Summary
Denne protokollen beskriver hvordan å produsere funksjonelle sinus nodal vev fra murine pluripotente stamceller (PSC). T-BOX3 (TBX3) overekspresjon pluss hjerte Myosin-heavy-kjeden (Myh6) promoter antibiotika utvalg fører til svært rene pacemaker celle aggregater. Disse "Induced-sinoatriell-organer" ("iSABs") har over 80% pacemakerceller, viser sterkt økte juling priser og er i stand til tempo myokard ex vivo.
Abstract
Behandling av "syk sinus syndrom" er basert på kunstig pacemaker. Disse bærer farer som batterifeil og infeksjoner. Dessuten mangler de hormonrespons og den samlede fremgangsmåte er kostnadskrevende. "Biologiske pacemakere" generert fra PSC avtaler kan bli et alternativ, men typisk innhold av pacemakerceller i embryoid Bodies (EBS) er ekstremt lav. Den beskrevne protokollen kombinerer "forward programmering" av murine PSC avtaler via sinusknuten indus TBX3 med Myh6-promoter basert antibiotika utvalg. Dette gir cardiomyocyte aggregater konsistente av> 80% fysiologisk funksjonelle pacemakerceller. Disse "indusert-sinoatriell-organer" ("iSABs") er spontant kontrahering på ennå unådde frekvenser (400-500 bpm) som tilsvarer nodal celler isolert fra mus hjerter og er i stand til å tempo murine myocardium ex vivo. Ved hjelp av den beskrevne protokollen svært ren sinusnodal enkeltceller kan genereres som for eksempel kan anvendes for in vitro legemiddeltesting. Videre kan iSABs generert i henhold til denne protokollen bli et avgjørende skritt mot hjertet tissue engineering.
Introduction
Begrepet "sick sinus syndrom" oppsummerer flere sykdommer som fører til forverring av pacemaker system. Det består av patologisk, symptomatisk sinus bradykardi, sinus blokk, sinusarrest samt takykardi-bradykardi syndrom. Dermed er en "syk sinus syndrom" ofte ledsaget av generelle hjertesykdommer som for eksempel en iskemisk hjertesykdom, kardiomyopati eller myokarditt. I dag er terapeutiske metoder basert på implantasjon av elektriske pacemakere. Men går dette sammen med en rekke risikoer som infeksjoner og batterifeil. Totalt sett er forekomsten av komplikasjoner fortsatt svært høy hos pasienter som har implantert et kunstig pacemaker. Videre, i motsetning til den endogene pacemaker, disse enhetene ikke svare på hormonstimulering.
En fremtidig alternativ kan stole på tilgjengeligheten av "biologiske pacemakere" som PSC avtaler kan tjenesom en egnet cellulær kilde, og som også ville være meget verdifull for in vitro legemiddeltesting. Ennå, ligger et stort problem i svært sjeldne utseende sinus nodal celler innenfor embryoid organer (EBS) - dette vanligvis ikke overstiger ~ 0,5% 1.
Tidligere ble det vist at "forover programmering" mot spesifikke cardiomyocyte subtyper er mulig via overekspresjon av forskjellige kardiovaskulære tidlige transkripsjonsfaktorer slik som mesoderm-spesifikk-posterior 1 (MesP1) og NK2-transkripsjonsfaktor relatert, locus 5 (Nkx2.5) 2, 3. For normal størrelse og funksjon av den sinusnode (SAN), er T-box transkripsjonsfaktor Tbx3 avgjørende, noe som har vist seg å initiere pacemakeren genet program og å kontrollere differensiering av SAN 4. Mens denne forbedrede synligheten av funksjonelle pacemakerceller, innholdet fremdeles ikke overskred ~ 40% i løpet av hele cardiomyocytic cellepopulasjonen.
Derfor ble en ytterligere Myh6-promotor basert antibiotiske seleksjonstrinnet 5 innført av oss. Dette fører til slutt til enda unobserved cardiomyocyte aggregater ("indusert sino-atriale legemer" iSABs "), som utviser meget Øket maling frekvenser (> 400 bpm) in vitro, for første gang er tilnærmet de av en murin hjerte og sammenlignes med in vitro dyrket sinus nodal celler isolert fra en murine hjerte til 6. Under isoprenaline administrasjonen selv slo frekvenser på 550 bpm er oppnådd. Spesielt, iSABs består av over 80% funksjonelle nodal celler som fremgår av omfattende fysiologiske analyser 7. Nylig, til flere tilnærminger generere sinus nodal celler ved hjelp av direkte omprogrammering 19 markører overflate 14 eller farmakologisk behandling med små molekyler 16,17 ble beskrevet. Likevel har ingen av disse fremgangsmåter ført til en så høy renhet pacemakerceller og stolpene frekvenser i nærheten av den murine hanart som er observert i iSABs.
Videre, i en ex vivo-modell av dyrkede voksen mus ventrikulære skiver som har mistet sin spontane bankende aktivitet, de iSABs er i stand til å integrere inn i stykke vev, og derved gjenværende spontant aktive og robust pacing hjerteskivene til sammentrekninger 7. En detaljert protokoll for generering av disse iSABs er beskrevet i denne artikkelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Anbefalinger Før start
- Ikke bruk PSC avtaler forurenset med mycoplasma, fordi de ikke vil skille ordentlig inn i sinusknuten celler. Test for mycoplasma forurensning før protokollen. Gjør dette ved hjelp av en PCR kit for rask, svært følsom påvisning av mykoplasma og følge produsenten `protokollen.
- For hver petriskål (trinn 2.3.4), frakk ett 10 cm 2 cellekultur tallerken med steril 7 ml 0,1% gelatin fra kaldtvannsfisk huden i 1 time ved 37 ° C. Ta av gelatin og la formen tørke under sterile betingelser i et sterilt benk.
- Før du kan begynne differensiering protokollen du trenger en dobbel transfektert stabil mus ES cellelinje klone som inneholder følgende funksjoner: i) Constitutive over-uttrykk for TBX3 bruker en pattedyrekspresjonsvektor. Ii) Den G418-resistens-genet under kontroll av den Myh6-promoter 5.
- De udifferensierte pscs cellene skal være co-dyrked med bestrålte feeder-celler i henhold til standard betingelser som beskrevet 1.
2. Differensiering Prosedyre
- To dager før Differensiering - Fjern PSC avtaler fra mateceller.
- Aspirere mediet, cellene vaskes med 10 ml fosfatbufret saltoppløsning PBS, tilsett 7 ml Collagenase IV-løsning og inkuberes cellene i 10 minutter ved 37 ° C. Plasser en steril 40 um filter i et 50 ml rør.
- Nøye skyll PSC kolonier (unngå å fjerne feeder-celler) ved pipettering av kollagenase løsningen opp og ned fem ganger.
- Overfør cellesuspensjonen til en 40 um filter skylles filteret tre ganger med 8 ml PBS. Snu deg rundt filteret og legg den opp ned i en petriskål. Fjern de PSC cellekolonier ved å pipettere 10 ml PBS til bunnen av filteret.
- Overfør cellesuspensjonen til et 15 ml rør og sentrifuger i 5 minutter ved 300 x g.
- Ta av PBS, suspendere cellene i 1 ml Accutase og jegncubate ved 37 ° C i 5 min.
- Tilsett 10 ml PBS, blanding av celleløsningen ved å pipettere opp og ned 5 ganger og sentrifuger i 5 minutter ved 300 x g.
- Fjern PBS, suspendere cellene i 10 ml kultiveringsmedium og bestemme celleantallet.
- Seed 15.000 celler / cm2 på en 75 cm to filterkolben og dyrke dem i 2 dager ved 37 ° C, 5% CO2. Etter 2 dager i kolben bør være 50-70% sammenflytende.
- Dag 0 - Start av Differensiering
- Fjern mediet og vask av cellene med 10 ml PBS.
- Aspirer PBS, tilsett 2 ml Accutase og inkuberes cellene ved 37 ° C i 5 min. Plasser en steril 40 um filter i et 50 ml rør.
- Tilsett 10 ml PBS, overføre cellesuspensjonen til 40 um filter skylles filteret via tilsetning av 10 ml PBS og sentrifugegjennomstrømnings i 5 min ved 300 x g.
- Suspender cellene i 10 ml differensieringsmedium og bestemme celleantallet.
- Fortynne tHan cellesuspensjon med differensieringsmedium til en endelig konsentrasjon på 20 000 celler / ml.
- Pipetter 20 ml vann og 5 ml hengende dråpe (HD) oppløsning i en kvadratisk petriskål for å unngå uttørking av HDS.
MERK: For hver 24 brønners plate som inneholder iSABs (se avsnitt 2.8.6.4/2.8.7) starte med 16 petriskåler. - Pipette opp til 50 ml cellesuspensjon i en skuff.
- Snu lokket på petriskålen. Plassere 180 HDS hver inneholder 20 mikroliter (400 celler / HD) cellesuspensjon på lokket ved hjelp av en 12 kanals pipette.
- Snu forsiktig rundt lokket og plasser det i petriskål.
MERK: Hastigheten på å snu lokket er svært viktig. Hvis lokket er snudd for sakte eller for fort, er overflatespenningen av cellesuspensjonen ikke er høy nok til å beholde den hengende dråper på lokket. Før du prøver å produsere HDS for første gang praksis snu rundt lokket med 20 mL dråper medium. - Dyrke cellene i 2 dager på tre7 ° C, 5% CO 2 for å la dem danne EBS.
MERK: Plasser en petriskål fylt med vann på toppen av en stabel av 5 petriskåler. Ellers HD i den øvre petriskål vil tørke.
- Dag 2
- Snu forsiktig rundt lokket av den kvadratiske petriskål og overføre EBS avledet fra to petriskåler (360 EBS) til en 50 ml tube.
- Vent 10 minutter for å la de EBS bosette nederst i røret (Ikke sentrifuger EBS).
- Aspirer så mye medium som mulig, suspendere EBS i 10 ml differensiering medium og overføre suspensjonen til en 10 cm petriskål.
- Dag 2-6 Suspensjon kultur
- Dyrke EBS i suspensjon for 4 dager ved 37 ° C, 5% CO 2, endre medium etter 2 dager.
MERK: Selv om petriskål ikke er belagt (i motsetning til en cellekulturskål) EBS ofte fester seg til overflaten. Styr petriskåler for vedlagte EBS hver dag og om nødvendig løsne EBSfra overflaten ved forsiktig pipettering. Valgfritt: Rist de petriskåler kontinuerlig i løpet av suspensjonskultur periode. Vær forsiktig med hastigheten på shaker. EBS bør verken akkumuleres i midten og heller flyte til grensen av petriskåler.
- Dyrke EBS i suspensjon for 4 dager ved 37 ° C, 5% CO 2, endre medium etter 2 dager.
- Dag 6
- Overfør EBS fra en petriskål til ett gelatin belagt 10 cm 2 cellekultur parabolen.
- Dag 7-12
- Cellene skulle begynne å slå etter 8-12 dager. Sjekk for å slå foci av cellene daglig under et mikroskop. Cellene begynne å danne et lag.
- Endre medium daglig.
MERK: Etter å endre medium, cellene krever 3-4 timer å komme seg og til å begynne å slå igjen.
- Dag 12-15 Valg av sinus nodal celler.
- Tre dager etter at cellene har begynt stolpene (rundt dag 12 til 15), aspireres mediet og pipettes 10 ml friskt medium inneholdende differensiering 400 ug / ml G418 i cellene.
- Fjern mediet forsiktig uten aspirering av cellelaget.
- Tilsett 10 ml PBS og fjern forsiktig PBS uten aspirering av cellelaget.
- Tilsett 10 ml Collagenase IV løsning, overføre cellene til et 50 ml rør og inkuberes cellene ved 37 ° C i 5 min.
- Kraftig blande suspensjonen ved å pipettere opp og ned 10 ganger, og cellene inkuberes ved 37 ° C i 5 min. En suspensjon av små klaser skulle oppstå. Hvis det fremdeles er store deler av laget igjen, gjenta deretter trinn 2.8.4 to ganger til.
- Tilsett 20 ml PBS og sentrifuger i 10 minutter ved 300 x g.
- Aspirer PBS nøye.
MERK: Hvis iSABs skal genereres fortsette med trinn 2.8.7. Hvis iSAB avledet sinus nodal enkeltceller skal genereres gå videre med trinn 2.9. - Suspendere cellenei 12 ml differensieringsmedium inneholdende 400 pg / ml G418 og frø dem på 6 brønner med gelatin belagte 24 brønner (2 ml / brønn).
- Generasjon av enkelt nodal celle.
- Suspender cellene fra trinn 2.8.6 i 5 ml Accutase og inkuber ved 37 ° C i 5 min.
- Kraftig blande suspensjonen ved å pipettere opp og ned 10 ganger, og cellene inkuberes ved 37 ° C i 5 min.
- Tilsett 20 ml PBS og sentrifuger i 5 minutter ved 300 x g.
- Suspender cellene i 12 ml differensieringsmedium inneholdende 400 pg / ml G418 og frø dem på 6 brønner i en gelatin belagte 24 brønner (2 ml / brønn).
- Dag 2 etter dissosiasjon, aspirere mediet, og cellene vaskes tre ganger med PBS. Tilsett 1 ml differensiering middels / godt.
- Dag 4-8 etter dissosiasjon, endre Medium hver 2. dag. På dag 10 etter Dissosiasjon bruk iSABs eller iSAB avledet sinus nodal enkeltceller er tilgjengelig for videre analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den beskrevne protokollen tillater generering av iSABs med juling frekvens på rundt 450 bpm fra PSC avtaler (vist i filmen) som er i nærheten til muse hjertet slo frekvens. Etter dissosiering av iSABs (trinn 2.8.8) de observerte enkeltceller viser den typiske formen på cellene i sinusknuten (spindel og edderkopp-celler), som vist i figur 1. Disse cellene sterkt uttrykte proteiner som er kjent for å være essensiell for funksjonen av sinusknuten som hyperpolarization-aktivert syklisk nukleotid-gated kation kanal 4 (Hcn4), Connexin45 (Cx45), Connexin30.2 (Cx30.2) og Myh6 (Figur 2A - C). Etter behandling av iSAB avledede celler med legemidler, cellene viser forventet oppførsel: som i sinusknuten, morsomme kanalblokker ZD7288 (figur 3A) samt den muskariniske reseptor agonist karbakol (figur 3B), både føre til en betydelig redusert vibrerende frekvens av iSAB derived celler. Den β-adrenoreseptor-agonist isoprenalin fører til en forhøyet vibrerende frekvens (figur 3C).
Figur 1: Cellular formen på spindelen og spider celler Typisk cellulær form av iSAB avledet spindelen (A) og en spider (B) nodal celle. Skala bar 20 mikrometer.
Figur 2: Uttrykk for sinus node markører. (A) Expression of HCN4 (gul) og Cx45 (magenta), (B) Expression of Cx45 (magenta) og Cx30.2 (gul) og (C) Myh6 (magenta) i sinusknuten celler. Kontra kjerner (turkis). Skala bar 20 mikrometer.
Figur 3: Farmakologisk behandling av iSABs Representative stolpene frekvens på iSABs før (kontroll) og etter behandling med ZD7288 (A), Carbachol (B) og isoprenalin (C). Dataene representerer åtte uavhengige iSABs og er presentert som gjennomsnitt ± SD. *** P <0,001
Figur 4: Skjematisk av differensiering protokollen. Forenklet tegneserie som gjenspeiler den eksperimentelle flytskjema for iSAB generasjon.
Film:. Beating av iSABs Beating av en typisk indusert sinoatriell kroppen (iSAB) etter dissosiasjon PleaSE klikk her for å se denne videoen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Evnen til å produsere stamcelle avledet pacemaker celler kan tillate rekonstituering av riktig hjerterytmen i betydningen "biologiske pacemaker". Likeledes vil dopingprøver in vitro dra nytte av deres tilgjengelighet. PSC avtaler kan gi opphav til en hvilken som helst celletype av pattedyrkroppen inkludert cardiomyocytes med pacemaker celle egenskaper 8,9,10,11,12,13. Men typisk celle populasjoner innenfor "embryoid Bodies" er svært heterogen, noe som uunngåelig fører til kravet om pålitelig valg og isolasjon strategier - dette gjelder spesielt for den svært sjeldne celle type hjerte nodal celler. Mange måter basert på eksogene og endogene overflaten markører 14, på farmakologisk administrasjon av små molekyler 15,16,17 og på direkte omprogrammering strategier 18,19 har blitt fulgt. I tillegg er ikke-stilk-celle-baserte metoder som tar sikte på å simulere biologiske pacemakerevia manipulering av terminal effektormolekyler underliggende sarcolemmal elektrofysiologi i stedet for de novo genererer fullt funksjonelle nodal celler 20,21.
Men ingen av disse kom opp med de nødvendige høye spontane sammentrekning frekvenser og cellulær renhet. I kontrast, fører vår protokoll til celler som ikke bare utviser elektriske svingninger, men også de subtile elektrofysiologisk og kalsium signalegenskaper samt karakteristiske morfologiske trekk ved endogene pacemakerceller 7. Denne teknologien kan bli en viktig forutsetning for alternativer til elektroniske pace enheter.
Selv om denne protokollen ble optimalisert i løpet av sin utvikling, er det fortsatt noen trinn som kan forårsake problemer: Utgangspunktet for valg av iSAB er kritisk til protokollen. Juling av cellene er en indikator for αMHC-Expression i differensierende celler. Myh6-Expression går sammen med expression av G418 motstand genet. Starte utvalg for tidlig vil slukke mye av cellene som potensielt ville differensiere inn kardiomyocytter og vil derfor redusere det totale utbyttet av sinus nodal celler. Et annet kritisk punkt er dissosiasjonen av cellelaget (trinn 2.8). Grunnen til dette er at cellene danner en robust ekstracellulær matriks og en sterk kraft som er nødvendig for å dissosiere cellelaget. Om nødvendig, bør skritt 2.8.4 gjentas til små klynger av celler har utviklet seg fra cellelaget. Unngå direkte dissosiasjon av cellelaget ved f.eks trypsin, fordi det viste seg å være av meget lav virkningsgrad.
For fremtidige kliniske anvendelser, følgende hindringer fortsatt må tas opp: overføring av tilnærmingen til generering av menneskelige iSABs som kan bli et avgjørende skritt mot fremtidig celleterapi og in vitro narkotika-testing. Dessuten er teknikken fortsatt basert på stabil genmodifiseringerkationer av pscs og derfor må endres før det kan anvendes på pasienter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iscove's liquid medium with stable glutamine | Biochrom AG | FG 0465 | |
| DMEM liquid medium without Na-pyruvate, with stable glutamine | Biochrom AG | FG 0435 | |
| CLS type IV, CLS IV | Biochrom AG | C4-22 | |
| Non-essential amino acids | Biochrom AG | K 0293 | |
| FBS Superior | Biochrom AG | S 0615 | |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Biochrom AG | L 0473 | |
| G 418-BC liquid (ready-to-use solution), sterile | Biochrom AG | A 2912 | |
| Reagent reservoir PP f.multichannel pip. 60ml,sterile | Brand | 703409 | |
| Accutase | eBioscience,Inc. | 00-4555-56 | |
| Eppendorf Xplorer/Xplorer plus, electronic pipette | Eppendorf | 4861000155 | |
| Falcon Cell Strainer 40 µm | Falcon | 352340 | |
| Penicillin/Streptomycin | GE Healthcare | P11-010 | |
| Petri Dishes | Greiner BioOne | 663102 | |
| DPBS without Ca and Mg | PAN-Biotech | P04-36500 | |
| Fetal bovine serum | PAN-Biotech | P30-3302 | |
| Leukemia inhibitory factor | Phoenix Europe GmbH | LIF-250 | |
| Quadratic petri dishes | Roth | PX67.1 | |
| Gelatin from cold water fish skin | SigmaAldrich | G7765 | |
| 2-Mercaptoethanol | SigmaAldrich | M3148 | |
| 1-Thioglycerol | SigmaAldrich | M6145 | |
| Tissue culture dishes | TPP | 93100 | |
| Tissue culture flask | TPP | 90076 | |
| Tissue culture test plates (24 well) | TPP | 92424 |
References
- Wobus, A. M., Wallukat, G., Hescheler, J. Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers. Differentiation. 48 (3), 173-182 (1991).
- David, R., et al. MesP1 drives vertebrate cardiovascular differentiation through Dkk-1-mediated blockade of Wnt-signalling. Nat Cell Biol. 10, 338-345 (2008).
- David, R., et al. Forward programming of pluripotent stem cells towards distinct cardiovascular cell types. Cardiovasc Res. 84 (2), 263-272 (2009).
- Hoogaars, W. M., et al. Tbx3 controls the sinoatrial node gene program and imposes pacemaker function on the atria. Genes Dev. 21 (9), 1098-1112 (2007).
- Klug, M. G., Soonpaa, M. H., Koh, G. Y., Field, L. J. Genetically selected cardiomyocytes from differentiating embronic stem cells form stable intracardiac grafts. J Clin Invest. 98 (1), 216-224 (1996).
- Marger, L., et al. Pacemaker activity and ionic currents in mouse atrioventricular node cells. Channels (Austin). 5 (3), 241-250 (2011).
- Jung, J. J., et al. Programming and isolation of highly pure physiologically and pharmacologically functional sinus-nodal bodies from pluripotent stem cells). Stem cell reports. 2 (5), 592-605 (2014).
- Maltsev, V. A., Wobus, A. M., Rohwedel, J., Bader, M., Hescheler, J. Cardiomyocytes differentiated in vitro from embryonic stem cells developmentally express cardiac-specific genes and ionic currents. Circulation research. 75 (2), 233-244 (1994).
- He, J. Q., Ma, Y., Lee, Y., Thomson, J. A., Kamp, T. J. Human embryonic stem cells develop into multiple types of cardiac myocytes: action potential characterization. Circ Res. 93 (1), 32-39 (2003).
- Yanagi, K., et al. Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels and T-type calcium channels confer automaticity of embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem cells. 25 (11), 2712-2719 (2007).
- Barbuti, A., et al. Molecular composition and functional properties of f-channels in murine embryonic stem cell-derived pacemaker cells. J Mol Cell Cardiol. 46 (3), 343-351 (2009).
- Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American journal of physiology. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301 (5), H2006-H2017 (2011).
- David, R., Franz, W. M. From pluripotency to distinct cardiomyocyte subtypes. Physiology (Bethesda). 27 (3), 119-129 (2012).
- Scavone, A., et al. Embryonic stem cell-derived CD166+ precursors develop into fully functional sinoatrial-like cells). Circ Res. 113 (4), 389-398 (2013).
- Morikawa, K., et al. Identification, isolation and characterization of HCN4-positive pacemaking cells derived from murine embryonic stem cells during cardiac differentiation. Pacing Clin Electrophysiol. 33 (33), 290-303 (2010).
- Wiese, C., et al. Formation of the sinus node head and differentiation of sinus node myocardium are independently regulated by Tbx18 and Tbx3. Circ Res. 104 (3), 388-397 (2009).
- Kleger, A., et al. Modulation of calcium-activated potassium channels induces cardiogenesis of pluripotent stem cells and enrichment of pacemaker-like cells. Circulation. 122 (18), 1823-1836 (2010).
- Bakker, M. L., et al. T-box transcription factor TBX3 reprogrammes mature cardiac myocytes into pacemaker-like cells. Cardiovasc Res. 94 (3), 439-449 (2012).
- Kapoor, N., Liang, W., Marban, E., Cho, H. C. Direct conversion of quiescent cardiomyocytes to pacemaker cells by expression of Tbx18. Nat Biotechnol. 31 (1), 54-62 (2013).
- Johns, D. C., et al. Adenovirus-mediated expression of a voltage-gated potassium channel in vitro (rat cardiac myocytes) and in vivo (rat liver). A novel strategy for modifying excitability. J Clin Invest. 96 (2), 1152-1158 (1995).
- Nuss, H. B., Marban, E., Johns, D. C. Overexpression of a human potassium channel suppresses cardiac hyperexcitability in rabbit ventricular myocytes. J Clin Invest. 103 (6), 889-896 (1999).
