Introduction
В настоящем докладе мы описываем реализацию ближней инфракрасной флуорофорных меченых зондов для проверки в естественных условиях экспериментов изображений ксенотрансплантат с помощью экс естественных условиях проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии рассеченных ксенотрансплантатных опухолей. Мы сравниваем одну нано- доменов (+ 16а, 17 кДа) 1 и моноклональные антитела (Nika102, 150 кДа) 2,3 направленными в ту же антигена-мишени для конкретных в естественных условиях ближней инфракрасной флуоресценции изображений в модели лимфома ксенотрансплантатной. Целевой антиген АДФ-рибозилтрансферазной ARTC2.2 выражается как якорь GPI-клеточной поверхности экто- фермента клеток лимфомы 4-9.
Нанотел, полученные от верблюда тяжелой цепи только антитела представляют собой наименьшие доступные антиген-связывающие фрагменты 10,11. Только с ~ 15 кДа, эти небольшие фрагменты антител являются растворимыми, очень устойчивы и почками выводится из обращения 8,10. THESE свойства делают их особенно пригодными для конкретного и эффективного таргетинга опухолевых антигенов в естественных условиях 12-20. Общие цели антигена доступных нанотел являются рецептор эпидермального фактора роста (EGFR1 или HER-1), человеческого эпидермального роста типа фактором 2 (HER-2 или CD340), карциноэмбриональный антиген (СЕА) и адгезии сосудистых клеток молекулы-1 (VCAM-1 ) 21. Нанотела конъюгаты перспективные средства для иммунотерапии рака и лечении воспалительных заболеваний 22.
Недавние исследования показали, что нанотела позволяют более опухоли к фону (T / B) -ratios, чем обычные антител в в естественных условиях применения молекулярной визуализации 8,17,19. Это объясняется, главным образом, относительно бедных и медленно проникновения в ткани обычного антител, медленным выведением из обращения, и долго удержания в нецелевых тканях 23. Кроме того, избыток обычных антител приводит к неспецифической накопления Iп-мишени антиген-отрицательных опухолей, вызванных повышенной проницаемости и удержания (ЭПР) Эффект 24,25. Это означает, что более высокие дозы обычных антител может увеличить не только конкретные сигналы, но также и неспецифические сигналы, тем самым уменьшая максимальный достижимый коэффициент опухоли к фону. В отличие от этого, увеличение дозы увеличивает нанотел сигналы антиген-положительных опухолей, но не нормальной ткани или антиген-негативных опухолей (неопубликованные данные).
Помимо сравнения нанотел и обычных антител, мы очертить intraindividual оценку антиген-положительных и негативных, HBeAg ксенотрансплантатах в тех же мышей для прямого сравнения специфических и неспецифических сигналов из-за эффекта ЭПР. В ближней ИК-области флуорофорные сопряженные зонды позволили нам использовать единый зонд в естественных условиях и экс естественных условиях с использованием изображений ближней инфракрасной флуоресценции, проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии. Применение наших протоколов позволяет нерадиоактивные, очень чувствительна и недорого оптимизация в естественных условиях экспериментов молекулярной визуализации, таких как оценка новых антител конструкций, нацеленные на конкретные опухоли.
Цель этого урока исследования, чтобы выделить использование NIRF-визуализации для оценки новых антител конструкций в доклинической молекулярной визуализации.
В этом протоколе, все эксперименты проводились с малого животного системы NIRF-изображений, флуоресценции активирован сортировки клеток (FACS) проточной цитометрии и конфокальной микроскопии.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперименты были проведены в соответствии с международными стандартами по этическим использования животных и были одобрены местной комиссии защиты животных Медицинского центра университета, Гамбург.
1. Подготовка опухолевых клеток, мышей и антител конструктов
- Подготовка клеток лимфомы и аликвоты из подвала Matrix (Matrigel).
- День до инъекции опухолевых клеток поставить стерилизовать наконечник окно (1000 советы мкл) и пипетку в -20 ° C морозильнике.
- Оттепель бутылку с базальной матрицы на льду в 4 ° C холодильником O / N.
- В день инъекции заполнить ведро льда и поместите в подвал матрицу вместе с пипеткой, советы и 1 мл шприцы с 30 г хвои на льду.
- Аликвоты клеток лимфомы в объеме 100 мкл RPMI среде в 1,5 мл микроцентрифужных пробирках и тщательно перемешать со 100 мкл базальной матрицы. Составьте в предварительно охлажденныйшприцы и не поставить на лед до инъекции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте хорошую стерильную технику и работать на льду все время, чтобы предотвратить засорение подвале матрицы.
- Мыши Подготовка
- Используйте 8-10-недельных бестимусных голых мышей (NMRI- Foxn1 N U).
- Чтобы уменьшить автофлуоресценции кишечника держать мышей на люцерны свободной диете в течение 1 недели до визуализации в естественных условиях.
- Для введения клеток лимфомы анестезию мыши, чтобы осуществить с 2% изофлуран в индукционной камере. Поддержание 1-2% изофлуран для длительности процедуры с использованием изофлуораном коллектор.
- Вводите клетки лимфомы подкожно в плечо флангах. Для прямого внутри индивидуального сравнения вводят антиген-положительных и антиген-негативных клеток на правой и левой стороне, соответственно.
- Используйте большой и указательный палец ущипнуть кожу мыши и потяните ее от тела мыши. Вводите медленно и равномерно вЧехол создан пальцев, создавая один кластер клеток под кожей. Подвал матрица помогает держать вводили клетки на месте.
- Подготовка антител конструктов
- Этикетка моноклональных антител и отдельные нанотела области с коммерчески доступной мечения белков комплекта к флуоресцентным красителем AlexaFluor-680 (AF680) (Длина волны возбуждения = 679 нм, длина волны излучения = 702 нм) в соответствии с инструкциями изготовителя. Подсчитать количество красителей в нано- и обычных антител с использованием молярных коэффициентов экстинкции 15720 моль -1 см -1 и 203 000 моль -1 см -1, соответственно. Оценить чистоту антител конструкций по SDS-PAGE фракционированием и Кумасси пятно.
- Убедитесь, что специфичность конъюгаты путем проведения серии экспериментов в пробирке до фактического визуальных исследований. Проверьте специфику пометкаtibody строит в пробирке через блокирующие исследований и неспецифические изотипу контролирует 8,20.
Примечание: На этапе 1.2.4 число клеток на антиген-отрицательных и антиген-положительных клеток (или различных клеточных линий) может должны быть адаптированы в соответствии с различными темпами роста. Для этих экспериментов 0.5x10 6 DC27.10 ARTC2 отрицательным и 1.5x10 6 DC27.10 ARTC2 позитивные клетки были использованы для получения опухоли такого же размера. На этапе 1.3.1 Процесс маркировки и этикетирования эффективности антител зондов с флуорофорами могут отличаться от набора маркировки используется.
2. В естественных изображений
- После 7-9 дней, когда опухоли достигают ~ 8 мм в диаметре, инъекции 50 мкг AlexaFluor680 помечены конструкции антител в объеме 200 мкл физиологического раствора внутривенно в хвостовую вену мыши (MAB-AF680: 50 мкг с 2 красители / молекул ≈ ~ 4 ^ 14 флуорохромы ≈ ~ 0,8 мкг флуорохромии; нанотело-AF680: 50 μг с 0,3 красителей / молекула ≈ ~ 5,6 ^ 14 флуорохромы ≈ ~ 1,1 мкг флуорохромы).
- Инициализация системы визуализации и обезболить мышей, чтобы осуществить с 3% изофлуран использованием XGI-8 анестезии системы в индукции камеры до визуализации. Поддержание 1-2% изофлуран для продолжительности процедуры визуализации с использованием изофлуран коллектор размещены в камере формирования изображения.
- Мышей позиция по нагретой этапе визуализации с опухолями, направленных на камеру. Контролировать правильность обезболивания, зажимая палец или хвост животного; любая реакция животного показывает, что анестезия слишком светлый.
- Мониторинг частоты дыхания; анестезия слишком светлое, если частота дыхания увеличивается, и слишком глубоко, если частота дыхания уменьшается, глубоко или нерегулярно. Защита роговицы животного с глазной мази, чтобы предотвратить сухость в то время как под наркозом.
- Выберите флуоресцентные наборы фильтрующих 615-665 нм для возбуждения, 695-770 нм для emissioп, и 580-610 нм возбуждения вычитание фона с размером пикселя матрицы 51 2x 512. Установить время экспозиции Авто, пикселей биннинга до среднего и F / Stop, чтобы 2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Более короткое время экспозиции позволяют более быструю смену кадров; более длительное время экспозиции обеспечивают более высокую чувствительность. Биннинг контролирует размер пикселя на ПЗС-камеры. Увеличение биннинга увеличивает размер пикселя, чувствительность и частоту кадров, но снижает пространственное разрешение. F / Stop устанавливает размер камеры диафрагмы объектива. Размер отверстия определяет количество света, обнаруженного и глубину field.Note, что конфигурация может отличаться в зависимости от Imaging Device и экспериментальной установки. Обратитесь к руководству производителя для получения оптимальных результатов.- В программное обеспечение визуализации времени экспозиции оптимизации, F / стоп и пикселя на основе отбора по уровню экспрессии в клеточной линии. Измените эти настройки в любое время во время эксперимента, не влияя на количественный результат. Кроме того, чтобы программа Wizard изображений автоматически определитьпараметры.
- Мыши изображение перед инъекцией и 6 ч после инъекции антител конструкций.
ПРИМЕЧАНИЕ: маркировка эффективность может повлиять на требуемую дозу, необходимую для достижения оптимальных результатов визуализации. Поэтому количество требуемого антитела-конструкции для получения оптимальных результатов обработки изображений должно быть определено эмпирически. Это может варьироваться в зависимости от эффективности и маркировки размера конструкции, а также в модели опухоли и экспрессии целевого антигена.
3. Уборка урожая и подготовка опухолей
- Заполните ведро льда и поместите 4% параформальдегид (PFA) забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) / ингибитор протеазы (AEBSF) и PBS / 0,2% бычьего сывороточного альбумина (БСА) на льду.
- После того, как сеанс закончен изображений, увеличение концентрации изофлуран до 4%. После животное перестает дышать, удалить его из стадии визуализации и выполнять шейки дислокации.
- Гора мыши на пенопластовый блок и спрей с 70% этанола.
- Использование ножницс и щипцы, чтобы сократить внешнюю оболочку и вытащить его обратно осторожно, чтобы выставить опухоли. Удалить опухоли скальпелем, чтобы обеспечить опухолевой ткани остается неизменным.
- Cut опухоли в половине скальпелем. Поместите половину в пробирку с PBS / AEBSF для FACS анализ и другой половины в 50 мл пробирку с 4% PFA для иммуногистохимии.
- Подготовка для иммуногистохимии
- Хранить опухоли в 4% PFA в холодильнике при 4 ° С в течение 24 ч. Передача опухоли в пробирку с PBS / 30% сахарозы и держать в холодильнике при 4 ° С до тех пор, опухолевых опускается на дно пробирки.
- Вырезать опухоли в соответствующих заготовок для cryomolds. Положите опухоли в cryomolds и залейте октября соединения так, что опухоли покрыты.
- Положите формы на сухом льду и подождать, пока соединение не будет полностью заморожены. Трансфер замороженные опухоли до -80 ° C морозильник и хранить для иммуногистохимии.
- Резать замороженные опухоли в разделах 8 мкм с помощью микротома. Используйте стандартный immunohistoПротокол химия для окрашивания с антителами против CD31-AF488 визуализировать кровеносные сосуды и диамидино-фенилиндол (DAPI) для визуализации ядер.
Примечание: Опухолевые участки очень чувствительны к свету, как они уже содержат флуоресцентно меченые антитела. Сведите к минимуму воздействие на свет как можно больше.
- Подготовка к анализу FACS
- Поместите чашку Петри на льду и удалить поршень из 2,0 мл шприца. Поставьте опухоль в ячейки фильтра и сократить его нежно в 3-4 части, используя скальпель. Налейте начальное PBS в чашке Петри и использовать плоский конец плунжера пюре опухоли в клеточный фильтр.
- Промойте ячейки фильтра с начальным PBS промыть все клетки с 10 мл пипетки. Передача клеточной суспензии в новую пробирку и спина при 500 х г в течение 5 мин. Жидкость над осадком сливают и клетки вновь суспендируют в 10 мл PBS / 0,2% BSA. Граф клеток.
- Кратные 1-5 × 10 6 клеток лимфомы в 5 мл FACS трубы. Побочные клетки снова (500XG), отбросить супернатант и ресуспендируют в 100 мкл PBS / 0,2% BSA.
- Дополнительно, блок FcR с помощью анти-CD16 / CD32-мАт (FcgR3 / 2), который связывается с FcγR на льду в течение 10 мин. Промыть клетки один раз PBS / 0,2% BSA.
- Добавить анти-CD45-МАБ дискриминации лейкоцитов из других ячеек. Инкубировать в течение 20 мин на льду в темноте, с последующими двумя промывками ФБР / 0,2% БСА.
- Непосредственно перед FACS анализа пятна с пропидийиодидом в течение 15 мин на льду различить мертвые клетки, с последующими двумя промывками с обычной PBS. Ресуспендируют в 150 мкл для анализа FACS.
Примечание: На этапе 3.7.4 и 3.7.5 шаг других антител могут быть использованы в зависимости от субъекта опухоли.
4. FACS анализ
- Используйте серию шлюзами инструментов для ворот населения интерес в виде большого разброса, двойной дискриминации, исключения мертвых клеток, стробирования для CD45-положительных клеток, и стробирования для антиген-позитивных клеток.
- Во-первых, ворота из клетокмусор в прямом рассеяния (FSC-A) по сравнению с боковой разброс (SSC-А), используя участок двухпараметрическое. Дублеты Следующая Отбросить клеток. Наконец, ворота из не CD45-антиген-позитивными (CD45) и мертвых / умирая клетки (LD - Live / Dead-пятно).
- Образцы записей, используя тот же шаблон для всех экспериментов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к протоколу производителя для технической консультации по применению оборудования и аналитической программного обеспечения.
5. микроскопического анализа
- Анализ окрашенных криосрезы опухоли с помощью конфокальной микроскопии с иммерсионным объектива (40X объективной). Используйте Он-Neon 633 нм лазерного возбуждения AF680, аргоновый лазер для AF488, и 405-диод DAPI.
- Процесс исходные данные изображения, используя программное обеспечение, совместимое с микроскопом. Выполните фона коррекцию и фильтрацию шумов, если это необходимо. Выполните дополнительные настройки изображения, такие как секционирования, обрезки, а также настройки яркости и контрастности.
- Наконец GEnerate одну составную накладываемого изображения со всех каналов обнаружения. Отрегулируйте яркость и контрастность отдельных слоев. Композитные изображения покажет локализации клеток (DAPI-пятно, синий), распределения меченых антител конструкций (AF680-пятно, красный) и кровеносных сосудов (AF488-пятно, зеленый).
6. При анализе естественных изображений
- Открытые файлы изображения в ПО для обработки изображений и создания наложенного изображения путем комбинирования данных изображение фотография с данными флуоресценции изображения. Оптимизация отображения изображения путем удаления ткани автофлуоресценции фоновый сигнал от конкретного флуоресцентного сигнала. Это может быть сделано путем вычитания изображения, полученного с фонового фильтра, установленного из изображения, полученного с помощью фильтра, установленного для конкретной метки.
- Нарисуйте одинаковой циркулярной регионов измерения интереса (ROI) вокруг антиген-положительный опухоли и антиген-отрицательной опухоли. Для определения интенсивности сигнала фон, место круглое ROIв области животного, где сигнал флуоресценции как ожидается, будет низкой (например, задняя нога).
- Используйте те же трансформирования для всех животных во всех временных точках. Для позиционирования используйте фотографические черно-белые изображения, чтобы определить краев опухоли.
- Отображение данных ROI в таблице измерений. Используйте средний радиант данные эффективности, что позволяет более количественное сравнение флуоресцентных сигналов для дальнейших статистических анализов.
- Дисплей и сравнивать данные как абсолютных интенсивностей сигналов или рассчитать соотношение сигнал-фон с использованием измеренных данных ROI от целенаправленных ткани и фоновой ткани. Рассчитать отношение опухоли к фону путем деления стоимости поглощения опухоли, фоновое значение определяется из задней конечности.
- В качестве контроля, анализа и антиген-негативных и антиген-положительных опухолей у тех же животных, а также животных, которым вводили меченых управления изотипа, чтобы оценить специфичность сигналов в живом организме.
Representative Results
Флуоресцентно меченных зондов позволяют комбинации различных методов NIRF-томография (рис 1А). Мы стремились выполнять в естественных условиях NIRF-Imaging, проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии последовательно, чтобы сравнить флуоресцентно меченных нанотела и моноклональные антитела для конкретных в естественных изображений (рис 1б).
Мышам вводили 50 мкг нанотела и моноклонального антитела, чтобы оценить специфичность флуоресцентно меченных конструкций для визуализации в естественных условиях. Результаты показали специфическую маркировку антиген-положительных опухолей как с нанотела и моноклонального антитела через 6 ч после инъекции (рисунок 2). ROI анализ антиген-позитивных опухолей показали гораздо более высокий коэффициент T / В ~ 12 для нанотелу по сравнению с ~ 6 для моноклональных антител. Кроме того, нанотела не показали неспецифический сигнал в антиген-негативных опухолей, в то время какмоноклональное антитело показало неспецифические смешанные сигналы в антиген-негативных опухолей.
Кроме того, неспецифического сигнала отрицательных опухолей, моноклональное антитело также индуцирует неспецифические фоновые сигналы во всей животного. Это, вероятно, из-за чрезмерного бесплатно циркулирующих антител, которые слишком велики, чтобы быть почками. Напротив, животные, которым вводили нанотел показали неспецифические сигналы только в почках из-за почечной ликвидации малых нанотел.
Проточная цитометрия анализ опухолевых клеточных суспензий показали специфическую маркировку антиген-положительных опухолевых клеток как с AF680-конъюгаты 6 ч после инъекции. Чем сильнее сигнал флуоресценции нанотела меченых клеток по сравнению с моноклональное антитело меченых клеток отражает в естественных условиях результаты NIRF-изображений. Важно отметить, что анализ проточной цитометрии показали, что нет неспецифическое мечение антиген-негативных клетках с любой из двухконструкции (рис 3).
Люминесцентной микроскопии опухолевых криосрезах показали сильную и почти однородную маркировку антиген-положительных клеток с нанотела 6 ч после инъекции. Наоборот, моноклональное антитело показали гораздо слабее и довольно неоднородное окрашивание (фиг.4а). Антиген-отрицательные опухоли не показывают окрашивание 6 ч после инъекции нанотела, тогда как антиген-отрицательной опухоли вводили с обычной неспецифической антитела показывают, рассеянного окрашивания в интерстициальное пространство (фиг.4В).
Рисунок 1: визуализация Flourescence и антител конструкции. () Настройки изображений для оценки AF680-конъюгатов: IN VIVO NIRF-изображений с последующим проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии. (В
На рисунке 2: В естественных NIRF-изображений Изображения флуоресценции сигнала антиген-положительной (+) и антиген-отрицательной (-) опухоли у мышей, которые были введены с + 16а нанотела S (A) и моноклонального антитела Nika102 (B). . В естественных изображений была выполнена до (0 ч) и 6 ч после инъекции. Интенсивности сигналов отображаются в виде лучистой эффективности (P / сек / см 2 / Sr) / (мкВт / см 2).
Рисунок 3:Экс естественных FACS-анализ клеточных связанное антитело конструкций из опухолевых клеток суспензии. (A) Память стратегия FACS анализ опухолевых клеток. (B) Гистограммы отображения суммы внутривенно AF680-сопряженных нано- S + 16a и антител Nika102 специфически связывается с опухолевыми клетками в естественных условиях. Антиген-отрицательные опухоли отображаются в виде гистограмм и незаполненных антиген-положительных опухолей показаны в заполненных гистограмм.
Рисунок 4:. Экс естественных флуоресцентной микроскопии () Обзор флуоресцентной микроскопии целых антиген-положительных опухолевых криосрезов 6 ч после инъекции с + 16a 680 или Nika102 680. Сигнальные интенсивности в естественных условиях внутривенно вподверженном AF680-конъюгаты без каких-либо вторичной маркировки агентов отображаются красным цветом. Экс Vivo контрастно ядра отображаются синим цветом, а судов в зеленый цвет. Пунктирные линии показывают по внешним границам целых опухолей. (B) Крупный план флуоресцентной микроскопии антиген-положительных и антиген-негативных опухолей.
Discussion
Мы использовали в ближнем инфракрасном диапазоне меченный флюорофором нанотела и обычные моноклональные антитела, направленные против той же цели на клетках лимфомы для смешанных сравнения в естественных условиях, и экс виво анализ. Мы показали, что нанотела хорошо подходят в качестве диагностических средств для оперативного и конкретного обнаружения в естественных условиях лимфом.
В естественных условиях, S + 16a 680 позволило быстро и более конкретную обнаружение ARTC2-положительных ксенотрансплантатах. Помимо различной кинетикой для лучшей визуализации опухоли в живом организме, основным недостатком Nika102 680 был высокий сигнал от неспецифического ARTC2-отрицательных опухолей и неспецифических фоновых сигналов.
Экс естественных проточной цитометрии анализа дисперсных клеток из отсеченных опухолей не показали неспецифическое связывание с ARTC2-отрицательных клетках лимфомы инъекционных AF680-конъюгатов. Экс естественных флуоресценции показал, сильным и почти homogenПодразделения окрашивание клеток в ART2C-положительных опухолевых срезах в случае + 16a нано- сек, подтверждая, что нанотело удалось достичь даже отдаленные районы внутри опухоли после 6 ч. В отличие от этого, моноклональное антитело показали слабую и неоднородную окрашивание клеток в ARTC2-положительных опухолей после 6 ч. Лучшие результаты визуализации с обычным антителом может быть достигнуто после 24 ч или 48 ч (данные не показаны). Для того чтобы выполнить тщательное сравнение двух различных размеров конструкций, изображения в различные моменты времени (последовательно-томография) должна быть выполнена, чтобы определить оптимальный момент времени формирования изображения для каждой конструкции.
Как и в других предыдущих исследованиях, результаты, представленные здесь подчеркнуть, что в естественных условиях молекулярной визуализации с мечеными нанотел позволяет быстро и специфическую тот же день Опухоль изображений с высоким опухоли к фону отношений 12-15,17-19. Напротив, обычные антитела привести к снижению опухоли к фону отношений и неспецифических сигналов от противопехотныхGen-негативные опухоли в ранние сроки после инъекции из-за их медленным выведением из организма. Для того, чтобы получить оптимальные результаты работы с изображениями обычных антител, время визуализации указывает 24 ч или даже 48 ч после инъекции, как правило, необходимо. Эти данные согласуются с предыдущими исследованиями, которые показали, что обычные антитела с доказанным терапевтическим эффектом обладают ограниченными применение в молекулярной визуализации 17,19,26. Поэтому обычные антитела могут быть весьма подходит для использования в терапевтических целях в связи с их долгой полувыведения из плазмы, а нанотела довольно пригодны для целей визуализации из-за их быстрого выведения из обращения. Эти различия в связи с тем, что любой избыток небольших нанотел (15-17 кДа) быстро выводится через почки ликвидации, а избыток больших обычных антител (150 кДа) удерживается в обращении. Таким образом, основным преимуществом нанотел для молекулярной визуализации является низкая фоновый сигнал на ранних временных точек изображения regardlESS от введенной дозы. Это дает возможность получить изображение в тот же день и может быть переводимым в клинических условиях. Напротив, обычные антитела должны быть точно титровать, чтобы минимизировать неспецифические фоновые сигналы, при сохранении достаточно специфический сигнал от ткани-мишени (неопубликованные данные).
Одним из ограничений в естественных техники NIRF-изображений является низкая глубина проникновения, которые, как правило допускает только визуализацию подкожного, но не ортотопической модели опухоли. Однако это ограничение можно преодолеть в экспериментальных условиях на недавно разработанных томографических фотоакустическая методов, которые позволяют всего тела визуализации живых мышей 27. Другим ограничением методики NIRF-изображений является оценка дозы ткани по сравнению с радионуклидов-опосредованной визуализации. Тем не менее, нанотела может быть радиоактивным изотопом для позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) моделей ксенотрансплантатов и точной количественной оценкиTracer биораспределение. В самом деле, наши результаты NIRF-изображений в соответствии с недавнего исследования, что по сравнению нанотела и обычные антитела для ПЭТ. Авторы также пришли к выводу, что нанотела позволит в тот же день изображений с высоким опухоли к фону отношений 15.
Тем не менее, только маркировка конструкций антител с AF680 флуоресцентным красителем ближней инфракрасной области позволили нам всеобъемлющий в пробирке, в естественных условиях и экс естественных условиях ближней ИК-области сравнение изображений флуоресценции с помощью проточной цитометрии, флуоресцентная микроскопия, и NIRF-изображений. По этой причине, а потому, что это нерадиоактивное, очень чувствительна, недорогой, и использует сравнительно простой в производить целевые зонды, мы выступаем за использование метода NIRF-изображения для оценки новых антител конструкций в доклинической молекулярной визуализации.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана аспирантуру 'воспаление и регенерации "Совместного исследовательского центра 841 Немецкого исследовательского общества (Александр Ленц, Валентин Kunick, Уильям Fumey), Совместным научно-исследовательским центром 877 Немецкого исследовательского общества (Friedrich Koch-Nolte) , по Вернером Отто Фонда (Peter Bannas), по В. Сандер фонда (Питер Bannas Фридрих Кох-Nolte), а также Немецкого исследовательского (Martin TREPEL, Фридрих Haag и Фридриха Koch-Nolte). Мы благодарим университет онкологический центр Гамбург (UCCH) В Vivo оптических изображений основной комплекс и сотрудников в УКЭ для консультаций и их высокое качество обслуживания. Основной комплекс частично поддержана грантами от Deutsche Krebshilfe (немецкий помощи Рак).
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
AF680 protein labelling kit | Invitrogen | A20172 | |
Anti-CD16/CD32-antibody | BioXCell | BE0008 | |
Anti-CD31-antibody | Santa Cruz | sc-1506 | labeled with secondary antibody with AF488 |
Anti-CD45-antibody V450 | BD Biosciences | 560501 | |
AxioVision LE software | Zeiss | www.zeiss.com | |
Basement membrane matrix | BD Biosciences | 354234 | Alternative product can be used |
Cell strainer 70 µm | Corning | 431751 | Alternative product can be used |
Confocal microscope | Leica | www.leica-microsystems.com | Leica SP5 with the following lasers: He-Neon for AF680, Argon Laser for AF488, and a 405-Diode for DAPI |
DAPI | Molcular Probes | D1306 | |
DC27.10 cells | laboratory specific | Other cells with different surface targets can be used | |
DPBS | Sigma Aldrich | D8662 | |
FACS Canto II | BD Biosciences | www.bdbiosciences.com | |
Flourescence mircoscope | Zeiss | www.zeiss.com | Zeiss Axiovert 200 with Filter Set #32 for AF680: 000000-1031-354 |
ImageJ software | NIH | http://imagej.nih.gov/ij/ | |
IVIS 200 | Perkin Elmer | www.perkinelmer.com | Alternative in vivo imaging system can be used |
Leica LAS software | Leica | www.leica-microsystems.com | Software specific to microscope used |
Living Image software | Perkin Elmer | www.perkinelmer.com | Software specific to imaging system used |
Needles 30 G | BD Biosciences | 305128 | Alternative product can be used |
Nika102-antibody AF680 | laboratory specific | Other antibodies against different surface targets can be used | |
Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | Potential hazards: carcinogenic, can irritate the eyes and skin, contact may cause drying of the skin and/or allergic dermatitis |
s+16a-nanobody AF680 | laboratory specific | Other antibodies against different surface targets can be used | |
Syringes 1 ml | Braun | 916 1406 V | Alternative product can be used |
References
- Koch-Nolte, F., et al. Single domain antibodies from llama effectively and specifically block T cell ecto-ADP-ribosyltransferase ART2.2 in vivo. FASEB J. 21, 3490-3498 (2007).
- Koch-Nolte, F., et al. A new monoclonal antibody detects a developmentally regulated mouse ecto-ADP-ribosyltransferase on T cells: subset distribution, inbred strain variation, and modulation upon T cell activation. J Immunol. 163, 6014-6022 (1999).
- Koch-Nolte, F., et al. Use of genetic immunization to raise antibodies recognizing toxin-related cell surface ADP-ribosyltransferases in native conformation. Cell Immunol. 236, 66-71 (2005).
- Bannas, P., et al. Activity and specificity of toxin-related mouse T cell ecto-ADP-ribosyltransferase ART2.2 depends on its association with lipid rafts. Blood. 105, 3663-3670 (2005).
- Bannas, P., et al. Quantitative magnetic resonance imaging of enzyme activity on the cell surface: in vitro and in vivo monitoring of ADP-ribosyltransferase 2 on T cells. Mol Imaging. 9, 211-222 (2010).
- Bannas, P., et al. Transgenic overexpression of toxin-related ecto-ADP-ribosyltransferase ART2.2 sensitizes T cells but not B cells to NAD-induced cell death. Mol Immunol. 48, 1762-1770 (2011).
- Hottiger, M. O., Hassa, P. O., Luscher, B., Schuler, H., Koch-Nolte, F. Toward a unified nomenclature for mammalian ADP-ribosyltransferases. Trends Biochem Sci. 35, 208-219 (2010).
- Bannas, P., et al. In vivo near-infrared fluorescence targeting of T cells: comparison of nanobodies and conventional monoclonal antibodies. Contrast Media Mol Imaging. 9, 135-142 (2014).
- Scheuplein, F., et al. NAD+ and ATP released from injured cells induce P2X7-dependent shedding of CD62L and externalization of phosphatidylserine by murine T cells. J Immunol. 182, 2898-2908 (2009).
- Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
- Wesolowski, J., et al. Single domain antibodies: promising experimental and therapeutic tools in infection and immunity. Med Microbiol Immunol. 198, 157-174 (2009).
- Vaneycken, I., et al. Preclinical screening of anti-HER2 nanobodies for molecular imaging of breast cancer. FASEB J. 25, 2433-2446 (2011).
- Xavier, C., et al. Synthesis, preclinical validation, dosimetry, and toxicity of 68Ga-NOTA-anti-HER2 Nanobodies for iPET imaging of HER2 receptor expression in cancer. J Nucl Med. 54, 776-784 (2013).
- Tchouate Gainkam, L. O., et al. Correlation Between Epidermal Growth Factor Receptor-Specific Nanobody Uptake and Tumor Burden: A Tool for Noninvasive Monitoring of Tumor Response to Therapy. Mol Imaging Biol. 13 (5), 940-948 (2011).
- Vosjan, M. J., et al. Facile labelling of an anti-epidermal growth factor receptor Nanobody with 68Ga via a novel bifunctional desferal chelate for immuno-PET. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 38, 753-763 (2011).
- Oliveira, S., Heukers, R., Sornkom, J., Kok, R. J., van Bergen En Henegouwen, P. M. Targeting tumors with nanobodies for cancer imaging and therapy. Journal Of Controlled Release. 172 (3), 607-617 (2013).
- Kijanka, M., et al. Rapid optical imaging of human breast tumour xenografts using anti-HER2 VHHs site-directly conjugated to IRDye 800CW for image-guided surgery. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 40, 1718-1729 (2013).
- Zaman, M. B., et al. Single-domain antibody bioconjugated near-IR quantum dots for targeted cellular imaging of pancreatic cancer. J Nanosci Nanotechnol. 11, 3757-3763 (2011).
- Oliveira, S., et al. Rapid visualization of human tumor xenografts through optical imaging with a near-infrared fluorescent anti-epidermal growth factor receptor nanobody. Mol Imaging. 11, 33-46 (2012).
- Gainkam, L. O., et al. Comparison of the biodistribution and tumor targeting of two 99mTc-labeled anti-EGFR nanobodies in mice, using pinhole SPECT/micro-CT. J Nucl Med. 49, 788-795 (2008).
- Chakravarty, R., Goel, S., Cai, W. Nanobody: the 'magic bullet' for molecular imaging. Theranostics. 4, 386-398 (2014).
- Siontorou, C. G. Nanobodies as novel agents for disease diagnosis and therapy. International journal of nanomedicine. 8, 4215-4227 (2013).
- Kaur, S., et al. Recent trends in antibody-based oncologic imaging. Cancer Lett. 315, 97-111 (2012).
- Lammers, T., Kiessling, F., Hennink, W. E., Storm, G. Drug targeting to tumors: principles, pitfalls and (pre-) clinical progress. Journal Of Controlled Release. 161, 175-187 (2012).
- Jain, R. K., Stylianopoulos, T. Delivering nanomedicine to solid tumors. Nature reviews. Clinical Oncology. 7, 653-664 (2010).
- Lisy, M. R., et al. In vivo near-infrared fluorescence imaging of carcinoembryonic antigen-expressing tumor cells in mice. Radiology. 247, 779-787 (2008).
- Herzog, E., et al. Optical imaging of cancer heterogeneity with multispectral optoacoustic tomography. Radiology. 263, 461-468 (2012).