Summary
Detta protokoll beskriver hur man producerar funktionell sinus nodal vävnad från murina pluripotenta stamceller (PSC). T-Box3 (TBX3) uttryck plus kardiomyosin-tung kedja (Myh6) promotor antibiotikaselektion leder till mycket rena pacemaker cellaggregat. Dessa "Inducerade-sinoatriellt-organ" ("ISAbS") innehåller över 80% pacemakerceller, visar starkt ökad beating hastigheter och kan takten myokardiet ex vivo.
Abstract
Behandling av "sick sinus syndrom" är baserad på artificiella pacemakers. Dessa bär risker som batterifel och infektioner. Dessutom saknar de hormon lyhördhet och den totala proceduren är kostnadskrävande. "Biologiska pacemakrar" som genereras från PSC: er kan bli ett alternativ, men den typiska halten av pacemakerceller i Embryoid organ (EBS) är extremt låg. Den beskrivna protokollet kombinerar "framåt programmering" av murina PSC via sinusknutan inducerare TBX3 med Myh6-promotor baserad antibiotikaselektion. Detta ger cardiomyocyte aggregat konsekventa av> 80% fysiologiskt funktionella pacemakerceller. Dessa "inducerade-sinoatriellt-organ" ("ISAbS") är spontant upphandlande vid ännu onådda frekvenser (400-500 bpm) motsvarande knutpunkter celler isolerade från mus hjärtan och kan stimulera murina hjärtmuskeln ex vivo. Använda beskrivna protokollet högren sinusknutpunkter enskilda celler kan genereras som t.ex. kan användas för in vitro-drogtestning. Vidare kan ISAbS genererade enligt detta protokoll blir ett avgörande steg mot hjärtvävnadsteknik.
Introduction
Termen "sick sinus syndrom" sammanfattar flera sjukdomar som leder till försämring av hjärtpacemakersystem. Den består av patologisk, symptomatisk sinusbradykardi, sinoatriellt block, sinusstillestånd liksom takykardi-bradykardi syndrom. Därmed är en "sick sinus syndrom" ofta åtföljs av allmänna hjärtsjukdomar såsom en ischemisk hjärtsjukdom, kardiomyopati eller myokardit. För närvarande, är terapeutiska metoder baserade på implantation av elektriska pacemakers. Men går detta tillsammans med ett antal risker såsom infektioner och batterifel. Sammantaget är förekomsten av komplikationer fortfarande mycket hög hos patienter med implanterade en artificiell pacemaker. Vidare, i motsats till den endogena pacemaker, dessa anordningar inte svarar på hormonstimulering.
Ett framtida alternativ kan åberopa att det finns "biologiska pacemakers" för vilka gemensamma kontaktpunkter kunde tjänasom en lämplig cellulär källa, och som skulle också vara mycket värdefulla för in vitro-drogtestning. Ändå ett stort problem ligger i den mycket sällsynta utseende sinus nodal celler inom embryoidkroppar (EBS) - detta normalt inte överstiger ~ 0,5% 1.
Tidigare har det visat sig att "framåt programmering" mot specifika cardiomyocyte subtyper är genomförbart via överuttryck av distinkta tidiga kardiovaskulära transkriptionsfaktorer såsom mesoderm specifika-posterior 1 (MesP1) och NK2 transkriptionsfaktor relaterade, locus 5 (Nkx2.5) 2, 3. För normal storlek och funktion sinusknutan (SAN), är T-box transkriptionsfaktor Tbx3 avgörande, som har visat att initiera pacemakern genen programmet och för att kontrollera differentiering av SAN 4. Medan denna förbättrade utseendet av funktionella pacemakerceller, innehållet fortfarande inte översteg ~ 40% inom hela cardiomyocytic cellpopulationen.
Därför gjordes en extra Myh6-promotor baserad antibiotikaselektion steg 5 införs genom oss. Detta leder i slutändan till ännu obemärkt cardiomyocyte aggregat ("inducerade sinoatriellt organ;" ISAbS ") som uppvisar mycket ökade slå frekvenser (> 400 bpm) in vitro, för första gången som närmar de av en mus hjärta och jämförbar med in vitro-odlade sinus nodal celler som isolerats från en mus hjärta 6. Under Isoprenalin administrationen ens slå frekvenser av 550 bpm uppnås. Noterbart ISAbS består av över 80% funktionella nodala celler som framgår av omfattande fysiologiska analyser 7. Nyligen, flera metoder att generera sinus nodal celler med direkt omprogrammering 19, markörer ytan 14 eller farmakologisk behandling med små molekyler 16,17 beskrevs. Ändå har ingen av dessa metoder har lett till en sådan hög renhet av pacemakerceller och slå frekvenser nära den murina hankonst som observerats i ISAbS.
Dessutom i en ex vivo-modell av odlade vuxen mus ventrikulär skivor som har förlorat sin spontana stryk aktivitet, de ISAbS är kapabla att integreras i den del vävnaden och därmed kvar spontant aktiva och robust pacing hjärtat skivor till sammandragningar 7. En detaljerat protokoll för generering av dessa ISAbS beskrivs i detta dokument.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Rekommendationer Före
- Använd inte PSC kontaminerade med mykoplasma eftersom de inte kommer att skilja ordentligt i sinusknutan celler. Test för mykoplasmkontaminering innan protokollet. Gör detta med hjälp av en PCR-kit för snabb, mycket känslig detektion av mykoplasma och följ manufacturer`s protokollet.
- För varje petriskål (steg 2.3.4), päls en 10 cm 2 cellodling skål med steril 7 ml 0,1% gelatin från kallt vatten fisk hud under 1 timme vid 37 ° C. Avlägsna gelatin och låt skålen torka under sterila betingelser i en steril bänk.
- Innan du kan börja differentiering protokoll du behöver en dubbel transfekterad stabil mus ES cellinje klon som innehåller följande funktioner: i) Konstitutiv överuttryck av TBX3 med hjälp av en däggdjursexpressionsvektor. Ii) G418-resistensgenen under kontroll av den Myh6-promotorn 5.
- De odifferentierade PSC celler bör samarbeta odlad med bestrålade matarceller under standardförhållanden som beskrivs 1.
2. Differentiering Procedur
- Två dagar innan Differentiering - Ta PSC från matarceller.
- Aspirera mediet, tvätta cellerna med 10 ml fosfatbuffrad saltlösning PBS, tillsätt 7 ml kollagenas IV-lösning och inkubera cellerna under 10 min vid 37 ° C. Placera en steril 40 pm filter i en 50 ml tub.
- Skölj försiktigt PSC kolonierna (undvik att ta bort matar celler) genom att pipettera kollagenas lösningen upp och ner 5 gånger.
- Överför cellsuspensionen till en 40 pm filter, skölj filtret tre gånger med 8 ml PBS. Vänd runt filtret och placera den upp och ner i en petriskål. Avlägsna de PSC cellkolonier genom pipettering 10 ml PBS till botten av filtret.
- Överför cellsuspensionen till en 15 ml rör och centrifugera under 5 min vid 300 x g.
- Ta bort PBS, suspendera cellerna i 1 ml Accutase och jagncubate vid 37 ° C under 5 min.
- Lägg 10 ml PBS, blanda cellen lösningen genom att pipettera upp och ner 5 gånger och centrifugera under 5 min vid 300 x g.
- Ta bort PBS, suspendera cellerna i 10 ml odlingsmedium och bestämma antalet celler.
- Seed 15.000 celler / cm 2 på en 75 cm 2 filterkolv och odla dem i 2 dagar vid 37 ° C, 5% CO2. Efter 2 dagar kolven bör vara 50-70% konfluenta.
- Dag 0 - Start av Differentiering
- Avlägsna mediet och tvätta cellerna med 10 ml PBS.
- Aspirera PBS, tillsätt 2 ml Accutase och inkubera cellerna vid 37 ° C under 5 min. Placera en steril 40 pm filter i en 50 ml tub.
- Lägg 10 ml PBS, överför cellsuspensionen till 40 ^ m filter, skölj filter via tillsats av 10 ml PBS och centrifugera genomströmning under 5 min vid 300 x g.
- Suspendera cellerna i 10 ml differentieringsmedium och bestämma cellantalet.
- Späd than cellsuspensionen med differentieringsmedium till en slutlig koncentration av 20000 celler / ml.
- Pipettera 20 ml vatten och 5 ml hängande droppe (HD) lösning i en kvadratisk petriskål för att undvika uttorkning av HDs.
OBS: För varje 24 brunnar innehåller ISAbS (se avsnitt 2.8.6.4/2.8.7) börjar med 16 petriskålar. - Pipettera upp till 50 ml cellsuspension i ett fack.
- Vänd runt locket på petriskål. Placera 180 HDS vardera innehållande 20 pl (400 celler / HD) cellsuspension på locket med hjälp av en 12 kanals pipett.
- Vänd försiktigt runt locket och placera den på petriskål.
OBS: Den hastighet vända locket är mycket viktigt. Om locket vrids runt för långsamt eller för snabbt, är ytspänningen av cellsuspensionen inte tillräckligt hög för att kvarhålla den hängande droppar på locket. Innan du försöker att producera HDs för första gången praktiken vända locket med 20 il droppar medium. - Odla cellerna under 2 dagar vid 37 ° C, 5% CO2 för att låta dem bilda EBS.
OBS: Placera en petriskål fylld med vatten på toppen av en stapel av fem petriskålar. Annars HD i den övre petriskål torkar.
- Dag 2
- Vänd försiktigt runt locket för den kvadratiska petriskål och överför EBS härledda från två Petri-skålar (360 EBS) till en 50 ml tub.
- Vänta 10 minuter för att låta EBS avsätts i botten av röret (Centrifugera inte EBS).
- Sug så mycket medel som möjligt, upphäva EBS i 10 ml differentieringsmedium och överför suspensionen till en 10 cm petriskål.
- Dag 2-6 Suspension kultur
- Odla EBS i suspension i 4 dagar vid 37 ° C, 5% CO2, ändrar medium efter 2 dagar.
OBS: Även om petriskålen inte är belagt (i motsats till en cellodlingsskål) EBS ofta fäster på ytan. Styr petriskålar för anslutna EBS varje dag och vid behov detach EBSfrån ytan genom försiktig pipettering. Tillval: Skaka petriskålama kontinuerligt under suspensionsodlingsperioden. Var försiktig med hastigheten på shaker. EBS bör varken ansamlas i mitten eller flyta till gränsen av petriskålar.
- Odla EBS i suspension i 4 dagar vid 37 ° C, 5% CO2, ändrar medium efter 2 dagar.
- Dag 6
- Överför EBS från en petriskål med en gelatin belagda 10 cm 2 cellodling maträtt.
- Dag 7-12
- Cellerna bör börja slå efter 8-12 dagar. Kontrollera för att slå foci av cellerna dagligen under ett mikroskop. Cellerna börjar att bilda ett skikt.
- Ändra mediet dagligen.
OBS: När du har ändrat medium, cellerna kräver 3-4 tim att återhämta sig och börja slå igen.
- Dag 12-15 Selektion av sinus nodala celler.
- Tre dagar efter det att cellerna har börjat slå (omkring dag 12-15) aspireras medium och pipett 10 ml färskt differentieringsmedium innehållande 400 pg / ml G418 till cellerna.
- Ta mediet försiktigt utan att aspirera cellskiktet.
- Tillsätt 10 ml PBS och avlägsna PBS försiktigt utan att aspirera cellskiktet.
- Tillsätt 10 ml kollagenas IV-lösning, överföra celler till en 50 ml rör och inkubera cellerna vid 37 ° C under 5 min.
- Med kraft blanda suspensionen genom pipettering upp och ned 10 gånger och inkubera cellerna vid 37 ° C under 5 min. En suspension av små kluster skulle inträffa. Om det fortfarande finns stora delar av den vänstra lagret, upprepa sedan steg 2.8.4 två gånger.
- Lägg 20 ml PBS och centrifugera i 10 minuter vid 300 x g.
- Aspirera PBS försiktigt.
OBS: Om ISAbS ska genereras vidare med steg 2.8.7. Om ISAB härledd sinus nodal enstaka celler ska genereras gå vidare med steg 2.9. - Suspendera cellernai 12 ml differentieringsmedium innehållande 400 ug / ml G418 och utsäde dem på sex brunnar i gelatinbelagda 24 brunnar (2 ml / brunn).
- Generering av enstaka nodal cell.
- Suspendera cellerna från steg 2.8.6 i 5 ml Accutase och inkubera vid 37 ° C under 5 min.
- Med kraft blanda suspensionen genom pipettering upp och ned 10 gånger och inkubera cellerna vid 37 ° C under 5 min.
- Lägg 20 ml PBS och centrifugera i 5 min vid 300 x g.
- Suspendera cellerna i 12 ml differentieringsmedium innehållande 400 ug / ml G418 och utsäde dem på sex brunnar i en gelatinbelagda 24 brunnar (2 ml / brunn).
- Dag 2 efter dissociation, aspirera mediet och tvätta cellerna tre gånger med PBS. Tillsätt 1 ml differentieringsmedium / brunn.
- Dag 4-8 efter dissociation, ändra Medium varje 2: a dag. På dag 10 efter Dissociation använda ISAbS eller ISAB härlett sinus nodal enstaka celler finns tillgängliga för vidare analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den beskrivna protokollet medger generation ISAbS med stryk frekvens på cirka 450 slag per minut från PSC (visas i filmen) som är nära till musen hjärta slå frekvens. Efter dissociation av ISAbS (steg 2.8.8) de observerade enstaka celler visar den typiska formen av celler av sinusknutan (spindel och spindelceller) såsom visas i figur 1. Dessa celler starkt uttrycka proteiner som är kända att vara väsentliga för funktionen av sinusknutan som hyperpolarisation aktiverade cyklisk nukleotid-gated katjon kanal 4 (Hcn4), Connexin45 (Cx45), Connexin30.2 (Cx30.2) och Myh6 (Figur 2A - C). Efter behandling av ISAB härledda celler med läkemedel, cellerna visa de förväntade beteendet: som i sinusknutan, den roliga kanalblockerare ZD7288 (figur 3A) samt muskarinreceptor agonisten karbakol (figur 3B), båda orsakar en signifikant reducerad stryk frekvens av ISAB derived celler. Den β-adrenoreceptoragonist isoprenalin leder till en förhöjd malnings frekvens (figur 3C).
Figur 1: Cellulär form av spindel och spider celler Typiska cellulära formen på ISAB härledd spindel (A) och spindel (B) nodal cell. Scale bar 20 ^ m.
Figur 2: Redovisning av sinusknutan markörer. (A) Expression av HCN4 (gul) och Cx45 (magenta), (B) Expression av Cx45 (magenta) och Cx30.2 (gul) och (C) Myh6 (magenta) i sinusknutan celler. Motfärgning av cellkärnor (turkos). Scale bar 20 ^ m.
Figur 3: Farmakologisk behandling av ISAbS representant slå frekvens av ISAbS före (kontroll) och efter behandling med ZD7288 (A), karbakol (B) och isoprenalin (C). Data representerar åtta oberoende ISAbS och presenteras som medelvärde ± SD. *** P <0,001
Figur 4: Schematisk ritning av differentieringsprotokollet. Förenklad tecknad avspeglar den experimentella flödesschema för ISAB generation.
Film:. Misshandeln av ISAbS misshandeln av en typisk inducerad sinoatrial kropp (ISAB) efter dissociation Please Klicka här för att se filmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Förmågan att producera stamcells härledda pacemaker celler kan tillåta beredning av rätt hjärtrytmen i betydelsen "biologiska pacemakers". Likaså kommer drogtestning in vitro dra nytta av deras tillgänglighet. PSC: er kan ge upphov till någon celltyp av däggdjurskroppen inklusive kardiomyocyter med pacemaker cellegenskaper 8,9,10,11,12,13. Men vanligtvis cellpopulationer inom "Embryoid organ" är mycket heterogen, vilket oundvikligen leder till kravet på tillförlitliga strategier för urval och isolering - detta gäller i synnerhet den mycket sällsynta celltyp av hjärt nodal celler. Många metoder baserade på exogen och endogen ytmarkörer 14, om farmakologisk administration av små molekyler 15,16,17 och på direkta omprogrammering strategier 18,19 har följt. Dessutom, icke-stamcellsbaserade strategier som syftar till att efterlikna biologiska pacemakersvia manipulation av terminal effektormolekyler underliggande sarcolemmal elektrofysiologi i stället för de novo genererar fullt fungerande nodal celler 20,21.
Ändå ingen av dessa kom upp med de nödvändiga höga spontana kontraktion frekvenser och cellulära renhet. Däremot leder våra protokoll till celler som inte bara uppvisar elektriska svängningar utan även de subtila elektrofysiologiska och kalciumsignalering egenskaper samt utmärk morfologiska egenskaper hos endogena pacemakerceller 7. Denna teknik kan bli en viktig förutsättning för alternativ till elektroniska stimuleringsanordningar.
Även om detta protokoll optimerades under dess utveckling, det finns fortfarande några steg som kan orsaka problem: Utgångspunkten för valet av ISAB är kritisk till protokollet. Misshandeln av cellerna är en indikator för αMHC-Expression differentiera celler. Myh6-Expression går längs med expression av G418-resistensgenen. Starta valet för tidigt kommer släcka en hel del av de celler som potentiellt skulle differentieras till hjärtmuskelceller och kommer därför minska det totala utbytet av sinus nodal celler. Ett annat kritiskt steg är dissociationen av cellskiktet (steg 2.8). Anledningen till detta är att cellerna bildar en robust extracellulär matris och en stark kraft är nödvändig för att dissociera cellskiktet. Om nödvändigt bör steg 2.8.4 upprepas tills små kluster av celler har utvecklats från cellskiktet. Undvik direkt dissociation av cellskiktet genom t.ex. trypsin eftersom det visade sig vara av mycket låg verkningsgrad.
För framtida kliniska tillämpningar, följande hinder måste fortfarande lösas: överföring av förhållningssätt till generation mänskliga ISAbS som kan bli ett avgörande steg mot framtida cellterapi och in vitro drogtestning. Dessutom är tekniken fortfarande på stabil genetisk modifikatjoner av PSC och därför måste modifieras innan den kan tillämpas på patienter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iscove's liquid medium with stable glutamine | Biochrom AG | FG 0465 | |
| DMEM liquid medium without Na-pyruvate, with stable glutamine | Biochrom AG | FG 0435 | |
| CLS type IV, CLS IV | Biochrom AG | C4-22 | |
| Non-essential amino acids | Biochrom AG | K 0293 | |
| FBS Superior | Biochrom AG | S 0615 | |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Biochrom AG | L 0473 | |
| G 418-BC liquid (ready-to-use solution), sterile | Biochrom AG | A 2912 | |
| Reagent reservoir PP f.multichannel pip. 60ml,sterile | Brand | 703409 | |
| Accutase | eBioscience,Inc. | 00-4555-56 | |
| Eppendorf Xplorer/Xplorer plus, electronic pipette | Eppendorf | 4861000155 | |
| Falcon Cell Strainer 40 µm | Falcon | 352340 | |
| Penicillin/Streptomycin | GE Healthcare | P11-010 | |
| Petri Dishes | Greiner BioOne | 663102 | |
| DPBS without Ca and Mg | PAN-Biotech | P04-36500 | |
| Fetal bovine serum | PAN-Biotech | P30-3302 | |
| Leukemia inhibitory factor | Phoenix Europe GmbH | LIF-250 | |
| Quadratic petri dishes | Roth | PX67.1 | |
| Gelatin from cold water fish skin | SigmaAldrich | G7765 | |
| 2-Mercaptoethanol | SigmaAldrich | M3148 | |
| 1-Thioglycerol | SigmaAldrich | M6145 | |
| Tissue culture dishes | TPP | 93100 | |
| Tissue culture flask | TPP | 90076 | |
| Tissue culture test plates (24 well) | TPP | 92424 |
References
- Wobus, A. M., Wallukat, G., Hescheler, J. Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers. Differentiation. 48 (3), 173-182 (1991).
- David, R., et al. MesP1 drives vertebrate cardiovascular differentiation through Dkk-1-mediated blockade of Wnt-signalling. Nat Cell Biol. 10, 338-345 (2008).
- David, R., et al. Forward programming of pluripotent stem cells towards distinct cardiovascular cell types. Cardiovasc Res. 84 (2), 263-272 (2009).
- Hoogaars, W. M., et al. Tbx3 controls the sinoatrial node gene program and imposes pacemaker function on the atria. Genes Dev. 21 (9), 1098-1112 (2007).
- Klug, M. G., Soonpaa, M. H., Koh, G. Y., Field, L. J. Genetically selected cardiomyocytes from differentiating embronic stem cells form stable intracardiac grafts. J Clin Invest. 98 (1), 216-224 (1996).
- Marger, L., et al. Pacemaker activity and ionic currents in mouse atrioventricular node cells. Channels (Austin). 5 (3), 241-250 (2011).
- Jung, J. J., et al. Programming and isolation of highly pure physiologically and pharmacologically functional sinus-nodal bodies from pluripotent stem cells). Stem cell reports. 2 (5), 592-605 (2014).
- Maltsev, V. A., Wobus, A. M., Rohwedel, J., Bader, M., Hescheler, J. Cardiomyocytes differentiated in vitro from embryonic stem cells developmentally express cardiac-specific genes and ionic currents. Circulation research. 75 (2), 233-244 (1994).
- He, J. Q., Ma, Y., Lee, Y., Thomson, J. A., Kamp, T. J. Human embryonic stem cells develop into multiple types of cardiac myocytes: action potential characterization. Circ Res. 93 (1), 32-39 (2003).
- Yanagi, K., et al. Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels and T-type calcium channels confer automaticity of embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem cells. 25 (11), 2712-2719 (2007).
- Barbuti, A., et al. Molecular composition and functional properties of f-channels in murine embryonic stem cell-derived pacemaker cells. J Mol Cell Cardiol. 46 (3), 343-351 (2009).
- Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American journal of physiology. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301 (5), H2006-H2017 (2011).
- David, R., Franz, W. M. From pluripotency to distinct cardiomyocyte subtypes. Physiology (Bethesda). 27 (3), 119-129 (2012).
- Scavone, A., et al. Embryonic stem cell-derived CD166+ precursors develop into fully functional sinoatrial-like cells). Circ Res. 113 (4), 389-398 (2013).
- Morikawa, K., et al. Identification, isolation and characterization of HCN4-positive pacemaking cells derived from murine embryonic stem cells during cardiac differentiation. Pacing Clin Electrophysiol. 33 (33), 290-303 (2010).
- Wiese, C., et al. Formation of the sinus node head and differentiation of sinus node myocardium are independently regulated by Tbx18 and Tbx3. Circ Res. 104 (3), 388-397 (2009).
- Kleger, A., et al. Modulation of calcium-activated potassium channels induces cardiogenesis of pluripotent stem cells and enrichment of pacemaker-like cells. Circulation. 122 (18), 1823-1836 (2010).
- Bakker, M. L., et al. T-box transcription factor TBX3 reprogrammes mature cardiac myocytes into pacemaker-like cells. Cardiovasc Res. 94 (3), 439-449 (2012).
- Kapoor, N., Liang, W., Marban, E., Cho, H. C. Direct conversion of quiescent cardiomyocytes to pacemaker cells by expression of Tbx18. Nat Biotechnol. 31 (1), 54-62 (2013).
- Johns, D. C., et al. Adenovirus-mediated expression of a voltage-gated potassium channel in vitro (rat cardiac myocytes) and in vivo (rat liver). A novel strategy for modifying excitability. J Clin Invest. 96 (2), 1152-1158 (1995).
- Nuss, H. B., Marban, E., Johns, D. C. Overexpression of a human potassium channel suppresses cardiac hyperexcitability in rabbit ventricular myocytes. J Clin Invest. 103 (6), 889-896 (1999).
