Summary
Este protocolo describe cómo producir seno tejido ganglionar funcional a partir de células madre pluripotentes murinos (PSC). T-Caja3 (TBX3) sobreexpresión plus-cadena-miosina pesada cardiaca (MYH6) selección antibiótico promotor conduce a agregados de células marcapasos de alta pureza. Estos "inducida sinoauricular-cuerpos" ("iSABs") contienen más de 80 células marcapasos%, muestran altamente aumento de las tasas de latir y se puede regular el ritmo miocardio ex vivo.
Abstract
El tratamiento del "síndrome del seno enfermo" se basa en los marcapasos artificiales. Estos llevan peligros tales como fallo de la batería y las infecciones. Por otra parte, carecen de la capacidad de respuesta de la hormona y el procedimiento general es costosa. "Marcapasos biológicos" generados a partir de las ventanillas únicas pueden llegar a ser una alternativa, sin embargo, el contenido típico de las células marcapasos en cuerpos embrionarios (EB) es extremadamente baja. El protocolo descrito combina "programación futura" del PSC murinos través del TBX3 inductor nodo sinusal con antibióticos de selección basado MYH6-promotor. Esto produce agregados cardiomiocitos consistentes de> 80% de células marcapasos fisiológicamente funcionales. Estos "inducida por sinoauricular-cuerpos" ("iSABs") se contraen espontáneamente a frecuencias aún no alcanzados (400-500 bpm) correspondientes a las células ganglionares aisladas de corazones de ratones y son capaces de caminar de miocardio murino ex vivo. Utilizando el protocolo descrito sinusal altamente puracélulas individuales nodales se pueden generar por ejemplo, que se puede utilizar para pruebas de drogas en vitro. Por otra parte, los iSABs generados de acuerdo con este protocolo puede llegar a ser un paso crucial hacia la ingeniería de tejidos del corazón.
Introduction
El término "síndrome del seno enfermo" resume múltiples enfermedades que conducen al deterioro del sistema de marcapasos cardíaco. Comprende patológica, bradicardia sintomática sinusal, bloqueo sinoauricular, paro sinusal, así como el síndrome de taquicardia-bradicardia. De este modo, un "síndrome del seno enfermo" suele ir acompañada de enfermedades cardíacas generales tales como la cardiopatía isquémica, las miocardiopatías o miocarditis. En la actualidad, los enfoques terapéuticos se basan en la implantación de marcapasos eléctricos. Sin embargo, esto va junto con una serie de riesgos tales como infecciones y fallo de la batería. En general, la incidencia de complicaciones es todavía muy alta en pacientes que han implantaron un marcapasos artificial. Además, a diferencia de la marcapasos endógeno, estos dispositivos no responden a la estimulación hormonal.
Una alternativa de futuro puede depender de la disponibilidad de "marcapasos biológicos" para el que PSC podrían servircomo fuente celular adecuado y que también sería de gran valor para vitro pruebas de drogas en. Sin embargo, un problema importante reside en la aparición muy rara de células nodales de los senos dentro de cuerpos embrioides (EBS) - esto normalmente no excede de ~ 0,5% 1.
Anteriormente, se demostró que la "programación hacia adelante" hacia los subtipos específicos de los cardiomiocitos es factible a través de la sobreexpresión de factores de transcripción distintos cardiovasculares precoces tales como el factor-mesodermo específica posterior 1 (MesP1) y NK2 de transcripción relacionados, locus 5 (Nkx2.5) 2, 3. Para el tamaño y la función del nódulo sinoauricular (SAN) normal, la T-box factor de transcripción Tbx3 es crucial, que se ha demostrado para iniciar el programa de genes marcapasos y para controlar la diferenciación de la SAN 4. Si bien esto mejora la apariencia de las células marcapasos funcionales, el contenido todavía no excedió de ~ 40% dentro de toda la población de células cardiomyocytic.
Por lo tanto, una etapa de selección de antibiótico basado MYH6-promotor adicional 5 fue introducido por nosotros. Esto conduce en última instancia a los agregados de cardiomiocitos todavía no observados ("cuerpos inducidos sinoauricular;" iSABs ") que exhiben altamente aumento de la frecuencia golpeando (> 400 bpm) in vitro, por primera vez se aproxima a las de un corazón murino y comparable a cultivado in vitro las células ganglionares de los senos aisladas de un corazón murino 6. Bajo la administración Isoprenalina se logran incluso superando frecuencias de 550 lpm. Notablemente, iSABs consisten en más del 80% de las células ganglionares funcionales como se desprende de un extenso análisis fisiológico 7. Recientemente, varios enfoques para generar seno células ganglionares mediante la reprogramación directa 19, superficie marcadores 14 o el tratamiento farmacológico con pequeñas moléculas 16,17 fueron descritos. Sin embargo, ninguno de estos métodos dio lugar a una alta pureza de las células marcapasos tal y golpeando a frecuencias cercanas a la murino élarte como se observa en iSABs.
Por otra parte, en un modelo ex vivo de las rebanadas ventriculares ratón adulto cultivadas que han perdido su actividad paliza espontánea, los iSABs son capaces de integrarse en el tejido rebanada, por lo que permanece activa espontáneamente y robustamente paseo por las rebanadas del corazón a las contracciones 7. Un protocolo detallado para la generación de estos iSABs se describe en este documento.
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Protocol
1. Recomendaciones Antes de empezar
- No utilice PSC contaminados con micoplasma porque no van a diferenciar adecuadamente en las células del nódulo sinusal. Prueba para la contaminación por micoplasmas antes de iniciar el protocolo. Para ello, utilice un kit de PCR para la detección rápida y altamente sensible de micoplasmas y seguir el protocolo del fabricante `.
- Para cada placa de Petri (paso 2.3.4), capa uno 10 cm 2 de células placa de cultivo estéril con 7 ml de 0,1% de gelatina de piel de pescado de agua fría durante 1 hora a 37 ° C. Retire la gelatina y dejar el plato seco en condiciones estériles en un banco estéril.
- Antes de poder iniciar el protocolo de diferenciación que necesita un ratón estable transfectadas ES clon línea celular doble que contiene las siguientes características: i) Constitutiva sobreexpresión de TBX3 utilizando un vector de expresión de mamífero. Ii) el gen de resistencia a G418 bajo el control del promotor MYH6-5.
- Las células indiferenciadas PSC deben ser co-cultivard con células alimentadoras irradiados en condiciones estándar como se describe 1.
2. Procedimiento Diferenciación
- Dos días antes de la diferenciación - Quitar las ventanillas únicas de células alimentadoras.
- Aspirar el medio, se lavan las células con 10 ml de solución salina tamponada con fosfato PBS, añadir solución de 7 ml de colagenasa IV e incubar las células durante 10 min a 37 ° C. Coloque un filtro estéril de 40 micras en un tubo de 50 ml.
- Enjuagar cuidadosamente las colonias PSC (evitar para eliminar las células alimentadoras) pipeteando la solución de colagenasa arriba y abajo 5 veces.
- Transferir la suspensión celular a un filtro de 40 micras, enjuague el filtro tres veces con 8 ml de PBS. Da la vuelta al filtro y colocarlo boca abajo en una placa de Petri. Retire las colonias de células PSC pipeteando 10 ml de PBS a la parte inferior del filtro.
- Transferir la suspensión celular a un tubo de 15 ml y centrifugar durante 5 min a 300 x g.
- Retire la PBS, suspender las células en 1 ml Accutase y incubate a 37 ° C durante 5 min.
- Añadir 10 ml de PBS, se mezcla la solución de células pipeteando arriba y abajo 5 veces y centrifugar durante 5 min a 300 x g.
- Retire la PBS, suspender las células en medio de cultivo de 10 ml y determinar el número de células.
- Semilla 15.000 células / cm 2 en un matraz de 75 cm 2 de filtro y cultivarlos durante 2 días a 37 ° C, 5% de CO2. Después de 2 días el matraz debería ser 50-70% de confluencia.
- Día 0 - Inicio de Diferenciación
- Retire el medio y se lavan las células con 10 ml de PBS.
- Aspirar el PBS, añadir 2 ml Accutase e incubar las células a 37 ° C durante 5 min. Coloque un filtro estéril de 40 micras en un tubo de 50 ml.
- Añadir 10 ml de PBS, transferir la suspensión celular a la del filtro 40 micras, enjuague el filtro mediante la adición de 10 ml de PBS y centrifugar el flujo a través durante 5 min a 300 x g.
- Suspender las células en medio de diferenciación 10 ml y determinar el número de células.
- Diluir tél de células en suspensión con medio de diferenciación a una concentración final de 20.000 células / ml.
- Pipetear 20 ml de agua y 5 ml de solución gota (HD) en una placa de Petri cuadrática para evitar desecación del HDs colgantes.
NOTA: Por cada 24 placas conteniendo así iSABs (ver sección 2.8.6.4/2.8.7) comenzar con 16 placas de Petri. - Pipetear hasta 50 ml de suspensión celular en una bandeja.
- Girar alrededor de la tapa de la placa de Petri. Coloque 180 HDs que contienen cada uno 20 l (400 células / HD) suspensión de células en la tapa con una pipeta de 12 canales.
- Con cuidado, gira alrededor de la tapa y colocarlo en la placa de Petri.
NOTA: La velocidad de giro alrededor de la tapa es muy importante. Si la tapa se dio la vuelta demasiado lento o demasiado rápido, la tensión superficial de la suspensión de células no es lo suficientemente alta para retener el colgante gotas en la tapa. Antes de tratar de producir HDs por primera práctica momento de hacerlo girar la tapa con 20 l gotas de medio. - Cultivar las células durante 2 días a 37 ° C, 5% de CO 2 para hacerles forman EBS.
NOTA: Coloque un plato de petri llena de agua en la parte superior de una pila de 5 placas de Petri. De lo contrario la HD en el plato superior de Petri se secará.
- Día 2
- Con cuidado, gira alrededor de la tapa del plato Petri cuadrática y transferir los EBS derivados de dos placas de Petri (360 EBS) a un tubo de 50 ml.
- Espere 10 minutos para dejar que el EB se depositan en el fondo del tubo (No centrifugar la EB).
- Aspirar tanto medio como sea posible, suspender los EBS en 10 ml de medio de diferenciación y transferir la suspensión a un plato de 10 cm Petri.
- Día de la cultura 2.6 Suspensión
- Cultivar los EBS en suspensión durante 4 días a 37 ° C, 5% de CO 2, cambie medio después de 2 días.
NOTA: A pesar de que la placa de Petri no está recubierta (en oposición a una placa de cultivo celular) de los OC menudo se adhieren a la superficie. Controlar las placas de Petri para EB unidos cada día y si es necesario, retire los EBSde la superficie por pipeteo suave. Opcional: Agitar las placas de Petri de forma continua durante el período de cultivo en suspensión. Tenga cuidado con la velocidad del agitador. Las EB ni deben acumular en el medio ni flotar a la frontera de las placas de Petri.
- Cultivar los EBS en suspensión durante 4 días a 37 ° C, 5% de CO 2, cambie medio después de 2 días.
- Día 6
- Transfiera los EB de un placa de Petri con una gelatina recubiertas 10 cm placa de cultivo celular 2.
- Día 12/07
- Las células deben comenzar a batir después de 8-12 días. Compruebe por golpear a los focos de las células diariamente bajo un microscopio. Las células comienzan a formar una capa.
- Cambio de medio día.
NOTA: Después de cambiar medio, las células requieren 3-4 horas para recuperarse y comenzar a latir de nuevo.
- Día 12-15 selección de las células ganglionares de los senos paranasales.
- Tres días después de que las células han empezado a golpear (alrededor del día 12-15), aspirar las medianas y pipeta 10 ml de medio de diferenciación fresca que contienen 400 mg / ml de G418 a las células.
- Retire el medio con cuidado, sin aspirar la capa de células.
- Añadir 10 ml de PBS y retirar el PBS con cuidado, sin aspiración de la capa de células.
- Añadir 10 ml de solución de colagenasa IV, transferir las células a un tubo de 50 ml y se incuban las células a 37 ° C durante 5 min.
- Mezclar vigorosamente la suspensión por la pipeta hacia arriba y hacia abajo 10 veces y se incuban las células a 37 ° C durante 5 min. Debe producirse una suspensión de pequeñas agrupaciones. Si aún hay grandes partes de la capa de la izquierda, a continuación, repita el paso 2.8.4 dos veces más.
- Añadir 20 ml de PBS y centrifugar durante 10 min a 300 x g.
- Aspirar el PBS con cuidado.
NOTA: Si iSABs se deben generar continúe con el paso 2.8.7. Si las células individuales nodales isab sinusales derivado deben generarse continuar con el paso 2.9. - Suspender las célulasen 12 ml de medio de diferenciación que contiene 400 mg / ml de G418 y semillas de ellos en 6 pozos de gelatina recubiertas 24 pocillos (2 ml / pocillo).
- Generación de células ganglionares sola.
- Suspender las células de la etapa 2.8.6 en 5 ml Accutase y se incuba a 37 ° C durante 5 min.
- Mezclar vigorosamente la suspensión por la pipeta hacia arriba y hacia abajo 10 veces y se incuban las células a 37 ° C durante 5 min.
- Añadir 20 ml de PBS y centrifugar durante 5 min a 300 x g.
- Suspender las células en 12 ml de medio de diferenciación que contienen 400 mg / ml de G418 y semillas de ellos en 6 pocillos de una gelatina recubiertos 24 pocillos (2 ml / pocillo).
- Día 2 después de la disociación, aspirar el medio y lavar las células tres veces con PBS. Añadir 1 ml de medio de diferenciación / pocillo.
- Día 4-8 después de la disociación, cambio de medio cada 2º día. En el día 10 después de iSABs uso disociación o isab seno derivada nodal células individuales están disponibles para su posterior análisis.
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Representative Results
El protocolo descrito permite la generación de iSABs con una frecuencia de latidos de alrededor de 450 ppm de PSC (que se muestran en la película) que está cerca de la frecuencia de los latidos del corazón del ratón. Después de la disociación de iSABs (etapa 2.8.8) las células individuales observados muestran la forma típica de las células del nodo sinusal (células fusiformes y de la araña) como se muestra en la Figura 1. Estas células proteínas altamente expresas que se sabe que son esenciales para la función de del nodo sinusal como cíclico canal hiperpolarización activados por nucleótidos cerrada cación 4 (HCN4), Connexin45 (Cx45), Connexin30.2 (Cx30.2) y MYH6 (Figura 2 A - C). Después del tratamiento de las células con isab derivados farmacéuticos, las células muestran el comportamiento esperado: como en el nodo sinusal, el bloqueador divertido canal de ZD7288 (Figura 3A), así como el agonista de receptor muscarínico carbacol (Figura 3B), a la vez causa un golpeo reducido significativamente frecuencia de deriv isabcélulas ed. El agonista isoprenalina β-adrenérgicos conduce a una frecuencia de latidos elevada (Figura 3C).
Figura 1: forma celular del husillo y de la araña células de la forma celular típico de isab husillo derivado (A) y la araña (B) de células nodal. Barra de escala 20 micras.
Figura 2: Expresión de marcadores nodo sinusal. (A) Expresión de HCN4 (amarillo) y Cx45 (magenta), (B) Expresión de Cx45 (magenta) y Cx30.2 (amarillo) y (C) MYH6 (magenta) en las células del nodo sinusal. Counterstaining de núcleos (turquesa). Barra de escala 20 micras.
Figura 3: El tratamiento farmacológico de iSABs Representante superando frecuencia de iSABs antes (control) y después del tratamiento con ZD7288 (A), carbacol (B) e isoprenalina (C). Los datos representan ocho iSABs independientes y se presentan como media ± desviación estándar. *** P <0,001
Figura 4: Esquema del protocolo de diferenciación. Dibujos animados simplificado que refleja el diagrama de flujo experimental para la generación isab.
Película:. Golpiza de iSABs Golpiza de un cuerpo sinusal inducida típica (ISAB) después de la disociación PleaSe Haz clic aquí para ver el vídeo.
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Discussion
La capacidad de producir tallo de células derivadas de células marcapasos cardíacos puede permitir la reconstitución del ritmo cardíaco adecuado en el sentido de "marcapasos biológicos". Del mismo modo, las pruebas de drogas in vitro se beneficiará de su disponibilidad. PSC puede dar lugar a cualquier tipo de célula del cuerpo de un mamífero incluyendo cardiomiocitos con propiedades de células marcapasos 8,9,10,11,12,13. Sin embargo, por lo general las poblaciones de células dentro de "cuerpos embrionarios" son muy heterogéneas, lo que conduce inevitablemente a la exigencia de las estrategias de selección y aislamiento fiable - esto se aplica en particular al tipo de célula muy rara de células ganglionares cardíacos. Numerosos enfoques basados en la superficie exógenos y endógenos Marcadores de 14, en la administración farmacológica de moléculas pequeñas 15,16,17 y sobre las estrategias de reprogramación directos 18,19 han sido seguidos. Además, los enfoques basados en células no-madre-dirigidos a emular los marcapasos biológicosa través de la manipulación de moléculas efectoras terminales subyacentes electrofisiología sarcolema en lugar de novo que generan las células ganglionares completamente funcionales 20,21.
Sin embargo, ninguno de estos se acercó con las altas frecuencias de contracción espontánea necesarias y pureza celular. En contraste, nuestro protocolo conduce a las células que no sólo presentan oscilaciones eléctricas, sino también las características sutiles de señalización electrofisiológico y calcio, así como características morfológicas distintivas de las células marcapasos endógenos 7. Esta tecnología puede convertirse en un requisito importante para las alternativas a los dispositivos de estimulación electrónica.
Aunque este protocolo se ha optimizado durante su desarrollo, todavía hay algunos pasos que pueden causar problemas: El punto de partida para la selección de isab es crítico con el protocolo. El golpeo de las células es un indicador para αMHC-Expresión en la diferenciación de las células. MYH6-Expresión va junto con su expression del gen de resistencia G418. Inicio de la selección demasiado pronto se extinguirá una gran cantidad de las células que potencialmente podrían diferenciarse en cardiomiocitos y por lo tanto disminuir el rendimiento global de las células ganglionares de los senos paranasales. Otro paso crítico es la disociación de la capa de células (paso 2.8). La razón de esto es que las células forman una matriz extracelular robusto y una fuerza fuerte es necesario para disociar la capa de células. Si es necesario, la etapa 2.8.4 se debe repetir hasta pequeños grupos de células han desarrollado a partir de la capa de células. Evite disociación directa de la capa de células por ejemplo tripsina, ya que resultó ser de muy baja eficiencia.
Para las futuras aplicaciones clínicas, los siguientes obstáculos que aún deben ser abordados: la transferencia del enfoque a la generación de iSABs humanos que pueden llegar a ser un paso crucial hacia la terapia de células futuro y en pruebas de drogas vitro. Además, la técnica todavía se basa en modifi genética establetendrá que ser modificado cationes de PSC y por lo tanto antes de que se puede aplicar a los pacientes.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iscove's liquid medium with stable glutamine | Biochrom AG | FG 0465 | |
| DMEM liquid medium without Na-pyruvate, with stable glutamine | Biochrom AG | FG 0435 | |
| CLS type IV, CLS IV | Biochrom AG | C4-22 | |
| Non-essential amino acids | Biochrom AG | K 0293 | |
| FBS Superior | Biochrom AG | S 0615 | |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Biochrom AG | L 0473 | |
| G 418-BC liquid (ready-to-use solution), sterile | Biochrom AG | A 2912 | |
| Reagent reservoir PP f.multichannel pip. 60ml,sterile | Brand | 703409 | |
| Accutase | eBioscience,Inc. | 00-4555-56 | |
| Eppendorf Xplorer/Xplorer plus, electronic pipette | Eppendorf | 4861000155 | |
| Falcon Cell Strainer 40 µm | Falcon | 352340 | |
| Penicillin/Streptomycin | GE Healthcare | P11-010 | |
| Petri Dishes | Greiner BioOne | 663102 | |
| DPBS without Ca and Mg | PAN-Biotech | P04-36500 | |
| Fetal bovine serum | PAN-Biotech | P30-3302 | |
| Leukemia inhibitory factor | Phoenix Europe GmbH | LIF-250 | |
| Quadratic petri dishes | Roth | PX67.1 | |
| Gelatin from cold water fish skin | SigmaAldrich | G7765 | |
| 2-Mercaptoethanol | SigmaAldrich | M3148 | |
| 1-Thioglycerol | SigmaAldrich | M6145 | |
| Tissue culture dishes | TPP | 93100 | |
| Tissue culture flask | TPP | 90076 | |
| Tissue culture test plates (24 well) | TPP | 92424 |
References
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