Summary
Bu protokol, kemirgen pluripotent kök hücreler (PSC) fonksiyonel sinüs düğüm doku üretmek açıklamaktadır. T-Box3 (TBX3) ekspresyonu artı kalp Myosin ağır zincir (Myh6) promotör antibiyotik seçimi son derece saf kalp pili hücre agrega yol açar. Bu "İsteyerek-sinoatrial-organları" ("iSABs"), son derece dayak oranları arttı göstermek% 80'in üzerinde kalp pili hücreleri içeren ve miyokard ex vivo pace edebiliyoruz.
Abstract
"Hasta sinüs sendromu" Tedavi yapay kalp pili dayanmaktadır. Bunlar pil arızası ve enfeksiyonlar gibi tehlikeleri ayı. Ayrıca, hormon eksikliği yanıt ve genel prosedür maliyeti yoğundur. PSC'ler oluşturulan "Biyolojik kalp pilleri" bir alternatif haline gelebilir, ancak Embriyoid Oluşumu kalp pili hücrelerinin tipik içeriği (EBS) son derece düşüktür. açıklanan protokol Myh6-organizatörü bazlı antibiyotik seçimi ile sinüs düğümü indükleyici TBX3 yoluyla kemirgen PSC'lerin "ileri programlama" birleştirir. Bu>% 80 fizyolojik fonksiyonel kalp pili hücrelerinin tutarlı kardiyomiyosit agrega verir. Bu "uyarılmış-sinoatrial-organları" ("iSABs") kendiliğinden fare kalplerinden izole düğüm hücrelere karşılık gelen henüz ulaşılmamış frekanslarda (400-500 bpm) olarak sözleşme ve kemirgen miyokard ex vivo pace edebiliyoruz. Açıklanan protokol oldukça saf sinüs kullanmaNodal tek hücreler in vitro ilaç testi için kullanılabilir, ki burada, örneğin oluşturulabilir. Ayrıca, bu protokole göre üretilen iSABs kalp doku mühendisliği yolunda çok önemli bir adım olabilir.
Introduction
dönem "hasta sinüs sendromu" kalp pili sisteminin bozulmasına yol açan birden hastalıkları özetler. Bu patolojik, semptomatik sinüs bradikardi, sinoatrial blok, sinüs tutuklama yanı sıra taşikardi-bradikardi sendromu oluşur. Böylece, bir "hasta sinüs sendromu", genellikle böyle bir iskemik kalp hastalığı, kardiyomiyopati ya da miyokardit gibi genel kalp hastalıkları eşlik ediyor. Şu anda, tedavi yaklaşımları elektrik pili implantasyonu dayanmaktadır. Ancak, bu tür enfeksiyonların ve pil arızası gibi risklerin bir dizi ile birlikte gider. Genel olarak, komplikasyonların insidansı halen hastaların yapay kalp pili implante olan çok yüksektir. Endojen kalp karşı Ayrıca, bu cihazlar, hormon stimülasyonuna yanıt vermez.
Gelecekteki bir alternatif olan PSC'ler hizmet verebilir "biyolojik kalp pili" durumu güveniyor olabilirUygun bir hücre kaynağı olan ve aynı zamanda in vitro ilaç testi için oldukça yararlı olacaktır. Ancak, büyük bir sorun embriyoid organları (EBS) içindeki sinüs düğüm hücrelerin çok nadir görünüm yatıyor - bu genellikle ~% 0.5 1 aşmaz.
Daha önce, bu özel kardiyomiyosit alt tiplerine karşı "ileri programlama", yani ilgili Mesoderm-özgü arka 1 (MesP1) ve NK2 transkripsiyon faktörü, lokus 5 (Nkx2.5) 2 gibi farklı erken kardiyovasküler transkripsiyon faktörlerinin aşırı ifadesi yoluyla mümkün olduğu gösterilmiştir, 3. Normal boyut ve sinoatriyal düğüm (SAN) bir fonksiyonu için, T-box transkripsiyon faktörü Tbx3 pili gen programının başlatılmasını ve SAN 4 farklılaşmasını kontrol ettiği gösterilmiştir olan, son derece önemlidir. Bu fonksiyonel kalp pili hücrelerinin görünümünü gelişmiş iken, içeriği hala tüm cardiomyocytic hücre popülasyonu içinde ~ 40% geçmedi.
Bu nedenle, ek bir Myh6-organizatörü bazlı antibiyotik seçimi adım 5 bizim tarafından tanıtıldı. In vitro ekili bir kemirgen kalbin olanlar ve karşılaştırılabilir yaklaşıldığıdır ilk kez in vitro yüksek artış yenerek frekansları (> 400 bpm) sergilerler; Bu sonuçta henüz farkedilmemiş kardiyomiyosit agrega (iSABs "" uyarılmış Çin-atriyal organları ") yol açar bir murin kalp 6 izole sinüs düğüm hücreleri. İzoprenalin yönetimi altında 550 bpm bile dayak frekansları elde edilir. Özellikle, iSABs 7 analizleri geniş fizyolojik itibaren belirgin% 80'in üzerinde fonksiyonel düğüm hücreleri oluşur. Son zamanlarda, çeşitli yaklaşımlar doğrudan yeniden programlama 19 kullanılarak Sinus düğüm hücreleri oluşturmak için, yüzey 16,17 tarif edildi küçük moleküller ile 14 ya da farmakolojik tedavi işaretler. Ancak, bu yöntemlerin hiçbiri kalp pili hücrelerinin böyle bir yüksek saflıkta yol açtı ve murin yakın frekansları yenerek osanat iSABs görüldüğü gibi.
Dahası, spontan dayak aktivitesini kaybetmiş ekili yetişkin fare ventriküler dilimleri bir ex vivo modelde, iSABs, dilim dokusu içine entegre böylece kendiliğinden aktif kalan ve sağlam kasılmaların 7 kalp dilimleri pacing yeteneğine sahiptir. Bu iSABs üretimi için ayrıntılı bir protokol bu yazıda açıklanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Öneriler Başlamadan Önce
- Onlar sinüs düğümü hücrelerine doğru ayırt çünkü mikoplazma ile kontamine PSC'ler kullanmayın. Protokolü başlamadan önce mikoplazma kontaminasyonu için test. Mikoplazmalar hızlı, son derece duyarlı bir PCR kiti kullanılarak bu yapın ve, üreticinin protokolü izleyin.
- Her bir Petri kabı (aşama 2.3.4), kaplama, bir 10 sm, 37 ° C'de 1 saat boyunca soğuk su balığı deri steril 7 mi,% 0.1 jelatin ile 2 hücre kültür çanağı için. Steril bir tezgah steril koşullar altında çanak kuru jelatin çıkarın ve izin.
- Bir memeli ifade vektörü kullanılarak TBX3 i) Kurucu aşırı ifadesi: Eğer farklılaşma protokolü başlamadan önce aşağıdaki özellikleri içeren bir çift transfekte kararlı fare ES hücre hattı klonu gerekir. Ii) Myh6-destekleyici 5 kontrolü altında G418 direnç geni.
- farklılaşmamış PSC hücreler, bir P-yetiştirmek olmalıdırtarif edilen 1 gibi standart koşullar altında ışınlanmış besleyici hücreler d.
2. Farklılaşma Prosedürü
- İki Gün Farklılaşma önce - besleyici hücreleri PSC'ler çıkarın.
- 10 ml fosfat tamponlu tuzlu su, PBS ile yıkama hücreleri, ortam aspire 7 mi kollajenaz IV, bir çözeltisi eklenmekte ve 37 ° C'de 10 dakika boyunca kuluçkalayın. 50 ml'lik bir tüp içinde bir steril 40 mikron filtre yerleştirin.
- Dikkatle PSC koloniler durulama yukarı ve aşağı 5 kez kollajenaz çözüm pipetleme (besleyici hücreleri çıkarmak için kaçının).
- , 40 mikron filtre hücre süspansiyonu aktarın 8 ml PBS ile filtreyi üç kez yıkayın. Filtre etrafında döndürün ve baş aşağı bir petri yerleştirin. Filtrenin tabanına 10 mi PBS pipetleme PSC hücre kolonileri çıkarın.
- 300 x g, 5 dakika boyunca 15 ml'lik bir tüp ve santrifüj hücre süspansiyonu aktarın.
- 1 ml Accutase ve i hücreleri askıya, PBS Kaldır5 dakika boyunca 37 ° C'de ncubate.
- 10 ml PBS ilave 300 x g 5 dakika boyunca aşağı 5 kez ve santrifüj yukarı pipetleme ve hücre çözeltisi karıştırılır.
- , PBS çıkarın, 10 ml ekimi ortamda hücrelerin askıya ve hücre sayısını belirlemek.
- Tohum 15,000 hücre / 75 cm2 filtre şişesi üzerine dayanan cm2 ve 37 ° C,% 5 CO2 ve 2 gün süreyle yetiştirilir. 2 gün sonra, şişe,% 50-70 konfluent olmalıdır.
- Gün 0 - Farklılaşma Başlangıç
- Ortamı çıkarın ve 10 ml PBS ile yıkama hücreleri.
- , PBS aspire 2 mi Accutase ilave et ve 5 dakika boyunca 37 ° C'de kuluçkalayın. 50 ml'lik bir tüp içinde bir steril 40 mikron filtre yerleştirin.
- 40 um'lik bir filtreden hücre süspansiyonu transferi, 10 mi PBS ekleyin 10 ml PBS ilavesiyle ve santrifüj ile filtre durulama akış yoluyla 300 x g, 5 dakika karıştırıldı.
- 10 ml farklılaşma ortamda hücreleri Askıya ve hücre sayısını belirlemek.
- T seyreltinO 20,000 hücre / ml'lik nihai bir konsantrasyona kadar farklılaşma ortamı ile süspansiyon hücre.
- Pipet 20 ml su ve HDS kurutulması çıkmasını engellemek için bir ikinci derece Petri kabındaki damla (HD) çözeltisi asılı 5 mi.
NOT: Her 24 plaka içeren iSABs için 16 Petri kapları ile başlar (bölüm 2.8.6.4/2.8.7 bakınız). - Bir tepsiye 50 mi hücre süspansiyonu kadar Pipet.
- Petri kapağı etrafında çevirin. 12 kanallı pipet kullanarak kapak üzerine 180 HDS her içeren 20 ul (400 hücre / HD) hücre süspansiyonu yerleştirin.
- Dikkatle kapak dönüp Petri kabı üzerine yerleştirin.
NOT: Kapağın etrafında dönme hızı çok önemlidir. Kapak çok yavaş ya da çok hızlı döndü ise, hücre süspansiyonu yüzey gerilimi asılı kapağındaki damlaları korumak için yeterince yüksek değil. Orta 20 ul damla kapak etrafında dönen ilk kez uygulama için HDS üretmeye çalışıyor önce. - 3 2 gün boyunca hücrelerin kültive7 ° C,% 5 CO 2 onları EBS formu izin.
NOT: 5 Petri kapları bir yığının üzerine su dolu yerleştirin, bir petri. Aksi takdirde, üst petri HD kurur.
- Gün 2
- Dikkatle kuadratik Petri kabı kapağının etrafında çevirin ve 50 ml tüp iki Petri kapları (360 EBS) türetilen EBS aktarmak.
- EBS tüpün dibinde yerleşmek izin 10 dakika bekleyin (EBS santrifüj etmeyin).
- Aspire mümkün olduğu kadar ortam olarak, 10 mi farklılaşma ortamda EBS askıya ve 10 cm Petri için süspansiyonun aktarın.
- Gün 2-6 Süspansiyon kültürü
- 37 ° C'de 4 gün boyunca süspansiyon içinde EBS yetiştirmek,% 5 CO2, 2 gün sonra ortam değiştirin.
Not: EBS genellikle yüzeye eklemek (bir hücre kültürü tabağına aksine) petri tabağı kaplı değildir bile. EBS ekli EBS, her gün ve gerektiğinde kopmakta eğer petri kapları kontrolNazik pipetleme yüzeyinden. İsteğe bağlı: süspansiyon kültürü döneminde sürekli petri kapları çalkalayın. Çalkalayıcı hızıyla dikkatli olun. EBS ne ortasında birikir ne Petri yemekleri sınırına yüzer gerekir.
- 37 ° C'de 4 gün boyunca süspansiyon içinde EBS yetiştirmek,% 5 CO2, 2 gün sonra ortam değiştirin.
- Gün 6
- Bir jelatin kaplı 10 cm 2 hücre kültürü çanak bir Petri kabı EBS aktarın.
- Gün 7-12
- Hücreler 8-12 gün sonra yenmek için başlamalıdır. Günlük mikroskop altında hücrelerin odakları yenerek kontrol edin. hücreler, bir tabaka oluşturmak için başlar.
- Orta gazetesine değiştirin.
NOT: orta değiştirdikten sonra, hücreler kurtarmak ve tekrar dayak başlamak için 3-4 saat gerektirir.
- Sinüs düğüm hücrelerin Gün 12-15 seçimi.
- Hücreler (günlük 12-15 civarında) çarpmaya başladı olan üç gün sonra, hücreler, 400 ug / ml G418 içeren taze farklılaştırma ortamının orta ve pipet 10 ml aspire.
- Hücre katmanı aspire etmeden dikkatlice orta çıkarın.
- PBS 10 ml ekleyin ve hücre tabakası aspire etmeden dikkatlice PBS kaldırmak.
- 50 ml'lik bir tüpe hücreleri transferi ve 5 dakika süreyle 37 ° C'de inkübe hücreleri, kollajenaz IV, 10 ml solüsyonu ekleyin.
- Şiddetle yukarı pipetleme ve 10 kat aşağı süspansiyon karıştırın ve 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe hücreleri. Küçük kümeler bir süspansiyon meydana gelmelidir. Hala sol katmanın büyük parçalar varsa, o adım 2.8.4 iki kez daha tekrarlayın.
- 300 x g, 10 dakika boyunca 20 ml PBS ve santrifüj ekleyin.
- PBS dikkatle aspire.
NOT: iSABs adım 2.8.7 devam elde edilecek ise. Isab türetilmiş sinüs düğüm tek hücre oluşturulur olursak adım 2.9 ile devam. - Hücreleri Askıya12 ml farklılaşma karışımı, 400 ug / ml G418 ihtiva eden ve kaplanmış jelatin 6 kuyu 24 kuyu (/ oyuk 2 mi) üzerine tohum.
- Tek düğüm hücrenin üretilmesi.
- 5 mi Accutase adım 2.8.6 gelen süspanse edildi ve 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Şiddetle yukarı pipetleme ve 10 kat aşağı süspansiyon karıştırın ve 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe hücreleri.
- 300 x g, 5 dakika boyunca 20 ml PBS ve santrifüj ekleyin.
- 400 ug / ml G418 ihtiva eden 12 mi farklılaşma ortamı içinde süspanse 24 kuyu (2 ml / oyuk) kaplanmış bir jelatin 6 kuyu bunları tohum.
- Ayrışma sonrası Gün 2, orta aspire ve PBS ile hücreler üç kez yıkayın. Iyi / 1 ml farklılaşma ortamı ekleyin.
- Gün 4-8 ayrışma sonra, her 2. gün Orta değiştirin. Ayrılma kullanımı iSABs veya isab edilen sinüs 10 gün sonra düğüm tek hücre, daha fazla analiz için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
açıklanan protokol fare kalp dayak frekansına yakın (film gösterilir) PSC'ler yaklaşık 450 bpm bir dayak frekansı ile iSABs üretimi sağlar. Şekil 1 'de gösterildiği gibi, iSABs ayrışmasından (aşama 2.8.8) sonra gözlenen tek hücre sinüs düğümü (mil ve örümcek hücreleri) hücrelerin, tipik şeklini gösterir. Bu hücreler bilinen yüksek hızlı protein fonksiyonu için önemli olduğu hiperpolarizasyon aktive siklik nükleotid kapılı katyon kanalı 4 (Hcn4), Connexin45 (CX45), Connexin30.2 (Cx30.2) ve Myh6 (- C Şekil 2A) gibi sinüs düğümü. Farmasötiklerle isab türetilen hücrelerin bir işlemin ardından hücreler beklenen davranış gösterir: sinüs düğümü gibi, komik kanal tıkayıcı ZD7288 (Şekil 3A) ve aynı zamanda muskarinik reseptör agonisti karbakol (Şekil 3B), her ikisi de önemli ölçüde azaltılmış bir dayak neden isab İkincil sıklığıed hücreler. β-adrenoreseptör agonisti izoprenalin yüksek bir dayak frekansı (Şekil 3C) yol açar.
Şekil 1: mili ve örümcek hücreleri isab edilen mili (A) ve örümcek (B), nodal hücresinin tipik hücresel şekil hücresel şeklinde olabilir. Ölçek çubuğu 20 mikron.
Şekil 2: sinüs düğümü belirteçlerin ifadesi. (A), (sarı) HCN4 ve CX45 (kırmızı), sinüs düğümü hücrelerinde CX45 (kırmızı) ve (sarı) Cx30.2 (B) sentezlenmesi ve (C) Myh6 (kırmızı) ekspresyonu. Çekirdek (turquois) olarak counterstaining. Ölçek çubuğu 20 mikron.
Şekil 3: Farmakolojik iSABs Temsilci tedavisi önce (kontrol) iSABs sıklığını dayak ve ZD7288 (A), karbakol (B) ve İzoprenalin (C) ile tedavi sonrası. Veri sekiz bağımsız iSABs temsil ve ortalama ± SD olarak sunulmaktadır. *** P <0.001
Şekil 4: farklılaşma protokolünün şematik. Isab nesil için deneysel akış şemasını yansıtan Basitleştirilmiş karikatür.
Film:. Ayrışma sonrası tipik kaynaklı sinoatriyal vücudun (Isab) olarak iSABs Dayak ve Dayak Please Bu videoyu görmek için buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
yetenek "biyolojik kalp pili" anlamında uygun kalp ritminin sulandırma izin verebilir hücre kaynaklı kalp pili kök hücreler üretmek için. Aynı şekilde, in vitro uyuşturucu testi onların durumu yararlanacaktır. PSC'leri kalp pili hücresi özellikleri 8,9,10,11,12,13 ile kardiyomiyositlere dahil memeli vücudunun herhangi bir hücre türüne yol açabilir. Ancak, genellikle "Embriyoid Bodies" içinde hücre popülasyonları kaçınılmaz güvenilir bir seçim ve izolasyon stratejilerinin gereksinimine yol açan, oldukça heterojen - Bu kalp düğüm hücreleri çok nadir hücre tipi için geçerlidir. Eksojen ve endojen yüzeye dayalı çok sayıda yaklaşımlar küçük moleküllerin 15,16,17 farmakolojik idaresi ve 18,19 takip edilmiş, doğrudan yeniden programlama stratejileri, 14 işaretler. Buna ek olarak, olmayan kök hücre bazlı yaklaşımlar biyolojik kalp pilleri taklit amaçlayantamamen işlevsel düğüm hücreleri 20,21 yerine de novo sarkolemmal elektrofizyoloji yatan üreten terminali efektör moleküllerin manipülasyonu yoluyla.
Ancak, bunların hiçbiri gerekli yüksek spontan kasılma frekansları ve hücresel saflık ile geldi. Buna karşılık, bizim protokol sadece elektrik titreşimleri değil, aynı zamanda ince elektrofizyolojik ve kalsiyum sinyal özellikleri yanı sıra endojen kalp pili hücrelerinin 7 ayırt edici morfolojik özelliklerini sergilemek olmayan hücrelere yol açar. Bu teknoloji, elektronik cihazların pili alternatifler için önemli bir ön koşul haline gelebilir.
Bu protokol gelişimi sırasında optimize edilmiş olmasına rağmen, yine de sorunlara neden olabilir bazı adımlar vardır: Isab seçimi için başlangıç noktası protokolü önemlidir. Hücrelerin dayak hücrelerini ayırt αMHC-İfade için bir göstergedir. Myh6-İfade eski ile birlikte giderG418 direnç geni ifadesini gösterir. Çok erken seçimi başlayarak potansiyel kardiyomiyositlere ayırt eden ve bu nedenle sinüs düğüm hücrelerinin genel verim azalacak hücrelerin bir çok sönecektir. Başka önemli bir adım hücre tabakası (adım 2.8) ayrışma olduğunu. Bunun nedeni, hücre sağlam bir hücre-dışı matris oluşturan ve güçlü bir kuvvet hücre tabakasını ayırmak için gerekli olmasıdır. Gerekirse, aşama 2.8.4 hücrelerin küçük kümeler hücre tabakasının gelişmiş kadar tekrarlanmalıdır. Çok düşük verimlilik çıktı çünkü örneğin tripsin hücre tabakasının doğrudan ayrışma kaçının.
Gelecekteki klinik uygulamalar için, aşağıdaki engeller hala ele alınması gerekir: Gelecekteki hücre tedavisi doğru ve in vitro ilaç-test önemli bir adım olabilir insan iSABs nesil yaklaşım aktarımı. Ayrıca, teknik, hala stabil genetik modifi dayanmaktadırBu hastaya tatbik edilmeden önce, bu nedenle PSC'lerin ve katyonları modifiye edilmesi gerekir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iscove's liquid medium with stable glutamine | Biochrom AG | FG 0465 | |
| DMEM liquid medium without Na-pyruvate, with stable glutamine | Biochrom AG | FG 0435 | |
| CLS type IV, CLS IV | Biochrom AG | C4-22 | |
| Non-essential amino acids | Biochrom AG | K 0293 | |
| FBS Superior | Biochrom AG | S 0615 | |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Biochrom AG | L 0473 | |
| G 418-BC liquid (ready-to-use solution), sterile | Biochrom AG | A 2912 | |
| Reagent reservoir PP f.multichannel pip. 60ml,sterile | Brand | 703409 | |
| Accutase | eBioscience,Inc. | 00-4555-56 | |
| Eppendorf Xplorer/Xplorer plus, electronic pipette | Eppendorf | 4861000155 | |
| Falcon Cell Strainer 40 µm | Falcon | 352340 | |
| Penicillin/Streptomycin | GE Healthcare | P11-010 | |
| Petri Dishes | Greiner BioOne | 663102 | |
| DPBS without Ca and Mg | PAN-Biotech | P04-36500 | |
| Fetal bovine serum | PAN-Biotech | P30-3302 | |
| Leukemia inhibitory factor | Phoenix Europe GmbH | LIF-250 | |
| Quadratic petri dishes | Roth | PX67.1 | |
| Gelatin from cold water fish skin | SigmaAldrich | G7765 | |
| 2-Mercaptoethanol | SigmaAldrich | M3148 | |
| 1-Thioglycerol | SigmaAldrich | M6145 | |
| Tissue culture dishes | TPP | 93100 | |
| Tissue culture flask | TPP | 90076 | |
| Tissue culture test plates (24 well) | TPP | 92424 |
References
- Wobus, A. M., Wallukat, G., Hescheler, J. Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers. Differentiation. 48 (3), 173-182 (1991).
- David, R., et al. MesP1 drives vertebrate cardiovascular differentiation through Dkk-1-mediated blockade of Wnt-signalling. Nat Cell Biol. 10, 338-345 (2008).
- David, R., et al. Forward programming of pluripotent stem cells towards distinct cardiovascular cell types. Cardiovasc Res. 84 (2), 263-272 (2009).
- Hoogaars, W. M., et al. Tbx3 controls the sinoatrial node gene program and imposes pacemaker function on the atria. Genes Dev. 21 (9), 1098-1112 (2007).
- Klug, M. G., Soonpaa, M. H., Koh, G. Y., Field, L. J. Genetically selected cardiomyocytes from differentiating embronic stem cells form stable intracardiac grafts. J Clin Invest. 98 (1), 216-224 (1996).
- Marger, L., et al. Pacemaker activity and ionic currents in mouse atrioventricular node cells. Channels (Austin). 5 (3), 241-250 (2011).
- Jung, J. J., et al. Programming and isolation of highly pure physiologically and pharmacologically functional sinus-nodal bodies from pluripotent stem cells). Stem cell reports. 2 (5), 592-605 (2014).
- Maltsev, V. A., Wobus, A. M., Rohwedel, J., Bader, M., Hescheler, J. Cardiomyocytes differentiated in vitro from embryonic stem cells developmentally express cardiac-specific genes and ionic currents. Circulation research. 75 (2), 233-244 (1994).
- He, J. Q., Ma, Y., Lee, Y., Thomson, J. A., Kamp, T. J. Human embryonic stem cells develop into multiple types of cardiac myocytes: action potential characterization. Circ Res. 93 (1), 32-39 (2003).
- Yanagi, K., et al. Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels and T-type calcium channels confer automaticity of embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem cells. 25 (11), 2712-2719 (2007).
- Barbuti, A., et al. Molecular composition and functional properties of f-channels in murine embryonic stem cell-derived pacemaker cells. J Mol Cell Cardiol. 46 (3), 343-351 (2009).
- Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American journal of physiology. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301 (5), H2006-H2017 (2011).
- David, R., Franz, W. M. From pluripotency to distinct cardiomyocyte subtypes. Physiology (Bethesda). 27 (3), 119-129 (2012).
- Scavone, A., et al. Embryonic stem cell-derived CD166+ precursors develop into fully functional sinoatrial-like cells). Circ Res. 113 (4), 389-398 (2013).
- Morikawa, K., et al. Identification, isolation and characterization of HCN4-positive pacemaking cells derived from murine embryonic stem cells during cardiac differentiation. Pacing Clin Electrophysiol. 33 (33), 290-303 (2010).
- Wiese, C., et al. Formation of the sinus node head and differentiation of sinus node myocardium are independently regulated by Tbx18 and Tbx3. Circ Res. 104 (3), 388-397 (2009).
- Kleger, A., et al. Modulation of calcium-activated potassium channels induces cardiogenesis of pluripotent stem cells and enrichment of pacemaker-like cells. Circulation. 122 (18), 1823-1836 (2010).
- Bakker, M. L., et al. T-box transcription factor TBX3 reprogrammes mature cardiac myocytes into pacemaker-like cells. Cardiovasc Res. 94 (3), 439-449 (2012).
- Kapoor, N., Liang, W., Marban, E., Cho, H. C. Direct conversion of quiescent cardiomyocytes to pacemaker cells by expression of Tbx18. Nat Biotechnol. 31 (1), 54-62 (2013).
- Johns, D. C., et al. Adenovirus-mediated expression of a voltage-gated potassium channel in vitro (rat cardiac myocytes) and in vivo (rat liver). A novel strategy for modifying excitability. J Clin Invest. 96 (2), 1152-1158 (1995).
- Nuss, H. B., Marban, E., Johns, D. C. Overexpression of a human potassium channel suppresses cardiac hyperexcitability in rabbit ventricular myocytes. J Clin Invest. 103 (6), 889-896 (1999).
