Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Validering af Nanobody og antistofbaserede Published: April 6, 2015 doi: 10.3791/52462
* These authors contributed equally

Introduction

I den foreliggende rapport beskriver vi implementeringen af nær-infrarøde fluorophormærket prober til validering af in vivo xenograft billeddannelse eksperimenter ved hjælp af ex vivo flowcytometri og fluorescens mikroskopi af de dissekerede xenotransplantattumorer. Vi sammenligner et enkelt domæne nanobody (s + 16a, 17 kDa) 1 og et monoklonalt antistof (Nika102, 150 kDa) 2,3 rettet mod det samme mål antigen til specifik in vivo nær-infrarød fluorescens billeddannelse i et lymfom xenograft model. Målantigenet ADP-ribosyltransferase ARTC2.2 udtrykkes som et GPI-forankret celleoverflade ecto-enzymet ved lymfomceller 4-9.

Nanobodies afledt fra kamel tung-kæde kun antistoffer er den mindste tilgængelige antigenbindende fragmenter 10,11. Med kun ~ 15 kDa, disse små antistoffragmenter er opløselige, meget stabil og er renalt fjernet fra omløb 8,10. Tisse egenskaber gør dem særligt velegnede til specifik og effektiv målretning af tumorantigener in vivo 12-20. Fælles antigen mål for tilgængelige nanobodies er epidermal vækstfaktor receptor (EGFR1 eller HER-1), human epidermal vækstfaktor type 2 (HER-2 eller CD340), carcinoembryonisk antigen (CEA) og vaskulært celleadhæsionsmolekyle-1 (VCAM-1 ) 21. Nanobody konjugater er lovende redskaber til cancerimmunterapi og behandling af inflammatoriske sygdomme 22.

Nylige undersøgelser har vist, at nanobodies tillader højere tumor-til-baggrund (T / B) -ratios end konventionelle antistoffer i in vivo molekylære billeddannelsesanvendelser 8,17,19. Dette forklares hovedsageligt af den relativt dårlige og langsomme vævspenetration af konventionelle antistoffer, langsom clearance af cirkulation og lang opholdstid i ikke-målrettet væv 23. Desuden overskud af konventionelle antistoffer fører til uspecifik akkumulering in målantigen-negative tumorer forårsaget af den øgede permeabilitet og fastholdelse (EPR) effektuere 24,25. Dette betyder, at højere doser af konventionelle antistoffer kan øge ikke kun specifikke signaler, men også ikke-specifikke signaler, hvorved den maksimalt opnåelige tumor-til-baggrund-forholdet. I modsætning hertil at øge dosis af nanobodies øger signalerne fra antigen-positive tumorer, men ikke af normalt væv eller antigen-negative tumorer (upublicerede data).

Ud over sammenligningen af ​​nanobodies og konventionelle antistoffer, vi skitsere en intraindividuelle vurdering af antigen-positive og -negative xenotransplantater i samme mus til direkte sammenligning af konkrete og uspecifikke signaler på grund af EPR effekt. De nær-infrarøde fluorofor konjugerede prober tilladt os at udnytte en enkelt probe in vivo og ex vivo under anvendelse af nær-infrarødt fluorescensimagografi, flowcytometri, og fluorescensmikroskopi. Anvende vores protokoller giver mulighed for ikkeradioaktive, meget følsomme, og billig optimering af in vivo molekylære billeddiagnostiske eksperimenter såsom evaluering af nye antistofkonstruktioner for målretning specifik tumor.

Formålet med denne tutorial undersøgelse er at fremhæve brugen af ​​NIRF-billeddannelse til vurdering af nye antistofkonstruktioner i præklinisk molekylær billeddannelse.

I denne protokol, blev alle eksperimenter udført med et lille dyr NIRF-Imaging-system, en fluorescens-aktiveret cellesorterer (FACS) flowcytometer og et konfokalt mikroskop.

Protocol

BEMÆRK: Forsøg blev udført i overensstemmelse med de internationale retningslinjer for etisk anvendelse af dyr, og blev godkendt af den lokale dyrevelfærd provision på University Medical Center, Hamburg.

1. Fremstilling af tumorceller, mus og antistofkonstruktioner

  1. Udarbejdelse af lymfomceller og alikvoteringsprocessen af ​​Basement Matrix (Matrigel).
    1. Dagen før injektion af tumorceller løber steriliseret spids boks (1.000 tips pi) og den passende pipette i -20 ° C fryser.
    2. Optø flasken med kælderen matrix på is i 4 ° C køleskab O / N.
    3. På dagen for injektionen fylde en ice bucket og placere kælderen matrix sammen med pipette, tips, og 1 ml sprøjter med 30 g nåle på is.
    4. Alikvot lymfomceller i et volumen på 100 pi RPMI-medium i 1,5 ml mikrocentrifugerør og blandes omhyggeligt med 100 pi af kælderen matrix. Udarbejde i pre-afkøletsprøjter og lagt på is indtil injektion.
      BEMÆRK: Brug god steril teknik og arbejde på is hele tiden for at forhindre tilstopning af kælderen matrix.
  2. Mus Forberedelse
    1. Brug 8-10 uger gamle athymiske nøgne mus (NMRI- Foxn1 n u).
    2. For at reducere autofluorescens af tarmen holde musene på lucerne-fri diæt i 1 uge før in vivo-billeddannelse.
    3. Til injektion af lymfomceller bedøver mus for at bevirke med 2% isofluran i en induktion kammer. Oprethold 1-2% isofluran for varigheden af ​​proceduren under anvendelse af en isofluoran manifold.
    4. Sprøjt lymfomceller subkutant i skulderen fløjene. Til direkte intra-individuel sammenligning injicere antigen-positive og antigen-negative celler i højre og venstre side, hhv.
      1. Brug en tommelfinger og pegefinger klemme huden af ​​mus og trække den væk fra kroppen af ​​musen. Sprøjt langsomt og jævnt iposen skabt af fingrene, hvilket skaber en enkelt klynge af celler under huden. Kælderen matrix med til at holde injicerede celler på plads.
  3. Fremstilling af antistof-konstrukter
    1. Mærk monoklonale antistoffer og enkelt domæne nanobodies med et kommercielt tilgængeligt protein mærkning kit til det fluorescerende farvestof AlexaFluor-680 (AF680) (excitationsbølgelængde = 679 nm, emission bølgelængde = 702 nm) ifølge producentens instruktioner. Beregn antal farvestoffer pr nanobody og konventionel antistof under anvendelse af molære ekstinktionskoefficienter på 15.720 mol -1 cm -1 og 203.000 mol -1 cm -1 henholdsvis. Vurdere renhed antistofkonstruktioner med SDS-PAGE størrelse fraktionering og Coomassie brilliant blåsplint.
    2. Sikre specificiteten af de mærkede konjugater ved at gennemføre en række in vitro forsøg, inden den egentlige billeddiagnostiske undersøgelser. Test specificitet mærkede entibody konstruktioner in vitro gennem blokerende undersøgelser og uspecifik isotypekontroller 8,20.
      BEMÆRK: I trin 1.2.4 celletal for antigen-negative og antigen-positive celler (eller forskellige celler linjer) skal måske tilpasses efter forskellige vækstrater. Til disse eksperimenter blev 0.5x10 6 DC27.10 ARTC2 negativ og 1,5x10 6 DC27.10 ARTC2 positive celler anvendes til at opnå tumorer af tilsvarende størrelse. I trin 1.3.1 processen med mærkning og etikettering effekt af antistofprober med fluorophorer kan afvige mærkningen kit anvendes.

2. In Vivo Imaging

  1. Efter 7-9 dage, når tumorer nå ~ 8 mm i diameter, injicere 50 ug AlexaFluor680 mærket antistof konstruktioner i et volumen på 200 pi saltvand intravenøst ​​i halevenen af ​​mus (mAb-AF680: 50 ug med 2 farvestoffer / molekyle ≈ ~ 4 ^ 14 fluorochromer ≈ ~ 0,8 ug fluorochromer; Nanobody-AF680: 50 μg med 0,3 farvestoffer / molekyle ≈ ~ 5.6 ^ 14 fluorochromer ≈ ~ 1,1 ug fluorochromer).
  2. Initialiser billeddannende system og bedøver mus for at bevirke med 3% isofluran ved hjælp af en XGI-8 anæstesi system i induktion kammer før billeddannelse. Oprethold 1-2% isofluran for varigheden af ​​den billeddannende procedure under anvendelse af isofluran manifold huse i afbildningskammeret.
    1. Position mus på opvarmet imaging scene med tumorer rettet mod kameraet. Overvåg korrekt bedøvelse ved at klemme tå eller hale af dyret; nogen reaktion af dyret viser, at anæstesi er for lys.
    2. Overvåg respirationsfrekvensen; anæstesi er for lys, hvis åndedræt forøges, og for dybt, hvis respirationshastigheden er nedsat, dyb eller uregelmæssig. Beskyt animal hornhinder med øje salve for at forhindre tørhed, mens under anæstesi.
  3. Vælg fluorescerende filter sæt 615-665 nm for excitation, 695-770 nm for Emissionsfaktorn, og 580-610 nm excitation for baggrundssubtraktion med en 51 2x 512 pixel matrix størrelse. Indstil eksponeringen tid til auto, pixel binning til mellemstore og F / Stop til 2.
    BEMÆRK: Kortere eksponeringstider muliggøre hurtigere frame rates; længere eksponeringstider giver større følsomhed. Binning styrer pixelstørrelse på CCD kamera. Forøgelse af binning øger pixelstørrelse, følsomhed, og frame rate, men reducerer rumlige opløsning. F / Stop indstiller størrelsen på kameralinsen blænde. Størrelse Blænden styrer mængden af ​​lys detekteret og dybden af ​​field.Note at indstillinger kan afvige imaging enhed og eksperimentel oprettet. Se i producentens manual for optimale resultater.
    1. I imaging software optimere eksponeringstid, F / stop og pixelsammenfletning baseret på ekspressionen af ​​den cellelinje. Ændre disse indstillinger når som helst i løbet af et eksperiment uden at påvirke den kvantitative resultat. Alternativt, lad guiden Imaging software automatisk bestemmeparametrene.
  4. Billede mus før injektionen og 6 timer efter injektion af antistof konstruktioner.
    BEMÆRK: Mærkningen effekt kan påvirke den nødvendige dosis er nødvendig for at opnå optimale billeddiagnostiske resultater. Derfor mængden af ​​krævede antistof-konstruktion for at opnå optimale billeddiagnostiske resultater skal bestemmes empirisk. Det kan variere afhængigt af mærkning effekt og størrelse af konstruktionen samt tumormodel og target-antigen-ekspression.

3. Høst og Udarbejdelse af tumorer

  1. Fyld en isspand og placere 4% paraformaldehyd (PFA) phosphatbufret saltvand (PBS) / protease inhibitor (AEBSF) og PBS / 0,2% bovint serumalbumin (BSA) på is.
  2. Når imaging session er færdig, øge koncentrationen af ​​isofluran til 4%. Efter dyr ophører vejrtrækning, fjerne det fra imaging scenen og udføre cervikal dislokation.
  3. Mount musen på en Styrofoam blok og spray med 70% ethanol.
  4. Brug sakss og pincet til at skære den ydre hud og trække den forsigtigt tilbage for at blotlægge tumorer. Fjern tumorer med skalpel for at sikre tumorvæv forbliver intakt.
  5. Cut tumorer i halvdelen anvender en skalpel. Anbring den ene halvdel i en samling rør med PBS / AEBSF for FACS analyser og den anden halvdel i en 50 ml rør med 4% PFA for immunohistokemi.
  6. Forberedelse til immunhistokemi
    1. Hold tumorer i 4% PFA i køleskabet ved 4 ° C i 24 timer. Overfør tumorer til et rør med PBS / 30% saccharose og holde i køleskabet ved 4 ° C, indtil tumor synker til bunden af ​​røret.
    2. Skær tumorer i passende stykker for cryomolds. Sæt tumorer i cryomolds og fyld med OCT-forbindelse, så tumorerne er dækket.
    3. Sæt forme på tøris og vent, indtil forbindelsen er helt frosset. Overførsel frosne tumorer til -80 ° C fryser og opbevares for immunhistokemi.
    4. Cut frosne tumorer i sektioner af 8 pm med en mikrotom. Brug standard immunohistokemiskkemi protokol til pletten med antistof mod CD31-AF488 at visualisere blodkar og diamidino-phenylindol (DAPI) at visualisere kerner.
      BEMÆRK: tumorsektioner er meget følsomme over for lys, som de indeholder allerede fluorescensmærkede antistoffer. Minimer udsættelse for lys så meget som muligt.
  7. Forberedelse til FACS-analyse
    1. Placer petriskål på is og fjern stemplet fra en 2,0 ml sprøjte. Sæt tumor i cellen si og skær den forsigtigt ind 3-4 stykker med en skalpel. Hæld den indledende PBS i petriskålen og bruge den flade ende af stemplet at mash tumoren i cellen si.
    2. Skyl cellefilter med den oprindelige PBS at udvaske alle celler med en 10 ml pipette. Overførsel cellesuspension i et nyt rør og centrifugering ved 500 xg i 5 min. Supernatanten fjernes, og cellerne resuspenderes i 10 ml PBS / 0,2% BSA. Tæl celler.
    3. Alikvote 1-5 x 10 6 lymfom celler i en 5 ml FACS rør. Spin celler igen (500xg), kassere supernatanten og resuspender i 100 pi PBS / 0,2% BSA.
    4. Eventuelt blok FcR anvendelse af et anti-CD16 / CD32-mAb (FcgR3 / 2), som binder til FcyR på is i 10 min. Vask cellerne én gang med PBS / 0,2% BSA.
    5. Tilføj anti-CD45-mAb at diskriminere leukocytter fra andre celler. Inkuber i 20 minutter på is i mørke, efterfulgt af to vaske med PBS / 0,2% BSA.
    6. Lige før FACS-analyse pletten med propidiumiodid i 15 minutter på is for at skelne døde celler, efterfulgt af to vaske med almindelig PBS. Resuspender i 150 pi for FACS-analyse.
      BEMÆRK: I trin 3.7.4 og trin 3.7.5 andre antistoffer kan anvendes afhængigt af tumor enhed.

4. FACS-analyse

  1. Brug en række gating værktøjer til gate populationen af ​​interesse i form af store scatter, dublet diskrimination, udelukkelse af døde celler, gating for CD45-positive celler, og gating for antigen-positive celler.
    1. Først gate ud cellesnavs i en forward scatter (FSC-A) versus sidespredning (SSC-A) under anvendelse af en to-parameter plot. Næste udsmid celle dubletter. Endelig gate af ikke CD45-antigen-positive (CD45) og døde / døende celler (LD - levende / død-plet).
  2. Optag prøver bruger den samme skabelon for alle forsøg.
    BEMÆRK: Se fabrikantens protokol for teknisk rådgivning om brugen af ​​hardware og analytisk software.

5. mikroskopisk analyse

  1. Analyser farvede tumor kryosnit hjælp af en konfokal mikroskop med en olie nedsænkning linse (40X objektiv). Brug en He-Neon 633 nm laser excitation af AF680, en Argon Laser for AF488, og en 405-Diode for DAPI.
  2. Behandle de rå billeddata ved hjælp af en software kompatibelt med mikroskopet. Udfør baggrund-korrektion og støjfiltrering om nødvendigt. Udfør yderligere billedjusteringer som sektionering, beskæring samt lysstyrke og kontrast justeringer.
    1. Endelig generate en enkelt sammensat overlay billede fra alle afsløring kanaler. Juster lysstyrke og kontrast af de enkelte lag. De sammensatte billeder viser lokalisering af celler (DAPI-pletten, blå), distribution af mærkede antistofkonstruktioner (AF680-plet, rød) og blodkar (AF488-plet, grøn).

6. In Vivo Imaging Analyse

  1. Åbne billedfiler i imaging software og oprette et overlay billede ved at kombinere fotografier billeddata med fluorescens billeddata. Optimer billedvisning ved at fjerne væv autofluorescens baggrund signal fra den specifikke fluorescerende signal. Dette kan gøres ved at trække billedet erhvervet med baggrund filtersæt fra billedet erhvervet med filteret indstilles specifikt for sporstof.
  2. Tegn identiske cirkulære måling regioner af interesse (ROI) omkring antigen-positive tumor og antigen-negative tumor. For at bestemme baggrund signalintensitet, placere en cirkulær ROIi et område af dyret, hvor det forventes fluorescenssignal at være lav (f.eks bagben).
    1. Brug de samme ROI'er for alle dyr på alle tidspunkter. Til anbringelse, bruge fotografiske sort-hvide billeder, for at identificere tumor marginer.
  3. Display ROI data i en måling tabel. Brug gennemsnitlig strålende effektivitet data, der muliggør en mere kvantitativ sammenligning af fluorescerende signaler for yderligere statistiske analyser.
    1. Display og sammenligne data som absolutte signalintensiteter eller beregne signal-baggrund procent med målte ROI data fra målrettede væv og baggrund væv. Beregn tumor-til-baggrund-forholdet ved at dividere tumoroptagelse værdi af baggrunden værdi bestemmes ud fra bagbenet.
    2. Som kontroller, også analysere antigen-negative og antigen-positive tumorer i de samme dyr og dyr injiceret med mærkede isotypekontroller at vurdere specificiteten af signaler i vivo.

Representative Results

Fluorescensmærkede prober tillader kombinationen af forskellige NIRF-billeddannende teknikker (figur 1A). Vi har til formål at udføre in vivo NIRF-billeddannelse, flowcytometri, og fluorescensmikroskopi sekventielt for at sammenligne fluorescensmærkede nanobodies og monoklonale antistoffer til specifik in vivo imaging (figur 1B).

Mus blev injiceret med 50 ug nanobody og monoklonalt antistof til at vurdere specificiteten af de fluorescensmærkede konstruktioner til in vivo-billeddannelse. Resultaterne viste specifik mærkning af antigen-positive tumorer med både nanobody og monoklonalt antistof ved 6 timer efter injektion (figur 2). ROI analyser af antigen-positive tumorer udviste en meget højere T / B-forhold på ~ 12 til nanobody forhold til ~ 6 for det monoklonale antistof. Desuden nanobody viste ingen uspecifik signal i de antigen-negative tumorer, hvorimodmonoklonalt antistof viste uspecifikke forstyrrende signaler i antigen-negative tumorer.

Udover den uspecifikke signal af de negative tumorer, også det monoklonale antistof inducerede uspecifikke baggrundssignaler i hele dyret. Dette er sandsynligvis på grund af overdreven frit cirkulerende antistoffer, der er for store til at blive renalt. Omvendt dyr injiceret med nanobodies viste uspecifikke signaler kun i nyrerne på grund af den renale elimination af de små nanobodies.

Flowcytometri analyser af tumor cellesuspensioner viste specifik mærkning af antigen-positive tumorceller med både AF680-konjugater 6 timer efter injektion. Jo stærkere fluorescenssignal af nanobody mærkede celler i forhold til monoklonale antistof mærket celler afspejler de in vivo NIRF-imaging resultater. Vigtigere er det, flowcytometriske analyser viser, at der ikke er nogen specifik mærkning af antigen-negative celler med en af ​​de tokonstruktioner (figur 3).

Fluorescensmikroskopi af tumor kryosektioner viste en stærk og næsten homogen mærkning af antigen-positive celler med nanobody 6 timer efter injektion. Omvendt, det monoklonale antistof viste en meget svagere og temmelig uhomogen farvning (figur 4A). Antigen-negative tumorer viser ingen farvning 6 timer efter injektion af nanobody, hvorimod antigen-negative tumorer injiceret med det konventionelle antistof viser uspecifik spredt farvning i det interstitielle rum (figur 4B).

Figur 1
Figur 1: fluorescens billeddannelse og antistof konstruktioner. (A) Imaging setup for evaluering af AF680-konjugater: In vivo NIRF-imaging efterfulgt af flowcytometri og fluorescensmikroskopi. (B

Figur 2
Figur 2: In vivo NIRF-imaging Billeder af fluorescenssignalet af antigen-positive (+) og antigen-negative (-) tumorer i mus, der er blevet injiceret med nanobody s + 16a (A) og monoklonalt antistof Nika102 (B). . In vivo billeddannelse blev udført før (0 timer) og 6 timer efter injektion. Signalintensiteter vises som strålende effektivitet (p / sek / cm2 / SR) / (pW / cm2).

Figur 3
Figur 3:Ex vivo FACS analyser af cellebundet antistofkonstruktioner fra tumor cellesuspensioner. (A) gating strategi for FACS analyser af tumorceller. (B) Histogrammer viser mængden af injiceret intravenøst ​​AF680-konjugeret nanobody s + 16a og antistof Nika102 specifikt bundet til tumorcellerne in vivo. Antigen-negative tumorer vises som ubesatte histogrammer og antigen-positive tumorer vises som fyldte histogrammer.

Figur 4
Figur 4:. Ex vivo fluorescensmikroskopi (A) Overblik fluorescensmikroskopi af hele antigen-positive tumorceller kryosektioner 6 timer efter injektion af S + 16a 680 eller Nika102 680. Signalintensiteter af in vivo intravenøstfremskrevne AF680-konjugater uden nogen sekundær-mærkningsmidler vises i rødt. Ex vivo modfarvet kerner vises i blåt og skibe med grønt. Stiplede linjer angiver ydre margener for hele tumorer. (B) Nærbilleder fluorescensmikroskopi af antigen-positive og antigen-negative tumorer.

Discussion

Vi brugte nærinfrarøde fluorophormærket nanobodies og konventionelle monoklonale antistoffer rettet mod det samme mål om lymfomceller til en multimodal sammenligning af in vivo og ex vivo analyser. Vi viste, at nanobodies er velegnede som diagnostiske værktøjer til hurtig og specifik in vivo detektion af lymfomer.

In vivo, S + 16a 680 tillod en hurtig og mere specifik påvisning af ARTC2-positive xenotransplantater. Bortset fra de forskellige kinetik for bedste tumor visualisering in vivo, den største ulempe ved Nika102 680 var den høje uspecifik signal fra ARTC2-negative tumorer og ikke-specifikke baggrundssignaler.

Ex vivo flowcytometrisk analyse af dispergerede celler fra dissekerede tumorer viste ingen specifik binding til ARTC2-negative lymfomceller af indsprøjtet AF680-konjugater. Ex vivo fluorescens afslørede stærk og næsten homogeneskellige farvning af celler i ART2C-positive tumorsnit i tilfælde af nanobody s + 16a, der bekræfter, at nanobody kunne nå endnu fjerntliggende områder i tumoren efter 6 timer. I modsætning hertil det monoklonale antistof viste svagere og uhomogen farvning af celler i ARTC2-positive tumorer efter 6 timer. Bedre imaging resultater med den konventionelle antistof kan opnås efter 24 timer eller 48 timer (data ikke vist). For at udføre en grundig sammenligning af to forskellige størrelser konstruktioner billeddannelse på forskellige tidspunkter (seriel-billeddannelse) skal udføres for at identificere den optimale imaging tidspunktet for hver konstruktion.

Ligesom andre tidligere undersøgelser, hvis resultater rapporteret her understrege, at in vivo-molekylær billeddannelse med mærkede nanobodies muliggør hurtig og konkret samme dag tumorafbildning med høj tumor-til-baggrund nøgletal 12-15,17-19. Omvendt konventionelle antistoffer resulterer i lave tumor-til-baggrund nøgletal og ikke-specifikke signaler fra antiGen-negative tumorer tidligt efter injektion på grund af deres langsomme clearance fra kroppen. For at opnå optimale billeddannende resultater med konventionelle antistoffer, afbildningstiden punkt 24 timer eller endda 48 timer efter injektion er almindeligvis nødvendig. Disse resultater er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser, der har foreslået, at konventionelle antistoffer med dokumenteret terapeutisk fordel har begrænset anvendelighed i molekylær billeddannelse 17,19,26. Derfor konventionelle antistoffer kan være temmelig egnet til terapeutiske formål på grund af deres lange plasmahalveringstid mens nanobodies er temmelig egnet til billeddannelsesformål på grund af deres hurtige clearance fra kredsløbet. Disse forskelle skyldes, at eventuelle overskydende af de mindre nanobodies (15-17 kDa) hurtigt ryddes via renal elimination mens over større konventionelle antistoffer (150 kDa) fastholdes i kredsløbet. Så den store fordel af nanobodies for molekylær billeddannelse er den lave baggrund signal på tidlige imaging tidspunkter regardless af den injicerede dosis. Dette giver samme dag billeddannelse og kan være overføres til et klinisk miljø. Omvendt konventionelle antistoffer at være nøjagtigt titreres for at minimere ikke-specifikke baggrundssignaler, samtidig med at tilstrækkeligt specifikt signal fra målvævet (upublicerede data).

En af begrænsningerne for in vivo NIRF-imaging teknik er lav indtrængningsdybde som generelt kun tillader billeddannelse af subkutan men ikke ortotopisk tumormodeller. Men denne begrænsning overvindes i en eksperimentel indstilling fra de nyligt udviklede tomografiske foto-akustiske teknikker, der tillader hele kroppen billeddannelse af levende mus 27. En anden begrænsning af NIRF-imaging teknik er vurderingen af ​​dosis væv sammenlignet med radionuklid-medieret billeddannelse. Imidlertid kan nanobodies mærkes radioaktivt til positronemissionstomografi (PET) billeddannelse af xenograftmodeller og præcis kvantitativ vurdering afsporstof biofordeling. Faktisk vores NIRF billeddannelse resultater er i overensstemmelse med en nylig undersøgelse, som sammenlignede nanobodies og konventionelle antistoffer for PET imaging. Forfatterne kom også til den konklusion, at nanobodies tillader samme dag billeddannelse med høj tumor-til-baggrund nøgletal 15.

Men kun mærkning af antistof-konstruktioner med nær-infrarødt fluorescerende farvestof AF680 tilladt os omfattende in vitro, in vivo og ex vivo nærinfrarøde fluorescensimagografi sammenligning ved anvendelse af flowcytometri, fluorescensmikroskopi, og NIRF-billeddannelse. Af denne grund, og fordi det er ikke-radioaktiv, meget følsom, billig og anvender forholdsvis let at fremstille målrettede prober, vi går anvendelsen af ​​NIRF-imaging teknik til evaluering af nye antistofkonstruktioner i præklinisk molekylær billeddannelse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af forskerskolen "Inflammation og regenerering« af Collaborative Research Centre 841 af Deutsche Forschungsgemeinschaft (Alexander Lenz, Valentin kunick, William fumey), ved Collaborative Research Centre 877 af Deutsche Forschungsgemeinschaft (Friedrich Koch-Nolte) ved Werner Otto Foundation (Peter bannas), som Wilhelm Sander Foundation (Peter bannas, Friedrich Koch-Nolte), og af Deutsche Forschungsgemeinschaft (Martin Trepel, Friedrich Haag og Friedrich Koch-Nolte). Vi takker University Cancer Center Hamburg (UCCH) In vivo Optical Imaging Core Facility og personale på UKE til høring, og deres service af høj kvalitet. Core Facility blev støttet delvist af tilskud fra Deutsche Krebshilfe (tysk Cancer Aid).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AF680 protein labelling kit Invitrogen A20172
Anti-CD16/CD32-antibody BioXCell BE0008
Anti-CD31-antibody Santa Cruz sc-1506 labeled with secondary antibody with AF488
Anti-CD45-antibody V450 BD Biosciences 560501
AxioVision LE software Zeiss www.zeiss.com
Basement membrane matrix BD Biosciences 354234 Alternative product can be used
Cell strainer 70 µm Corning 431751 Alternative product can be used
Confocal microscope Leica  www.leica-microsystems.com Leica SP5 with the following lasers: He-Neon for AF680, Argon Laser for AF488, and a 405-Diode for DAPI
DAPI Molcular Probes D1306
DC27.10 cells  laboratory specific Other cells with different surface targets can be used
DPBS Sigma Aldrich D8662
FACS Canto II BD Biosciences www.bdbiosciences.com
Flourescence mircoscope Zeiss www.zeiss.com Zeiss Axiovert 200 with Filter Set #32 for AF680: 000000-1031-354
ImageJ software NIH http://imagej.nih.gov/ij/
IVIS 200 Perkin Elmer www.perkinelmer.com Alternative in vivo imaging system can be used
Leica LAS software Leica www.leica-microsystems.com Software specific to microscope used
Living Image software Perkin Elmer www.perkinelmer.com Software specific to imaging system used
Needles 30 G BD Biosciences 305128 Alternative product can be used
Nika102-antibody AF680 laboratory specific Other antibodies against different surface targets can be used
Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148 Potential hazards: carcinogenic, can irritate the eyes and skin, contact may cause drying of the skin and/or allergic dermatitis
s+16a-nanobody AF680 laboratory specific Other antibodies against different surface targets can be used
Syringes 1 ml Braun 916 1406 V Alternative product can be used

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Koch-Nolte, F., et al. Single domain antibodies from llama effectively and specifically block T cell ecto-ADP-ribosyltransferase ART2.2 in vivo. FASEB J. 21, 3490-3498 (2007).
  2. Koch-Nolte, F., et al. A new monoclonal antibody detects a developmentally regulated mouse ecto-ADP-ribosyltransferase on T cells: subset distribution, inbred strain variation, and modulation upon T cell activation. J Immunol. 163, 6014-6022 (1999).
  3. Koch-Nolte, F., et al. Use of genetic immunization to raise antibodies recognizing toxin-related cell surface ADP-ribosyltransferases in native conformation. Cell Immunol. 236, 66-71 (2005).
  4. Bannas, P., et al. Activity and specificity of toxin-related mouse T cell ecto-ADP-ribosyltransferase ART2.2 depends on its association with lipid rafts. Blood. 105, 3663-3670 (2005).
  5. Bannas, P., et al. Quantitative magnetic resonance imaging of enzyme activity on the cell surface: in vitro and in vivo monitoring of ADP-ribosyltransferase 2 on T cells. Mol Imaging. 9, 211-222 (2010).
  6. Bannas, P., et al. Transgenic overexpression of toxin-related ecto-ADP-ribosyltransferase ART2.2 sensitizes T cells but not B cells to NAD-induced cell death. Mol Immunol. 48, 1762-1770 (2011).
  7. Hottiger, M. O., Hassa, P. O., Luscher, B., Schuler, H., Koch-Nolte, F. Toward a unified nomenclature for mammalian ADP-ribosyltransferases. Trends Biochem Sci. 35, 208-219 (2010).
  8. Bannas, P., et al. In vivo near-infrared fluorescence targeting of T cells: comparison of nanobodies and conventional monoclonal antibodies. Contrast Media Mol Imaging. 9, 135-142 (2014).
  9. Scheuplein, F., et al. NAD+ and ATP released from injured cells induce P2X7-dependent shedding of CD62L and externalization of phosphatidylserine by murine T cells. J Immunol. 182, 2898-2908 (2009).
  10. Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
  11. Wesolowski, J., et al. Single domain antibodies: promising experimental and therapeutic tools in infection and immunity. Med Microbiol Immunol. 198, 157-174 (2009).
  12. Vaneycken, I., et al. Preclinical screening of anti-HER2 nanobodies for molecular imaging of breast cancer. FASEB J. 25, 2433-2446 (2011).
  13. Xavier, C., et al. Synthesis, preclinical validation, dosimetry, and toxicity of 68Ga-NOTA-anti-HER2 Nanobodies for iPET imaging of HER2 receptor expression in cancer. J Nucl Med. 54, 776-784 (2013).
  14. Tchouate Gainkam, L. O., et al. Correlation Between Epidermal Growth Factor Receptor-Specific Nanobody Uptake and Tumor Burden: A Tool for Noninvasive Monitoring of Tumor Response to Therapy. Mol Imaging Biol. 13 (5), 940-948 (2011).
  15. Vosjan, M. J., et al. Facile labelling of an anti-epidermal growth factor receptor Nanobody with 68Ga via a novel bifunctional desferal chelate for immuno-PET. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 38, 753-763 (2011).
  16. Oliveira, S., Heukers, R., Sornkom, J., Kok, R. J., van Bergen En Henegouwen, P. M. Targeting tumors with nanobodies for cancer imaging and therapy. Journal Of Controlled Release. 172 (3), 607-617 (2013).
  17. Kijanka, M., et al. Rapid optical imaging of human breast tumour xenografts using anti-HER2 VHHs site-directly conjugated to IRDye 800CW for image-guided surgery. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 40, 1718-1729 (2013).
  18. Zaman, M. B., et al. Single-domain antibody bioconjugated near-IR quantum dots for targeted cellular imaging of pancreatic cancer. J Nanosci Nanotechnol. 11, 3757-3763 (2011).
  19. Oliveira, S., et al. Rapid visualization of human tumor xenografts through optical imaging with a near-infrared fluorescent anti-epidermal growth factor receptor nanobody. Mol Imaging. 11, 33-46 (2012).
  20. Gainkam, L. O., et al. Comparison of the biodistribution and tumor targeting of two 99mTc-labeled anti-EGFR nanobodies in mice, using pinhole SPECT/micro-CT. J Nucl Med. 49, 788-795 (2008).
  21. Chakravarty, R., Goel, S., Cai, W. Nanobody: the 'magic bullet' for molecular imaging. Theranostics. 4, 386-398 (2014).
  22. Siontorou, C. G. Nanobodies as novel agents for disease diagnosis and therapy. International journal of nanomedicine. 8, 4215-4227 (2013).
  23. Kaur, S., et al. Recent trends in antibody-based oncologic imaging. Cancer Lett. 315, 97-111 (2012).
  24. Lammers, T., Kiessling, F., Hennink, W. E., Storm, G. Drug targeting to tumors: principles, pitfalls and (pre-) clinical progress. Journal Of Controlled Release. 161, 175-187 (2012).
  25. Jain, R. K., Stylianopoulos, T. Delivering nanomedicine to solid tumors. Nature reviews. Clinical Oncology. 7, 653-664 (2010).
  26. Lisy, M. R., et al. In vivo near-infrared fluorescence imaging of carcinoembryonic antigen-expressing tumor cells in mice. Radiology. 247, 779-787 (2008).
  27. Herzog, E., et al. Optical imaging of cancer heterogeneity with multispectral optoacoustic tomography. Radiology. 263, 461-468 (2012).

Tags

Medicine Nanobody antistof VHH fluorescensimagografi molekylær billeddannelse xenograft dyremodel
Validering af Nanobody og antistofbaserede<em&gt; In Vivo</em&gt; Tumor xenograft NIRF-imaging Forsøg på mus ved brug<em&gt; Ex vivo</em&gt; Flowcytometri og mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bannas, P., Lenz, A., Kunick, V.,More

Bannas, P., Lenz, A., Kunick, V., Fumey, W., Rissiek, B., Schmid, J., Haag, F., Leingärtner, A., Trepel, M., Adam, G., Koch-Nolte, F. Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy. J. Vis. Exp. (98), e52462, doi:10.3791/52462 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter