Abstract
Plantebaserte systemer blir betraktet som en verdifull plattform for produksjon av rekombinante proteiner på grunn av deres godt dokumentert potensial for den fleksible, rimelige produksjon av høy kvalitet, bioaktive produkter.
I denne studien ble sammenlignet vi ekspresjon av en målt humant rekombinant protein i tradisjonelle fermenterings-baserte cellekulturer (bakterie- og insekt) med plantebaserte ekspresjonssystemer, både transiente og stabile.
For hver plattform, beskrev vi oppsett, optimalisering og lengden av produksjonsprosessen, det endelige produktets kvalitet og utbyttene og vi evaluert foreløpige produksjonskostnader, som er spesifikke for det valgte målet rekombinant protein.
Samlet indikerer resultatene at bakterier er uegnet for fremstilling av målproteinet på grunn av sin oppbygging innenfor uoppløselige inklusjonslegemer. På den annen side, plantebaserte systemer er allsidige plattformer tlue tillate produksjon av det valgte proteinet med lavere-kostnader enn Baculovirus / insektcellesystemet. Spesielt stabile transgene linjer viste det høyeste utbytte av det endelige produktet og forbigående uttrykker planter raskest prosessutvikling. Imidlertid kan ikke alle rekombinante proteiner nytte av plantebaserte systemer, men den beste produksjonsplattform bør bestemmes empirisk med en sak-til-sak tilnærming, som beskrevet her.
Protocol
1. Bygging av ekspresjonsvektorer
- Kommersiell rekombinasjon kloning system:
- Forsterke full-lengde sekvens av målgenet (hGAD65mut) med passende primere som tillater tilsetning av et CACC klemme i 5'-enden av genet som tidligere beskrevet 2.
- Klone gelrenset amplifikasjonsprodukt, i henhold til de retnings kloning kit spesifikasjoner, i inngangsvektor (topoisomerase bundet) ved sammensetting av reaksjonen i et totalvolum på 6 ul, ved bruk av en 1,5: 1 molar ratio innsatsen: vektor og 1 ul saltoppløsning (0,2 M NaCl og 0,01 MgCl2). Inkuber i 5 min ved romtemperatur (RT).
- Forvandle hele reaksjon i kjemisk kompetente E. coli-celler i henhold til retnings kloning kit spesifikasjoner og skjerm innhentet kolonier av koloni PCR 3, ved hjelp av M13 framover og bakover primere inkludert i retnings kloning kit. Isolere plasmid fra en pomerksomme koloni ifølge plasmid DNA forberedelse kit spesifikasjoner og sekvens innsatsens bruker M13 framover og bakover primere for å sikre fravær av mutasjoner tre.
- Bruk fått innreise klone å utføre rekombinasjon reaksjon av Lambda rekombinasen Clonase II Enzyme (LR) med bestemte destinasjons vektorer: for rekombinant protein uttrykk i bakterieceller med pDEST17 (givende pDEST17.G65mut), i planter (forbigående eller stabil) med pK7WG2 (givende pK7WG2.G65mut), i Baculovirus / insektcellesystemet med det lineariserte viral DNA (givende Baculo.G65mut) 4. Montere reaksjonen ifølge clonase kit spesifikasjoner, med 100 ng av inngangsvektor, 150 ng vektor og destinasjon 2 ul av enzymblandingen i et sluttvolum på 10 ul. Inkuber blandingen ved romtemperatur i 1 time.
- Forvandle den rekombinasjon produktet inn kjemisk kompetente E. coli-celler i henhold til clonase kit spesifikasjoner. Skjerm innhentet kolonier av PCR 3
- Isolere plasmid-DNA ved å bruke et kommersielt minipreparation DNA-kit og bekrefter nærvær av target-sekvensen ved PCR-3, ved å bruke de samme spesifikke primer-kombinasjoner som er beskrevet i det foregående trinnet.
- Bruk innhentet PCR-positive plasmider å forvandle ulike målorganismer, avhengig av plattformen valgt for rekombinant protein uttrykk som beskrevet i følgende trinn.
- MagnICON system 5-7:
- Klone målgenet i 3'-modulen pICH31070, som tidligere beskrevet i detalj 7, hvilket ga pICH31070.G65mut. BrukFølgende spesifikke reaksjonssyklus: 30 min inkubasjon ved 37 ° C, 5 min ved 50 ° C og deretter i 5 minutter ved 80 ° C.
2. Rekombinant Protein Expression
- Bakteriell celle system:
- Forvandle pDEST17.G65mut til E. coli BL21 (DE3) elektrokompetente celler ved hjelp av standardteknikker og skjerm koloniene dyrket på ampicillin-inneholdende (100 ug / ml) LB-medium, etter koloni PCR ved anvendelse av de følgende transgene-spesifikke primere: 5'-CTGGTGCCAAGTGGCTCAGA-3 'og 5' -CACACGCCGGCAGCAGGT-3 ', med en glødetemperatur på 58 ° C og en forlengelse på 20 sek. Utføre PCR-reaksjonen i et totalvolum på 20 ul etter oppløsning bakterieceller med en plastspiss i røret.
- Inokulere en enkelt koloni over natten ved 37 ° C i 3 ml ampicillin-inneholdende (100 ug / ml) LB-medium.
- Fortynn bakteriekultur 1: 100 i 100 ml frisk LB-medium (inklusive ampicilli) og inkuberes ved 37 ° C i 1-6 timer inntil en endelig OD 600 på 0,8.
- Indusere rekombinant proteinekspresjon ved tilsetning av isopropil-β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) til en sluttkonsentrasjon på 1 mM og inkuberes kulturen under kraftig rysting i 3 timer ved 37 ° C.
- Samle cellene ved sentrifugering ved 4000 xg i 20 min, og bruke bakterielle pellet for proteinekstraksjon (trinn 3.1.1.1).
- Baculovirus / insektcellesystem:
- Seed Spodoptera frugiperda (Sf9) celler inn i 6-brønners plater (8 x 10 5 celler per brønn) og vask to ganger med 2 ml av ikke-supplert Grace Insect medium.
- Fjerne og erstatte medium dråpevis med transfeksjon blanding (5 pl LR rekombinant reaksjon, 6 mL Celfectin løsning og 200 mL ikke-supplert Grace Insect Medium).
- Inkuber platene ved 27 ° C i 5 timer.
- Fjerne og erstatte transfeksjon blanding med 2 ml friskt Sf-900 medium, supplert med 10% føtalt bovint serum, 10 ug / ml gentamycin og 100 uM ganciklovir å velge rekombinante Baculovirus kloner.
- Etter inkubasjon i 96 timer ved 27 ° C, samle medium (V1 viral lager), sentrifuger ved 4000 xg å fjerne celler og store rusk og oppbevares mørkt ved 4 ° C.
- Seed 1 x 10 6 Sf9-celler per brønn i 2,5 ml Sf-900 medium inneholdende 10% føtalt bovint serum, 10 ug / ml gentamycin og 100 uM ganciklovir og infisere med 100 ul V1 lager i hver brønn.
- Inkuberes cellene i 3 dager ved 27 ° C.
- Samle og sentrifuger medium ved 4000 x g.
- Lagre supernatanten (V2 høy titer lager) ved 4 ° C.
- Seed 1 x 10 6 Sf9-celler per brønn i 2,5 ml Sf-900 medium inneholdende 10% føtalt bovint serum, 10 ug / ml gentamycin og 100 uM ganciklovir og infisere med 25 ul av V2 lager i hver brønn.
- Inkuberes cellene i 3 dager ved 27 ° C.
- Samle celler ved sentrifuger ved 4000 xg og bruke insektcelle pellet for proteinekstraksjon (trinn 3.1.2. 1).
- Nicotiana benthamiana transient ekspresjonssystemer:
- Grow N. benthamiana planter i et drivhus under naturlig lys innenfor temperaturområdet 18-23 ° C. For agroinfection bruke 4-5 uker gamle planter.
- Hold agroinfected planter i et klimakammer ved 22 ° C med en 13 timers dag / 11 timers natt daglengde.
- Kommersiell rekombinasjon kloning system:
- Introduser pK7WG2.G65mut i Agrobacterium tumefaciens stamme EHA105 elektrokompetente celler som tidligere beskrevet 8 og skjermen koloniene, dyrket på LB-medium inneholdende rifampicin (50 ug / ml), streptomycin (300 ug / ml) og spectinomycin (100 ug / ml) etter 2 dagers inkubering ved 28 ° C, etter koloni PCR 8 ved hjelp av følgende transgene-spesifikke primere: 5'-CATGGTGGAGCACGACACGCT-3 & #8217; og 5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3 ', med en glødetemperatur på 58 ° C og en forlengelse tid på 50 sek. Utføre PCR-reaksjonen i et totalvolum på 20 ul.
- Inokulere bakterier i 30 ml LB-medium inneholdende rifampicin (50 ug / ml), streptomycin (300 ug / ml) og spectinomycin (100 ug / ml) i to dager ved 28 ° C.
- Samle bakterier ved sentrifugering ved 4000 xg i 20 min, og resuspender pelleten i 10 ml infiltrering buffer (10 mM MES, 10 mM MgCl2, 100 uM acetosyringone, pH 5,6). Måle OD 600 verdi, og deretter justere den til 0,9 ved fortynning i den samme buffer.
MERK: det totale volumet som trengs for å infiltrere tre N. benthamiana planter er 30 ml. - Bruk en 2,5 ml nålløs sprøyte for å infiltrere Agrobacterium suspensjon i N. benthamiana blader. Sakte og forsiktig injisere blad paneler med suspensjon fra sprøyten. Infiltrere tre utvidet ltakskjegget per plante og bruke tre planter som triplicates.
MERK: for helse- og sikkerhetsmessige grunner beskyttelsesbriller under infiltrasjon prosessen. - Samle agroinfiltrated blader to dager etter smitte (dpi) og fryse i flytende nitrogen. Butikk plantevev ved -80 ° C.
- MagnICON system:
- Introdusere MagnICON vektorer - 5'-modulen (pICH20111), 3'-modul (pICH31070.G65mut) og integrase modulen (pICH14011) - i A. tumefaciens GV3101 belastning ved bruk av standard teknikker. Sikt de kolonier dyrket på LB-medium inneholdende 50 ug / ml rifampicin og passende vektor-spesifikke antibiotika (50 ug / ml karbenicillin for pICH20111 og pICH14011, 50 ug / ml kanamycin for pICH31070), ved koloni-PCR ved anvendelse av spesifikke primere for hver vektor.
- Vaksinere seg de tre A. tumefaciens stammer i 5 ml LB-medium inneholdende 50 ug / ml rifampicin og passende vektor-spesifikke antibiotikaog rist over natten ved 28 ° C.
- Pellet over natten bakteriekulturer ved sentrifugering ved 4000 xg i 20 min og resuspendere dem i to volumer av den innledende bakteriekultur av 10 mM MES (pH 5,5) og 10 mM MgSO4.
- Bland like volumer av bakteriesuspensjoner inneholdende de tre vektorer og bruke suspensjonsblanding for sprøyte infiltrasjon av N. benthamiana blader. Infiltrere tre utvidede blader per plante.
- Samle agroinfiltrated blader på fire dpi og fryse i flytende nitrogen.
- Butikk plantevev ved -80 ° C.
- Tobakksplante stabil uttrykk system:
- Vokse og opprettholde in vitro plantlets av N. tabacum (var SR1.) på fast anlegg kulturmedium (4,4 g / l Murashige og Skoog - MS - medium, inkludert vitaminer, 30 g / l sakkarose, pH 5,8, 7 g / l anlegg agar) under kontrollerte betingelser i klimakammeret ved 25 ° C med 16 timer / 8 timers dag / night regime.
- Start en pre-kultur av A. tumefaciens EHA105 husing ekspresjonsvektoren pK7WG2.G65mut i 5 ml flytende Yeb medium med egnede antibiotika (rifampicin 50 ug / ml, streptomycin 300 ug / ml spectinomycin 100 ug / ml) og vokse over natten ved 28 ° C på en orbital-rystemaskin sett ved 200 rpm.
- Bruker 1 ml av pre-kulturen for å inokulere en 50 ml kultur i Agrobacterium Yeb medium pluss antibiotika (rifampicin 50 ug / ml, streptomycin 300 ug / ml spectinomycin 100 ug / ml) og vokse i 24 timer, helt til den bakterielle kulturen mettet (OD 600 verdi av 0,5-1,0).
- Samle bakterier ved sentrifugering ved 4000 xg i 20 min, og resuspender pelleten i 50 ml flytende plantekulturmedium. Gjenta dette trinnet to ganger for å fjerne antibiotika.
- Ta første sunne fullt utvidet blader fra in vitro tobakksplanter og skjær dem i ca 1 cm kvadrater.
- Overføring blad stykkertil dype petriskåler som inneholder bakteriell suspensjon og gå ut i mørket i 20 min.
- Fjern blad stykker fra suspensjon og klatt tørr på sterilt filter papir.
- Plasser blad stykker med adaxial side (øvre blad overflate) på solid plantedyrkingsmedium som inneholder 1,0 mikrogram / ml 6-benzylaminopurine (BAP) og 0,1 mikrogram / ml naftalen eddiksyre (NAA) og inkuberes plater for to dager i et klimakammer ved kontrollert forhold (25 ° C, 16 timer dag / 8 timers natt).
- Overføring blad stykker på fast kulturmedium (inkludert 1,0 ug / ml BAP, 0,1 ug / ml NAA, 500 ug / ml cefotaksim, 100 ug / ml kanamycin) med abaxial overflate (nedre overflate av bladet) er i kontakt med mediet.
- Inkuber platene i 2-3 uker i klimakammeret ved 25 ° C med 16 t / 8 timers dag / natt-regimet for å indusere shoot dannelse. Subkultur hver 2 uker etter overføring av blad eksplantater til frisk faste plantekulturmedium inneholdende 1,0 ug / ml BAP, 0,1 ug / ml NAA, 500ug / ml cefotaksim og 100 ug / ml kanamycin.
- Når skuddene vises overføre dem til Magenta-bokser inneholdende faste kulturmedium med 500 ug / ml cefotaksim og 100 ug / ml kanamycin for å indusere dannelsen rot. Inkuber kimplanter med 16 timers dag / natt 8 timers fotoperiode ved 25 ° C i 1-2 uker.
- Når røttene form, overføre plantene til jord i drivhuset.
- Samle et blad brikke for hver plante og isolere genomisk DNA med et kommersielt kit.
- Påvise tilstedeværelsen av transgenet ved spesifikk PCR. Bruke 30 ng genomisk DNA som templat for PCR-amplifisering ved å bruke de følgende transgene-spesifikke primere: 5'-CTGGTGCCAAGTGGCTCAGA-3 'og 5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3', med en glødetemperatur på 58 ° C og en forlengelse på 20 sek . Utføre PCR-reaksjonen i et totalvolum på 50 ul.
- Analyser 220 bp produkt ved elektroforese på 1% agarosegel i Tris-acetat-EDTA (TAE) -buffer (40 mM Trer, 20 mM eddiksyre, og 1 mM EDTA).
- Velg transgene planter inneholdende målgenet.
- Samle et blad stykke fra hver av de valgte transgen plante og fryse i flytende nitrogen umiddelbart.
- Forberede totale proteinekstrakter fra plante blad vev (trinn 3.1.3) og teste hver prøve av western blot analyse som tidligere beskrevet 2 for å velge den beste rekombinant protein uttrykker tobakksplanten.
- Bag blomster av valgt beste resultater plante den før blomstringen for å hindre krysspollinering.
- Etter blomstringen, frukt modning og frø tørking, samle poser.
- Separate frø fra agnene og lagre dem på et tørt rom ved kontrollert temperatur (20-24 ° C).
- Purke tørkede frø å produsere andre generasjon transgene planter og deretter velge den beste resultater anlegget for å være selvbestøvet.
- Gjenta samme prosedyre som er beskrevet i trinn 2.4.19-2.4.21 for senere generasjoner.
3. rekombinant protein Expression Analyser
- Total proteinekstraksjon:
- Bakterieceller:
- Resuspender cellepelleten bakteriell, oppsamlet som beskrevet i trinn 2.1.5, i halvparten av volumet av Tris-bufret saltvann kultur (TBS - 2 mM Tris / HCl, 500 mM NaCl), pH 7,4 supplementert med 1 mM phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF).
- Sonikere resuspendert cellepellet tre ganger i 40 sekunder på halv effekt, samtidig som prøven på is.
- Klargjøre lysatet ved sentrifugering ved 14 000 xg i 20 min ved 4 ° C.
- Overføring supernatant til et rent rør og lagre både supernatant og pellet separat ved -80 ° C.
- Oppløseliggjøre inklusjonslegemene, som er samlet i pelleten, i en halv celle lysat volum av TBS, pH 8,0 supplert med 6 M urea ved kraftig risting over natten ved romtemperatur.
- Sentrifuger ved 10000 x g i 25 min ved romtemperatur og samle supernatanten i en renrør.
- Lagre både supernatant og pellet ved -80 ° C.
- Insektsceller:
- Vask infisert insekt cellepelleten, oppsamlet som beskrevet i trinn 2.2.12, med 1 ml fosfatbufret saltoppløsning (PBS - 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2 HPO 4, 1,8 mM KH 2PO 4) pH 7,4.
- Resuspender celler i 200 ul lyseringsbuffer (20 mM Tris / HCl pH 8,0, 0,5 M NaCl, 3 mM β-merkaptoetanol og 1% Tween-20) og inkuberes på is i 30 min.
- Sentrifuger cellene oppløst ved 14.000 xg i 20 min ved 4 ° C.
- Samle løselige fraksjoner og oppbevar ved -80 ° C og kast pellet.
- Plant blad vev:
- Grind N. benthamiana eller N. tabacum vev til fint pulver i flytende nitrogen ved hjelp av morter og pistill.
- Homogen 100 mg av grunnvevet i 300 ul av ekstraksjonsbuffer (40 mM Hepes pH 7,9, 5 mM DTT, 1,5% CHAPS), supplemented med 3 mL av proteasehemmer cocktail og tine på is.
MERK: det valgte forholdet mellom plantevevet vekt (g) til buffer volum (ml) er 1: 3. - Sentrifuger ved 30.000 xg ekstrakt i 30 min ved 4 ° C.
- Samle supernatanten i et rent rør og oppbevares ved -80 ° C.
- Bakterieceller:
- Coomassie gel farging:
- Tilbered en passende fortynning av det totale proteinekstrakter (f.eks, 2 ul av plante-ekstrakt, 5 pl av bakterielle og insekt ekstrakter) til et sluttvolum på 10 ul buffer ekstraksjon og tilsett 5 pl av 3 x prøvebuffer (1,5 M Tris / HCl pH 6,8, 3% SDS, 15% glyserol, 4% β-merkaptoetanol) til en sluttkonsentrasjon 1x.
- Kok prøver for 10 min.
- Separate proteiner med 10% SDS-PAGE.
- Etter elektroforese, varme gel i nærvær av Coomassie oppløsning A (0,05% Brilliant Blue R-250, 25% isopropanol, 10% eddiksyre) i en mikrobølgeovn i omtrent to minutterss inntil kokepunktet.
- Kjøle ned gel til romtemperatur med forsiktig risting.
- Forkast Coomassie farging løsning A.
- Destain gel ved oppvarming i nærvær av Coomassie oppløsning B (0,05% Brilliant Blue R-250, 25% isopropanol), C (0,002% Brilliant Blue R-250, 10% eddiksyre) og D (10% eddiksyre) hver gang å følge den samme protokoll for farging.
- Etter den siste varme takt med løsningen D, la gel avfarging till bakgrunn er klart 9.
- Western blot-analyse:
- Etter elektroforese, overføring proteiner separert bort på en nitrocellulosemembran ved å bruke standard teknikker og blokken med 4% melk i PBS, pH 7,4 ved romtemperatur i 1 time.
- Inkuber blot over natten ved 4 ° C eller i 4 timer ved romtemperatur i blokkeringsoppløsning inneholdende kanin primære antistoff dannet mot målproteinet på 1: 10.000 og supplert med 0,1% Tween-20.
- Etter primær antistoff etiketting, vaskes membranen 3 ganger i 5 minutter hver med blokkeringsløsning inneholdende 0,1% Tween-20.
- Inkuber med pepperrot peroksidase (HRP) -conjugate anti-kanin-antistoff på 1: 10000 i 1,5 timer.
- Vask membran 5 ganger i 5 minutter hver med PBS-T (PBS supplert med 0,1% Tween-20).
- Behandle western blot ved anvendelse av kjemiluminescens peroksydasesubstrat.
- Radiologisk immunomåling (RIA):
- Tillat reagenser (antiserum, tracer og protein A Sepharose) for å nå romtemperatur og pipette 20 ul proteinekstraktprøver og standarder ved forskjellige konsentrasjoner (fra 300-2,400 ng / ml kommersiell rekombinant hGAD65) i 12 x 75 mm polystyrenrør.
- Tilsett 20 ul antiserum, fremstilt fortynning 1:30 serumet fra plasmaferese av en T1D pasient.
- Tilsett 50 ul tracer (125-I-GAD65) og inkuberes i 2 timer ved romtemperatur. Still et rør med tracer bare å beregne den totale aktivitet.
- Legg 50 mLav protein A Sepharose, og inkuberes i 1 time ved romtemperatur.
- Dispensere 1 ml kald PBS-buffer i hvert rør og sentrifuger ved 1500 xg ved 4 ° C i 30 min.
- Dekanter rørene for å fjerne supernatant og absorbere gjenværende væske på trekkpapir ved å banke forsiktig tube.
- Mål immunopresipitert radioaktivitet i alle rør ved å telle i 1 minutt i en gammateller.
- Plottet i log skala bindingsfrekvens (B / T%) av kalibratorene er relatert til total aktivitet, for å etablere standardkurven, og lese GAD konsentrasjon av prøvene av kalibreringskurven 10.
MERK: Begrensede områder bør være utformet for lagring, håndtering og deponering av radioaktivt materiale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En eksperimentell design for heterolog ekspresjon av en målt rekombinant protein i forskjellige produksjonssystemer som er beskrevet her. Den første brennpunkt ble oppsettet av de forskjellige plattformer ved å etablere de optimale forhold for ekspresjon av målproteinet i hvert system.
Ekspresjon av målproteinet, hGAD65mut, ble indusert i triplikat E. coli kulturer. Etter 3 timers for ekspresjon ved 37 ° C, ble bakteriecellene oppsamlet ved sentrifugering og lysert ved ultralydbehandling. Etter et sentrifugeringstrinn, ble oppløselige proteiner separert fra uoppløselige inklusjonslegemer og innledende analyser viste at hGAD65mut akkumulert herskende i uoppløselige inklusjonslegemer (data ikke vist). Rekombinant protein oppløsnings kreves bruk av urea 6 M, som, for sine sterke denaturerende egenskaper, griper med RIA-analyse, noe som gjør mulig en skikkelig kvantifisering av hGAD65mut. Flere strategier har væreno rapportert for å begrense dannelsen av inklusjonslegemer, som omfatter dyrking av mikrobielle celler ved lav temperatur 11. Kulturene ble dyrket ved 15 ° C og 20 ° C, og rekombinant protein-ekspresjon ble indusert ved de samme temperaturer. Som vist i Figur 1A, oppløseliggjøringen av hGAD65mut produsert ved begge temperaturer, igjen krever urea (kolonnene S2). Dermed trenger lave temperaturer i dette forsøket ikke hindre hGAD65mut danner uoppløselige aggregater.
Baculovirus-vektorer inneholdende sekvensen hGAD65mut (Baculo.G65mut) ble uttrykt i Sf9 adherente cellekulturer. V1 og V2 høytiter aksjer var forberedt og de beste resultatene smitteforhold ble satt opp evaluere ulike viruslagerbeholdningen 5-50 mL. Som vist i figur 1B, ble den optimale viruslagervolum identifisert som 25 ul, hvilket ga 11,8 ± 0,8 ug rekombinant protein per ml kulturmedium, som bedømt ved hjelp av RIAanalysen (tabell 1).
Etter infiltrasjon, tidsforløpet analyse av agroinfected N. benthamiana blader ble gjennomført i de to forbigående ekspresjonssystemer. For pK7WG2-basert system, ble blad prøver samles daglig i området 1-5 dpi, ble totale løselige proteiner (TSP) ut og like mengder TSP ble analysert ved western blot (figur 1C). Denne analysen fremhevet at maksimal akkumulering av target rekombinante protein er nådd 2 dpi. Derfor, ble bladene høstet to dpi og proteinekstrakter ble analysert ved hjelp av RIA for måling av rekombinant protein akkumulering, som viser et snitt på 67,8 ug / g flw (frisk bladvekt, tabell 1). Rekombinante protein uttrykk nivåer, ved hjelp av dette systemet kan forbedres ytterligere, ved samtidig å infiltrere bladene med en suppressor av Post-Transkripsjonell genet Slå (PTGs) som P19 eller HC Pro 12.
DenSamtidig retters påvisning ble utført med N. benthamiana blader agroinfected med MagnICON vektorer: infiserte bladene ble samlet 1-8 dpi og like mengder TSP ble analysert ved western blot. Denne analysen viste at den maksimale rekombinant protein akkumulering oppnås 4 ppt (figur 1D), med en midlere akkumulering av det rekombinante protein fra 78,8 pg / g flw (tabell 1), som bedømt ved hjelp av RIA.
Ekspresjonen av hGAD65mut i transgene tobakksplanter er tidligere blitt rapportert 12, som viser at rekombinante proteinnivå betydelig varieres blant uavhengig transformerte linjer. Best resultater hGAD65mut T1 transgen plante var selv krysset og avledet planter (T2) ble analysert for å velge igjen de beste resultater ett. Denne prosedyren ble gjentatt over flere generasjoner for å utvikle en homogen produksjonsplattform, sjekker ytelsen i hver generasjon av RIA til det ikkeytterligere forbedring ble oppnådd (data ikke vist). I figur 1E er en representativ Western blot av T5 transgene planter rapportert, hvor homogeniteten av rekombinante protein utbytte er tydelig. Som vist på figur 1F, økte det gjennomsnittlige hGAD65mut utbytte fra T2 til T6, og nådde nivået på 99,1 ug / g flw (tabell 1) og, i utvelgelsesprosessen, avtok standardavviket av ekspresjonsnivået.
Figur 1:. Plattform oppsett Sett opp av beste forutsetninger for hGAD65mut uttrykk i hver plattform. (A) E. coli induserbar uttrykk plattform. Bakterielle celler ble dyrket ved 15 ° C eller 20 ° C. Øvre panel, western blot av hGAD65mut i celleekstrakter (2 ug TSP per felt). Nedre panel, lasting kontroll farget med Coomassie. n.c. = Negativ kontroll, bakterieceller transformert med pDEST17 vektor inneholdende kloramfenikol-resistensgenet; T: Totalt prøver; S1: Supernatant etter ultralyd og sentrifugering; S2 og P: Supernatant (1) og pellet (2) etter sentrifugering av prøven oppløst i urea-inneholdende buffer. (B) Baculovirus / insektcelle plattform. Følgende viruslagerbeholdningen ble testet: 5, 25 og 50 ul Øvre panel, western blot av hGAD65mut i celleekstrakter (5 mikrogram TSP per kjørefelt) Nedre panel, lasting kontroll farget med Coomassie... nc = negativ kontroll, ekstrakt av ikke-transforminsektsceller. (C) Forbigående i N. uttrykk benthamiana planter ved hjelp av pK7WG2 vektor. Prøvene ble samlet daglig, 1-5 dpi (baner 1-5). Øvre panel, western blot av hGAD65mut i blad ekstrakter (2,5 mikrogram TSP per kjørefelt). Nedre panel, lasting kontroll farget med Coomassie, hvor den store subenhetenav Rubisco er tydelig. nc = negativ kontroll, planter infiltrert med pK7WG2 vektor bærer GFP markør genet. (D) Transient ekspresjon i N. benthamiana planter ved hjelp MagnICON vektorer. Prøvene ble samlet daglig, 1-8 dpi (baner 1-8). Øvre panel, western blot av hGAD65mut i blad ekstrakter (5 mikrogram TSP per kjørefelt). Nedre panel, lasting kontroll farget med Coomassie hvor stor subenhet av Rubisco er tydelig . nc = negativ kontroll, planter infiltrert bare med pICH20111 5'-modul og pICH14011 integrase-modulen. Tall indikerer molekylmasse markør i kDa. pc = positiv kontroll, 15 ng av kommersielle hGAD65 produsert i Baculovirus / insektcellesystemet. (E) Stabil ekspresjon i N. tabacum planter. Blad prøver ble samlet inn fra forskjellige T5 planter (banene 1-11). Øvre panel, western blot av hGAD65mut i blad ekstrakter (5 mikrogram TSP per kjørefelt). Nedre panel, lasting kontroll farget with Coomassie. nc = negativ kontroll, vill-type planter. Tall indikerer molekylmasse markør i kDa. pc = positiv kontroll, 15 ng av kommersielle hGAD65 produsert i Baculovirus / insektcellesystemet. (F) Stabil ekspresjon i N. tabacum planter. Boxplot representasjon av hGAD65mut akkumulering over flere generasjoner avledet fra best resultater hGAD65mut T1 transgen tobakksplanten rapportert som mikrogram / g FLW beregnet fra RIA data. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| System | [HGAD65mut] (ug / ml) | [HGAD65mut] |
| Baculo / insekt | 117.5 ± 7.7 | 11,8 ± 0,8 pg / ml kulturmedium |
| Transient | 22.6 ± 0.9 | 67.8 ± 2.7 mg / g FLW |
| MagnICON | 26.3 ± 5.9 | 78,8 ± 17,8 mikrogram / g FLW |
| Elite T6 | 33,0 ± 3,8 | 99,1 ± 11,3 mikrogram / g FLW |
Tabell 1: hGAD65mut gir hGAD65mut rentene i ulike plattformer - fermenteringsdyrkede basert (Baculo / Insekt) og plantebaserte (pK7WG2- og MagnICON i N. benthamiana og elite T6 i N. tabacum). Andre kolonne - hGAD65mut konsentrasjon i proteinekstrakter (ug / ml). Tredje kolonne - hGAD65mut innholdet i frisk bladvekt (ug / g flw) for plantebaserte plattformer og i cellekulturmedium (ug / ml) for fermentor-basert plattform.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne studien ble tre forskjellige plattformer ble sammenlignet for ekspresjon av et rekombinant humant protein: bakterielle celler, Baculovirus / insektceller og planter. Anlegget-basert plattform ble videre undersøkt ved å utnytte tre mest brukte uttrykk teknologier (dvs. transient - MagnICON og pK7WG2 basert - og stabile). Målproteinet valgt for dette forsøk hGAD65mut, er tidligere blitt uttrykt i forskjellige systemer 13, og dets produksjon og funksjonalitet er lett påvisbar og målbar 14.
Bakterieceller var ikke en effektiv produksjonsplattform fordi hGAD65mut dannet inkludering organer, selv ved lav temperatur vekstforhold, og dermed krever møysommelig oppløseliggjøring og refolding å oppnå sitt opprinnelige eksteriør. Faktisk, er den viktigste svikt av denne plattform for ekspresjon av rekombinante proteiner komplekse den rette konformasjon av det endelige produktet.
DenBaculovirus / insektcelle plattform mediert en høy ekspresjon av immunoreaktivt rekombinant protein, men den viktigste begrensning av dette ekspresjonssystem er den høye kostnaden av kulturmedium, som kreves for å vokse insektceller. Det ble anslått at de totale produksjonskostnadene for 1 g hGAD65mut kunne nå € 700 i denne produksjonsplattform (vurderer 9 L av insektcellekultur media kreves). En ytterligere begrensning av dette uttrykket plattformen er behovet for steril dyrking av insektceller, noe som krever at personell med aseptisk manipulering ferdigheter. For å sikre effektivt rekombinant protein akkumulering to kritiske parametrene må reguleres nøye i dette ekspresjonssystem: de virale lagerbeholdningen som brukes til å infisere celler og tidspunktet for viral infeksjon. Videre vaskemidlet, som brukes for totalt oppløselig protein ekstraksjon fra Sf9 insektceller, påvirker drastisk rekombinant protein solubiliseringen.
Plantebaserte systemene var den mest gunstig plattform;rm å uttrykke hGAD65mut: planten-laget rekombinante protein var immunoreaktive og akkumulert i høye nivåer i bladvevet. Sammenligning av forskjellige plantebaserte ekspresjonssystemer, ble de høyeste utbytter oppnås i stabile transformerte tobakksplanter (tabell 1) og, hvis vurderer den totale biomassen av tobakken sammenlignet med N. benthamiana, som brukes for transient ekspresjon, er den samlede høyere produktivitet av tobakk tydelig. Imidlertid er den viktigste begrensning av stabilt transformerte tobakksplantebasert plattform tiden som kreves for oppsett av systemet, som i vår undersøkelse tok 20 måneder. Faktisk, bør en homozygot linje velges for rekombinant protein uttrykk homogenitet og det kan kreve gjentatte selv kryss sykluser, fra den høyeste T1 uttrykke linjer. Spesielt når den valgte T1 bærer mer enn ett eksemplar av den transgene trekk, kan avlsprogrammet ta opp til 3 år.
Forbigående ekspresjonssystemer tilbudtnytte av rask oppskalering på grunn av en kort intervall mellom transformasjon og uttrykk og oppsett av uttrykket plattform kreves 4 dager. Men en begrensning av plantebaserte forbigående systemer er at deres automatisering er neppe gjennomfør på en lab-skala med mindre dedikert high-end utstyr for agro-infiltrasjon brukes. Derfor kan en skikkelig beregningen for storskala produksjon av hGAD65 hjelp transient-baserte systemer ikke utføres her. På den annen side, spekulerer vi at de totale produksjonskostnader for 1 g av rekombinant protein ved hjelp T6 stabil tobakkslinje kan beregnes på mindre enn € 5 (med tanke på jord for dyrking av 60 tobakksplanter). For å sikre effektiv agroinfiltration og proteinproduksjon flere kritiske parametere bør kontrolleres nøye (plante utviklingsstadiet, vokse og infiltrasjon tilstand av Agrobacterium), som tidligere rapportert 15. Videre, for hvert uttrykk eksperimentere en bestemt tid-retters analyse bør væreutført for å velge den oppløsningen som tillater den høyeste akkumulering av det rekombinante protein.
Eksemplet diskutert her kan betraktes som en proof-of-prinsippet case study, som fremhever noen av de konkrete fordelene med plantebasert produksjon i forhold til tradisjonelle systemer. Spesielt kan tobakkstransgene linjer homogent som uttrykker det rekombinante protein bli betraktet som en verdifull plattform for masseproduksjon av rekombinante proteiner som er nødvendige i store mengder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast extract | Sigma | Y1333 | |
| Tryptone | Formedium | TRP03 | |
| Agar Bacteriological Grade | Applichem | A0949 | |
| Sf-900 II SFM medium | Gibco | 10902-088 | |
| Grace’s Insect Medium, unsupplemented | Gibco | 11595-030 | |
| Cellfectin II Reagent | Invitrogen | 10362-100 | |
| MS medium including vitamins | Duchefa Biochemie | M0222 | |
| Sucrose | Duchefa Biochemie | S0809 | |
| Plant agar | Duchefa Biochemie | P1001 | |
| Ampicillin sodium | Duchefa Biochemie | A0104 | Toxic |
| Gentamycin sulphate | Duchefa Biochemie | G0124 | Toxic |
| Ganciclovir | Invitrogen | I2562-023 | |
| Carbenicillin disodium | Duchefa Biochemie | C0109 | Toxic |
| Kanamycin sulfate | Sigma | K4000 | Toxic |
| Rifampicin | Duchefa Biochemie | R0146 | Toxic – 25 mg/ml stock in DMSO |
| Streptomycin sulfate | Duchefa Biochemie | S0148 | Toxic |
| Spectinomycin dihydrochloride | Duchefa Biochemie | S0188 | |
| IPTG (isopropil-β-D-1-tiogalattopiranoside) | Sigma | I5502 | Toxic |
| MES hydrate | Sigma | M8250 | |
| MgCl2 | Biochemical | 436994U | |
| Acetosyringone | Sigma | D134406 | Toxic – 0.1 M stock in DMSO |
| Syringe (1 ml) | Terumo | ||
| MgSO4 | Fluka | 63136 | |
| BAP (6-Benzylaminopurine) | Sigma | B3408 | Toxic |
| NAA (Naphtalene acetic acid) | Duchefa Biochemie | N0903 | Irritant |
| Cefotaxime | Mylan Generics | ||
| Trizma base | Sigma | T1503 | Adjust pH with 1 N HCl to make Tris-HCl buffer |
| HCl | Sigma | H1758 | Corrosive |
| NaCl | Sigma | S3014 | 1 M stock |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791 | |
| PMSF (Phenylmethanesulfonylfluoride) | Sigma | P7626 | Corrosive, toxic |
| Urea | Sigma | U5378 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | Toxic |
| Tween-20 | Sigma | P5927 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | |
| DTT (Dithiothreitol) | Sigma | D0632 | Toxic – 1 M stock, store at -20 °C |
| CHAPS | Duchefa Biochemie | C1374 | Toxic |
| Plant protease inhibitor cocktail | Sigma | P9599 | Do not freeze/thaw too many times |
| SDS (Sodium dodecyl sulphate) | Sigma | L3771 | Flammable, toxic, corrosive – 10% stock |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Brilliant Blue R-250 | Sigma | B7920 | |
| Isopropanol | Sigma | 24137 | Flammable |
| Acetic acid | Sigma | 27221 | Corrosive |
| Anti-Glutamic acid decarboxylase 65/67 | Sigma | G5163 | Do not freeze/thaw too many times |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibody | Sigma | A6154 | Do not freeze/thaw too many times |
| Sf9 Cells | Life Technologies | 11496 | |
| BL21 Competent E. coli | New England Biolabs | C2530H | |
| Protein A Sepharose | Sigma | P2545 | |
| Cell culture plates | Sigma | CLS3516 | |
| Radio Immuno Assay kit | Techno Genetics | 12650805 | Radioactive material |
References
- Hampe, C. S., Hammerle, L. P., Falorni, A., Robertson, J., Lernmark, A. Site-directed mutagenesis of K396R of the 65 kDa glutamic acid decarboxylase active site obliterates enzyme activity but not antibody binding. FEBS Lett. 488 (3), 185-189 (2001).
- Avesani, L., et al. Recombinant human GAD65 accumulates to high levels in transgenic tobacco plants when expressed as an enzymatically inactive mutant. Plant Biotechnol. J. 9 (8), 862-872 (2010).
- Sambrook, J., et al. Molecular Cloning: A laboratory manual. Second Edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (1989).
- Avesani, L., et al. Comparative analysis of different biofactories for the production of a major diabetes autoantigen. Transgenic Res. 23, 281-291 (2014).
- Marillonnet, S., Giritch, A., Gils, M., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. In planta engineering of viral RNA replicons: efficient assembly by recombination of DNA modules delivered by Agrobacterium. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA). 101 (18), 6852-6857 (2004).
- Gleba, Y., Klimyuk, V., Marillonnet, S. Viral vectors for the expression of proteins in plants). Curr. Opin. Biotechnol. 18, 134-141 (2007).
- Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS One. 3 (11), (2008).
- Xu, R., Li, Q. Q. Protocol: streamline cloning of genes into binary vectors in Agrobacterium via the Gateway TOPO vector system. Plant Methods. 4 (4), 1-7 (2008).
- Fairbanks, G., Steck, T. L., Wallach, D. F. Electrophoretic analysis of the major polypeptides of the human erythrocyte membrane. Biochemistry. 10 (13), 2606-2617 (1971).
- Falorni, A., et al. Radioimmunoassay detects the frequent occurrence of autoantibodies to the Mr 65,000 isoform of glutamic acid decarboxylase in Japanese insulin-dependent diabetes. Autoimmunity. 19, 113-125 (1994).
- Hunt, I. From gene to protein: a review of new and enabling technologies for multi-parallel protein expression. Protein Expr. Purif. 40 (1), 1-22 (2005).
- Arzola, L., et al. Transient co-expression of post-transcriptional silencing suppressor for increased in planta expression of a recombinant anthrax receptor fusion protein. Int. J. Mol. Sci. 12 (8), 4975-4990 (2011).
- Merlin, M., Gecchele, E., Capaldi, S., Pezzotti, M., Avesani, L. Comparative evaluation of recombinant protein production in different biofactories: the green perspective. Biomed. Res. Int. 2014, 136419 (2014).
- Avesani, L., et al. Improved in planta expression of the human islet autoantigen glutamic acid decarboxylase (GAD65). Transgenic Res. 12 (2), 203-212 (2003).
- Leuzinger, K., et al. Efficient agroinfiltration of Plants for high-level transient expression of recombinant proteins. J Vis Exp. (77), (2013).
