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Medicine

Nanobody और एंटीबॉडी के आधार के मान्यकरण Published: April 6, 2015 doi: 10.3791/52462
Automatic Translation
*1, *1,2, 1,2, 1,2, 2, 1,2, 2, 3, 4, 1, 2
1Department of Diagnostic and Interventional Radiology, University Medical Center, Hamburg, 2Institute of Immunology, University Medical Center, Hamburg, 3University Cancer Center Hamburg, University Medical Center, Hamburg, 4Department of Oncology and Hematology, University Medical Center, Hamburg
* These authors contributed equally

Introduction

वर्तमान रिपोर्ट में, हम पूर्व vivo विच्छेदित xenograft ट्यूमर के प्रवाह cytometry और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके इन विवो xenograft इमेजिंग प्रयोगों के सत्यापन के लिए लगभग अवरक्त फ्लोरोफोरे में लेबल जांच के कार्यान्वयन का वर्णन है। हम एक डोमेन nanobody (एस + 16A, 17 केडीए) एक और vivo में विशिष्ट के लिए एक ही लक्ष्य प्रतिजन के लिए निर्देशित एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (Nika102, 150 केडीए) 2,3 तुलना अवरक्त के पास एक लिंफोमा xenograft मॉडल में प्रतिदीप्ति इमेजिंग। लक्ष्य प्रतिजन ADP-ribosyltransferase ARTC2.2 लिंफोमा कोशिकाओं 4-9 से एक जीपीआई-लंगर कोशिका की सतह Ecto-एंजाइम के रूप में व्यक्त किया जाता है।

Camelid से निकाली गई Nanobodies भारी चेन केवल एंटीबॉडी सबसे छोटी उपलब्ध प्रतिजन बाध्यकारी टुकड़े 10,11 हैं। केवल ~ 15 केडीए के साथ, इन छोटे एंटीबॉडी टुकड़े, घुलनशील बहुत स्थिर रहे हैं और renally परिसंचरण 8,10 से मंजूरी दे दी है। टीhese गुण विवो 12-20 में ट्यूमर एंटीजन के विशिष्ट और कुशल लक्ष्यीकरण के लिए उन्हें विशेष रूप से अनुकूल बनाते हैं। उपलब्ध nanobodies की आम प्रतिजन लक्ष्य (EGFR1 या उसके -1), मानव epidermal वृद्धि कारक टाइप 2 (उसे-2 या CD340), एंटीजन (सीईए) और नाड़ी कोशिका आसंजन अणु-1 (Vcam-एक epidermal वृद्धि कारक रिसेप्टर हैं ) 21। Nanobody conjugates के भड़काऊ रोगों 22 के कैंसर प्रतिरक्षा चिकित्सा और उपचार के लिए होनहार उपकरण हैं।

हाल के अध्ययनों से उच्च ट्यूमर करने वाली पृष्ठभूमि (टी / बी) में विवो आणविक इमेजिंग अनुप्रयोगों 8,17,19 में पारंपरिक एंटीबॉडी से -ratios nanobodies अनुमति देते हैं कि पता चला है। इस गैर-लक्षित ऊतकों 23 में पारंपरिक एंटीबॉडी, प्रचलन से धीमी गति से निकासी, और लंबे समय तक बनाए रखने के अपेक्षाकृत गरीब और धीमी गति से ऊतक पैठ द्वारा मुख्य रूप से समझाया गया है। इसके अलावा, पारंपरिक एंटीबॉडी के अतिरिक्त गैर विशिष्ट संचय मैं करने के लिए सुरागबढ़ाया पारगम्यता और प्रतिधारण (EPR) की वजह से एन लक्ष्य प्रतिजन नकारात्मक ट्यूमर 24,25 प्रभाव। इस पारंपरिक एंटीबॉडी की अधिक मात्रा इस प्रकार अधिकतम प्राप्त ट्यूमर करने वाली पृष्ठभूमि अनुपात को कम करने, विशिष्ट संकेतों लेकिन यह भी अविशिष्ट संकेतों को न केवल वृद्धि हो सकती है कि इसका मतलब है। इसके विपरीत, nanobodies की खुराक में वृद्धि नहीं बल्कि सामान्य ऊतक या प्रतिजन नकारात्मक ट्यूमर (अप्रकाशित डेटा) के प्रतिजन पॉजिटिव ट्यूमर के संकेत बढ़ जाती है।

Nanobodies और पारंपरिक एंटीबॉडी की तुलना से परे है, हम कारण EPR प्रभाव के लिए विशिष्ट और nonspecific संकेतों के प्रत्यक्ष तुलना के लिए एक ही चूहों में प्रतिजन सकारात्मक और -negative xenografts की एक intraindividual आकलन रूपरेखा। लगभग अवरक्त फ्लोरोफोरे संयुग्मित जांच में अमेरिका, लगभग अवरक्त प्रतिदीप्ति इमेजिंग का उपयोग vivo और पूर्व vivo में एक भी जांच का फायदा उठाने के प्रवाह cytometry, और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी की अनुमति दी। हमारे प्रोटोकॉल को लागू करने के लिए गैर की अनुमति देता हैऐसे विशिष्ट ट्यूमर लक्षित करने के लिए नई एंटीबॉडी निर्माणों के मूल्यांकन के रूप में विवो आणविक इमेजिंग प्रयोगों की, रेडियोधर्मी अत्यधिक संवेदनशील है, और सस्ती अनुकूलन।

इस ट्यूटोरियल अध्ययन का उद्देश्य पूर्व नैदानिक ​​आणविक इमेजिंग में नई एंटीबॉडी निर्माणों के मूल्यांकन के लिए NIRF-इमेजिंग के उपयोग पर प्रकाश डाला है।

इस प्रोटोकॉल में, सभी प्रयोगों एक छोटे पशु NIRF-इमेजिंग प्रणाली के साथ प्रदर्शन कर रहे थे, एक प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल सॉर्टर (FACS) कोशिकामापी प्रवाह है, और एक confocal खुर्दबीन।

Protocol

नोट: प्रयोगों जानवरों के नैतिक उपयोग पर अंतरराष्ट्रीय दिशा निर्देशों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया और विश्वविद्यालय के मेडिकल सेंटर, हैम्बर्ग की स्थानीय पशु कल्याण आयोग द्वारा अनुमोदित किया गया।

ट्यूमर कोशिकाओं, चूहे, और एंटीबॉडी constructs के 1. तैयारी

  1. लिंफोमा कोशिकाओं की तैयारी और तहखाने मैट्रिक्स की aliquoting (Matrigel)।
    1. ट्यूमर कोशिकाओं के इंजेक्शन से पहले दिन एक निष्फल टिप बॉक्स (1000 μl सुझावों) और -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में उपयुक्त पिपेट डाल दिया।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज हे / एन में बर्फ पर तहखाने मैट्रिक्स के साथ बोतल गला लें।
    3. इंजेक्शन के दिन पर एक बर्फ बाल्टी भरने और पिपेट, सुझावों के साथ साथ तहखाने मैट्रिक्स जगह है, और बर्फ पर 30 जी सुइयों के साथ एक मिलीलीटर सीरिंज।
    4. 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में RPMI माध्यम के 100 μl की एक मात्रा में विभाज्य लिंफोमा कोशिकाओं और तहखाने मैट्रिक्स के 100 μl के साथ सावधानी से मिश्रण। पूर्व ठंडा में ड्रासीरिंज और इंजेक्शन जब तक बर्फ पर डाल दिया।
      नोट: अच्छा बाँझ तकनीक का प्रयोग करें और बर्फ पर तहखाने मैट्रिक्स के clogging रोकने के लिए पूरे समय काम करने के लिए।
  2. चूहे की तैयारी
    1. 8-10 सप्ताह पुरानी athymic नग्न चूहों (NMRI- Foxn1 एन यू) का प्रयोग करें।
    2. आंत के autofluorescence पूर्व vivo इमेजिंग के लिए एक सप्ताह के लिए एक अल्फला मुक्त आहार पर चूहों रखने को कम करने के लिए।
    3. लिंफोमा के इंजेक्शन के लिए कोशिकाओं को एक प्रेरण कक्ष में 2% isoflurane के साथ लागू करने के लिए चूहों anesthetize। एक isofluorane कई गुना का उपयोग कर प्रक्रिया की अवधि के लिए 1-2 isoflurane% बनाए रखें।
    4. कंधे flanks में subcutaneously लिंफोमा कोशिकाओं इंजेक्षन। प्रत्यक्ष इंट्रा-व्यक्ति तुलना के लिए क्रमश: सही और बाईं ओर प्रतिजन सकारात्मक और प्रतिजन नकारात्मक कोशिकाओं इंजेक्षन।
      1. माउस की त्वचा चुटकी और माउस के शरीर से दूर खींचने के लिए एक अंगूठे और तर्जनी का प्रयोग करें। धीरे-धीरे और समान रूप में इंजेक्षनत्वचा के नीचे कोशिकाओं की एक एकल क्लस्टर बनाने उंगलियों के द्वारा बनाई गई पाउच,। तहखाने मैट्रिक्स जगह में इंजेक्शन कोशिकाओं रखने में मदद करता है।
  3. एंटीबॉडी constructs की तैयारी
    1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार फ्लोरोसेंट रंजक AlexaFluor-680 (AF680) (उत्तेजना तरंगदैर्ध्य = 679 एनएम, उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य = 702 एनएम) के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रोटीन लेबलिंग किट के साथ मोनोक्लोनल एंटीबॉडी और एकल डोमेन nanobodies लेबल। 15,720 मोल -1 सेमी -1 और 203,000 मोल -1 सेमी -1, क्रमशः की दाढ़ विलुप्त होने के गुणांक का उपयोग कर nanobody और पारंपरिक एंटीबॉडी प्रति रंगों की संख्या की गणना। एसडीएस पृष्ठ आकार विभाजन और Coomassie खूब नीला दाग से एंटीबॉडी निर्माणों की शुद्धता का आकलन करें।
    2. वास्तविक इमेजिंग अध्ययन से पहले इन विट्रो प्रयोगों की एक श्रृंखला का आयोजन द्वारा लेबल conjugates की विशिष्टता सुनिश्चित करें। लेबल वाले एक की विशिष्टता टेस्टtibody अवरुद्ध अध्ययन के माध्यम से इन विट्रो में constructs और unspecific निर्धारण 8,20 नियंत्रित करता है।
      नोट: चरण में प्रतिजन नकारात्मक और प्रतिजन पॉजिटिव कोशिकाओं (या विभिन्न कोशिकाओं लाइनों) के लिए 1.2.4 सेल नंबर विभिन्न विकास दर के अनुसार अनुकूलित किया जा सकता है। इन प्रयोगों के लिए, 0.5x10 6 DC27.10 ARTC2 नकारात्मक और 1.5x10 6 DC27.10 ARTC2 सकारात्मक कोशिकाओं समान आकार के ट्यूमर प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया। कदम 1.3.1 में fluorophores के साथ एंटीबॉडी जांच की लेबलिंग और लेबलिंग प्रभावकारिता की प्रक्रिया का इस्तेमाल किया लेबलिंग किट से भिन्न हो सकती है।

2. vivo इमेजिंग में

  1. 50 माइक्रोग्राम प्रति 2 के साथ रंगों / अणु: ट्यूमर व्यास में ~ 8 मिमी तक पहुँच जाने पर 7-9 दिनों के बाद, AlexaFluor680 के 50 माइक्रोग्राम प्रति नसों माउस की पूंछ नस (एमएबी-AF680 में 200 μl खारा की एक मात्रा में एंटीबॉडी निर्माणों में लेबल इंजेक्षन ≈ ~ 4 ^ 14 fluorochromes ≈ ~ 0.8 माइक्रोग्राम प्रति fluorochromes; Nanobody-AF680: 50 μ0.3 रंगों के साथ जी / अणु ≈ ~ 5.6 ^ 14 fluorochromes ≈ ~ 1.1 माइक्रोग्राम प्रति fluorochromes)।
  2. इमेजिंग प्रणाली को आरंभ और 3 isoflurane% इमेजिंग के लिए पहले प्रेरण कक्ष में एक XGI-8 संज्ञाहरण प्रणाली का उपयोग करने के साथ लागू करने के लिए चूहों anesthetize। इमेजिंग कक्ष में रखे isoflurane के कई गुना का उपयोग कर इमेजिंग प्रक्रिया की अवधि के लिए 1-2 isoflurane% बनाए रखें।
    1. कैमरे की ओर निर्देशित ट्यूमर के साथ गरम इमेजिंग मंच पर स्थिति चूहों। पैर के अंगूठे या जानवर की पूंछ pinching द्वारा उचित anesthetization निगरानी के लिए; जानवर के किसी भी प्रतिक्रिया संज्ञाहरण भी प्रकाश है कि इंगित करता है।
    2. श्वसन की दर को मॉनिटर; संज्ञाहरण श्वसन दर में वृद्धि हुई है, तो भी प्रकाश और भी गहरी श्वसन दर में कमी आई है, तो गहरी या अनियमित है। संज्ञाहरण के तहत जबकि सूखापन को रोकने के लिए एक आँख मरहम के साथ जानवर की कॉर्निया को सुरक्षित रखें।
  3. उत्तेजना के लिए 615-665 एनएम, emissio के लिए 695-770 एनएम के फ्लोरोसेंट फिल्टर सेट चुनेंएन, और एक 51 2x 512 पिक्सेल मैट्रिक्स के आकार के साथ पृष्ठभूमि घटाव के लिए 580-610 एनएम उत्तेजना। मध्यम करने के लिए ऑटो के लिए जोखिम समय, पिक्सेल binning सेट और एफ / 2 के लिए बंद करो।
    नोट: कम जोखिम गुना तेजी से फ्रेम दर सक्षम; अब जोखिम गुना अधिक संवेदनशीलता प्रदान करते हैं। Binning सीसीडी कैमरे पर पिक्सेल आकार नियंत्रित करता है। Binning बढ़ाने पिक्सेल आकार, संवेदनशीलता, और फ्रेम दर बढ़ जाती है, लेकिन स्थानिक संकल्प कम कर देता है। एफ / स्टॉप कैमरे के लेंस एपर्चर के आकार सेट। एपर्चर आकार का पता चला प्रकाश की मात्रा और सेटिंग्स डिवाइस और प्रयोगात्मक सेट अप इमेजिंग से अलग कर सकते हैं कि field.Note की गहराई को नियंत्रित करता है। इष्टतम परिणामों के लिए निर्माता की पुस्तिका से परामर्श करें।
    1. इमेजिंग सॉफ्टवेयर का अनुकूलन जोखिम समय में, एफ / बंद करो और पिक्सेल binning सेल लाइन की अभिव्यक्ति के स्तर के आधार पर। मात्रात्मक परिणाम को प्रभावित किए बिना एक प्रयोग के दौरान किसी भी समय इन सेटिंग बदलें। वैकल्पिक रूप से, इमेजिंग जादूगर सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से निर्धारणपैरामीटर।
  4. छवि इंजेक्शन से पहले चूहों और एंटीबॉडी निर्माणों के इंजेक्शन के बाद 6 घंटा।
    नोट: लेबलिंग प्रभावकारिता इष्टतम इमेजिंग परिणामों के लिए आवश्यक आवश्यक खुराक प्रभावित कर सकता है। इष्टतम इमेजिंग परिणामों के लिए आवश्यक एंटीबॉडी का निर्माण इसलिए राशि empirically निर्धारित किया जाना है। यह लेबलिंग प्रभावकारिता और आकार का निर्माण के रूप में अच्छी तरह से ट्यूमर मॉडल और लक्ष्य प्रतिजन अभिव्यक्ति के आधार पर भिन्न हो सकते हैं।

3. संचय और ट्यूमर की तैयारी

  1. एक बर्फ बाल्टी भरने और 4%, paraformaldehyde (पीएफए) फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) / protease अवरोध करनेवाला (AEBSF) और बर्फ पर पीबीएस / 0.2% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) रखें।
  2. इमेजिंग सत्र के समाप्त होने के बाद, 4% isoflurane की एकाग्रता में वृद्धि। पशु साँस लेने में रहता है के बाद, इमेजिंग मंच से इसे हटाने और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था प्रदर्शन करते हैं।
  3. माउंट एक स्टायरोफोम ब्लॉक पर माउस और 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे।
  4. इस्तेमाल की कैंचीs और संदंश बाहरी त्वचा में कटौती और ट्यूमर को बेनकाब करने के लिए सावधानी से इसे वापस खींचने के लिए। ट्यूमर के ऊतक बरकरार है सुनिश्चित करने के लिए स्केलपेल के साथ ट्यूमर को निकाल दें।
  5. एक स्केलपेल का उपयोग कर आधे में कटौती ट्यूमर। पीबीएस / FACS के लिए AEBSF विश्लेषण करती है और immunohistochemistry के लिए 4% पीएफए ​​के साथ एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में अन्य आधे के साथ एक संग्रह ट्यूब में एक आधा रखें।
  6. Immunohistochemistry के लिए तैयारी
    1. 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर फ्रिज में 4% पीएफए ​​में ट्यूमर रखें। पीबीएस / 30% sucrose के साथ एक ट्यूब के लिए ट्यूमर स्थानांतरण और ट्यूब के नीचे करने के ट्यूमर डूब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर फ्रिज में रखें।
    2. Cryomolds के लिए उपयुक्त टुकड़ों में ट्यूमर काटें। Cryomolds में ट्यूमर रखो और ट्यूमर कवर कर रहे हैं इतना है कि अक्टूबर परिसर के साथ भरें।
    3. सूखी बर्फ पर नए साँचे रखो और परिसर पूरी तरह से जमे हुए है जब तक प्रतीक्षा करें। जमे हुए ट्यूमर -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्थानांतरण और immunohistochemistry के लिए दुकान।
    4. कट एक सूक्ष्म साथ 8 माइक्रोन के वर्गों में ट्यूमर जमे हुए। मानक immunohisto का प्रयोग करेंरसायन शास्त्र प्रोटोकॉल नाभिक कल्पना करने के लिए रक्त वाहिकाओं और diamidino-phenylindole (DAPI) कल्पना करने के लिए CD31-AF488 के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दाग।
      नोट: वे पहले से ही fluorescently लेबल एंटीबॉडी होते ही ट्यूमर वर्गों प्रकाश में बहुत संवेदनशील होते हैं। जितना संभव हो उतना हल्का करने के लिए जोखिम को कम।
  7. FACS विश्लेषण के लिए तैयारी
    1. बर्फ पर पेट्री डिश प्लेस और एक 2.0 मिलीलीटर सिरिंज से सवार को हटा दें। सेल झरनी में ट्यूमर रखो और एक स्केलपेल का उपयोग 3-4 टुकड़ों में धीरे यह कटौती। पेट्री डिश में प्रारंभिक पीबीएस डालो और सेल झरनी के भीतर ट्यूमर मैश सवार के फ्लैट अंत का उपयोग करें।
    2. एक 10 मिलीलीटर विंदुक के साथ सभी कोशिकाओं को धोने के लिए प्रारंभिक पीबीएस के साथ सेल झरनी फ्लश। 5 मिनट के लिए 500 XG पर एक नया ट्यूब और स्पिन में सेल निलंबन स्थानांतरण। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 10 मिलीलीटर पीबीएस / 0.2% BSA में कोशिकाओं resuspend। कोशिकाओं की गणना।
    3. एक 5 मिलीलीटर FACS ट्यूब में विभाज्य 1-5 एक्स 10 6 लिंफोमा कोशिकाओं। फिर से स्पिन कोशिकाओं (500XG), 100 μl पीबीएस / 0.2% BSA में सतह पर तैरनेवाला और resuspend त्यागें।
    4. वैकल्पिक रूप से, का उपयोग करते हुए ब्लॉक FCR एक विरोधी CD16 / 10 मिनट के लिए बर्फ पर FcγR को बांधता है कि CD32-mAb (FcgR3 / 2)। पीबीएस के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें / 0.2% बीएसए।
    5. अन्य कोशिकाओं से ल्यूकोसाइट भेदभाव करने के लिए विरोधी CD45-mAb जोड़ें। पीबीएस / 0.2% BSA के साथ दो washes के द्वारा पीछा अंधेरे में बर्फ पर 20 मिनट के लिए सेते हैं।
    6. राइट propidium आयोडाइड के साथ FACS विश्लेषण दाग से पहले बर्फ पर 15 मिनट सादे पीबीएस के साथ दो washes के द्वारा पीछा मृत कोशिकाओं, विचार करने के लिए। FACS विश्लेषण के लिए 150 μl में resuspend।
      नोट: चरण 3.7.4 और कदम 3.7.5 अन्य एंटीबॉडी में ट्यूमर इकाई के आधार पर किया जा सकता है।

4. FACS विश्लेषण

  1. CD45 सकारात्मक कोशिकाओं के लिए gating, और प्रतिजन पॉजिटिव कोशिकाओं के लिए gating, बड़े बिखराव, नक़ल भेदभाव, मृत कोशिकाओं के बहिष्कार के रूप में फाटक के लिए ब्याज की आबादी gating के उपकरणों की एक श्रृंखला का उपयोग करें।
    1. सबसे पहले, गेट बाहर सेलएक दो पैरामीटर साजिश का उपयोग कर पक्ष तितर बितर (एसएससी-ए) बनाम एक आगे तितर बितर (FSC-ए) में मलबे। अगला त्यागें सेल दोहरी। अंत में, गेट बाहर गैर (CD45) CD45-प्रतिजन सकारात्मक और मृत / कोशिकाओं मर (एलडी - लाइव / मृत दाग)।
  2. सभी प्रयोगों के लिए एक ही टेम्पलेट का उपयोग कर रिकॉर्ड नमूने हैं।
    नोट: हार्डवेयर और विश्लेषणात्मक सॉफ्टवेयर के उपयोग के संबंध में तकनीकी सलाह के लिए निर्माता प्रोटोकॉल का संदर्भ लें।

5. सूक्ष्म विश्लेषण

  1. एक तेल विसर्जन लेंस (40x उद्देश्य) के साथ एक confocal खुर्दबीन का उपयोग दाग ट्यूमर cryosections का विश्लेषण करें। AF680 के एक वह नियॉन 633 एनएम लेजर उत्तेजना, AF488 के लिए एक आर्गन लेजर, और DAPI के लिए एक 405-डायोड का प्रयोग करें।
  2. माइक्रोस्कोप के साथ संगत सॉफ्टवेयर का उपयोग कच्चे छवि डेटा की प्रक्रिया। पृष्ठभूमि-सुधार और शोर यदि आवश्यक हो तो छान प्रदर्शन करते हैं। इस तरह, सेक्शनिंग फसल के रूप में भी चमक और विपरीत समायोजन के रूप में अतिरिक्त छवि समायोजन प्रदर्शन करते हैं।
    1. अंत में जीईसभी का पता लगाने चैनलों से एक समग्र ओवरले छवि nerate। अलग-अलग परतों की चमक और विपरीत समायोजित करें। समग्र चित्र कोशिकाओं (हरा AF488-दाग,) (DAPI के दाग, नीला), लेबल एंटीबॉडी निर्माणों (लाल AF680-दाग,) और रक्त वाहिकाओं के वितरण के स्थानीयकरण दिखाएगा।

Vivo इमेजिंग विश्लेषण में 6.

  1. इमेजिंग सॉफ्टवेयर में ओपन छवि फ़ाइलें और प्रतिदीप्ति छवि डेटा के साथ तस्वीर छवि डेटा के संयोजन के द्वारा एक उपरिशायी छवि बनाने के लिए। विशिष्ट फ्लोरोसेंट संकेत से ऊतक autofluorescence पृष्ठभूमि संकेत को हटाने के द्वारा छवि प्रदर्शन का अनुकूलन। इस दरियाफ्त के लिए विशिष्ट सेट फिल्टर के साथ प्राप्त कर लिया छवि से सेट एक पृष्ठभूमि फिल्टर के साथ प्राप्त कर लिया छवि को घटाकर द्वारा किया जा सकता है।
  2. प्रतिजन पॉजिटिव ट्यूमर और प्रतिजन नकारात्मक ट्यूमर के आसपास ब्याज (आरओआई) के समान परिपत्र माप क्षेत्रों ड्रा। पृष्ठभूमि संकेत तीव्रता का निर्धारण करने के लिए, एक परिपत्र आरओआई जगहप्रतिदीप्ति संकेत (जैसे, पैर हिंद) कम होने की उम्मीद है, जहां जानवर के एक क्षेत्र में।
    1. सभी समय बिंदुओं पर सभी जानवरों के लिए एक ही ROIs का प्रयोग करें। स्थिति के लिए, ट्यूमर मार्जिन की पहचान के लिए फोटो सफेद काले और छवियों का उपयोग करें।
  3. एक माप तालिका में प्रदर्शित आरओआई डेटा। आगे सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए फ्लोरोसेंट संकेतों के एक और मात्रात्मक तुलना में सक्षम बनाता है जो औसत उज्ज्वल दक्षता डेटा का उपयोग करें।
    1. प्रदर्शन और निरपेक्ष संकेत तीव्रता के रूप में डेटा की तुलना या लक्षित ऊतक और पृष्ठभूमि के ऊतकों से मापा आरओआई डेटा का उपयोग कर संकेत करने वाली पृष्ठभूमि अनुपात की गणना। पिछले अंग से निर्धारित पृष्ठभूमि मूल्य द्वारा ट्यूमर तेज मूल्य विभाजित करके ट्यूमर करने वाली पृष्ठभूमि अनुपात की गणना।
    2. नियंत्रण के रूप में, यह भी vivo में संकेतों की विशिष्टता का आकलन करने में लेबल निर्धारण नियंत्रण के साथ इंजेक्शन प्रतिजन नकारात्मक और प्रतिजन सकारात्मक एक ही पशुओं में ट्यूमर के रूप में अच्छी तरह से जानवरों का विश्लेषण।

Representative Results

Fluorescently लेबल जांच अलग NIRF-इमेजिंग तकनीक (चित्रा 1 ए) के संयोजन के लिए अनुमति देते हैं। हम vivo इमेजिंग (चित्रा 1 बी) में विशिष्ट के लिए fluorescently लेबल nanobodies और मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की तुलना करने के क्रम में, इन विवो NIRF-इमेजिंग प्रदर्शन प्रवाह cytometry, और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी क्रमिक रूप से करने के उद्देश्य से।

चूहे में vivo इमेजिंग के लिए fluorescently लेबल निर्माणों की विशिष्टता का मूल्यांकन करने के nanobody और मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के 50 माइक्रोग्राम प्रति इंजेक्शन के साथ किया गया। परिणाम इंजेक्शन के बाद 6 घंटा (चित्रा 2) में nanobody और मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ दोनों प्रतिजन पॉजिटिव ट्यूमर के विशिष्ट लेबलिंग से पता चला है। आरओआई मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के लिए ~ 6 की तुलना में nanobody के लिए एक बहुत अधिक टी / बी अनुपात ~ 12 दिखाया प्रतिजन पॉजिटिव ट्यूमर का विश्लेषण करती है। इसके अलावा, nanobody, जबकि प्रतिजन नकारात्मक ट्यूमर में कोई अविशिष्ट संकेत से पता चलामोनोक्लोनल एंटीबॉडी प्रतिजन नकारात्मक ट्यूमर में अविशिष्ट confounding संकेतों से पता चला है।

नकारात्मक ट्यूमर के अविशिष्ट संकेत इसके अलावा, मोनोक्लोनल एंटीबॉडी भी पूरे जानवर में अविशिष्ट पृष्ठभूमि संकेतों प्रेरित किया। इस वजह से renally उत्सर्जित होने के लिए भी बड़े हैं, जो अत्यधिक मुक्त परिसंचारी एंटीबॉडी, की संभावना है। उल्टे, nanobodies इंजेक्शन के साथ जानवरों केवल छोटे nanobodies के गुर्दे उन्मूलन की वजह से गुर्दे में अविशिष्ट संकेतों से पता चला है।

Cytometry, ट्यूमर सेल निलंबन का विश्लेषण प्रवाह इंजेक्शन के बाद AF680-conjugates के 6 घंटा दोनों के साथ प्रतिजन पॉजिटिव ट्यूमर कोशिकाओं के विशिष्ट लेबलिंग से पता चला है। मोनोक्लोनल एंटीबॉडी लेबल कोशिकाओं की तुलना में nanobody लेबल की कोशिकाओं के मजबूत प्रतिदीप्ति संकेत में विवो NIRF-इमेजिंग परिणामों को दर्शाता है। महत्वपूर्ण बात है, प्रवाह cytometric विश्लेषण दोनों में से किसी के साथ प्रतिजन नकारात्मक कोशिकाओं का कोई अविशिष्ट लेबलिंग है कि वहाँ से पता चलता हैनिर्माणों (चित्रा 3)।

ट्यूमर cryosections की प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी इंजेक्शन के बाद nanobody 6 घंटा साथ प्रतिजन पॉजिटिव कोशिकाओं के एक मजबूत और लगभग समरूप लेबलिंग से पता चला है। उल्टे, मोनोक्लोनल एंटीबॉडी एक बहुत कमजोर है और न inhomogeneous धुंधला (चित्रा -4 ए) दिखाया। प्रतिजन नकारात्मक ट्यूमर मध्य अंतरिक्ष (4B चित्रा) में पारंपरिक एंटीबॉडी शो अविशिष्ट बिखरे हुए धुंधला के साथ इंजेक्शन जबकि प्रतिजन नकारात्मक ट्यूमर, nanobody के इंजेक्शन के बाद कोई धुंधला 6 घंटा दिखा।

चित्र 1
चित्रा 1: Flourescence इमेजिंग और एंटीबॉडी निर्माणों। प्रवाह cytometry और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा पीछा में विवो NIRF-इमेजिंग: AF680-conjugates के मूल्यांकन के लिए (ए) इमेजिंग सेटअप। (ब

चित्र 2
चित्रा 2: में विवो NIRF-इमेजिंग की प्रतिदीप्ति संकेत की छवियाँ प्रतिजन सकारात्मक (+) और प्रतिजन नकारात्मक (-) nanobody एस + 16A (ए) और मोनोक्लोनल एंटीबॉडी Nika102 (बी) के साथ इंजेक्शन दिया गया है कि चूहों में ट्यूमर। । vivo इमेजिंग (0 एच) और इंजेक्शन के बाद 6 घंटे पहले प्रदर्शन किया था। सिग्नल तीव्रता उज्ज्वल दक्षता (पी / सेकंड / 2 सेमी / एस आर) / (μW / 2 सेमी) के रूप में प्रदर्शित कर रहे हैं।

चित्र तीन
चित्र तीन:FACS के लिए पूर्व vivo FACS के विश्लेषण के ट्यूमर सेल निलंबन से सेल बाध्य एंटीबॉडी निर्माणों की। (ए) Gating रणनीति ट्यूमर कोशिकाओं के विश्लेषण करती है। (बी) Histograms विशेष रूप से vivo में ट्यूमर कोशिकाओं के लिए बाध्य नसों के द्वारा इंजेक्शन के AF680 संयुग्मित nanobody एस + 16A और एंटीबॉडी Nika102 की राशि प्रदर्शित करते हैं। प्रतिजन नकारात्मक ट्यूमर भरे histograms और प्रतिजन पॉजिटिव ट्यूमर के रूप में प्रदर्शित कर रहे हैं भरा histograms के रूप में प्रदर्शित कर रहे हैं।

चित्रा 4
चित्रा 4:। 6 एच एस + 16A 680 या Nika102 680 के इंजेक्शन के बाद पूरे प्रतिजन पॉजिटिव ट्यूमर cryosections की पूर्व vivo प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (ए) अवलोकन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी। इन विवो नसों में की सिग्नल तीव्रताकिसी भी माध्यमिक लेबलिंग एजेंटों के बिना jected AF680-conjugates के लाल रंग में प्रदर्शित कर रहे हैं। पूर्व vivo counterstained नाभिक हरे रंग में नीले और जहाजों में प्रदर्शित कर रहे हैं। बिंदीदार लाइनों पूरे ट्यूमर के बाहरी मार्जिन संकेत मिलता है। (बी) के प्रतिजन सकारात्मक और प्रतिजन नकारात्मक ट्यूमर की क्लोज़-अप प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी।

Discussion

हम इन विवो और पूर्व vivo विश्लेषण के बहुविध तुलना के लिए लिंफोमा कोशिकाओं पर एक ही लक्ष्य के खिलाफ निर्देशित लगभग अवरक्त फ्लोरोफोरे में लेबल nanobodies और पारंपरिक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया। हम nanobodies अच्छी तरह से लिम्फोमा के तेजी से और विशिष्ट vivo में पता लगाने के लिए नैदानिक ​​उपकरण के रूप में उपयुक्त हैं कि पता चला है।

विवो में, + 16A 680 ARTC2 पॉजिटिव xenografts की एक तेजी से और अधिक विशिष्ट पहचान के लिए अनुमति दी है। इसके अलावा इन विवो में सबसे अच्छा ट्यूमर दृश्य के लिए अलग कैनेटीक्स से, Nika102 680 की बड़ी खामी ARTC2 नकारात्मक ट्यूमर और अविशिष्ट पृष्ठभूमि संकेतों से उच्च अविशिष्ट संकेत था।

विच्छेदित ट्यूमर इंजेक्ट AF680-conjugates की ARTC2 नकारात्मक लिंफोमा कोशिकाओं को कोई अविशिष्ट बंधन दिखाया से पूर्व vivo प्रवाह cytometric छितरी कोशिकाओं का विश्लेषण करती है। पूर्व vivo प्रतिदीप्ति लगभग homogen मजबूत पता चला है औरnanobody 6 घंटे के बाद ट्यूमर के भीतर भी दूरदराज के क्षेत्रों तक पहुँचने में सक्षम था कि इस बात की पुष्टि nanobody एस + 16A के मामले में ART2C पॉजिटिव ट्यूमर वर्गों में कोशिकाओं के ous धुंधला,। इसके विपरीत, मोनोक्लोनल एंटीबॉडी 6 घंटा बाद ARTC2 पॉजिटिव ट्यूमर में कोशिकाओं के कमजोर और inhomogeneous धुंधला दिखाया। पारंपरिक एंटीबॉडी के साथ बेहतर इमेजिंग परिणाम 24 घंटा या 48 घंटे के बाद हासिल किया जा सकता है (डेटा) नहीं दिखाया। दो अलग आकार निर्माणों की एक पूरी तरह से तुलना प्रदर्शन करने के लिए आदेश में, अलग अलग समय बिंदुओं (धारावाहिक-इमेजिंग) में इमेजिंग प्रत्येक निर्माण के लिए इष्टतम इमेजिंग समय बिंदु की पहचान करने के लिए किया जाना है।

अन्य पिछले अध्ययनों की तरह, यहां बताया परिणामों विवो में लेबल nanobodies साथ आणविक इमेजिंग उच्च ट्यूमर करने वाली पृष्ठभूमि अनुपात 12-15,17-19 के साथ तेजी से और विशिष्ट उसी दिन ट्यूमर इमेजिंग की अनुमति देता है कि जोर। उल्टे, पारंपरिक एंटीबॉडी कम ट्यूमर करने वाली पृष्ठभूमि अनुपात और विरोधी से अविशिष्ट संकेतों में परिणामकारण शरीर से उनकी धीमी गति से निकासी के लिए जल्दी इंजेक्शन के बाद जनरल नकारात्मक ट्यूमर। पारंपरिक एंटीबॉडी के साथ इष्टतम इमेजिंग परिणाम प्राप्त करने के लिए, इमेजिंग समय 24 घंटा या इंजेक्शन आमतौर पर आवश्यक हैं के बाद भी 48 घंटा बताते हैं। इन निष्कर्षों को सिद्ध चिकित्सीय लाभ के साथ पारंपरिक एंटीबॉडी आणविक इमेजिंग 17,19,26 में उपयोगिता सीमित है कि सुझाव दिया है कि पिछले अध्ययनों के साथ समझौते में हैं। Nanobodies कारण प्रचलन से उनके तेजी से निकासी के लिए इमेजिंग उद्देश्यों के लिए नहीं बल्कि अनुकूल हैं, जबकि इसलिए पारंपरिक एंटीबॉडी की वजह से उनकी लंबी प्लाज्मा आधा जीवन के लिए उपचारात्मक उद्देश्यों के लिए नहीं बल्कि उपयुक्त हो सकता है। इन मतभेदों को बड़ा पारंपरिक एंटीबॉडी (150 केडीए) से अधिक प्रचलन में बरकरार रखा गया है, जबकि छोटे nanobodies (15-17 केडीए) के किसी भी अधिक तेजी से गुर्दे उन्मूलन के माध्यम से मंजूरी दे दी है कि इस तथ्य के कारण हैं। तो आणविक इमेजिंग के लिए nanobodies के प्रमुख लाभ जल्दी इमेजिंग समय बिंदुओं पर कम पृष्ठभूमि संकेत है regardlइंजेक्शन की खुराक की ईएसएस। यह वही दिन इमेजिंग की अनुमति देता है और नैदानिक ​​सेटिंग। उल्टे करने के लिए अनुवाद किया जा सकता है, पारंपरिक एंटीबॉडी बिल्कुल लक्षित ऊतक (अप्रकाशित डेटा) से काफी विशिष्ट संकेत बनाए रखते हुए, अविशिष्ट पृष्ठभूमि संकेतों को कम से कम करने के लिए titrated किया जाना है।

इन विवो NIRF-इमेजिंग तकनीक की सीमाओं में से एक आम तौर पर नहीं बल्कि Orthotopic ट्यूमर मॉडल के चमड़े के नीचे का केवल इमेजिंग की अनुमति देता है जो कम प्रवेश गहराई है। हालांकि, इस सीमा चूहों 27 रहने के पूरे शरीर इमेजिंग की अनुमति है कि हाल ही में विकसित tomographic तस्वीर ध्वनिक तकनीक से एक प्रयोगात्मक सेटिंग में दूर किया जा सकता है। रेडियोन्यूक्लाइड की मध्यस्थता इमेजिंग की तुलना में NIRF-इमेजिंग तकनीक की एक और सीमा ऊतक खुराक का आकलन है। हालांकि, nanobodies xenograft मॉडल और की सटीक मात्रात्मक मूल्यांकन के पोजीट्रान एमिशन टोमोग्राफी (पीईटी) इमेजिंग के लिए radiolabelled किया जा सकता हैदरियाफ्त biodistribution। दरअसल, हमारे NIRF-इमेजिंग परिणाम nanobodies और पीईटी इमेजिंग के लिए पारंपरिक एंटीबॉडी की तुलना में है कि हाल के एक अध्ययन के अनुसार कर रहे हैं। लेखकों को भी nanobodies उच्च ट्यूमर करने वाली पृष्ठभूमि अनुपात 15 के साथ एक ही दिन इमेजिंग की अनुमति देते हैं कि इस निष्कर्ष पर आया था।

हालांकि, लगभग अवरक्त फ्लोरोसेंट रंजक AF680 के साथ एंटीबॉडी निर्माणों में से सिर्फ लेबलिंग विवो में, हमें इन विट्रो में व्यापक अनुमति दी है और पूर्व vivo लगभग अवरक्त प्रतिदीप्ति इमेजिंग तुलना, प्रवाह cytometry प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, और NIRF-इमेजिंग का उपयोग। यह nonradioactive सस्ती, अत्यधिक संवेदनशील है, और अपेक्षाकृत आसान करने के लिए उत्पादन लक्षित जांच का उपयोग करता है, क्योंकि इस कारण से, और, हम पूर्व नैदानिक ​​आणविक इमेजिंग में नई एंटीबॉडी निर्माणों के मूल्यांकन के लिए NIRF-इमेजिंग तकनीक के उपयोग की वकालत।

Acknowledgments

इस काम ड्यूश Forschungsgemeinschaft की सहयोगात्मक अनुसंधान केन्द्र 877 (फ्रेडरिक कोच-नोल्टे) से ग्रेजुएट स्कूल 'शोथ और उत्थान' ड्यूश Forschungsgemeinschaft की सहयोगात्मक अनुसंधान केन्द्र 841 (सिकंदर लेन्ज, वैलेन्टिन Kunick, विलियम Fumey) के द्वारा समर्थित किया गया , विल्हेम Sander फाउंडेशन द्वारा वर्नर ओटो फाउंडेशन (पीटर Bannas), (पीटर Bannas, फ्रेडरिक कोच-नोल्टे), द्वारा और ड्यूश Forschungsgemeinschaft (मार्टिन Trepel, फ्रेडरिक हाग और फ्रेडरिक कोच-नोल्टे) द्वारा। हम विवो ऑप्टिकल इमेजिंग कोर सुविधा और कर्मचारियों uke पर परामर्श के लिए और उनके उच्च गुणवत्ता सेवा में विश्वविद्यालय के कैंसर केंद्र हैम्बर्ग (UCCH) धन्यवाद। कोर सुविधा ड्यूश Krebshilfe (जर्मन कैंसर चिकित्सा) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AF680 protein labelling kit Invitrogen A20172
Anti-CD16/CD32-antibody BioXCell BE0008
Anti-CD31-antibody Santa Cruz sc-1506 labeled with secondary antibody with AF488
Anti-CD45-antibody V450 BD Biosciences 560501
AxioVision LE software Zeiss www.zeiss.com
Basement membrane matrix BD Biosciences 354234 Alternative product can be used
Cell strainer 70 µm Corning 431751 Alternative product can be used
Confocal microscope Leica  www.leica-microsystems.com Leica SP5 with the following lasers: He-Neon for AF680, Argon Laser for AF488, and a 405-Diode for DAPI
DAPI Molcular Probes D1306
DC27.10 cells  laboratory specific Other cells with different surface targets can be used
DPBS Sigma Aldrich D8662
FACS Canto II BD Biosciences www.bdbiosciences.com
Flourescence mircoscope Zeiss www.zeiss.com Zeiss Axiovert 200 with Filter Set #32 for AF680: 000000-1031-354
ImageJ software NIH http://imagej.nih.gov/ij/
IVIS 200 Perkin Elmer www.perkinelmer.com Alternative in vivo imaging system can be used
Leica LAS software Leica www.leica-microsystems.com Software specific to microscope used
Living Image software Perkin Elmer www.perkinelmer.com Software specific to imaging system used
Needles 30 G BD Biosciences 305128 Alternative product can be used
Nika102-antibody AF680 laboratory specific Other antibodies against different surface targets can be used
Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148 Potential hazards: carcinogenic, can irritate the eyes and skin, contact may cause drying of the skin and/or allergic dermatitis
s+16a-nanobody AF680 laboratory specific Other antibodies against different surface targets can be used
Syringes 1 ml Braun 916 1406 V Alternative product can be used

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References

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चिकित्सा अंक 98 Nanobody एंटीबॉडी VHH प्रतिदीप्ति इमेजिंग आणविक इमेजिंग xenograft पशु मॉडल
Nanobody और एंटीबॉडी के आधार के मान्यकरण<em&gt; Vivo</emचूहे में&gt; ट्यूमर xenograft NIRF-इमेजिंग प्रयोगों का प्रयोग<em&gt; पूर्व vivo</em&gt; फ्लो और माइक्रोस्कोपी
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Bannas, P., Lenz, A., Kunick, V.,… More

Bannas, P., Lenz, A., Kunick, V., Fumey, W., Rissiek, B., Schmid, J., Haag, F., Leingärtner, A., Trepel, M., Adam, G., Koch-Nolte, F. Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy. J. Vis. Exp. (98), e52462, doi:10.3791/52462 (2015).

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