Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Generation af murine pacemaker celleaggregater Baseret på ES-celle-programmering i kombination med Myh6-Promotor-Selection

Published: February 17, 2015 doi: 10.3791/52465

Summary

Denne protokol beskriver, hvordan man producere funktionel sinus nodal væv fra murine pluripotente stamceller (PSC). T-BOX3 (TBX3) overekspression plus kardial myosin-tung-kæde (Myh6) promoter antibiotisk selektion fører til meget rene pacemaker celleaggregater. Disse "induceret sinoatriale-organer" ("iSABs") indeholder over 80% pacemaker celler, viser stærkt forøgede bankende satser og er i stand til at pace myocardium ex vivo.

Abstract

Behandling af "syg sinus-syndrom" er baseret på kunstige pacemakere. Disse er forsynet farer som fiasko og infektioner batteri. Desuden mangler de hormon reaktionsevne og den samlede procedure er omkostningskrævende. "Biologiske pacemakere" genereret fra kvikskranker kan blive et alternativ, men det typiske indhold af pacemaker celler i embryoide legemer (EB'er) er meget lav. Den beskrevne protokol kombinerer "fremad programmering" af murine kvikskranker via sinusknuden inducer TBX3 med Myh6-promotor baseret antibiotikaselektion. Dette giver cardiomyocyte aggregater konsistente på> 80% fysiologisk funktionelle pacemaker celler. Disse "inducerede-sinoatriale-organer" ("iSABs"), er spontant kontraherende ved endnu unåede frekvenser (400-500 bpm), som svarer til nodal celler isoleret fra mus hjerter og er i stand til at pace murine myocardium ex vivo. Ved hjælp af beskrevne protokol yderst ren sinusnodal enkelte celler kan genereres som f.eks kan anvendes til in vitro test af lægemidler. Endvidere kan iSABs genereret ifølge denne protokol blive et afgørende skridt i retning af hjerte tissue engineering.

Introduction

Udtrykket "syg sinus-syndrom" opsummerer flere sygdomme, der fører til en forringelse af pacemaker-systemet. Det består patologisk, symptomatisk sinus bradykardi, sinoatrialt blok, sinusstop samt takykardi-bradykardi syndrom. Derved en "syg sinus-syndrom" ofte ledsaget af generelle hjertesygdomme såsom en iskæmisk hjertesygdom, kardiomyopati eller myocarditis. På nuværende tidspunkt er terapeutiske fremgangsmåder baseret på implantation af elektriske pacemakere. Men går det sammen med en række risici, såsom infektioner og batteri fiasko. Samlet er forekomsten af ​​komplikationer er stadig meget højt i patienter, der har implanteret en kunstig pacemaker. Endvidere, i modsætning til den endogene pacemaker, disse enheder ikke reagerer på hormon stimulation.

En fremtidig alternativ kan påberåbe sig tilgængeligheden af ​​"biologiske pacemakere", hvortil kvikskranker kan tjenesom en passende cellulær kilde, og som også ville være særdeles værdifuldt til in vitro test af lægemidler. Men et stort problem ligger i meget sjældne udseende sinus nodal celler i embryoide organer (EBS) - det typisk ikke overstiger ~ 0,5% 1.

Tidligere blev det vist, at "fremad programmering" til specifikke cardiomyocyte undertyper er muligt via overekspression af forskellige tidlige kardiovaskulære transkriptionsfaktorer såsom Mesoderm-specifik-posterior 1 (MesP1) og NK2 transskription faktor relateret, locus 5 (Nkx2.5) 2, 3. For normal størrelse og funktion sinusknude (SAN), T-box transkriptionsfaktor Tbx3 er afgørende, som har vist sig at indlede pacemaker genet program og til at styre differentieringen af SAN 4. Mens dette forbedrede udseende af funktionelle pacemaker-celler, indholdet stadig ikke overstiger ~ 40% inden for hele cardiomyocytic cellepopulation.

Derfor blev yderligere Myh6-promotoren baseret antibiotisk selektion trin 5 indføres af os. Dette fører i sidste ende til endnu uobserverede cardiomyocyte aggregater ("inducerede sinoatrial organer" iSABs "), der udviser stærkt forøgede slå frekvenser (> 400 bpm) in vitro, for første gang at tilnærme dem af en muse hjerte og kan sammenlignes med in vitro dyrkede sinus nodal celler isoleret fra et muse hjerte 6. Under Isoprenaline administration opnås endog slå frekvenser på 550 bpm. Især iSABs består af over 80% funktionelle nodal celler som det fremgår af en omfattende fysiologiske analyser 7. For nylig, at flere tilgange generere sinus nodal celler ved hjælp af direkte omprogrammering 19, overflademarkører 14 eller farmakologisk behandling med små molekyler 16,17 blev beskrevet. Men ingen af ​​disse metoder har ført til sådan en høj renhed af pacemaker-celler og slå frekvenser tæt på murine hankunst som observeret i iSABs.

Desuden i en ex vivo model for dyrkede voksne mus ventrikulære skiver, der har mistet deres spontane bankende aktivitet, de iSABs er i stand til at integrere ind i skive væv og derved forbliver spontant aktiv og håndfast pacing hjertet skiver til sammentrækninger 7. En detaljeret protokol for generering af Disse udvalg er beskrevet i dette dokument.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Anbefalinger Inden start

  1. Brug ikke kvikskranker forurenet med mycoplasma, fordi de ikke vil differentiere ordentligt ind i sinus node celler. Test for mycoplasma forurening, før du starter protokollen. Gør dette ved hjælp af en PCR kit til hurtig, meget følsom påvisning af mycoplasma og følg manufacturer`s protokol.
  2. For hver petriskål (trin 2.3.4) Coat en 10 cm2 cellekultur skål med sterilt 7 ml 0,1% gelatine fra koldt vand fiskeskind i 1 time ved 37 ° C. Fjern gelatine og lad skålen tør under sterile betingelser i en steril bænk.
  3. Før du kan starte differentiering protokol, du har brug for en dobbelt transficeret stabil mus ES cellelinie klon, der indeholder følgende funktioner: i) Konstitutiv overekspression af TBX3 hjælp af en pattedyrekspressionsvektor. Ii) G418-resistens genet under kontrol af Myh6-promotoren 5.
  4. De udifferentierede PSC celler skal co-dyrked med bestrålede fødeceller under standardbetingelser som beskrevet 1.

2. Differentiering Procedure

  1. To dage før Differentiering - Tag kvikskranker fra feeder-celler.
    1. Aspirer mediet, vask af cellerne med 10 ml phosphatbufret saltvand PBS, tilsættes 7 ml Collagenase IV opløsning og inkuber cellerne i 10 minutter ved 37 ° C. Placer en steril 40 um filter i et 50 ml rør.
    2. Skyl forsigtigt PSC kolonier (undgå at fjerne feeder celler) ved pipettering af collagenaseopløsning op og ned 5 gange.
    3. Overfør cellesuspensionen til en 40 um filter, skylles filteret tre gange med 8 ml PBS. Vend filteret og placere den på hovedet i en petriskål. Fjern PSC cellekolonier ved pipettering 10 ml PBS til bunden af ​​filteret.
    4. Overfør cellesuspensionen til et 15 ml rør og centrifugeres i 5 minutter ved 300 x g.
    5. Fjern PBS, suspendere cellerne i 1 ml Accutase og jegncubate ved 37 ° C i 5 minutter.
    6. Tilsæt 10 ml PBS, bland cellen opløsning ved pipettering op og ned 5 gange og centrifugeres i 5 minutter ved 300 x g.
    7. Fjern PBS suspendere cellerne i 10 ml dyrkningsmedium og bestemme celleantallet.
    8. Seed 15.000 celler / cm2 på en 75 cm2 filter kolbe og dyrke dem i 2 dage ved 37 ° C, 5% CO2. Efter 2 dage kolben bør være 50-70% sammenflydende.
  2. Dag 0 - Start af differentiering
    1. Fjern mediet og vask af cellerne med 10 ml PBS.
    2. Aspirer PBS, tilsættes 2 ml Accutase og inkuber cellerne ved 37 ° C i 5 minutter. Placer en steril 40 um filter i et 50 ml rør.
    3. Tilsæt 10 ml PBS, overføre cellesuspensionen til 40 um filter, skylles filteret via tilsætning af 10 ml PBS og centrifuger gennemløbet i 5 minutter ved 300 x g.
    4. Suspender cellerne i 10 ml differentiering medium og bestemme celleantallet.
    5. Fortynd than cellesuspension med differentiering medium til en slutkoncentration på 20.000 celler / ml.
    6. Pipette 20 ml vand og 5 ml hængende dråbe (HD) opløsning i en kvadratisk petriskål for at undgå udtørring af HDS.
      BEMÆRK: For hver 24-brønds plade indeholdende iSABs (se afsnit 2.8.6.4/2.8.7) start med 16 petriskåle.
    7. Pipette op til 50 ml cellesuspension i en bakke.
    8. Vend låget af petriskålen. Placer 180 HD hver indeholder 20 pi (400 celler / HD) cellesuspension på låget ved hjælp af en 12-kanal pipette.
    9. Vend forsigtigt rundt i låget, og læg den på petriskål.
      BEMÆRK: hastighed dreje rundt låget er meget vigtigt. Hvis låget drejes rundt for langsomt eller for hurtigt, overfladespændingen af ​​cellesuspensionen ikke er høj nok til at bevare den hængende dråber på låget. Før du prøver at fremstille HD for første gang praksis dreje rundt låget med 20 ul dråber medium.
    10. Dyrk cellerne i 2 dage ved 37 ° C, 5% CO2 at lade dem danne EB'er.
      BEMÆRK: Anbring en petriskål fyldt med vand på toppen af ​​en stak af 5 petriskåle. Ellers HD i den øvre petriskål vil tørre.
  3. Dag 2
    1. Drej forsigtigt omkring låget for den kvadratiske petriskål og overføre EBS stammer fra to petriskåle (360 EbS) til et 50 ml rør.
    2. Vent 10 min at lade EB'er bosætte i bunden af ​​røret (Må ikke centrifugeres EBS).
    3. Aspirer så meget medie som muligt, suspendere EBS i 10 ml differentiering medium og overføre suspensionen til en 10 cm petriskål.
  4. Dag 2-6 suspensionskultur
    1. Dyrk EBS i suspension i 4 dage ved 37 ° C, 5% CO 2, ændre medium efter 2 dage.
      NB: Selv om petriskålen ikke er belagt (i modsætning til en cellekultur skål) EBS ofte vedhæfte til overfladen. Styr de petriskåle for vedhæftede EB'er hver dag og om nødvendigt detach EBSfra overfladen ved forsigtig pipettering. Valgfrit: Ryst petriskåle kontinuerligt under suspension kultur periode. Vær forsigtig med hastigheden af ​​shakeren. EBS bør hverken ophobes i midten eller flyde på grænsen af ​​petriskåle.
  5. Dag 6
    1. Overfør EBS fra en petriskål til en gelatineovertrukne 10 cm2 cellekultur skålen.
  6. Dag 7-12
    1. Cellerne bør begynde at slå efter 8-12 dage. Check for at slå foci af cellerne dagligt under et mikroskop. Cellerne begynder at danne et lag.
    2. Skift medium hver dag.
      BEMÆRK: Når du har ændret medium, cellerne kræver 3-4 timer at komme sig og begynde at slå igen.
  7. Dag 12-15 Udvælgelse af sinus nodal celler.
    1. Tre dage efter at cellerne er begyndt at slå (omkring dag 12-15), indsuges medium og 10 ml af frisk differentiering medium indeholdende 400 ug / ml G418 til cellerne.
  8. BEMÆRK: Det er muligt, at cellelaget allerede er adskilt fra overfladen.
    1. Fjern mediet forsigtigt, uden at opsugning cellelaget.
    2. Der tilsættes 10 ml PBS og fjern PBS forsigtigt, uden at aspirere cellen lag.
    3. Tilsæt 10 ml collagenase IV opløsning, overføres cellerne til et 50 ml rør og inkuberes cellerne ved 37 ° C i 5 minutter.
    4. Kraftigt blande suspensionen ved pipettering op og ned 10 gange og inkuberes cellerne ved 37 ° C i 5 minutter. En suspension af små klynger bør forekomme. Hvis der stadig store dele af laget venstre, derefter gentage trin 2.8.4 to gange mere.
    5. Der tilsættes 20 ml PBS og centrifugeres i 10 minutter ved 300 x g.
    6. Aspirer PBS omhyggeligt.
      BEMÆRK: Hvis iSABs skal genereres videre med trin 2.8.7. Hvis ISAB afledt sinus nodal enkeltceller skal genereres gå videre med trin 2.9.
    7. Suspender cellernei 12 ml differentiering medium indeholdende 400 ug / ml G418 og frø dem på 6 brønde af gelatineovertrukne 24 brønde (2 ml / brønd).
  9. Fremstilling af enkeltstrenget nodal celle.
    1. Suspender cellerne fra trin 2.8.6 i 5 ml Accutase og inkuberes ved 37 ° C i 5 minutter.
    2. Kraftigt blande suspensionen ved pipettering op og ned 10 gange og inkuberes cellerne ved 37 ° C i 5 minutter.
    3. Der tilsættes 20 ml PBS og centrifugeres i 5 minutter ved 300 x g.
    4. Suspender cellerne i 12 ml differentiering medium indeholdende 400 ug / ml G418 og frø dem på 6 brønde i en gelatineovertrukne 24 brønde (2 ml / brønd).
  10. Dag 2 efter dissociation, aspireres medium og vaskes cellerne tre gange med PBS. Tilsæt 1 ml differentiering medium / godt.
  11. Dag 4-8 efter dissociation, ændre Medium hver 2. dag. På dag 10 efter Dissociation brug iSABs eller ISAB afledt sinus nodal enkelte celler er til rådighed for yderligere analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den beskrevne protokol tillader generation af iSABs med et bankende frekvens på omkring 450 bpm fra kvikskranker (vist i filmen), som er tæt på musen hjerte slå frekvens. Efter dissociation af iSABs (trin 2.8.8) de observerede enkelte celler viser den typiske form af celler fra sinusknuden (spindel og spider celler) som vist i figur 1. Disse celler stærkt udtrykkelige proteiner, der er kendt for at være af afgørende betydning for den funktion, af sinusknuden som hyperpolarisationsaktiveret cyklisk nukleotid-gated kation kanal 4 (Hcn4), Connexin45 (Cx45), Connexin30.2 (Cx30.2) og Myh6 (figur 2A - C). Efter behandling af ISAB afledte celler med farmaceutiske cellerne viser de forventede adfærd: ligesom i sinusknuden, funny kanal blokker ZD7288 (figur 3A) samt muscarin receptor agonist carbachol (figur 3B), der begge forårsager en signifikant reduceret bankende hyppigheden af ​​ISAB derived celler. Den β-adrenoreceptor agonist isoprenalin fører til en forhøjet slagfrekvens (figur 3C).

Figur 1
Figur 1: Cellular form af spindel og spider celler Typisk cellulær form af ISAB afledt spindel (A) og spider (B) nodal celle. Scale bar 20 pm.

Figur 2
Figur 2: Ekspression af sinus node markører. (A) Ekspression af HCN4 (gul) og Cx45 (magenta), (B) Ekspression af Cx45 (magenta) og Cx30.2 (gul) og (C) Myh6 (magenta) i sinusknuden celler. Kontrastfarvning af kerner (turkis). Scale bar 20 pm.


Figur 3: Farmakologisk behandling af iSABs repræsentant slagfrekvens af iSABs før (kontrol) og efter behandling med ZD7288 (A), carbachol (B) og isoprenalin (C). Dataene repræsenterer otte uafhængige iSABs og præsenteres som gennemsnit ± SD. *** P <0,001

Figur 4
Figur 4: Skematisk af differentiering protokollen. Forenklet tegneserie afspejler den eksperimentelle flow-chart for ISAB generation.

Film:. Slå af iSABs slå af en typisk induceret sinoatriale krop (ISAB) efter dissociation anbringendeSE klik her for at se denne video.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Evnen til at producere stamceller afledt pacemaker-celler kan tillade rekonstituering af korrekt hjerterytme i betydningen "biologiske pacemakere". Ligeledes vil narkotikatests in vitro drage fordel af deres tilgængelighed. Kvikskranker kan give anledning til en celle type pattedyrs krop, herunder kardiomyocytter med pacemaker celleegenskaber 8,9,10,11,12,13. Men typisk cellepopulationerne inden "embryoide legemer" er meget heterogene, hvilket uundgåeligt fører til krav om pålidelige udvælgelse og isolation strategier - det gælder især for den meget sjældne celletype af hjerte-nodal celler. Talrige metoder baseret på eksogene og endogene overflademarkører 14 om farmakologisk administration af små molekyler 15,16,17 og på direkte omprogrammering strategier 18,19 er blevet fulgt. Desuden ikke-stamme-cellebaserede midler til formål at efterligne biologiske pacemakerevia manipulation af terminale effektormolekyler underliggende sarcolemmal elektrofysiologi i stedet for de novo genererer fuldt funktionelle nodal celler 20,21.

Men ingen af ​​disse kom op med de nødvendige høje spontane sammentrækning frekvenser og cellulær renhed. I modsætning hertil vores protokol medfører celler, som ikke blot udviser elektriske svingninger, men også de subtile elektrofysiologiske og calcium signalering beskaffenhed samt karakteristiske morfologiske træk af endogene pacemaker celler 7. Denne teknologi kan blive en vigtig forudsætning for alternativer til elektroniske pacing enheder.

Selv om denne protokol blev optimeret i løbet af dets udvikling, er der stadig nogle trin, der kan forårsage problemer: Udgangspunktet for udvælgelsen af ​​ISAB er kritisk over for protokollen. Slå af cellerne er en indikator for αMHC-ekspression i differentierende celler. Myh6-Expression går sammen med expression af G418 resistensgenet. Start af for tidligt vil slukke en masse af celler, som potentielt ville differentiere i cardiomyocytter og vil derfor reducere det samlede udbytte af sinus nodal celler. En anden kritisk trin er dissociation af cellelaget (trin 2.8). Grunden til dette er, at cellerne danner en robust ekstracellulær matrix og en stærk kraft er nødvendig for at adskille cellelaget. Hvis det er nødvendigt, skal trin 2.8.4 gentages indtil små klynger af celler har udviklet sig fra cellen lag. Undgå direkte dissociation af cellelaget ved fx trypsin, fordi det viste sig at være af meget lav effektivitet.

For fremtidige kliniske anvendelser, stadig har brug for følgende hindringer, der skal løses: overførsel af tilgangen til generering af humane iSABs som kan blive et afgørende skridt i retning af fremtidig celleterapi og in vitro drug-test. Desuden er teknikken stadig baseret på et stabilt genetisk modifikationer af PSC og vil derfor være nødvendigt at ændre, før den kan anvendes til patienter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Iscove's liquid medium with stable glutamine Biochrom AG FG 0465
DMEM liquid medium without Na-pyruvate, with stable glutamine Biochrom AG FG 0435
CLS type IV, CLS IV Biochrom AG C4-22
Non-essential amino acids Biochrom AG K 0293
FBS Superior Biochrom AG S 0615
Sodium pyruvate (100 mM) Biochrom AG L 0473
G 418-BC liquid (ready-to-use solution), sterile Biochrom AG A 2912
Reagent reservoir PP f.multichannel pip. 60ml,sterile Brand 703409
Accutase eBioscience,Inc. 00-4555-56
Eppendorf Xplorer/Xplorer plus, electronic pipette Eppendorf 4861000155
Falcon Cell Strainer 40 µm Falcon 352340
Penicillin/Streptomycin  GE Healthcare P11-010
Petri Dishes Greiner BioOne 663102
DPBS without Ca and Mg PAN-Biotech P04-36500
Fetal bovine serum PAN-Biotech P30-3302
Leukemia inhibitory factor Phoenix Europe GmbH LIF-250
Quadratic petri dishes Roth PX67.1
Gelatin from cold water fish skin SigmaAldrich G7765
2-Mercaptoethanol SigmaAldrich M3148 
1-Thioglycerol SigmaAldrich M6145
Tissue culture dishes TPP 93100
Tissue culture flask TPP 90076
Tissue culture test plates (24 well) TPP 92424

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wobus, A. M., Wallukat, G., Hescheler, J. Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers. Differentiation. 48 (3), 173-182 (1991).
  2. David, R., et al. MesP1 drives vertebrate cardiovascular differentiation through Dkk-1-mediated blockade of Wnt-signalling. Nat Cell Biol. 10, 338-345 (2008).
  3. David, R., et al. Forward programming of pluripotent stem cells towards distinct cardiovascular cell types. Cardiovasc Res. 84 (2), 263-272 (2009).
  4. Hoogaars, W. M., et al. Tbx3 controls the sinoatrial node gene program and imposes pacemaker function on the atria. Genes Dev. 21 (9), 1098-1112 (2007).
  5. Klug, M. G., Soonpaa, M. H., Koh, G. Y., Field, L. J. Genetically selected cardiomyocytes from differentiating embronic stem cells form stable intracardiac grafts. J Clin Invest. 98 (1), 216-224 (1996).
  6. Marger, L., et al. Pacemaker activity and ionic currents in mouse atrioventricular node cells. Channels (Austin). 5 (3), 241-250 (2011).
  7. Jung, J. J., et al. Programming and isolation of highly pure physiologically and pharmacologically functional sinus-nodal bodies from pluripotent stem cells). Stem cell reports. 2 (5), 592-605 (2014).
  8. Maltsev, V. A., Wobus, A. M., Rohwedel, J., Bader, M., Hescheler, J. Cardiomyocytes differentiated in vitro from embryonic stem cells developmentally express cardiac-specific genes and ionic currents. Circulation research. 75 (2), 233-244 (1994).
  9. He, J. Q., Ma, Y., Lee, Y., Thomson, J. A., Kamp, T. J. Human embryonic stem cells develop into multiple types of cardiac myocytes: action potential characterization. Circ Res. 93 (1), 32-39 (2003).
  10. Yanagi, K., et al. Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels and T-type calcium channels confer automaticity of embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem cells. 25 (11), 2712-2719 (2007).
  11. Barbuti, A., et al. Molecular composition and functional properties of f-channels in murine embryonic stem cell-derived pacemaker cells. J Mol Cell Cardiol. 46 (3), 343-351 (2009).
  12. Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American journal of physiology. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301 (5), H2006-H2017 (2011).
  13. David, R., Franz, W. M. From pluripotency to distinct cardiomyocyte subtypes. Physiology (Bethesda). 27 (3), 119-129 (2012).
  14. Scavone, A., et al. Embryonic stem cell-derived CD166+ precursors develop into fully functional sinoatrial-like cells). Circ Res. 113 (4), 389-398 (2013).
  15. Morikawa, K., et al. Identification, isolation and characterization of HCN4-positive pacemaking cells derived from murine embryonic stem cells during cardiac differentiation. Pacing Clin Electrophysiol. 33 (33), 290-303 (2010).
  16. Wiese, C., et al. Formation of the sinus node head and differentiation of sinus node myocardium are independently regulated by Tbx18 and Tbx3. Circ Res. 104 (3), 388-397 (2009).
  17. Kleger, A., et al. Modulation of calcium-activated potassium channels induces cardiogenesis of pluripotent stem cells and enrichment of pacemaker-like cells. Circulation. 122 (18), 1823-1836 (2010).
  18. Bakker, M. L., et al. T-box transcription factor TBX3 reprogrammes mature cardiac myocytes into pacemaker-like cells. Cardiovasc Res. 94 (3), 439-449 (2012).
  19. Kapoor, N., Liang, W., Marban, E., Cho, H. C. Direct conversion of quiescent cardiomyocytes to pacemaker cells by expression of Tbx18. Nat Biotechnol. 31 (1), 54-62 (2013).
  20. Johns, D. C., et al. Adenovirus-mediated expression of a voltage-gated potassium channel in vitro (rat cardiac myocytes) and in vivo (rat liver). A novel strategy for modifying excitability. J Clin Invest. 96 (2), 1152-1158 (1995).
  21. Nuss, H. B., Marban, E., Johns, D. C. Overexpression of a human potassium channel suppresses cardiac hyperexcitability in rabbit ventricular myocytes. J Clin Invest. 103 (6), 889-896 (1999).

Tags

Developmental Biology murine pluripotente stamceller (PSC) syg sinus-syndrom iSABs inducerede sinoatrialt organer kardiomyocytter pacemaker
Generation af murine pacemaker celleaggregater Baseret på ES-celle-programmering i kombination med Myh6-Promotor-Selection
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rimmbach, C., Jung, J. J., David, R. More

Rimmbach, C., Jung, J. J., David, R. Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection. J. Vis. Exp. (96), e52465, doi:10.3791/52465 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter