Protocol
OBS: Rutiner som använder zebrafisk godkändes av UCSF s Institutional Animal Care och användning kommittén.
1. Beredning av verktyg
- Sätt minutia stiftet i ett stift hållare och klämma stiftet.
- Med fin spets pincett, försiktigt böja spetsen på stiftet för att skapa en liten krok.
- För manipulation och stabilisering av embryot under skade, böja i slutet av en 28 gauge ½ tum nål monterad på en insulinspruta med hjälp vass tång.
2. Beredning av Zebrafish embryon för skada
- Ställ in zebrafisk häckande par och samla ägg i ägg vatten (60ug / ml akvarium alter) som visats tidigare 22.
- Lägg 0,003% N-fenyltiokarbamid (PTU) till ägget vatten när embryona är cirka 8 timmar efter befruktning (HPF) för att förhindra melanin.
- Dechorionate tvådagars efter befruktning (DPF) embryon före försöket med hjälp fin spets pincett.
- Söva embryona med 0,02% buffrad 3-aminobensoesyra (Tricaine) ca 10 min före manipulationer.
3. Mekanisk kärlskada av embryon
- Överför sövda embryon till en depression bild på en dissekera stereomikroskop med hjälp av en överförings pipett.
- Använda kort platt sida av sprutans nål att manipulera embryot med den dominanta handen, placera embryot på sidan med den ventrala ytan vänd bort från nålen.
- Placera minutiae stiftet med spetsen riktad direkt mot den ventrala ytan av fisk posteriort till det urogenitala öppningen. Placera minutiae stift vid en liten vinkel, så att den krökta spetsen är i stånd att tränga igenom periderm direkt i kaudalvenen (Figur 1 </ Strong>).
- Använd sprutan nål för att manipulera embryot, borra kaudalvenen med minutians stiftet genom att knacka embryot in i stiftet till lätt haka stiftet i venen.
- Använda sprutnål, dra embryot bort från minutians tappen för att skapa en liten reva i kärlet.
OBS: En framgångsrik skada kommer att resultera i omedelbar blödning från venen.
4. Analys av Hemostasis
- Välj bara embryon med synbart cirkulerande blodkroppar för denna procedur.
- Förbered att börja timern så snart minutians stiftet dras från kärlet.
- Starta timern så fort blodförlust kan visualiseras från såret. När blodförlust från såret upphör, stoppa timern och registrera den totala tiden som blödningstid. Om koagulation hämmas, registrera sig tid att när det inte längre finns synligt cirkulerande blodkroppar.
5. Analys av sårläkning
- Överföring post-skada djur på glasbottnade avbildnings rätter för mikroskopi.
- Avlägsna majoriteten av ägg vatten.
- Täck embryona i 0,3-1,2% låg smält agaros upplöst i ägg vatten, uppvärmd till mellan 42 och 45 ºC och kompletterat med 0,02% Tricaine.
- Positions embryon på sina sidor med pincett.
- Efter agarosen svalnar, fyll skålen med 0,02% Tricaine i ägg vatten.
- Förvärva bilder med bright, epifluorescens eller konfokalmikroskopi.
- Ta embryo från agarosen med hjälp pincett och överföra tillbaka till ägg vatten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mekanisk kärlskada utfördes på 2 dpf embryon (Figur 2A - C). Skada leder till en snabb och tillförlitlig koagulation svar mätt som tid till upphörande av blödning (figur 2D). För att avgöra huruvida skillnader i koagulering svaret kunde mätas, var den antikoagulerande hirudin administreras till embryon genom injektion i Duct av Cuvier omedelbart före sårskada (5-10 nl av 1 enhet per il hirudin upplöst i vatten) (för demonstration av injektioner i Duct av Cuvier, se tidigare JUPITER artikeln 23) 24. Administrationen av hirudin före skadan medfört ökat markant blödningstider kontra fordonsstyrning (figur 2D).
Bevis på kärlskador och koagulation kan ses omedelbart efter skada med hjälp av transgena linjer för endotel (kdrl: EGFP) och röda blodkroppar (gata1a: dsRed 25,26. Bilder förvärvades sekventiellt var 5 min för en 12 tim period med hjälp epifluorescens. Representant stillbilder visas under olika stadier av sårläkning (Figur 3). Med en kombination av differentialinterferenskontrast (DIC) och fluorescensmikroskopi, är det möjligt att mäta distinkta parametrar för sårläkning. För att bestämma huruvida eller inte sårreparation följde en reproducerbar mönster över experiment tid att återupprättas blodflödet mätt i fyra grupper av fisk. Kärlskada resulterade i en tillförlitlig stereotypa gensvar av 253 ± 16 min till återupprättandet av blodflödet genom skadade kärl (n = 4-5 fiskar per experiment, genomsnitt ± SEM).
Figur 1: Diagram över 2 dpf embryo visar placering av minutiae stift för perf orming mekanisk skada kaudalvenen (CV). Kärl fack är skuggad i grått.
Figur 2: Blödning tider kan visuellt mätas efter mekanisk skada Stills från realtidsvideo från zebrafisk kärlskada på 2 DPF embryon.. Bilderna visas vid skadetillfället (A), under den aktiva blodförlust från såret (B), och efter upphörande av blodförlust (C). Alla tider som anges är i sekunder. Embryon är orienterade i sidled med anterior upptill och ventrala yta vänd åt vänster. Scale bar 100 | im. Administration av antikoagulerande hirudin ledde till signifikant ökad blödningstider kontra fordonsstyrning (D) (p <0,0001, T-test).pg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:. Visualisering mekanisk skada och reparation med hjälp av transgena markörer Stills från timelapse DIC och fluorescens mikroskopi efter kärlskada med hjälp av markörer för vaskulär endotel (kdrl: egfp) och röda blodkroppar (gata1a: dsRed) i 2 dpf embryon. Bilder visade en lucka i fartyg och lokala röda blodkroppar ackumulation (t = 25), partiell reparation med återupprättade blodflöde (t = 210), och tydligen fullständig återställning av normal kärlstruktur (t = 615). Tiden anges i minuter. Embryon är orienterade i sidled med anterior upptill och ventrala yta vänd åt vänster. * Anger positionen för den dorsala aorta. Skadan (pilspets) störde kaudalvenen och en del av den kaudala plexus. Skalabar 25 ^ m.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zebrafisk har framgångsrikt använts som en modell för olika typer av sår, inklusive laserskada 13-15, laserinducerad trombos 16 och epitelial såra 10. Vi rapporterar en metod för mekanisk skada som är enkel att utföra och ger en kontrollerad skada i en in vivo-modell som är mycket mottaglig för realtid mikroskopi. Skada leder till en snabb och mätbar BLODS respons och en reproducerbar sårläkning program som kan övervakas med hjälp av video och Timelapse mikroskopi.
Deras enkla och stereotypa kärlanatomi, som medger reproducerbar skada vid en definierad och mikroskopiskt tillgänglig webbplats, och närvaron av de flesta kärl- och hematopoetiska celltyper gör zebrafisk embryon särskilt användbara för att studera reaktioner på skada. Men zebrafisk embryon inte har funktionella lymfocyter under de första veckorna av utveckling 5,6, vilket gör detta system mest aplig för att studera bidraget av medfödd immunitet i inflammation och reparation. För närvarande ett brett utbud av transgen zebrafisk existera med markörer för celler och proteiner som deltar i trombbildning, koagulation, inflammation och sårläkning, inklusive linjer som märka trombocyter, fibrinogen, erytrocyter, leukocyter och vaskulär endotel 17,21,25- 31. Dessa och andra verktyg bör göra det möjligt att följa processer i hemostas och reparation i betydande detalj.
Mekanisk skada kompletterar laserskada för studier av hemostas i zebrafisk. Medan laser-inducerad skada har använts i åratal för att utlösa trombbildning i zebrafiskembryon och musmodeller, de mekanismer genom vilka laserskada utlöser koagulation och aktivering trombocyter / blodplättar är inte helt kända 16,32. Mekanisk skada ger ett fysiologiskt relevant metod för att inducera koagulation av vaskulär brott och, förmodligen,vävnadsfaktorberoende initiering av koagulationskaskaden. Upptäckten att hirudin behandling signifikant ökad blödningstider efter skada tyder på att denna modell är trombin beroende. Mekanisk skada kompletterar dessutom laserskada genom att tillhandahålla tillräcklig störning av ett blodkärl för att ge en möjlighet att följa fartygets reparation. Tidigare studier har framgångsrikt använt mekanisk skada genom skalpell snitt och nålstick för att visa skillnader i blödningstider under förhållanden av farmakologisk och genetisk manipulation 19,33. Den minutia pin skada som används i den nuvarande modellen kan komplettera andra modeller skade genom att tillhandahålla en mer reproducerbar skada på grund av de små och definierade storleken av såret den producerar och genom att ge en möjlighet att bättre studera kärlrekanalise och reparation.
Epithelial sårade i zebrafisk har visat sig vara en kraftfull modell för att studera inflammation och sårläkning 10. Förmågan attinföra en kärlskada ger en möjlighet att bedöma reparation av mer komplexa sår i miljöer där fibrin ger en provisorisk matris, tromber och skräp rensas, och fartygen regenerera. Eftersom dessa processer deltar i normal vävnad reparation och i akut och kronisk inflammation och vaskulär patologi, bör denna metod hjälper till att modellera aspekter av mänskliga sjukdomar i ett system där cellulära beteenden kan övervakas i realtid i en hel djurmodell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minutia Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Tip diameter 0.0125 mm, rod diameter 0.1 mm |
| Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Dumont #5 Fine Tip Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Glass Depression Slide | Aquatic Eco-Systems | M30 | |
| Low Melting Agarose | Lonza | 50081 | Preheated to 42 º C |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| 3-aminobenzoic acid (Tricaine) | Sigma Aldrich | E10521 | |
| Hirudin | Sigma Aldrich | H7016 | |
| Glass bottom imaging dishes | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZH10 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axio Observer | |
| Aquarium salts | Instant Ocean | ||
| Insulin syringe with 28.5 G needle | Becton Dickinson | 329461 |
References
- Gore, A. V., Monzo, K., Cha, Y. R., Pan, W., Weinstein, B. Vascular development in the zebrafish. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (5), a006684 (2012).
- Boatman, S., et al. Assaying hematopoiesis using zebrafish. Blood Cells Mol Dis. 51 (4), 271-276 (2013).
- Ellett, F., Lieschke, G. J. Zebrafish as a model for vertebrate hematopoiesis. Curr Opin Pharmacol. 10 (5), 563-570 (2010).
- Liu, J., Stainier, D. Y. Zebrafish in the study of early cardiac development. Circ Res. 110 (6), 870-874 (2012).
- Traver, D., et al. The zebrafish as a model organism to study development of the immune system. Adv Immunol. 81, 253-330 (2003).
- Lieschke, G. J., Trede, N. S. Fish immunology. Curr Biol. 19 (16), R678-R682 (2009).
- Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Curr Opin Microbiol. 11 (3), 277-283 (2008).
- Oehlers, S. H., et al. A chemical enterocolitis model in zebrafish larvae that is dependent on microbiota and responsive to pharmacological agents. Dev Dyn. 240 (1), 288-298 (2011).
- Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends Genet. 29 (11), 611-620 (2013).
- LeBert, D. C., Huttenlocher, A. Inflammation and wound repair. Semin Immunol. , (2014).
- Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology. J Leukoc Biol. 94 (4), 633-642 (2013).
- Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459 (7249), 996-999 (2009).
- Rosenberg, A. F., Wolman, M. A., Franzini-Armstrong, C., Granato, M. In vivo nerve-macrophage interactions following peripheral nerve injury. J Neurosci. 32 (11), 3898-3909 (2012).
- Otten, C., Abdelilah-Seyfried, S. Laser-inflicted injury of zebrafish embryonic skeletal muscle. J Vis Exp. (71), e4351 (2013).
- Matrone, G., et al. Laser-targeted ablation of the zebrafish embryonic ventricle: a novel model of cardiac injury and repair. Int J Cardiol. 168 (4), 3913-3919 (2013).
- Jagadeeswaran, P., Carrillo, M., Radhakrishnan, U. P., Rajpurohit, S. K., Kim, S. Laser-induced thrombosis in zebrafish. Methods Cell Biol. 101, 197-203 (2011).
- Vo, A. H., Swaroop, A., Liu, Y., Norris, Z. G., Shavit, J. A. Loss of fibrinogen in zebrafish results in symptoms consistent with human hypofibrinogenemia. PLoS One. 8 (9), e74682 (2013).
- Liu, Y., et al. Targeted mutagenesis of zebrafish antithrombin III triggers disseminated intravascular coagulation and thrombosis, revealing insight into function. Blood. , (2014).
- Jagadeeswaran, P., Liu, Y. C. A hemophilia model in zebrafish: analysis of hemostasis. Blood Cells Mol Dis. 23 (1), 52-57 (1997).
- Jagadeeswaran, P., Gregory, M., Day, K., Cykowski, M., Thattaliyath, B. Zebrafish: a genetic model for hemostasis and thrombosis. J Thromb Haemost. 3 (1), 46-53 (2005).
- Lin, H. F., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106 (12), 3803-3810 (2005).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. J Vis Exp. (61), (2012).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P. Analysis of blood coagulation in the zebrafish. Blood Cells Mol Dis. 25 (3-4), 3-4 (1999).
- Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132 (23), 5199-5209 (2005).
- Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat Immunol. 4 (12), 1238-1246 (2003).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev Biol. 248 (2), 307-318 (2002).
- Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
- Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Dev Biol. 7, 48 (2007).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).
- Gray, C., et al. Simultaneous intravital imaging of macrophage and neutrophil behaviour during inflammation using a novel transgenic zebrafish. Thromb Haemost. 105 (5), 811-819 (2011).
- Bellido-Martin, L., Chen, V., Jasuja, R., Furie, B., Furie, B. C. Imaging fibrin formation and platelet and endothelial cell activation in vivo. Thromb Haemost. 105 (5), 776-782 (2011).
- Bielczyk-Maczynska, E., et al. A loss of function screen of identified genome-wide association study Loci reveals new genes controlling hematopoiesis. PLoS Genet. 10 (7), e1004450 (2014).
