Introduction
I denna rapport beskriver vi genomförande av nära-infrarött fluoroformärkt sönder för validering av in vivo xenograft imaging experiment med hjälp ex vivo flödescytometri och fluorescensmikroskopi av de dissekerade xenotransplantattumörer. Vi jämför en enda domän Nanobody (s + 16a, 17 kDa) 1 och en monoklonal antikropp (Nika102, 150 kDa) 2,3 riktad till samma mål antigen för specifik in vivo nära infraröda fluorescens avbildning i ett lymfom xenograftmodell. Målantigenet ADP-ribosyltransferas ARTC2.2 uttrycks som en GPI-förankrad cellyte ekto-enzym av lymfomceller 4-9.
Nanobodies härrör från kamel tung kedja enbart antikroppar är de minsta tillgängliga antigenbindande fragment 10,11. Med bara ~ 15 kDa, dessa små antikroppsfragment är lösliga, mycket stabil och rensas renalt ur cirkulationen 8,10. Tessa egenskaper gör dem särskilt lämpade för specifik och effektiv målsökning av tumörantigener in vivo 12-20. Vanliga antigenmål av tillgängliga nanobodies är den epidermala tillväxtfaktorreceptorn (EGFR1 eller HER-1), human epidermal tillväxtfaktor typ 2 (HER-2 eller CD340), karcinoembryonalt antigen (CEA) och vaskulär celladhesionsmolekyl-1 (VCAM-1 ) 21. Nanobody konjugat är lovande verktyg för immunterapi och behandling av inflammatoriska sjukdomar 22.
Nyligen genomförda studier har visat att nanobodies medge högre tumör-till-bakgrund (T / B) -ratios än konventionella antikroppar i molekylära bildprogram in vivo 8,17,19. Detta förklaras främst av den relativt fattiga och långsam vävnadspenetration av konventionella antikroppar, långsam clearance ur omlopp och lång uppehållstid i icke-riktade vävnader 23. Dessutom överskott av konventionella antikroppar leder till ospecifik ackumulering in målantigen negativa tumörer orsakas av förbättrad permeabilitet och retention (EPR) effekt 24,25. Detta innebär att högre doser av konventionella antikroppar kan öka inte bara specifika signaler, men även ospecifika signaler, vilket minskar maximala tumör-till-bakgrundsförhållande. I motsats, att öka dosen av nanobodies ökar signalerna från antigenpositiva tumörer men inte av normal vävnad eller antigennegativa tumörer (opublicerade data).
Bortom jämförelse av nanobodies och konventionella antikroppar, vi beskriva en intraindividuell bedömning av antigen-positiva och -negativa xenotransplantat i samma möss för direkt jämförelse av specifika och ospecifika signaler på grund av EPR effekten. De nära infraröda fluoroforenheter konjugerade sonder tillät oss att utnyttja en ensam sond in vivo och ex vivo använder nära infraröd fluorescens avbildning, flödescytometri och fluorescensmikroskopi. Tillämpa våra protokoll tillåter ickeradioaktivt, mycket känslig, och billig optimering av in vivo molecular imaging experiment såsom utvärdering av nya antikroppskonstrukt för specifik tumörmåls.
Syftet med den här guiden studie är att belysa användningen av NIRF-avbildning för utvärdering av nya antikroppskonstrukt i preklinisk molekylär avbildning.
I detta protokoll, var alla experiment utfördes med en smådjurs NIRF-avbildningssystem, en fluorescensaktiverad cellsorterare (FACS) flödescytometer, och ett konfokalmikroskop.
Protocol
OBS: Experiment utfördes i enlighet med internationella riktlinjer för etisk användning av djur och har godkänts av den lokala djurskydds uppdrag av University Medical Center, Hamburg.
1. Beredning av tumörceller, möss och Antibody konstruktioner
- Beredning av lymfomceller och på delning av Basement Matrix (Matrigel).
- Dagen före injektion av tumörceller sätter en steriliserad spetslåda (1000 il tips) och lämplig pipett i -20 ° C frys.
- Tina flaskan med källaren matrisen på is i 4 ° C kylskåp O / N.
- På dagen för injektionen fylla en ishink och placera källaren matrisen tillsammans med pipett, tips och 1 ml sprutor med 30 G nålar på is.
- Alikvot lymfomceller i en volym av 100 | il RPMI-medium i 1,5 ml mikrocentrifugrör och blanda försiktigt med 100 | il av källaren matrisen. Rita upp i förväg kyldsprutor och sätta på is tills injektion.
OBS: Använd god steril teknik och att arbeta på is hela tiden för att förhindra igensättning av källaren matrisen.
- Möss Framställning
- Använd 8-10 veckor gamla atymiska nakna möss (NMRI- Foxn1 n u).
- För att minska autofluorescens av tarmen hålla mössen på en alfalfa-diet under 1 vecka före in vivo imaging.
- För injektion av lymfom celler söva möss att åstadkomma med 2% isofluran i en induktionskammare. Behåll 1-2% isofluran under hela proceduren med en isofluoran grenrör.
- Injicera lymfomceller subkutant i skulderflankerna. För direkt intraindividuella jämförelse injicera antigenpositiva och antigennegativa celler på höger och vänster sida, respektive.
- Använd en tumme och pekfinger för att nypa huden på musen och dra den bort från kroppen av musen. Injicera långsamt och jämnt inpåsen skapas av fingrarna, vilket skapar ett enda kluster av celler under huden. Källaren matrisen hjälper hålla injicerade cellerna på plats.
- Beredning av Antibody konstruktioner
- Märk monoklonala antikroppar och enda domän nanobodies med ett kommersiellt tillgängligt proteinmärkningssats till den fluorescerande färg Alexafluor-680 (AF680) (excitationsvåglängd = 679 nm, emissionsvåglängd = 702 nm) enligt tillverkarens instruktioner. Beräkna antalet färgämnen per Nanobody och konventionell antikropp med användning av molära extinktionskoefficienter av 15.720 mol -1 cm -1 och 203.000 mol -1 cm -1, respektive. Bedöm renhet antikroppskonstrukt med SDS-PAGE storleksfraktionering och Coomassie lysande blå fläck.
- Se till specificiteten av de märkta konjugat genom att utföra en serie in vitro-experiment innan själva imaging studier. Testa specificitet märkt entibody konstruktioner in vitro genom blockeringsstudier och ospecifik isotypkontrollerna 8,20.
OBS: I steg 1.2.4 cellantal för antigennegativa och antigen-positiva celler (eller olika cellinjer) kan behöva anpassas beroende på olika tillväxttakter. För dessa experiment var 0,5x10 6 DC27.10 ARTC2 negativ och 1,5x10 6 DC27.10 ARTC2 positiva celler användes för att erhålla tumörer av liknande storlek. I steg 1.3.1 processen märkning och etikettering effekt av antikroppssonder med fluoroforer kan avvika med märkningen kit som används.
2. In vivo Imaging
- Efter 7-9 dagar, när tumörerna når ~ 8 mm i diameter, injicera 50 ^ g av AlexaFluor680 märkta antikroppskonstruktionerna i en volym av 200 | il koksaltlösning intravenöst i svansvenen hos musen (mAb-AF680: 50 ^ g med 2 färgämnen / molekyl ≈ ~ 4 ^ 14 fluorokromer ≈ ~ 0.8 ug fluorokromer, Nanobody-AF680: 50 μg med 0.3 färgämnen / molekyl ≈ ~ 5.6 ^ 14 fluorokromer ≈ ~ 1.1 ug fluorokromer).
- Initiera bildsystem och söva möss att åstadkomma med 3% isofluran med hjälp av en XGI-8 anestesi-system i induktionskammare före avbildning. Behåll 1-2% isofluran under hela avbildningsförfarandet med hjälp av isofluran grenrör inrymt i avbildning kammaren.
- Positions möss på uppvärmd avbildning scenen med tumörer riktade mot kameran. Övervaka att anesthetization genom att nypa tån eller svansen på djuret; någon reaktion av djuret visar att anestesi är för ljus.
- Övervaka respirationshastigheten; anestesi är för ljus om andningsfrekvensen ökar och för djupt om andningsfrekvensen minskar, djup eller oregelbunden. Skydda djurets hornhinnor med en ögonsalva att förhindra torrhet under narkos.
- Välj fluorescerande filteruppsättningar av 615-665 nm för excitering, 695-770 nm för emission, och 580-610 nm excitation för bakgrundssubtraktion med en 51 2x 512 matrispixelstorlek. Ställ exponeringstid på auto, pixel binning till medium och F / Stopp till 2.
OBS: Kortare exponeringstider möjliggör snabbare frame rates; längre exponeringstider ger större känslighet. Binning styr pixelstorlek på CCD-kamera. Ökning av binning ökar pixelstorlek, känslighet och bildhastighet, men reducerar rumslig upplösning. F / Stop sätter storleken på kameralinsen bländare. Den öppningsstorlek kontrollerar mängden ljus detekteras och djupet av field.Note att inställningarna kan skilja sig genom avbildning enhet och experimentell inrättas. Rådfråga tillverkarens bruksanvisning för optimala resultat.- I optimera exponeringstid bildbehandlingsprogram, F / stopp och pixel binning bygger på uttrycket nivån på cellinje. Ändra dessa inställningar när som helst under ett experiment utan att påverka den kvantitativa resultat. Alternativt låta programmet Imaging Wizard automatiskt bestämmaparametrarna.
- Bild möss före injektion och 6 timmar efter injektion av antikroppskonstrukt.
OBS: Effekten märkningen kan påverka erforderliga dosen som behövs för optimala avbildningsresultat. Därför mängden krävs antikropps konstruktion för optimala avbildningsresultat måste bestämmas empiriskt. Den kan variera beroende på effekten märkning och storlek av konstruktionen liksom tumörmodellen och målet-antigenexpression.
3. Skörd och Beredning av tumörer
- Fyll en ice och placera 4% paraformaldehyd (PFA) fosfatbuffrad saltlösning (PBS) / proteasinhibitor (AEBSF) och PBS / 0,2% bovint serumalbumin (BSA) på is.
- När avbildning session har avslutats, öka koncentrationen av isofluran till 4%. Efter djur upphör andningen, ta bort den från bildstadiet och utföra halsdislokation.
- Montera musen på en frigolit block och spraya med 70% etanol.
- Använd scissors och pincett för att skära den yttre huden och dra den tillbaka försiktigt att exponera tumörer. Ta bort tumörer med skalpell för att säkerställa tumörvävnad förblir intakt.
- Cut tumörer i hälften med hjälp av en skalpell. Placera ena halvan i ett provrör med PBS / AEBSF för FACS analyser och den andra hälften i en 50 ml tub med 4% PFA för immunohistokemi.
- Förberedelse för immunohistokemi
- Förvara tumörer i 4% PFA i kylen vid 4 ° C under 24 h. Överför tumörer till ett rör med PBS / 30% sackaros och förvara i kylskåp vid 4 ° C tills tumör sjunker till botten av röret.
- Skär tumörer i lämpliga bitar för cryomolds. Sätt tumörerna i cryomolds och fyll med oktober förening så att tumörerna är täckta.
- Sätt formar på torris och vänta tills föreningen är helt frusen. Överför frysta tumörer till -80 ° C frys och lagra för immunohistokemi.
- Klipp frysta tumörer i sektioner av 8 um med en mikrotom. Använd standard immunohistokemi-protokollet för att färga med antikropp mot CD31-AF488 att visualisera blodkärl och diamidino-fenylindol (DAPI) för att visualisera kärnor.
OBS: Tumörsektioner är mycket känsliga för ljus eftersom de redan innehåller fluorescerande antikroppar. Minimera exponering för ljus så mycket som möjligt.
- Förberedelse för FACS-analys
- Placera petriskål på is och ta bort kolven från en 2,0 ml spruta. Sätt tumören i cellen sil och skär den försiktigt i 3-4 bitar med hjälp av en skalpell. Häll den initiala PBS i petriskålen och använda den platta änden av kolven för att mosa tumören i cellen silen.
- Spola cellen silen med den initiala PBS för att tvätta ur alla celler med en 10 ml pipett. Överför cellsuspensionen i ett nytt rör och centrifugera vid 500 xg under 5 minuter. Kasta bort supernatanten och återsuspendera cellerna i 10 ml PBS / 0,2% BSA. Räkna celler.
- Alikvotera 1-5 x 10 6 lymfomceller i en 5 ml FACS-rör. Spin celler igen (500xg), kassera supernatanten och återsuspendera i 100 l PBS / 0,2% BSA.
- Eventuellt blockera FcR användning av en anti-CD16 / CD32-mAb (FcgR3 / 2) som binder till FcyR på is under 10 min. Tvätta cellerna en gång med PBS / 0,2% BSA.
- Lägg anti-CD45-mAb att diskriminera leukocyter från andra celler. Inkubera i 20 minuter på is i mörker, följt av två tvättar med PBS / 0,2% BSA.
- Precis innan FACS-analys fläcken med propidiumjodid i 15 min på is för att urskilja döda celler, följt av två tvättar med vanligt PBS. Resuspendera i 150 ul för FACS-analys.
OBS: I steg 3.7.4 och steg 3.7.5 andra antikroppar kan användas beroende på tumör enheten.
4. FACS-analys
- Använd en serie grind verktyg för grind den intressanta populationen i form av stora spridning, dubb diskriminering, uteslutning av döda celler, slussning för CD45 positiva celler, och slussning för antigen positiva celler.
- Först grind ut cellenskräp i en framåtspridning (FSC-A) versus sidospridning (SSC-A) med användning av en två-parameters kurva. Nästa kastas överbord cell dubletter. Slutligen grind ut icke CD45-antigen-positiva (CD45) och döda / döende celler (LD - levande / dead-fläck).
- Rekordprover som använder samma mall för alla experiment.
OBS: Se tillverkarens protokoll för teknisk rådgivning om användning av hårdvara och analytisk mjukvara.
5. Mikroskopisk analys
- Analysera färgade tumör kryosnitt använder en konfokalmikroskop med en oljeimmersionslins (40X objektiv). Använd en Han-Neon 633 nm laser excitation av AF680, en Argon Laser för AF488, och en 405-Diod för DAPI.
- Bearbeta råbilddata med hjälp av en programvara som är kompatibel med mikroskopet. Utför bakgrunds-korrigering och brusfiltrering vid behov. Utför ytterligare bildjusteringar såsom sektione, beskärning samt ljusstyrka och kontrast justering.
- Slutligen GEnerate en enda sammansatt överlägg bild från alla detekteringskanaler. Justera ljusstyrka och kontrast av de enskilda skikten. De sammansatta bilder visar lokalisering av celler (DAPI-fläck, blå), distribution av märkta antikroppskonstrukt (AF680-fläck, röd) och blodkärl (AF488-fläck, grön).
6. In vivo Imaging Analys
- Öppna bildfiler i bildbehandlingsprogram och skapa en överlagringsbild genom att kombinera fotografera bilddata med fluorescens bilddata. Optimera bildvisning genom att ta bort vävnad autofluorescens bakgrundssignal från specifika fluorescerande signalen. Detta kan göras genom att subtrahera bilden förvärvades med en bakgrundsfiltret inställt från bilden förvärvades med filtersatsens specifika för spårämnet.
- Rita identiska cirkulära mätnings regioner av intresse (ROI) runt antigenpositiva tumörer och den antigennegativa tumörer. För att bestämma bakgrundssignalintensitet, placera en cirkulär ROIi ett område av djuret där fluorescenssignalen förväntas vara låg (t.ex., bakbenet).
- Använd samma ROI för alla djur vid alla tidpunkter. För positionering, använd fotografiska svartvita bilder för att identifiera tumörmarginaler.
- Display ROI data i en mätning bord. Använd genomsnittliga strålningseffektivitet uppgifter, vilket möjliggör en mer kvantitativ jämförelse av fluorescerande signaler för ytterligare statistiska analyser.
- Display och jämföra data som absoluta signalintensiteter eller beräkna signal-till-bakgrunds graden med uppmätta ROI data från riktad vävnad och bakgrundsvävnad. Beräkna det tumör-till-bakgrundsförhållande genom att dividera tumörupptag värdet med bakgrundsvärdet bestämdes från bakbenet.
- Som kontroller, även analysera antigen negativa och antigen-positiva tumörer i samma djur samt djur som injicerats med märkta isotypkontroller att bedöma specificiteten av signaler in vivo.
Representative Results
Fluorescensmärkta prober medger kombinationen av olika NIRF-avbildningstekniker (Figur 1A). Vårt mål var att utföra in vivo NIRF-avbildning, flödescytometri, och fluorescensmikroskopi sekventiellt i syfte att jämföra fluorescensmärkta nanobodies och monoklonala antikroppar för specifik in vivo-avbildning (Figur 1B).
Möss injicerades med 50 ^ g av Nanobody och monoklonal antikropp för att utvärdera specificiteten hos de fluorescensmärkta konstrukt för in vivo-avbildning. Resultaten visade specifik märkning av antigenpositiva tumörer med både Nanobody och monoklonal antikropp vid 6 h efter injektion (fig 2). ROI-analyser av de antigenpositiva tumörer uppvisade en mycket högre / B-förhållande T ~ 12 för Nanobody jämfört med ~ 6 för den monoklonala antikroppen. Dessutom visade Nanobody ingen ospecifik signal i antigennegativa tumörer, medanmonoklonal antikropp visade ospecifika confounding signaler i antigennegativa tumörer.
Förutom den icke-specifik signal jämfört med de negativa tumörer, den monoklonala antikroppen inducerade också ospecifika bakgrundssignaler i hela djuret. Detta beror sannolikt på alltför fritt cirkulerande antikroppar, som är för stora för att utsöndras via njurarna. Omvänt djur injicerade med nanobodies visade ospecifika signaler endast i njurarna på grund av renal eliminering av de små nanobodies.
Flödescytometri analyser av tumör cellsuspensioner visade särskild märkning av antigenpositiva tumörceller med både AF680-konjugat 6 timmar efter injektion. Den starkare fluorescenssignalen av Nanobody märkta celler jämfört med monoklonala antikroppar märkta celler återspeglar de in vivo NIRF-imaging resultat. Viktigt är att de flödescytometriska analyser visar att det inte finns någon icke-specifik märkning av antigennegativa celler med endera av de tvåkonstruktioner (Figur 3).
Fluorescensmikroskopi av tumör kryosnitt uppvisade en stark och nästan homogen märkning av antigenpositiva celler med Nanobody 6 h efter injektion. Omvänt uppvisade den monoklonala antikroppen en mycket svagare och ganska inhomogen färgning (Figur 4A). Antigennegativa tumörer uppvisar ingen färgning 6 h efter injektion av Nanobody, medan antigennegativa tumörer injicerade med det konventionella antikroppen visar ospecifik utspridda färgning i det interstitiella utrymmet (Figur 4B).
Figur 1: fluorescens imaging och antikroppskonstrukt. (A) Imaging setup för utvärdering av AF680-konjugat: In vivo NIRF-avbildning följt av flödescytometri och fluorescensmikroskopi. (B
Figur 2: In vivo NIRF-imaging Bilder av fluorescenssignalen av antigen-positiva (+) och antigen-negativa (-) tumörer hos möss som injicerats med Nanobody s + 16a (A) och monoklonal antikropp Nika102 (B). . In vivo imaging utfördes före (0 h) och 6 timmar efter injektion. Signal intensiteter visas som strålningsutbytet (p / sek / cm 2 / sr) / (^ W / cm 2).
Figur 3:Ex vivo-FACS-analyser av cellbundna antikropp konstruktioner från tumör cellsuspensioner. (A) gating strategi för FACS-analyser av tumörceller. (B) Histogram visar mängden av den intravenöst injicerade AF680-konjugerad Nanobody s + 16a och antikropp Nika102 specifikt bunden till tumörceller in vivo. Antigen-negativa tumörer visas som ofyllda histogram och antigen-positiva tumörer visas som fyllda histogram.
Figur 4:. Ex vivo fluorescensmikroskopi (A) Översikt fluorescensmikroskopi av hela antigenpositiva tumör kryosnitt 6 timmar efter injektion av s + 16a 680 eller Nika102 680. Signal intensiteter av in vivo intravenöst iprognostiserade AF680-konjugat utan några sekundära-märkning medel visas i rött. Ex vivo motfärgade kärnor visas i blått och kärl i grönt. Prickade linjer indikerar yttre marginaler hela tumörer. (B) Närbild fluorescensmikroskopi av antigen-positiva och antigennegativa tumörer.
Discussion
Vi använde nära infraröda fluoroformärkt nanobodies och konventionella monoklonala antikroppar riktade mot samma mål på lymfomceller för ett multimodalt jämförelse av in vivo och ex vivo-analyser. Vi visade att nanobodies är väl lämpade som diagnostiska verktyg för snabb och specifik in vivo detektion av lymfom.
In vivo, s + 16a 680 tillät en snabb och mer specifik detektion av ARTC2-positiva xenotransplantat. Bortsett från de olika kinetik för bästa tumör visualisering in vivo, den stora nackdelen av Nika102 680 var den höga ospecifika signalen från ARTC2-negativa tumörer och icke-specifika bakgrundssignaler.
Ex vivo-flödescytometrisk analys av dispergerade celler från dissekerade tumörer uppvisade ingen icke-specifik bindning till ARTC2-negativa lymfomceller av injicerade AF680-konjugat. Ex vivo fluorescens avslöjade stark och nästan homogenlig färgning av celler i ART2C-positiva tumörsektioner vid Nanobody s + 16a, vilket bekräftar att den Nanobody kunde nå även avlägsna områden inom tumören efter 6 timmar. I motsats härtill uppvisade den monoklonala antikroppen svagare och inhomogen färgning av celler i ARTC2-positiva tumörer efter 6 h. Bättre resultat bildbehandling med den konventionella antikroppen kan åstadkommas efter 24 h eller 48 h (data ej visade). För att utföra en grundlig jämförelse av två olika stora konstruktioner, har bildåtergivning vid olika tidpunkter (seriell-imaging) som skall utföras för att identifiera den optimala avbildningstiden punkten för varje konstrukt.
Liksom andra tidigare studier, de resultat som redovisas här understryka att in vivo molecular imaging med märkta nanobodies möjliggör snabb och specifik samma dag tumöravbildning med stor tumör mot bakgrund nyckeltal 12-15,17-19. Omvänt konventionella antikroppar resulterar i låga tumör-till-bakgrund nyckeltal och ospecifika signaler från antigen-negativa tumörer tidigt efter injektion på grund av deras långsamma clearance från kroppen. För att erhålla optimala avbildningsresultat med konventionella antikroppar, imaging tidpunkter 24 h eller ens 48 timmar efter injektion vanligen behövs. Dessa resultat är i överensstämmelse med tidigare studier som har föreslagit att konventionella antikroppar med bevisad terapeutisk fördel har begränsad användbarhet i molekylär avbildning 17,19,26. Därför konventionella antikroppar kan vara ganska lämpad för terapeutiska ändamål på grund av deras långa halveringstid i plasma, medan nanobodies är ganska lämpade för avbildningsändamål på grund av deras snabba clearance från cirkulationen. Dessa skillnader beror på det faktum att varje överskott av de mindre nanobodies (15-17 kDa) elimineras snabbt via renal elimination medan överskottet av större konventionella antikroppar (150 kDa) är kvar i cirkulationen. Så den stora fördelen med nanobodies för molekylär avbildning är den låga bakgrundssignalen vid tidiga avbildning tidpunkter regardless av den injicerade dosen. Detta gör att samma dag avbildning och kan vara att överföra till den kliniska inställningen. Omvänt, konventionella antikroppar måste exakt titreras för att minimera ospecifika bakgrundssignaler, medan tillräckligt specifik signal behålla från riktade vävnaden (opublicerade data).
En av begränsningarna i in vivo NIRF-avbildningsteknik är den låga penetrationsdjup som i allmänhet endast tillåter avbildning av subkutant men inte av orthotopic tumörmodeller. Men kanske denna begränsning övervinnas i en experimentell miljö genom de nyligen utvecklade tomografiska fotoakustiska tekniker som gör att hela kroppen avbildning av levande möss 27. En annan begränsning av NIRF-avbildningsteknik är bedömningen av vävnadsdosen jämfört med radionuklid-medierad avbildning. Emellertid kan nanobodies radiomärkas för positronemissionstomografi (PET) avbildning av xenograft-modeller och exakt kvantitativ bedömning avtracer biofördelning. Faktum våra NIRF-imaging resultat är i överensstämmelse med en färsk studie som jämförde nanobodies och konventionella antikroppar för PET avbildning. Författarna kom även fram till att nanobodies tillåter samma dag avbildning med hög tumör-to-bakgrundsförhållanden 15.
Men bara märkning av antikroppskonstrukt med det nära infraröda fluorescerande färgämne AF680 tillät oss den omfattande in vitro, in vivo och ex vivo fluorescens avbildning jämförelse nära infrarött med hjälp av flödescytometri, fluorescensmikroskopi och NIRF-avbildning. Av denna anledning, och eftersom det är icke-radioaktivt, mycket känslig, billigt, och använder relativt enkel att producera riktade sonder, förespråkar vi användning av NIRF-bildteknik för utvärdering av nya antikroppskonstrukt i preklinisk molekylär avbildning.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av forskarskolan "Inflammation och förnyelse" av Collaborative Research Centre 841 av Deutsche Forschungsgemeinschaft (Alexander Lenz, Valentin Kunick, William Fumey), av Collaborative Research Centre 877 av Deutsche Forschungsgemeinschaft (Friedrich Koch-Nolte) , av Werner Otto Foundation (Peter Bannas), av Wilhelm Sander Foundation (Peter Bannas, Friedrich Koch-Nolte), och av Deutsche Forschungsgemeinschaft (Martin Trepel, Friedrich Haag och Friedrich Koch-Nolte). Vi tackar universitetet Cancer Center Hamburg (UCCH) In Vivo Optisk Imaging Core Facility och personal på UKE för samråd och deras service av hög kvalitet. Core Facility stöddes delvis av bidrag från Deutsche Krebshilfe (tyska Cancer Aid).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AF680 protein labelling kit | Invitrogen | A20172 | |
| Anti-CD16/CD32-antibody | BioXCell | BE0008 | |
| Anti-CD31-antibody | Santa Cruz | sc-1506 | labeled with secondary antibody with AF488 |
| Anti-CD45-antibody V450 | BD Biosciences | 560501 | |
| AxioVision LE software | Zeiss | www.zeiss.com | |
| Basement membrane matrix | BD Biosciences | 354234 | Alternative product can be used |
| Cell strainer 70 µm | Corning | 431751 | Alternative product can be used |
| Confocal microscope | Leica | www.leica-microsystems.com | Leica SP5 with the following lasers: He-Neon for AF680, Argon Laser for AF488, and a 405-Diode for DAPI |
| DAPI | Molcular Probes | D1306 | |
| DC27.10 cells | laboratory specific | Other cells with different surface targets can be used | |
| DPBS | Sigma Aldrich | D8662 | |
| FACS Canto II | BD Biosciences | www.bdbiosciences.com | |
| Flourescence mircoscope | Zeiss | www.zeiss.com | Zeiss Axiovert 200 with Filter Set #32 for AF680: 000000-1031-354 |
| ImageJ software | NIH | http://imagej.nih.gov/ij/ | |
| IVIS 200 | Perkin Elmer | www.perkinelmer.com | Alternative in vivo imaging system can be used |
| Leica LAS software | Leica | www.leica-microsystems.com | Software specific to microscope used |
| Living Image software | Perkin Elmer | www.perkinelmer.com | Software specific to imaging system used |
| Needles 30 G | BD Biosciences | 305128 | Alternative product can be used |
| Nika102-antibody AF680 | laboratory specific | Other antibodies against different surface targets can be used | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | Potential hazards: carcinogenic, can irritate the eyes and skin, contact may cause drying of the skin and/or allergic dermatitis |
| s+16a-nanobody AF680 | laboratory specific | Other antibodies against different surface targets can be used | |
| Syringes 1 ml | Braun | 916 1406 V | Alternative product can be used |
References
- Koch-Nolte, F., et al. Single domain antibodies from llama effectively and specifically block T cell ecto-ADP-ribosyltransferase ART2.2 in vivo. FASEB J. 21, 3490-3498 (2007).
- Koch-Nolte, F., et al. A new monoclonal antibody detects a developmentally regulated mouse ecto-ADP-ribosyltransferase on T cells: subset distribution, inbred strain variation, and modulation upon T cell activation. J Immunol. 163, 6014-6022 (1999).
- Koch-Nolte, F., et al. Use of genetic immunization to raise antibodies recognizing toxin-related cell surface ADP-ribosyltransferases in native conformation. Cell Immunol. 236, 66-71 (2005).
- Bannas, P., et al. Activity and specificity of toxin-related mouse T cell ecto-ADP-ribosyltransferase ART2.2 depends on its association with lipid rafts. Blood. 105, 3663-3670 (2005).
- Bannas, P., et al. Quantitative magnetic resonance imaging of enzyme activity on the cell surface: in vitro and in vivo monitoring of ADP-ribosyltransferase 2 on T cells. Mol Imaging. 9, 211-222 (2010).
- Bannas, P., et al. Transgenic overexpression of toxin-related ecto-ADP-ribosyltransferase ART2.2 sensitizes T cells but not B cells to NAD-induced cell death. Mol Immunol. 48, 1762-1770 (2011).
- Hottiger, M. O., Hassa, P. O., Luscher, B., Schuler, H., Koch-Nolte, F. Toward a unified nomenclature for mammalian ADP-ribosyltransferases. Trends Biochem Sci. 35, 208-219 (2010).
- Bannas, P., et al. In vivo near-infrared fluorescence targeting of T cells: comparison of nanobodies and conventional monoclonal antibodies. Contrast Media Mol Imaging. 9, 135-142 (2014).
- Scheuplein, F., et al. NAD+ and ATP released from injured cells induce P2X7-dependent shedding of CD62L and externalization of phosphatidylserine by murine T cells. J Immunol. 182, 2898-2908 (2009).
- Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
- Wesolowski, J., et al. Single domain antibodies: promising experimental and therapeutic tools in infection and immunity. Med Microbiol Immunol. 198, 157-174 (2009).
- Vaneycken, I., et al. Preclinical screening of anti-HER2 nanobodies for molecular imaging of breast cancer. FASEB J. 25, 2433-2446 (2011).
- Xavier, C., et al. Synthesis, preclinical validation, dosimetry, and toxicity of 68Ga-NOTA-anti-HER2 Nanobodies for iPET imaging of HER2 receptor expression in cancer. J Nucl Med. 54, 776-784 (2013).
- Tchouate Gainkam, L. O., et al. Correlation Between Epidermal Growth Factor Receptor-Specific Nanobody Uptake and Tumor Burden: A Tool for Noninvasive Monitoring of Tumor Response to Therapy. Mol Imaging Biol. 13 (5), 940-948 (2011).
- Vosjan, M. J., et al. Facile labelling of an anti-epidermal growth factor receptor Nanobody with 68Ga via a novel bifunctional desferal chelate for immuno-PET. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 38, 753-763 (2011).
- Oliveira, S., Heukers, R., Sornkom, J., Kok, R. J., van Bergen En Henegouwen, P. M. Targeting tumors with nanobodies for cancer imaging and therapy. Journal Of Controlled Release. 172 (3), 607-617 (2013).
- Kijanka, M., et al. Rapid optical imaging of human breast tumour xenografts using anti-HER2 VHHs site-directly conjugated to IRDye 800CW for image-guided surgery. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 40, 1718-1729 (2013).
- Zaman, M. B., et al. Single-domain antibody bioconjugated near-IR quantum dots for targeted cellular imaging of pancreatic cancer. J Nanosci Nanotechnol. 11, 3757-3763 (2011).
- Oliveira, S., et al. Rapid visualization of human tumor xenografts through optical imaging with a near-infrared fluorescent anti-epidermal growth factor receptor nanobody. Mol Imaging. 11, 33-46 (2012).
- Gainkam, L. O., et al. Comparison of the biodistribution and tumor targeting of two 99mTc-labeled anti-EGFR nanobodies in mice, using pinhole SPECT/micro-CT. J Nucl Med. 49, 788-795 (2008).
- Chakravarty, R., Goel, S., Cai, W. Nanobody: the 'magic bullet' for molecular imaging. Theranostics. 4, 386-398 (2014).
- Siontorou, C. G. Nanobodies as novel agents for disease diagnosis and therapy. International journal of nanomedicine. 8, 4215-4227 (2013).
- Kaur, S., et al. Recent trends in antibody-based oncologic imaging. Cancer Lett. 315, 97-111 (2012).
- Lammers, T., Kiessling, F., Hennink, W. E., Storm, G. Drug targeting to tumors: principles, pitfalls and (pre-) clinical progress. Journal Of Controlled Release. 161, 175-187 (2012).
- Jain, R. K., Stylianopoulos, T. Delivering nanomedicine to solid tumors. Nature reviews. Clinical Oncology. 7, 653-664 (2010).
- Lisy, M. R., et al. In vivo near-infrared fluorescence imaging of carcinoembryonic antigen-expressing tumor cells in mice. Radiology. 247, 779-787 (2008).
- Herzog, E., et al. Optical imaging of cancer heterogeneity with multispectral optoacoustic tomography. Radiology. 263, 461-468 (2012).
