Introduction
I denne rapporten beskriver vi gjennomføringen av nær-infrarøde fluoroformerket prober for validering av in vivo xenograft bildebehandling eksperimenter ved hjelp av ex vivo flowcytometri og fluorescens mikroskopi av de dissekerte xenografttumorer. Vi sammenligner et enkelt domene nanobody (s + 16a, 17 kDa) 1 og et monoklonalt antistoff (Nika102, 150 kDa) 2,3 rettet mot samme mål antigen for spesifikk in vivo nær-infrarøde fluorescens bildebehandling i en lymfom xenograft modell. Målantigenet ADP-ribosyltransferase ARTC2.2 uttrykkes som et GPI-forankret celleoverflate ecto-enzym ved lymfomceller 4-9.
Nanobodies avledet fra camelid tungkjede-antistoffer er bare de minste tilgjengelige antigenbindende fragmenter 10,11. Med bare ~ 15 kDa, disse små antistoffragmenter er løselig, veldig stabil og er nedsatt fjernet fra sirkulasjon 8,10. These egenskaper gjør dem spesielt egnet for spesifikke og effektiv målretting av tumorantigener in vivo 12-20. Vanlige antigen mål av tilgjengelige Nanobodies er den epidermale vekstfaktor-reseptor (EGFR1 eller HER-1), human epidermal vekstfaktor type 2 (HER-2 eller CD340), karsinoembryonalt antigen (CEA) og vaskulær celleadhesjonsmolekyl-1 (VCAM-1 ) 21. Nanobody konjugater er lovende verktøy for kreftimmunterapi og behandling av inflammatoriske sykdommer 22.
Nyere studier har vist at Nanobodies tillate høyere tumor-til-bakgrunn (T / B) -ratios enn konvensjonelle antistoffer i in vivo molekylavbildningsapplikasjoner 8,17,19. Dette forklares hovedsakelig av forholdsvis dårlig og treg vevspenetrasjon av konvensjonelle antistoffer, langsom klaring fra sirkulasjon, og lang oppholdstid i ikke-målrettede vev 23. Videre overskudd av konvensjonelle antistoffer fører til ikke-spesifikk akkumulering in target antigennegative svulster forårsaket av økt permeabilitet og oppbevaring (EPJ) effekt 24,25. Dette betyr at høyere doser av konvensjonelle antistoffer kan øke ikke bare bestemte signaler, men også ikke-spesifikke signaler, og dermed redusere den maksimale oppnåelige tumor-til-bakgrunnsforhold. I motsetning til dette, å øke dosen av Nanobodies øker signalene fra antigen-positive tumorer, men ikke fra normalt vev eller antigen-negative tumorer (upubliserte data).
Utover sammenligning av Nanobodies og konvensjonelle antistoffer, vi skissere en intra-individuell vurdering av antigen-positive og -negative xenotransplantater i samme mus for direkte sammenligning av spesifikke og ikke-spesifikke signaler på grunn av EPR virkning. De nær-infrarødt fluoroforpar konjugerte sonder tillatt oss å utnytte en enkelt sonde in vivo og ex vivo bruker nær-infrarødt fluorescens bildebehandling, flowcytometri, og fluorescens mikroskopi. Anvende våre protokoller tillater ikkeradioaktive, svært følsom, og billig optimalisering av in vivo molekylær avbildning eksperimenter slik som evaluering av nye antistoff konstruksjoner for spesifikk svulst målretting.
Målet med denne opplæringen studien er å synliggjøre bruken av NIRF-avbildning for evaluering av nye antistoff konstruksjoner i preklinisk molekylær avbildning.
I denne protokoll ble alle eksperimenter utført med en liten dyre NIRF-avbildningssystem, en fluorescens-aktivert cellesorterer (FACS) strømningscytometer og et konfokalt mikroskop.
Protocol
MERK: Forsøk ble utført i samsvar med internasjonale retningslinjer for etisk bruk av dyr, og ble godkjent av den lokale dyrevelferd provisjon ved University Medical Center, Hamburg.
1. Utarbeidelse av kreftceller, mus og Antistoff konstruerer
- Utarbeidelse av lymfom celler og alikvoteringsprosessen av Basement Matrix (Matrigel).
- Dagen før injeksjon av tumorceller sette en sterilisert spiss boks (1000 mL tips) og det passende pipette i -20 ° C fryser.
- Tine flasken med kjelleren matrise på isen i 4 ° C kjøleskap O / N.
- På dagen for injeksjon fylle en isen bøtte og plassere kjelleren matrise sammen med pipette, tips, og en ml sprøyter med 30 G nåler på is.
- Alikvoter lymfomceller i et volum på 100 pl av RPMI-medium i 1,5 ml mikrosentrifugerør og blandes omhyggelig med 100 ul av kjelleren matrise. Trekkes opp i pre-avkjøltesprøyter og lagt på is til injeksjon.
MERK: Bruk god steril teknikk og å arbeide på is hele tiden for å forhindre tilstopping av kjelleren matrise.
- Mus Forberedelse
- Bruk 8-10 ukers gammel atymiske nakne mus (NMRI- Foxn1 n u).
- For å redusere autofluorescens av tarmen holde mus på en alfalfa-fri diett i en uke før in vivo avbilding.
- For injeksjon av lymfom celler bedøve mus for å bevirke med 2% isofluran i en induksjonskammeret. Oppretthold 1-2% isofluran for varigheten av fremgangsmåten ved hjelp av en isofluorane manifold.
- Injiser lymfomceller subkutant i skulder flankene. For direkte intra-individuell sammenligning injisere antigen-positive og antigennegative celler på høyre og venstre side, henholdsvis.
- Bruk en tommel og pekefinger til å klype huden på musen og dra den bort fra kroppen av musen. Injisere langsomt og jevnt innposen er laget av fingrene, noe som skaper en enkelt klynge av celler under huden. Kjelleren matrise hjelper å holde injiserte celler på plass.
- Utarbeidelse av Antistoff konstruerer
- Merke monoklonale antistoffer og enkelt domene Nanobodies med en kommersielt tilgjengelig protein merking kit til den fluorescerende fargestoff AlexaFluor-680 (AF680) (eksitasjon bølgelengde = 679 nm, emisjon bølgelengde = 702 nm) i henhold til produsentens instruksjoner. Beregne antall fargestoffer per nanobody og konvensjonell antistoff ved hjelp av molare ekstinksjonskoeffisienter av 15720 mol -1 cm -1 og 203 000 mol -1 cm -1, henholdsvis. Vurdere renheten av antistoff konstruksjoner av SDS-PAGE størrelse fraksjonering og Coomassie strålende blå flekken.
- Sørge for spesifisiteten av de merkede konjugater ved å gjennomføre en serie av in vitro eksperimenter før de faktiske bildediagnostikk. Test spesifisitet av merket entibody konstruerer in vitro gjennom blokkerende studier og uspesifikke isotypen kontrollerer 8,20.
NB: I trinn 1.2.4 celle tall for antigen-negative og antigen-positive celler (eller ulike cellelinjer) kan måtte tilpasses etter ulike vekstrater. For disse eksperimentene ble 0.5x10 6 DC27.10 ARTC2 negativ og 1.5x10 6 DC27.10 ARTC2 positive celler brukes til å få svulster av tilsvarende størrelse. I trinn 1.3.1 prosessen for merking og merking effekt av antistoff-prober med fluoroforer, kan variere fra merkingssett som brukes.
2. In vivo avbildning
- Etter 7-9 dager, da tumorene nå ~ 8 mm i diameter, 50 injisere ug AlexaFluor680 merkede antistoffkonstruksjoner i et volum på 200 ul saltoppløsning intravenøst i halevenen til musen (mAb-AF680: 50 ug med to fargestoffer / molekyl ≈ ~ 4 ^ 14 fluorokromer ≈ ~ 0,8 mikrogram fluorokromer; Nanobody-AF680: 50 μg med 0,3 fargestoffer / molekyl ≈ ~ 5,6 ^ 14 fluorokromer ≈ ~ 1,1 mikrogram fluorokromer).
- Initialbildebehandlingssystemet og bedøve mus å gjennomføre med 3% isofluran ved hjelp av en XGI-8 anestesi system i induksjonskammeret før bildebehandling. Oppretthold 1-2% isofluran for varigheten av avbildningsprosedyren ved hjelp av isofluran manifold plassert i bilderommet.
- Posisjons mus på oppvarmet bildebehandling scenen med svulster rettet mot kameraet. Overvåke riktig anesthetization ved å klemme tå eller halen på dyret; en hvilken som helst reaksjon av dyret indikerer at anestesi er for lys.
- Overvåke åndedrett rate; anestesi er for lys hvis respirasjonsfrekvensen er økt og for dypt hvis respirasjonsfrekvensen er redusert, dyp eller uregelmessig. Beskytt dyrets hornhinner med et øye salve for å hindre tørrhet mens under narkose.
- Velg fluorescerende filter sett med 615-665 nm for eksitasjon, 695-770 nm for emission, og 580-610 nm eksitasjon for bakgrunnen subtraksjon med en 51 2x 512 pixel matrisestørrelse. Still eksponeringstiden til auto, pixel binning til medium og F / Stopp til 2.
MERK: Kortere eksponeringstider aktiver raskere bildefrekvens; lengre eksponeringstider gir større følsomhet. Binning styrer pikselstørrelse på CCD-kamera. Øke binning øker pikselstørrelse, følsomhet, og bildefrekvens, men reduserer romlig oppløsning. F / Stopp angir størrelsen på kameraet blenderåpning. Blenderstørrelse styrer mengden av lys oppdaget og dybden av field.Note at innstillingene kan variere fra bildeenheten og eksperimentell satt opp. Til produsentens manual for optimale resultater.- I bildebehandlingsprogrammer optimalisere eksponeringstid, F / stopp og pixel binning basert på uttrykket nivå av cellelinjen. Endre disse innstillingene når som helst i løpet av et eksperiment uten at det påvirker den kvantitative resultat. Alternativt, la programvaren Wizard Imaging automatisk bestemmeparametrene.
- Bilde mus før injeksjon og 6 timer etter injeksjon av antistoffkonstruksjoner.
MERK: Merkingen effekt kan påvirke den nødvendige dosen som trengs for optimal bilderesultater. Derfor er mengden av nødvendig antistoff-konstrukt for optimale avbildningsresultatene må bestemmes empirisk. Det kan variere avhengig av merking effekt og størrelsen på konstruksjonen, samt tumormodellen og target-antigen ekspresjon.
3. Høsting og klargjøring av Svulster
- Fyll en is bøtte og plassere 4% paraformaldehyd (PFA) fosfatbufret saltvann (PBS) / protease inhibitor (AEBSF) og PBS / 0,2% bovint serumalbumin (BSA) på is.
- Når avbildningssesjon er avsluttet, øker konsentrasjonen av isofluran til 4%. Etter dyr opphører å puste, fjerne den fra bilde scenen og utføre halshugging.
- Mount mus på en isoporblokk og spray med 70% etanol.
- Bruk sakss og tang for å klippe den ytre huden og dra den tilbake nøye for å avdekke svulster. Fjerne svulster med skalpell for å sikre svulstvev forblir intakt.
- Cut svulster i halv ved hjelp av en skalpell. Plasser en halvpart i et oppsamlingsrør med PBS / AEBSF for FACS-analyse og den andre halvparten i et 50 ml rør med 4% PFA for immunhistokjemi.
- Forberedelse for immunhistokjemi
- Hold svulster i 4% PFA i kjøleskapet ved 4 ° C i 24 timer. Overfør tumorer til en tube med PBS / 30% sukrose og holde i kjøleskap ved 4 ° C inntil de tumor synker til bunnen av røret.
- Skjær svulster i passende stykker for cryomolds. Sett svulster i cryomolds og fyll med oktober sammensatt slik at svulstene er dekket.
- Sett formene på tørris og vente til det sammensatte er helt frosset. Overføre frosne svulster til -80 ° C fryser og lagre for immunhistokjemi.
- Cut frosset svulster i deler av 8 mikrometer med en mikrotom. Bruk standard immunohistokjemi protokollen til å flekke med antistoff mot CD31-AF488 å visualisere blodårer og diamidino-phenylindole (DAPI) for å visualisere kjerner.
MERK: Tumor Snittene er svært følsomme for lys som de inneholder allerede fluorescensmerkede antistoffer. Minimer eksponering for lys så mye som mulig.
- Forberedelse for FACS analyse
- Plasser petriskål på is og fjerne stempelet fra en 2,0 ml sprøyte. Sett svulst i cellen sil og skjær den forsiktig inn 3-4 stykker ved hjelp av en skalpell. Hell den første PBS i petriskål og bruke den flate ende av stempelet for å mos svulsten innenfor cellefilter.
- Skyll cellefilter med den første PBS for å vaske ut alle cellene med en 10 ml pipette. Overfør cellesuspensjonen i et nytt rør og sentrifugering ved 500 xg i 5 min. Kast supernatanten og resuspender cellene i 10 ml PBS / 0,2% BSA. Telle celler.
- Alikvote 1-5 x 10 6 lymfom celler i en 5 ml FACS tube. Spin celler igjen (500xg), kast supernatanten og resuspender i 100 mL PBS / 0,2% BSA.
- Eventuelt blokk FcR ved hjelp av et anti-CD16 / CD32-mAb (FcgR3 / 2) som binder seg til FcγR på is i 10 min. Vask celler en gang med PBS / 0,2% BSA.
- Legg anti-CD45-mAb'et å diskriminere leukocytter fra andre celler. Inkuber i 20 min på is i mørket, etterfulgt av to vaskinger med PBS / 0,2% BSA.
- Rett før FACS-analyse flekken med propidiumjodid i 15 minutter på is for å skjelne døde celler, etterfulgt av to vaskinger med PBS vanlig. Resuspender i 150 mL for FACS analyse.
MERK: I trinn 3.7.4 og trinn 3.7.5 andre antistoffer kan brukes avhengig av svulsten enhet.
4. FACS Analyse
- Bruk en rekke gating verktøy til gate bestanden av interesse i form av stor spredning, dublett diskriminering, ekskludering av døde celler, gating for CD45 positive celler, og gating for antigen-positive celler.
- Ved første, gate ut cellerusk i en forward scatter (FSC-A) versus side scatter (SSC-A) med en to-parameter tomten. Neste Kast celle dubletter. Endelig gate ut non CD45-antigen-positive (CD45) og døde / døende celler (LD - live / dead-flekk).
- Rekordprøver som bruker samme mal for alle eksperimenter.
MERK: Se produsentens protokoll for tekniske råd om bruk av hardware og analytisk programvare.
5. Mikroskopisk analyse
- Analyser fargede tumor frysesnitt ved hjelp av et konfokal mikroskop med en olje nedsenking linse (40X objektiv). Bruk en He-Neon 633 nm laser eksitasjon av AF680, en Argon Laser for AF488, og en 405-Diode for DAPI.
- Behandle rå bildedata ved hjelp av en programvare som er kompatibel med mikroskopet. Utføre bakgrunns-korrigering og støyfiltrering om nødvendig. Utføre flere bildejusteringer som seksjonering, beskjæring samt lysstyrke og kontrast justeringer.
- Endelig generate et enkelt sammensatt overlay bilde fra alle deteksjons kanaler. Juster lysstyrken og kontrasten til de enkelte lag. De sammensatte bilder viser lokalisering av celler (DAPI-beis, blå), distribusjon av merkede antistoff konstruksjoner (AF680-beis, rød) og blodårer (AF488-flekken, grønn).
6. In vivo avbildning Analyse
- Åpne bildefiler i bildebehandlingsprogrammer og opprette et overlegg bilde ved å kombinere fotografi bildedata med fluorescens bildedata. Optimalisere bildeskjermen ved å fjerne vev autofluorescence bakgrunnssignal fra den spesifikke fluorescerende signal. Dette kan gjøres ved å subtrahere bilde ervervet med bakgrunn filter satt fra bildet ervervet med filteret satt spesifikke for tracer.
- Tegn identiske sirkulære måle regioner av interesse (ROI) rundt antigen-positive tumor og antigen-negative tumor. Å bestemme bakgrunnssignalintensitet, plasserer en sirkulær ROIi et område av dyret, hvor fluorescens-signalet antas å være lav (f.eks bakbenet).
- Bruk samme ROIs for alle dyr på alle tidspunkter. For posisjonering, bruker de fotografiske svart-hvitt-bilder for å identifisere kreft marginer.
- Skjerm ROI data i en måling tabellen. Bruk gjennomsnittlige strålingseffektiviteten data, noe som muliggjør en mer kvantitativ sammenligning av fluorescerende signaler for ytterligere statistiske analyser.
- Skjerm og sammenligne data som absolutte signalintensitet eller beregne signal-til-bakgrunn ratio ved å bruke målte ROI data fra målrettet vev og bakgrunn vev. Beregn tumor-til-bakgrunnsforhold ved å dividere tumoropptak ved bakgrunnsverdi bestemmes fra baklabb.
- Som kontroller, også analysere antigen-negative og antigen-positive tumorer i de samme dyrene samt dyr injisert med merket isotype kontroll for å fastslå spesifisiteten av signaler in vivo.
Representative Results
Fluorescens-merkede prober tillate kombinasjonen av forskjellige NIRF-avbildningsteknikker (figur 1A). Vi forsøkte å utføre in vivo NIRF-avbildning, flowcytometri, fluorescensmikroskopi sekvensielt for å sammenligne fluorescensmerkede Nanobodies og monoklonale antistoffer spesifikke for in vivo avbildning (figur 1B).
Mus ble injisert med 50 pg av nanobody og monoklonalt antistoff for å evaluere spesifisiteten av de fluorescensmerkede konstrukter for in vivo avbilding. Resultatene viste spesifikk merking av antigen-positive tumorer med både nanobody og monoklonalt antistoff ved 6 timer etter injeksjonen (figur 2). ROI-analyser av de antigen-positive tumorer viste en mye høyere T / B-forhold på ~ 12 for nanobody forhold til ~ 6 for det monoklonale antistoffet. Videre nanobody viste ingen uspesifikk signal i antigen-negative tumorer, mensmonoklonalt antistoff viste uspesifikke konfunderende signaler i antigennegative svulster.
I tillegg til den ikke-spesifikke signal av de negative tumorer, det monoklonale antistoff også indusert ikke-spesifikke bakgrunnssignaler på hele dyret. Dette skyldes sannsynligvis overdreven gratis sirkulerende antistoffer, som er for store til å bli utskilles gjennom nyrene. Tvert imot, dyr injisert med Nanobodies viste uspesifikke signaler bare i nyrene på grunn av nedsatt eliminasjon av de små Nanobodies.
Strømningscytometri analyser av tumorcellesuspensjoner viste spesifikk merking av antigen-positive tumorceller med både AF680-konjugater 6 timer etter injeksjon. Jo sterkere fluorescenssignal av nanobody merket celler sammenlignet med monoklonale antistoffer merket celler reflekterer in vivo NIRF-bildebehandling resultater. Viktigere, strømningscytometriske analyser viser at det ikke er noen ikke-spesifikk merking av antigen-negative celler med hver av de tokonstruksjoner (figur 3).
Fluorescens mikroskopi av tumorfrysesnitt viste en sterk og nesten homogen merking av antigen-positive celler med nanobody 6 timer etter injeksjon. Tvert imot, det monoklonale antistoff viste en mye svakere, og heller inhomogene farging (figur 4A). Antigen-negative tumorer viser ingen farging 6 timer etter injeksjon av nanobody, mens antigen-negative tumorer injisert med den konvensjonelle antistoff-vis ikke-spesifikke spredte flekker i det interstitielle rom (figur 4B).
Figur 1: flourescence bildebehandling og antistoff konstruksjoner. (A) Imaging oppsett for evaluering av AF680-konjugater: In vivo NIRF-imaging fulgt av flowcytometri og fluorescens mikroskopi. (B
Figur 2: In vivo-avbildning NIRF Bilder av fluorescens-signalet av antigen-positive (+) og antigen-negative (-) tumorer i mus som har blitt injisert med nanobody s + 16a (A) og monoklonalt antistoff Nika102 (B). . In vivo avbildning ble utført før (0-t) og 6 timer etter injeksjon. Signalintensiteter vises som strålings effektivitet (p / sek / cm 2 / sr) / (μW / cm 2).
Figur 3:Ex vivo FACS analyser av cellebundet antistoff-konstruksjoner fra tumorcellesuspensjoner. (A) gating strategi for FACS-analyser av tumorceller. (B) histogrammer viser mengden av injisert intravenøst AF680-konjugert nanobody s + 16a og antistoff Nika102 spesifikt bundet til tumorcellene in vivo. Antigennegative svulster vises som ufylte histogrammer og antigen-positive svulster vises som fylt histogrammer.
Fig. 4: Ex vivo fluorescens mikroskopi (A) Oversikt fluorescens mikroskopi av hele antigen-positive tumorfrysesnitt 6 timer etter injeksjon av r + 16a 680 eller 680 Nika102. Signalintensitetene til de in vivo intravenøstprojiserte AF680-konjugater uten noen sekundær-merking agenter vises i rødt. Ex vivo motfarget atomkjerner vises i blått og fartøy i grønt. Stiplede linjene indikerer ytre marginer av hele svulster. (B) Close-up fluorescensmikropskopi av antigen-positive og antigennegative svulster.
Discussion
Vi brukte nær-infrarøde fluoroformerket Nanobodies og konvensjonelle monoklonale antistoffer rettet mot det samme mål på lymfomceller for en multimodal sammenligning av in vivo og ex vivo-analyser. Vi viste at Nanobodies er godt egnet som diagnostisk verktøy for rask og spesifikk in vivo påvisning av lymfomer.
In vivo, s + 16a 680 tillates en rask og mer spesifikk påvisning av ARTC2-positive xenotransplantater. Bortsett fra de forskjellige kinetikk for beste tumor visualisering in vivo, den store ulempen med Nika102 680 var høy spesifikk signal fra ARTC2-negative tumorer og ikke-spesifikke bakgrunnssignaler.
Ex vivo flowcytometrisk analyser av spredte celler fra dissekert svulster viste ingen spesifikk binding til ARTC2-negative lymfomaceller av injisert AF680-konjugater. Ex vivo fluorescens avdekket sterk og nesten homogenOUS farging av celler i ART2C-positive tumorsnitt i tilfelle nanobody s + 16a, som bekrefter at nanobody var i stand til å nå enda fjerntliggende områder innen svulsten etter 6 timer. I motsetning til dette, det monoklonale antistoff viste svakere og inhomogene farging av celler i ARTC2-positive tumorer etter 6 timer. Bedre avbildningsresultater med den konvensjonelle antistoff kan oppnås etter 24 timer eller 48 timer (data ikke vist). For å utføre en grundig sammenligning av to forskjellige størrelser konstruksjoner, har avbildning ved forskjellige tidspunkter (seriell-imaging) som skal utføres for å finne optimale avbildnings tidspunkt for hver konstruksjon.
Som andre tidligere studier, resultatene som presenteres her understreke at in vivo molekylær avbildning med merkede Nanobodies tillater rask og bestemt samme dag svulst bildebehandling med høy tumor-til-bakgrunn forholdstall 12-15,17-19. Tvert imot, konvensjonelle antistoffer føre til lave tumor-til-bakgrunn forholdstall og uspesifikke signaler fra antigen-negative svulster tidlig etter injeksjon på grunn av deres sakte klaring fra kroppen. For å oppnå optimale bilderesultater med konvensjonelle antistoffer, påpeker bildebehandling tid 24 timer eller 48 timer etter injeksjon er ofte nødvendig. Disse funnene er i tråd med tidligere studier som har antydet at konvensjonelle antistoffer med bevist terapeutisk effekt har begrenset nytte i molekylær avbildning 17,19,26. Derfor er konvensjonelle antistoffer kan være ganske egnet for terapeutiske formål på grunn av sin lange halveringstid i plasma, mens Nanobodies er ganske egnet for avbildningsformål på grunn av deres hurtige clearance fra sirkulasjonen. Disse forskjellene skyldes det faktum at en hvilken som helst overskudd av de mindre Nanobodies (15-17 kDa) blir raskt fjernet via renal utskillelse, mens overskudd av større konvensjonelle antistoffer (150 kDa) er holdt tilbake i sirkulasjon. Så den store fordelen av Nanobodies for molekylær avbildning er den lave bakgrunnssignal ved tidlige bilde tidspunkter regardless av den injiserte dose. Dette gjør at samme dag avbildning og kan være forflyttbar i klinisk sammenheng. Omvendt, konvensjonelle antistoffer må nøyaktig kontrolleres for å minimalisere ikke-spesifikke bakgrunnssignaler, og samtidig opprettholde tilstrekkelig spesifikke signal fra målvevet (upubliserte data).
En av begrensningene i den in vivo NIRF-avbildningsteknikk er den lave inntrengningsdybde som generelt bare tillater avbildning av subkutan, men ikke av ortotopiske tumormodeller. Imidlertid kan denne begrensningen overvinnes i en eksperimentell innstilling av den nylig utviklede tomografiske fotoakustiske teknikker som gjør at hele kroppen avbildning av levende mus 27. En annen begrensning av NIRF-avbildningsteknikk er vurderingen av vev dose i forhold til radionuklide-mediert bildebehandling. Imidlertid kan Nanobodies bli radiomerket for positronemisjonstomografi (PET) avbildning av xenograft-modeller og presis kvantitativ vurdering avtracer biodistribusjon. Faktisk våre NIRF-MRI-resultatene er i samsvar med en fersk studie som sammenlignet Nanobodies og konvensjonelle antistoffer for PET billeddiagnostikk. Forfatterne kom også til den konklusjon at Nanobodies tillate samme dag bildebehandling med høy tumor-til-bakgrunn forholdstall 15.
Men bare merking av antistoff konstruksjoner med nær-infrarød fluorescerende fargestoff AF680 tillatt oss den omfattende in vitro, in vivo og ex vivo nær-infrarødt fluorescens bildebehandling sammenligning ved hjelp av flowcytometri, fluorescens mikroskopi, og NIRF-bildebehandling. Av denne grunn, og fordi det er ikke-radioaktivt, svært følsom, billig, og bruker relativt enkel å produsere målrettede sonder, vi argumentere for bruk av NIRF-avbildningsteknikk for evaluering av nye antistoff konstruksjoner i preklinisk molekylær avbildning.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av graduate school "Betennelse og regenerering" av Collaborative Research Centre 841 av Deutsche Forschungsgemeinschaft (Alexander Lenz, Valentin Kunick, William fumey), av Collaborative Research Centre 877 av Deutsche Forschungsgemeinschaft (Friedrich Koch-Nolte) , av Werner Otto Foundation (Peter Bannas), ved Wilhelm Sander Foundation (Peter Bannas, Friedrich Koch-Nolte), og ved Deutsche Forschungsgemeinschaft (Martin Trepel, Friedrich Haag og Friedrich Koch-Nolte). Vi takker Universitetet Cancer Center Hamburg (UCCH) In Vivo Optisk Imaging Core Facility og ansatte ved UKE for konsultasjon og sin høye kvalitet. The Core Facility ble støttet delvis med tilskudd fra Deutsche Krebshilfe (tysk Cancer Aid).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AF680 protein labelling kit | Invitrogen | A20172 | |
| Anti-CD16/CD32-antibody | BioXCell | BE0008 | |
| Anti-CD31-antibody | Santa Cruz | sc-1506 | labeled with secondary antibody with AF488 |
| Anti-CD45-antibody V450 | BD Biosciences | 560501 | |
| AxioVision LE software | Zeiss | www.zeiss.com | |
| Basement membrane matrix | BD Biosciences | 354234 | Alternative product can be used |
| Cell strainer 70 µm | Corning | 431751 | Alternative product can be used |
| Confocal microscope | Leica | www.leica-microsystems.com | Leica SP5 with the following lasers: He-Neon for AF680, Argon Laser for AF488, and a 405-Diode for DAPI |
| DAPI | Molcular Probes | D1306 | |
| DC27.10 cells | laboratory specific | Other cells with different surface targets can be used | |
| DPBS | Sigma Aldrich | D8662 | |
| FACS Canto II | BD Biosciences | www.bdbiosciences.com | |
| Flourescence mircoscope | Zeiss | www.zeiss.com | Zeiss Axiovert 200 with Filter Set #32 for AF680: 000000-1031-354 |
| ImageJ software | NIH | http://imagej.nih.gov/ij/ | |
| IVIS 200 | Perkin Elmer | www.perkinelmer.com | Alternative in vivo imaging system can be used |
| Leica LAS software | Leica | www.leica-microsystems.com | Software specific to microscope used |
| Living Image software | Perkin Elmer | www.perkinelmer.com | Software specific to imaging system used |
| Needles 30 G | BD Biosciences | 305128 | Alternative product can be used |
| Nika102-antibody AF680 | laboratory specific | Other antibodies against different surface targets can be used | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | Potential hazards: carcinogenic, can irritate the eyes and skin, contact may cause drying of the skin and/or allergic dermatitis |
| s+16a-nanobody AF680 | laboratory specific | Other antibodies against different surface targets can be used | |
| Syringes 1 ml | Braun | 916 1406 V | Alternative product can be used |
References
- Koch-Nolte, F., et al. Single domain antibodies from llama effectively and specifically block T cell ecto-ADP-ribosyltransferase ART2.2 in vivo. FASEB J. 21, 3490-3498 (2007).
- Koch-Nolte, F., et al. A new monoclonal antibody detects a developmentally regulated mouse ecto-ADP-ribosyltransferase on T cells: subset distribution, inbred strain variation, and modulation upon T cell activation. J Immunol. 163, 6014-6022 (1999).
- Koch-Nolte, F., et al. Use of genetic immunization to raise antibodies recognizing toxin-related cell surface ADP-ribosyltransferases in native conformation. Cell Immunol. 236, 66-71 (2005).
- Bannas, P., et al. Activity and specificity of toxin-related mouse T cell ecto-ADP-ribosyltransferase ART2.2 depends on its association with lipid rafts. Blood. 105, 3663-3670 (2005).
- Bannas, P., et al. Quantitative magnetic resonance imaging of enzyme activity on the cell surface: in vitro and in vivo monitoring of ADP-ribosyltransferase 2 on T cells. Mol Imaging. 9, 211-222 (2010).
- Bannas, P., et al. Transgenic overexpression of toxin-related ecto-ADP-ribosyltransferase ART2.2 sensitizes T cells but not B cells to NAD-induced cell death. Mol Immunol. 48, 1762-1770 (2011).
- Hottiger, M. O., Hassa, P. O., Luscher, B., Schuler, H., Koch-Nolte, F. Toward a unified nomenclature for mammalian ADP-ribosyltransferases. Trends Biochem Sci. 35, 208-219 (2010).
- Bannas, P., et al. In vivo near-infrared fluorescence targeting of T cells: comparison of nanobodies and conventional monoclonal antibodies. Contrast Media Mol Imaging. 9, 135-142 (2014).
- Scheuplein, F., et al. NAD+ and ATP released from injured cells induce P2X7-dependent shedding of CD62L and externalization of phosphatidylserine by murine T cells. J Immunol. 182, 2898-2908 (2009).
- Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
- Wesolowski, J., et al. Single domain antibodies: promising experimental and therapeutic tools in infection and immunity. Med Microbiol Immunol. 198, 157-174 (2009).
- Vaneycken, I., et al. Preclinical screening of anti-HER2 nanobodies for molecular imaging of breast cancer. FASEB J. 25, 2433-2446 (2011).
- Xavier, C., et al. Synthesis, preclinical validation, dosimetry, and toxicity of 68Ga-NOTA-anti-HER2 Nanobodies for iPET imaging of HER2 receptor expression in cancer. J Nucl Med. 54, 776-784 (2013).
- Tchouate Gainkam, L. O., et al. Correlation Between Epidermal Growth Factor Receptor-Specific Nanobody Uptake and Tumor Burden: A Tool for Noninvasive Monitoring of Tumor Response to Therapy. Mol Imaging Biol. 13 (5), 940-948 (2011).
- Vosjan, M. J., et al. Facile labelling of an anti-epidermal growth factor receptor Nanobody with 68Ga via a novel bifunctional desferal chelate for immuno-PET. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 38, 753-763 (2011).
- Oliveira, S., Heukers, R., Sornkom, J., Kok, R. J., van Bergen En Henegouwen, P. M. Targeting tumors with nanobodies for cancer imaging and therapy. Journal Of Controlled Release. 172 (3), 607-617 (2013).
- Kijanka, M., et al. Rapid optical imaging of human breast tumour xenografts using anti-HER2 VHHs site-directly conjugated to IRDye 800CW for image-guided surgery. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 40, 1718-1729 (2013).
- Zaman, M. B., et al. Single-domain antibody bioconjugated near-IR quantum dots for targeted cellular imaging of pancreatic cancer. J Nanosci Nanotechnol. 11, 3757-3763 (2011).
- Oliveira, S., et al. Rapid visualization of human tumor xenografts through optical imaging with a near-infrared fluorescent anti-epidermal growth factor receptor nanobody. Mol Imaging. 11, 33-46 (2012).
- Gainkam, L. O., et al. Comparison of the biodistribution and tumor targeting of two 99mTc-labeled anti-EGFR nanobodies in mice, using pinhole SPECT/micro-CT. J Nucl Med. 49, 788-795 (2008).
- Chakravarty, R., Goel, S., Cai, W. Nanobody: the 'magic bullet' for molecular imaging. Theranostics. 4, 386-398 (2014).
- Siontorou, C. G. Nanobodies as novel agents for disease diagnosis and therapy. International journal of nanomedicine. 8, 4215-4227 (2013).
- Kaur, S., et al. Recent trends in antibody-based oncologic imaging. Cancer Lett. 315, 97-111 (2012).
- Lammers, T., Kiessling, F., Hennink, W. E., Storm, G. Drug targeting to tumors: principles, pitfalls and (pre-) clinical progress. Journal Of Controlled Release. 161, 175-187 (2012).
- Jain, R. K., Stylianopoulos, T. Delivering nanomedicine to solid tumors. Nature reviews. Clinical Oncology. 7, 653-664 (2010).
- Lisy, M. R., et al. In vivo near-infrared fluorescence imaging of carcinoembryonic antigen-expressing tumor cells in mice. Radiology. 247, 779-787 (2008).
- Herzog, E., et al. Optical imaging of cancer heterogeneity with multispectral optoacoustic tomography. Radiology. 263, 461-468 (2012).
