprover poolades dagligen i intervallet 1-5 dpi, var de totala lösliga proteiner (TSP) extraheras och lika stora mängder av TSP analyserades genom western blöt (Figur 1C). Denna analys betonade att den maximala ackumuleringen av rekombinanta målproteinet uppnås 2 dpi. Därför togs bladen skörd 2 dpi och proteinextrakten analyserades genom RIA för mätning av rekombinant protein ackumulering, vilket visar ett genomsnitt av 67,8 ug / g FLW (färska blad vikt, Tabell 1). Rekombinanta proteinuttrycksnivåer, med detta system, kan förbättras ytterligare, genom samtidig infiltrera bladen med en suppressor av posttranskriptionell geners uttryck (PTGS) som P19 eller HC Pro 12.
Densamma tidsförlopp Detektionen utfördes med N. benthamiana lämnar agroinfected med MagnICON vektor: infekterade löv saml 1-8 dpi och lika mängder TSP analyserades genom western blot. Denna analys visade att maximal ackumulering rekombinanta proteinet erhålls 4 dpi (figur 1D), med en genomsnittlig ackumulering av det rekombinanta proteinet av 78,8 ug / g FLW (tabell 1), såsom utvärderats medelst RIA.
Uttrycket av hGAD65mut i transgena tobaksplantor har tidigare rapporterats 12, som visar att rekombinanta proteinnivåer varierade kraftigt bland oberoende transformerade linjer. Den bästa resultaten hGAD65mut T1 transgen växt var själv korsade och de härledda växter (T2) analyserades för att välja nytt bäst utför en. Detta förfarande upprepades under flera generationer att utveckla en homogen produktionsplattform, kontroll av prestanda i varje generation med RIA tills ingenytterligare förbättring uppnåddes (data ej visade). I figur 1E, är en representativ Western blöt av T5 transgena växter rapporterats, där homogenitet rekombinanta proteinutbyten är uppenbar. Som visas i figur 1F, ökade den genomsnittliga hGAD65mut avkastningen från T2 till T6, nådde nivån på 99,1 mikrogram / g FLW (tabell 1) och, under urvalsprocessen, minskade standardavvikelsen för uttrycksnivån.
Figur 1:. Plattform set-up Set up för bästa förutsättningarna för hGAD65mut uttryck i varje plattform. (A) E. coli inducerbart uttryck plattform. Bakterieceller odlades vid 15 ° C eller 20 ° C. Övre panel, western blöt av hGAD65mut i cellextrakt (2 ug TSP per spår). Undre panel, lastning kontroll färgades med Coomassie. n.c. = Negativ kontroll, bakterieceller transformerade med den pDEST17 vektorn innehållande kloramfenikol-resistensgenen; T: Totalt prover; S1: Supernatant efter sonikering och centrifugering; S2 och P: supernatant (1) och Pellet (2) efter centrifugering av provet solubiliseras i urea-innehållande buffert. (B) Baculovirus / insektscell plattform. Följande virala lagervolymer testades: 5, 25 och 50 | il Övre panel, western blöt av hGAD65mut i cellextrakt (5 ug TSP per bana) Undre panel, lastning kontroll färgades med Coomassie... NC = negativ kontroll, extrakt av icke-transformerade insektsceller. (C) Transient expression i N. benthamiana anläggningar som använder pK7WG2 vektorn. Prover togs dagligen, 1-5 dpi (banorna 1-5). Övre panel, western blot av hGAD65mut i bladextrakt (2,5 mikrogram TSP per körfält). Nedre panelen, lastning kontroll färgas med Coomassie, där den stora subenhetenav Rubisco är uppenbar. nc = negativ kontroll, växter infiltreras med pK7WG2 vektorn som bär gfp markörgen. (D) Transient expression i N. benthamiana anläggningar som använder MagnICON vektorer. Prover togs dagligen, 1-8 dpi (banorna 1-8). Övre panel, western blot av hGAD65mut i bladextrakt (5 mikrogram TSP per körfält). Nedre panelen, lastning kontroll färgades med Coomassie där den stora subenheten av Rubisco är uppenbart . nc = negativ kontroll, växter infiltrerade endast med pICH20111 5'-modul och pICH14011 gras-modul. Siffror indikerar molekylmassmarkör i kDa. pc = positiv kontroll, 15 ng av kommersiella hGAD65 producerade i Baculovirus / insektscellsystem. (E) Stabilt uttryck i N. tabacum växter. Bladprover togs från olika T5 anläggningar (spår 1-11). Övre panel, western blot av hGAD65mut i bladextrakt (5 mikrogram TSP per körfält). Lägre panel, lastning kontroll färgas wed Coomassie. NC = negativ kontroll, vildtypsväxter. Siffror indikerar molekylmassmarkör i kDa. pc = positiv kontroll, 15 ng av kommersiella hGAD65 producerade i Baculovirus / insektscellsystem. (F) Stabilt uttryck i N. tabacum växter. Boxplot representation av hGAD65mut ackumulation över flera generationer som härrör från bästa resultaten hGAD65mut T1 transgen tobaksplantan rapporteras som ug / g FLW beräknat från RIA-data. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| System | [HGAD65mut] (^ g / ml) | [HGAD65mut] |
| Baculo / insekt | 117,5 ± 7,7 | 11,8 ± 0,8 pg / ml odlingsmedium |
| Transient | 22,6 ± 0,9 | 67,8 ± 2,7 ng / g FLW |
| MagnICON | 26,3 ± 5,9 | 78,8 ± 17,8 ng / g FLW |
| Elite T6 | 33,0 ± 3,8 | 99,1 ± 11,3 ng / g FLW |
Tabell 1: hGAD65mut ger hGAD65mut avkastning i olika plattformar - fermenteringsbaserade (Baculo / Insect) och växtbaserade (pK7WG2- och MagnICON i N. benthamiana och elit T6 i N. tabacum). Andra spalten - hGAD65mut koncentration i proteinextrakt (ig / ml). Tredje kolumnen - hGAD65mut innehåll i färska blad vikt (ig / g FLW) för växtbaserade plattformar och i cellkulturmedium (pg / ml) för jästanken-baserad plattform.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna studie tre olika plattformar jämfördes för uttrycket av ett rekombinant humant protein: bakterieceller, baculovirus / insektsceller och växter. Anläggningen baserade plattformen utforskas ytterligare genom att utnyttja tre vanligt förekommande uttryck teknik (dvs, övergående - MagnICON och pK7WG2 baserade - och stabila). Målproteinet valdes för detta experiment, hGAD65mut, tidigare har uttryckt i olika system 13, och dess produktion och funktionalitet är lätt att upptäcka och mätbara 14.
Bakterieceller inte var en effektiv produktionsplattform eftersom hGAD65mut bildade inklusionskroppar, även vid låg temperatur odlingsförhållanden, vilket kräver mödosam solubilisering och återveck uppnå sin nativa konformation. Faktum är huvud misslyckande av denna plattform för expression av komplexa rekombinanta proteiner rätt konformationen av den slutliga produkten.
DenBaculovirus / insektscell plattform medierad ett högt uttryck av den immunoreaktiva rekombinanta proteinet, men den huvudsakliga begränsningen av detta expressionssystem är den höga kostnaden för kulturmedier, som krävs för att odla insektsceller. Det uppskattades att de totala produktionskostnaderna för 1 g hGAD65mut kunde nå 700 € i detta produktionsplattform (väger 9 liter insektscellodlingsmedier krävs). En ytterligare begränsning av detta uttryck plattform är behovet av sterila odling av insektsceller, vilket kräver personal med aseptiska manipulation färdigheter. För att säkerställa en effektiv rekombinant protein ackumulering två kritiska parametrar måste noggrant kontrolleras i detta uttryck systemet: de virala lagervolymer som används för att infektera celler och tidpunkten för virusinfektion. Dessutom tvättmedel, som används för total lösligt protein extraktion från Sf9 insektsceller, påverkar drastiskt rekombinant protein solubilisering.
Växtbaserade system var det mest fördelaktiga platform uttrycka hGAD65mut: växten gjorda rekombinant protein var immunoreaktivt och ackumuleras i höga nivåer i bladvävnader. Jämföra olika växtbaserade uttryckssystem, var den högsta avkastningen uppnås i stabila transformerade växter tobaks (Tabell 1) och, om väger den totala biomassan av tobak jämfört med N. benthamiana, som används för transient uttryck, är den totala högre produktivitet av tobak uppenbar. Emellertid är den tid som erfordras för installation av systemet, som i vår studie tog 20 månader den största begränsningen av stabilt transformerad tobaksväxt-baserad plattform. I själva verket bör en homozygot linje väljas för rekombinant proteinuttryck homogenitet och det kan kräva upprepad själv kors cykler, med start från den högsta T1 uttrycker linjer. I synnerhet när den valda T1 bär mer än en kopia av den transgena drag, kan avelsprogrammet ta upp till 3 år.
Transienta expressionssystem erbjödfördelen av snabb uppskalning på grund av en kort intervall mellan transformation och uttryck och set-up av uttrycket plattform som krävs fyra dagar. Dock är en begränsning av de växtbaserade gående system som deras automation är knappast genomförbart på ett labb skala såvida dedikerad högvärdig utrustning för agro-infiltration används. Därför kan en ordentlig beräkning för storskalig produktion av hGAD65 använder transienta baserade system inte utföras här. Å andra sidan, vi spekulerar att de totala produktionskostnaderna för 1 g av rekombinant protein med hjälp T6 stabilt tobakslinjen kan beräknas till mindre än € 5 (väger mark för att odla 60 tobaksplantor). För att säkerställa en effektiv agroinfiltration och proteinproduktion flera kritiska parametrar bör kontrolleras noga (växt utvecklingsstadium, växa och infiltration skick Agrobacterium), som tidigare rapporterats 15. Dessutom för varje uttryck experimentera en viss tidsförlopp analys bör varautförs för att välja den dpi som tillåter den högsta ackumuleringen av det rekombinanta proteinet.
Exemplet diskuteras här kan betraktas som en proof-of-principle fallstudie, som belyser några av de specifika fördelarna med växtbaserad produktion jämfört med traditionella system. I synnerhet kan tobakstransgena linjer homogent uttrycker det rekombinanta proteinet anses vara en värdefull plattform för massproduktion av rekombinanta proteiner som behövs i stora-mängder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast extract | Sigma | Y1333 | |
| Tryptone | Formedium | TRP03 | |
| Agar Bacteriological Grade | Applichem | A0949 | |
| Sf-900 II SFM medium | Gibco | 10902-088 | |
| Grace’s Insect Medium, unsupplemented | Gibco | 11595-030 | |
| Cellfectin II Reagent | Invitrogen | 10362-100 | |
| MS medium including vitamins | Duchefa Biochemie | M0222 | |
| Sucrose | Duchefa Biochemie | S0809 | |
| Plant agar | Duchefa Biochemie | P1001 | |
| Ampicillin sodium | Duchefa Biochemie | A0104 | Toxic |
| Gentamycin sulphate | Duchefa Biochemie | G0124 | Toxic |
| Ganciclovir | Invitrogen | I2562-023 | |
| Carbenicillin disodium | Duchefa Biochemie | C0109 | Toxic |
| Kanamycin sulfate | Sigma | K4000 | Toxic |
| Rifampicin | Duchefa Biochemie | R0146 | Toxic – 25 mg/ml stock in DMSO |
| Streptomycin sulfate | Duchefa Biochemie | S0148 | Toxic |
| Spectinomycin dihydrochloride | Duchefa Biochemie | S0188 | |
| IPTG (isopropil-β-D-1-tiogalattopiranoside) | Sigma | I5502 | Toxic |
| MES hydrate | Sigma | M8250 | |
| MgCl2 | Biochemical | 436994U | |
| Acetosyringone | Sigma | D134406 | Toxic – 0.1 M stock in DMSO |
| Syringe (1 ml) | Terumo | ||
| MgSO4 | Fluka | 63136 | |
| BAP (6-Benzylaminopurine) | Sigma | B3408 | Toxic |
| NAA (Naphtalene acetic acid) | Duchefa Biochemie | N0903 | Irritant |
| Cefotaxime | Mylan Generics | ||
| Trizma base | Sigma | T1503 | Adjust pH with 1 N HCl to make Tris-HCl buffer |
| HCl | Sigma | H1758 | Corrosive |
| NaCl | Sigma | S3014 | 1 M stock |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791 | |
| PMSF (Phenylmethanesulfonylfluoride) | Sigma | P7626 | Corrosive, toxic |
| Urea | Sigma | U5378 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | Toxic |
| Tween-20 | Sigma | P5927 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | |
| DTT (Dithiothreitol) | Sigma | D0632 | Toxic – 1 M stock, store at -20 °C |
| CHAPS | Duchefa Biochemie | C1374 | Toxic |
| Plant protease inhibitor cocktail | Sigma | P9599 | Do not freeze/thaw too many times |
| SDS (Sodium dodecyl sulphate) | Sigma | L3771 | Flammable, toxic, corrosive – 10% stock |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Brilliant Blue R-250 | Sigma | B7920 | |
| Isopropanol | Sigma | 24137 | Flammable |
| Acetic acid | Sigma | 27221 | Corrosive |
| Anti-Glutamic acid decarboxylase 65/67 | Sigma | G5163 | Do not freeze/thaw too many times |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibody | Sigma | A6154 | Do not freeze/thaw too many times |
| Sf9 Cells | Life Technologies | 11496 | |
| BL21 Competent E. coli | New England Biolabs | C2530H | |
| Protein A Sepharose | Sigma | P2545 | |
| Cell culture plates | Sigma | CLS3516 | |
| Radio Immuno Assay kit | Techno Genetics | 12650805 | Radioactive material |
References
- Hampe, C. S., Hammerle, L. P., Falorni, A., Robertson, J., Lernmark, A. Site-directed mutagenesis of K396R of the 65 kDa glutamic acid decarboxylase active site obliterates enzyme activity but not antibody binding. FEBS Lett. 488 (3), 185-189 (2001).
- Avesani, L., et al. Recombinant human GAD65 accumulates to high levels in transgenic tobacco plants when expressed as an enzymatically inactive mutant. Plant Biotechnol. J. 9 (8), 862-872 (2010).
- Sambrook, J., et al. Molecular Cloning: A laboratory manual. Second Edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (1989).
- Avesani, L., et al. Comparative analysis of different biofactories for the production of a major diabetes autoantigen. Transgenic Res. 23, 281-291 (2014).
- Marillonnet, S., Giritch, A., Gils, M., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. In planta engineering of viral RNA replicons: efficient assembly by recombination of DNA modules delivered by Agrobacterium. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA). 101 (18), 6852-6857 (2004).
- Gleba, Y., Klimyuk, V., Marillonnet, S. Viral vectors for the expression of proteins in plants). Curr. Opin. Biotechnol. 18, 134-141 (2007).
- Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS One. 3 (11), (2008).
- Xu, R., Li, Q. Q. Protocol: streamline cloning of genes into binary vectors in Agrobacterium via the Gateway TOPO vector system. Plant Methods. 4 (4), 1-7 (2008).
- Fairbanks, G., Steck, T. L., Wallach, D. F. Electrophoretic analysis of the major polypeptides of the human erythrocyte membrane. Biochemistry. 10 (13), 2606-2617 (1971).
- Falorni, A., et al. Radioimmunoassay detects the frequent occurrence of autoantibodies to the Mr 65,000 isoform of glutamic acid decarboxylase in Japanese insulin-dependent diabetes. Autoimmunity. 19, 113-125 (1994).
- Hunt, I. From gene to protein: a review of new and enabling technologies for multi-parallel protein expression. Protein Expr. Purif. 40 (1), 1-22 (2005).
- Arzola, L., et al. Transient co-expression of post-transcriptional silencing suppressor for increased in planta expression of a recombinant anthrax receptor fusion protein. Int. J. Mol. Sci. 12 (8), 4975-4990 (2011).
- Merlin, M., Gecchele, E., Capaldi, S., Pezzotti, M., Avesani, L. Comparative evaluation of recombinant protein production in different biofactories: the green perspective. Biomed. Res. Int. 2014, 136419 (2014).
- Avesani, L., et al. Improved in planta expression of the human islet autoantigen glutamic acid decarboxylase (GAD65). Transgenic Res. 12 (2), 203-212 (2003).
- Leuzinger, K., et al. Efficient agroinfiltration of Plants for high-level transient expression of recombinant proteins. J Vis Exp. (77), (2013).
