Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Toepassing van een High-throughput Published: December 1, 2014 doi: 10.3791/52467
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Department of Epidemiology, School of Public Health, The University of Michigan, 2Centre for Oral Health Research, School of Dental Sciences, Newcastle University

Summary

Het doel van deze methoden papier is het gebruik van een microfluïdische systeem te beschrijven voor de ontwikkeling van multi-species biofilms dat soort gewoonlijk geïdentificeerd in humaan supragingivale tandplaque bevatten. Methoden om biofilm architectuur, biofilm levensvatbaarheid, en een aanpak om te oogsten biofilm voor cultuur-afhankelijke of cultuur-onafhankelijke analyses zijn gemarkeerd beschrijven.

Abstract

Er zijn weinig high-throughput in vitro systemen die de ontwikkeling van multi-species biofilms die talrijke soorten gewoonlijk binnen in vivo orale biofilms gedetecteerd bevatten vergemakkelijken. Bovendien is een systeem dat natuurlijk humaan speeksel gebruikt als voedingsbron in plaats van kunstmatige media, bijzonder gewenst om de expressie van cellulaire en biofilm specifieke eigenschappen die de in vivo nabootsen gemeenschappen ondersteunen. We beschrijven een werkwijze voor de ontwikkeling van multi-species orale biofilms die vergelijkbaar zijn wat betreft samenstelling species, tandplak supragingivale, onder omstandigheden vergelijkbaar met de menselijke mondholte. Concreet zal dit werkwijzen artikel wordt beschreven hoe een in de handel verkrijgbaar microfluïdische systeem kan worden aangepast aan de ontwikkeling van multi-species orale biofilms ontleend vergemakkelijken en gekweekt in samengevoegd speeksel. Bovendien kan een beschrijving van het systeem in combinatie met een confocal laser scanning microscoop 3-D reconstructies biofilm voor architecturale en levensvatbaarheid analyses genereren gepresenteerd. Gezien de grote diversiteit van micro-organismen die groeien binnen biofilms in de microfluïdische systeem (met inbegrip van Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella, en Porphyromonas), zal een protocol worden gepresenteerd die beschrijven hoe de biofilm cellen te oogsten voor verdere subcultuur of DNA-extractie en analyse. De grenzen van zowel de microfluïdische biofilm systeem en de huidige state-of-the-art data analyses zullen worden aangepakt. Uiteindelijk wordt voorzien dat dit artikel een basislijn techniek die de studie van orale biofilms verbeteren en helpen bij de ontwikkeling van aanvullende technologieën die kunnen worden geïntegreerd met de microfluïdische platform ontstaat.

Introduction

Biofilms zijn architectonisch complex gemeenschappen van bacteriën die worden geaggregeerd op oppervlakken 1. Deze gemeenschappen bevatten doorgaans talrijke soorten die interageren met elkaar binnen de biofilm 2. Orale biofilms, de meest visueel opvallende zijn tandplaque, een aanhoudend probleem bij mensen en ongecontroleerd ontwikkeling resulteert in het genereren van taxonomisch diverse multispeciesvisserij gemeenschappen 3. De component bacteriën van deze verschillende gemeenschappen kan tot 1.000 keer meer resistent tegen antibiotica dan hun vrij zwevende (planktonische) tegenhangers 4-6. Het negeren van deze orale biofilm gemeenschappen, die cariës en parodontale aandoeningen kan veroorzaken te behandelen, heeft geresulteerd in een aanzienlijke last voor de volksgezondheid: meer dan 500 miljoen bezoeken aan de tandarts kantoor per jaar in de VS, en een ongeveer $ 108.000.000.000 te behandelen of parodontale voorkomen ziekte en cariës 7.

content ">" Terwijl veel microbiologen pleiten microbiële gedrag onder natuurlijke omstandigheden, op een paar van hen doen. Dit komt omdat hun moraal voor het overwinnen van de moeilijkheden wordt voortdurend ondermijnd door het aantrekkelijke gemak van het werken met het laboratorium culturen. "-Smith 8.

Op dit moment wordt orale biofilm onderzoek uitgevoerd met behulp van een verscheidenheid van in vivo en in vitro benaderingen, elk met hun eigen voor- en nadelen 9,10. In vitro benadert vaak gebruik van model biofilm systemen die relatief eenvoudig op te zetten, maar kan klinische missen / real-world relevantie 10,11. In vivo technieken vertrouwen typisch op diermodellen dat bepaalde aspecten van het humane orale milieu reproduceren, maar ook last van beperkingen door verschillen in anatomie, fysiologie, microbiologie en immunologie tussen mens en dier 12, 13. Opgemerkt moet worden dat orale biofilmskan ook worden ontwikkeld op glazuuroppervlakken gehouden in een stent binnen de monden van menselijke vrijwilligers, maar deze benadering is nog relatief duur en arbeidsintensief 14,15. Uiteindelijk roman agenten of technologieën om mondzorg te verbeteren, worden getest bij mensen onder gecontroleerde klinische studie omstandigheden 11. Momenteel vaak gebruikte werkwijze voor het identificeren en evalueren van nieuwe orale gezondheidszorg agentia eerst uitgevoerd laboratoriumonderzoek potentiële werkzaamheid onderscheiden, en dierstudies en "veldproeven" die clinici gebruiken om het succes van de techniek 9 evalueren voeren, 16,17. Helaas laboratoriumstudies neiging te vertrouwen op modelsystemen dat een groot voetafdruk delen en technologisch moeilijk te gebruiken, en bevatten vaak vereenvoudigde gemeenschappen een of hoogstens enkele soort mogelijke echte betekenis 10,18 ontlenen. Gezien het feit dat tandplaque biofilms bevatten meerdere soorten en vorm in een complex stromen speeksel milieu, ontwikkelen biofilms die bevatten of enkele species in kunstmatige media waarschijnlijk gemeenschappen die zich gedragen op een soortgelijke wijze als die in een real-world scenario 10,19 genereren. Om de tijd, kosten, opleidingseisen, en de arme representatieve karakter van het laboratorium model biofilm systemen vergeleken met de echte wereld milieu aan te pakken, recent ontwikkelde wij een hoge doorvoer en milieuvriendelijk germane biofilm systeem 20 (figuur 1). Het systeem bovendien gebruik van celvrije gepoolde humaan speeksel (CFS) als medium en onbehandelde gepoolde humane bacteriële cellen speeksel (CCS) als inoculum. Uniek is dat het systeem combineert ook microfluïdische technologie, een confocale laser scanning microscoop, en de cultuur-onafhankelijke bacteriële diversiteit analyse technologie. Dus het modelsysteem is milieuvriendelijk germaan (met speeksel als inoculum multi-species biofilms groeien 37 ° C in steriel gefiltreerd stromendespeeksel) en de orale biofilms bevatten soorten (waaronder Streptococcus, Neisseria, Veillonella en Porphyromonas soorten) in abundanties vertegenwoordiger van die gevonden in de vroege supragingivale plaque 20.

Wanneer men bedenkt dat dit werk beschrijft het gebruik van de nieuw ontwikkelde model systeem, moet bijzondere aandacht worden besteed aan de samensmelting van een confocale laser scanning microscoop (CLSM) microfluidics, en de cultuur-onafhankelijke diversiteit analyse technologieën. De vereniging van deze technologieën door onze onderzoeksgroep was opzettelijk en voegt niet alleen een high-throughput mogelijkheid om de nieuw ontwikkelde model systeem, maar maakt het ook mogelijk vragen te stellen die niet gemakkelijk kan worden aangepakt voordat met andere systemen. Allereerst CLSM heeft duidelijke voordelen boven traditionele microscopie het zorgt voor de driedimensionale analyse van biofilms. Vaak unappreciated, dit is zeer belangrijk biofilms heterogeen with betrekking tot soorten en ruimtelijke positie en de fysiologische omstandigheden opgelegd op verschillende ruimtelijke locaties binnen de biofilm 6,21. In overleg met de drie-dimensionale rendering software en software voor beeldanalyse, de biofilm architectuur, ruimtelijke relaties tussen component soorten, en de omvang van antimicrobiële doden kan worden geanalyseerd 22-24. Dergelijke vaardigheden zijn niet mogelijk met behulp van standaard uitgezonden licht of epifluorescentiemicroscopie. Vervolgens heeft microfluïdische aandacht vergaard op het gebied van microbiologie omdat dit aan de studie van biofilms onder zorgvuldig gecontroleerde omstandigheden (stroomsnelheid, temperatuur, pH, etc.) en slechts kleine hoeveelheden vloeistof 25-27 vereist. Als een punt van vergelijking, groeit een orale biofilm in het menselijk speeksel binnen een stroom cel modelsysteem (een systeem dat aantoonbaar wordt beschouwd als de steunpilaar model voor veel orale biofilm studies) voor 20 uur bij een vergelijkbaar debiet en afschuiving als dat bereiktin een microfluïdische systeem vereist ten minste 200 ml, in tegenstelling tot 800 gl in de microfluïdische inrichting 28-31. Zo, een microfluïdische model biofilm systeem maakt het mogelijk de studie van de hoeveelheid beperkt materiaal onder bepaalde omstandigheden. Tenslotte is Pyrosequencing technologie geoptimaliseerd in de afgelopen tien jaar slechts geringe hoeveelheden materiaal nodig om een ​​gemeenschapsanalyse voeren en voldoende veelzijdig diepte sequencing besturen om de identiteit van zelfs zeldzame soorten biofilm verkrijgen. Het gebruik van deze technologie, zoals bacteriële-tag gecodeerd FLX amplicon pyrosequencing (bTEFAP), heeft het mogelijk gemaakt voor de pertinente vragen over de ecologie van biofilms worden aangepakt 32,33. Dergelijke vragen doordrongen problemen in het verleden als Pyrosequencing niet beschikbaar vanwege de tijd en kosten om plasmide bibliotheken en complexe technologische en analytische stappen die nodig zijn om gegevens 33,34 afleiden maken. Natuurlijk, een groot voordeel met cultuur-onafhankelijke apderingen, zoals pyrosequencing, is dat de bacteriële soorten die niet kunnen worden gekweekt afzonderlijk in conventionele laboratoriummedia (dwz levensvatbare maar niet kweekbare soorten) kunnen worden gekweekt en geïdentificeerd in het modelsysteem en hun relatieve abundantie in de gemeenschap gekwantificeerde 35, 36 . Perspectief, al 1963 toe, wijlen Sigmund Socransky geschat dat ongeveer 50% van de bacteriën in geïsoleerde delen van de humane orale gingivale spleet niet kunnen worden gekweekt met behulp van laboratorium groeiomstandigheden 37.

Het doel van deze methoden paper is om de aanpak te beschrijven om mondelinge multi-species biofilms in een commercieel verkrijgbaar microfluïdisch (Bioflux) systeem onder te ontwikkelen: (i) de voorwaarden vertegenwoordiger van de menselijke mondholte en (ii) met een soortensamenstelling en overvloed die is vergelijkbaar met subgingivale plaque. Bovendien, met behulp van zowel freeware en commerciële software, we benadrukken hoe basic biofilmarchitectuur maatregelen kan worden afgeleid uit CLSM gegevens, met een focus op de aanpak van biofilm biomassa, ruwheid, en de levensvatbaarheid te kwantificeren (op basis van Levend / Dead vlekken). Tot slot, de stappen die nodig zijn om biofilm materiaal voor diversiteit analyse oogsten door bTEFAP worden beschreven.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Het speeksel collectie protocol hierin beschreven werd beoordeeld door de Universiteit van Michigan Institutional Review Board for Human Onderwerp Research.
OPMERKING: Met betrekking tot de institutionele reviews voor menselijke subject werk van dit type, moet vooraf afspraken en machtigingen worden vergaard uit de gastinstelling. In het bijzonder, afhankelijk van de instelling, IRB of ethiek goedkeuring zou moeten worden gezocht en goedgekeurd voordat het speeksel collectie van menselijke vrijwilligers kunnen gaan. Als hulpmiddel bij het ​​opstellen van een aanvraag, kan een nuttige NIH algoritme / grafiek hier te vinden: http://grants1.nih.gov/grants/policy/hs/PrivateInfoOrBioSpecimensDecisionChart.pdf

1. Voorbereiding van gepoolde speeksel voor gebruik als een milieuvriendelijk Germane groeimedium

  1. Werven> 5 personen voor speeksel donatie. Gebruik geen identificerende informatie niet te nemen, zodat er geen indivi-ALS zal speeksel doneren als ze ziek zijn, of hebben orale antibiotica genomen in de afgelopen 3 maanden, of voedsel of vloeistof hebt verbruikt, met uitzondering van water, in de vorige 2 uur voor donatie.
  2. Verzamel speeksel in 50 ml plastic buizen. Bundelen de verzamelde speeksel in een plastic beker, houden het op ijs. Gebruik geen glas als polymeren in het speeksel zal zich houden aan de interne glazen oppervlakken.
  3. Voeg dithiothreitol (DTT) tot een uiteindelijke concentratie van 2,5 mM uit een 100x voorraad. (Stock is bevroren in de single-use fracties bij -20 ° C). Roer gedurende 10 minuten in een plastic beker op ijs.
  4. Om deeltjes te verwijderen, centrifugeer de samengevoegde speeksel gedurende 30 min bij 17.500 x g.
  5. Verdun het speeksel met 3 volumina dH 2 O tot een vierde geven geconcentreerd speeksel.
  6. Filter-steriliseren speeksel met behulp van 0,22 pm polyethersulfon (PES), lage eiwitbinding filter. Gebruik filter met groot oppervlak, of gebruik meerdere kleine gebied filters. Houd speeksel in eenplastic container op het ijs tijdens het filteren.
  7. Bevries de gepoolde speeksel bij -80   ° C in 50 ml kunststofbuizen tot moest bacteriën groeien. Elk plastic buis is voor eenmalig gebruik en mag niet meer dan 35 ml bevatten elk microfluïdisch goed houdt een maximum van 1,2 ml (1,2 ml x 24 putten = 28,8 ml) en ruimte nodig is in elke buis als speeksel uitzet tijdens het invriezen.
  8. Voor gebruik ontdooien de samengevoegde speeksel bij kamertemperatuur. Eenmaal ontdooid, filter-steriliseren eens te meer (0,22 pm polyethersulfon, lage eiwitbinding filter om eventuele neerslag te verwijderen).

2. Voorbereiding van gepoolde speeksel voor gebruik als een inoculum

  1. Werven> 5 personen voor speeksel donatie. Gebruik geen identificerende informatie niet te nemen, zodat er geen personen zullen speeksel doneren als ze ziek zijn, hebben vóór donatie orale antibiotica genomen in de afgelopen 3 maanden, of voedsel of vloeistof hebt verbruikt, met uitzondering van water, in de vorige 2 uur. Verzamel samples meer dan 30 min.
  2. Verzamel speeksel in 50 ml kunststofbuizen bij kamertemperatuur en verzamel het speeksel verzameld in een plastic beker bij kamertemperatuur.
  3. Verdunnen gepoolde speeksel met geautoclaveerd algemene reagenszuiver glycerol om een ​​voorraad te leveren met een laatste verhouding van 25% glycerol, 75%-cel met speeksel [CCS].
  4. Freeze speeksel bij -80 ° C in 3 ml eenmalig aliquots tot gebruik.
  5. Indien vereist het microfluïdische systeem enten worden aliquots ontdooid bij kamertemperatuur en voorzichtig geschud op een vortexer voor 5 seconden voordat het gepipetteerd in het microfluïdische systeem zoals beschreven in stap 3 van het protocol, hieronder.

3. Groei van Oral Multi-species biofilms

  1. CFS voorbehandeling
    1. Eerste laag van de Bioflux microfluïdische kanalen met CVS. Voeg 100 ul van CVS aan elk stopcontact goed. Met behulp van de Bioflux control software, selecteert u "manual" en stel stroom van kanalen "B1-B24" that worden gebruikt.
    2. Vervolgens stelt afschuiving 1,0 dyne / cm² en start stroom gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur homogene verdeling van de CFS gehele kanaal te waarborgen. Zorg dat er vloeistof in elk inlaatkanaal om te controleren dat CVS stroomde door alle kanalen gelijkmatig.
    3. Incubeer plaat bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.
    4. Verwijder de CFS / voorbehandelen oplossing die in de uitlaat putjes blijft en dragen aan de inlaat putjes. Het totaal volume van 100 pi zal dienen in evenwicht tegen de druk wordt uitgeoefend op het inoculum uit het stopcontact ook.
  2. Inenting
    1. Aan elk stopcontact goed, voeg 100 ul van CCS inoculum. Plaats de microfluïdische plaat op de warmte plaat (temperatuur ingesteld op 37 ° C), selecteert u handmatig binnen de besturingssoftware, en stel stroom uit het stopcontact putten naar de inlaat putten (dwz, reverse) op 1,0 dyne / cm² voor precies 6 sec.
    2. Incubeer de microfluïdische plaat bij 37 ° C gedurende 40 min omvoor initiële hechting en groei van de bacteriën in het inoculum.
  3. Overnachting Groei
    1. Voor de geïnoculeerde kanalen gebruikt, zuig het afval inoculum uit elk van de uitlaat putjes. Voeg aan 1 ml totaal volume CFS in elk van de inlaat putjes (kan worden uitgevoerd op bestaande CFS).
    2. Incubeer de microfluïdische plaat bij 37 ° C, selecteert u handmatig en stel het programma te draaien op 0,2 dyne / cm² voor 20 uur.
  4. Vlek voorwas
    1. Zuig alle vloeistof uit de inlaat en uitlaat putten en voeg 100 ul PBS (pH 7,4) aan elk van de inlaat putjes. Stromen gedurende 20 min bij 0,2 dyne / cm².
  5. Vlek mengsel aanvulling
    1. Levensvatbaarheid celkleuring maken 100 ul vlek mengsel voor elk kanaal te worden gemerkt. Specifiek, voeg 3 ul van SYTO 9 en 3 pi propidiumjodide per ml PBS met behulp van commerciële levensvatbaarheid celkleuring kit zoals live / DEAD. Dit genereerteen kleuring mengsel dat 10 pM SYTO 9 en 60 uM propidiumjodide.
    2. Zuig het overgebleven PBS van de inlaat putjes en voeg 100 ul van de cellevensvatbaarheid vlek mengsel aan elke inlaat goed. Stel stromen 0.2 dyne / cm2 en laat de oplossing van inlaat naar uitlaat 45 min bij kamertemperatuur geroerd.
  6. Post-vlekken wassen
    1. Zuig het resterende vlek in elk van de inlaat putten en voeg 100 ul van PBS aan elk inlaat goed. Ingesteld om te stromen bij 0,2 dyne / cm² en voer de PBS-oplossing van inlaat naar uitlaat voor 20 min bij kamertemperatuur om de overtollige vlek te verwijderen.

4. Image Collection, 3D-rendering, en beeldanalyse

  1. Gebruik een omgekeerde confocale laser scanning microscoop (CLSM) om het beeld biofilm gegevens te verzamelen van de microfluïdische systeem. Zorg ervoor dat de CLSM in staat is om het gewicht van de Bioflux plaat, die 150 g kan bereiken weerstaan.
    OPMERKING: Gezien de dubbeltjensions van de microkanalen, de noodzaak gevoeligheid biofilmstructuur onderscheiden, en de eisen fluorescentiesignaal van verschillende intensiteit te detecteren, passen de CLSM met een 40X 1,25 NA objectieflens en een met soortgelijke optische kwaliteit, vergroting en numerieke apertuur.
  2. Standaardiseren van de emissie-capture poorten met gain en offset metingen constant gehouden wordt. Zorg ervoor dat het laservermogen niet meer dan 25%, want dit kan resulteren in een foto-bleken.
  3. Omzetten CLSM bestanden van de L EICA ik mage F ile type (LIF) naar OME (O pen M icroscopy M ilieu) bestandstype. Dit zorgt voor een grotere gemak van toegang en de compatibiliteit tussen softwareprogramma's. Gebruik in de handel verkrijgbare software zoals, IMARIS om bestanden te converteren naar dit type.

3D-weergave voor afbeeldingen / figuren

  1. Eenmaal omgezet naar OME-formaat, in de handel verkrijgbare software zoals IMARIS om de beelden te makenin 3D. Voer deze met behulp van een combinatie van "Easy3D" en "Overtref" opties.
    OPMERKING: Aandacht voor achtergrond signaal en drempelwaarden moeten worden gemaakt. Het histogram functie IMARIS kan worden gebruikt om het verzamelen bereik te verkrijgen en dit moet constant worden gehouden tussen beelden geanalyseerd.
  2. Spaar beelden met behulp van de functie "snapshot" en maak een zorgvuldige afweging te beeldresolutie voordat u deze opslaat bestandstypen.
  3. Assembleren afbeeldingen in cijfers met behulp van beeldbewerkingssoftware, zoals CorelDraw of Adobe Illustrator.

3D Image Analysis voor grafieken en tabellen

  1. Gebruik vrij beschikbaar ImageJ 23 en COMSTAT / COMSTAT2 38 voor beeldanalyse. Download de pakketten van http://rsb.info.nih.gov/ij/ en http://comstat.dk/, respectievelijk. Over de meest recente Java-update geïnstalleerd.
    OPMERKING: De software platform JAVA zal moeten worden geïnstalleerd prior het gebruik van de beeldanalyse software.
    1. Gebruik de ImageJ software met COMSTAT2 plugin om de OME bestanden voor elk beeld biofilm in "HyperStack" mode en uitzicht importeren met "split-kanalen".
    2. Individueel analyseren de twee kanalen (rood / propidiumjodide / dode wezen kanaal 0, groen / SYTO-9 / LIVE-zijnde kanaal 1) met behulp van de "histogram" functie van ImageJ. Deze functie geeft het totale aantal pixels van 8-bit OME bestanden (weergegeven als "count") bij elke kleurintensiteit van 0 tot 255 (getoond als "value"), waarbij 0 pixels zonder signaal (achtergrond) en waarbij 255 pixels met volledige signaalverzadiging.
    3. De gegevens te exporteren naar een spreadsheet-programma en de unificatie van alle signaalwaarden door weging van elke pixel door de overeenkomstige signaal intensiteit. Dit wordt uitgevoerd door het totale aantal op een gegeven signaalintensiteit vermenigvuldigen met het numerieke 8-bit waarde (0-255) van dat signaal intensiteit.
    4. De som van al gewogen waarden, 0-255, voor beide kanalen voor elke afbeelding biofilm vastgelegd. Neem de som van de gewogen waarden voor beide kanalen het percentage totale signaal van elk kanaal te bepalen. Doen dit om de relatieve verhouding of percentage rode en procent groene signaal (dwz het percentage "dood" en het percentage "live" voor elke behandeling) te bepalen.
    5. Voer statistische analyses, bijvoorbeeld met tweezijdige t-toets aangepast voor ongelijke variantie. Waarden van p <0,05 als significant beschouwd en de waarden van p <0,01 worden beschouwd als zeer significant.

5. Oogsten Biofilm Cellen voor Cultuur-onafhankelijke analyse

  1. Verwijder alle verbruikte en ongebruikte speeksel van inlaat en uitlaat putten. Was de putjes met 1 ml steriel gedestilleerd water drie keer.
  2. Voeg 100 ul steriel gedistilleerd water aan de inlaat putjes en met behulp van de software bedieningsinterface, langs desteriel gedestilleerd water vooruit door de kanalen> 8,0 dyne / cm2 (snelheid> 745 ul / uur, afschuiving van 800 sec -1) gedurende ten minste 5 minuten. Herhaal in omgekeerde richting ten minste 5 minuten en vervolgens de voorwaartse herhalen en achteruit wasstap proces.
  3. Controleer door licht of door epifluorescentie microscopie (indien cellen werden gekleurd / gelabeld) voor het grondig biofilms (figuur 2). Het verzamelen van de 100 pi celsuspensie en bewaar bij -80 ° C voor de cultuur-onafhankelijke analyse. Een kosten-effectieve analyse van de gemeenschap samenstelling kan worden bereikt door het gebruik van bacteriële-tag gecodeerd FLX amplicon pyrosequencing (bTEFAP) met behulp van de in Nance et al beschreven aanpak. 20

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

3D-rendering van biofilms

Representatieve resultaten zijn getoond in figuur 3. Een nuttig instrument IMARIS software is de mogelijkheid om elk segment van de verzamelde biofilm stack onderzoeken en combineren driedimensionale reconstructies gemaakt. Bovendien kunnen kunstmatige schaduweffecten worden toegevoegd om visueel te interpreteren driedimensionale structuren. Het gesmolten biofilms kunnen gericht worden in elke richting met verschillende vergrotingen tot biofilm of micro-kolonie structuur verkennen. De beelden weergegeven in Fig. 3 tonen de resultaten van de behandeling van een orale meerdere soorten biofilm. Van bijzonder belang is dat behandeling met 70% ethanol tot aanzienlijke kleurverandering meeste van de biofilm (van groen naar rood), suggereert significante celdood of cel schade. De grote micro-kolonies verschenen om meer dode cellen bevatten dan de onderliggende (en nu bloot) micro-kolonie cellen. Such een uitkomst is denkbaar dat te wijten aan van biofilm cellen-hechting DE omdat ethanol is een membraan-actieve antimicrobiële. Door omzetten van de bestanden naar OME formaat en analyseren van de gesmolten stapels in ImageJ kan worden gezien door toepassing histogram functies die de hoeveelheid rood en groen signaal omgekeerd evenredig tussen de onbehandelde biofilms en die behandeld met ethanol.

Kwantificering van de biofilm Properties

Tabel 1 toont de gemiddelden en standaardafwijkingen van essentiële structurele parameters. Een belangrijk voordeel van het gebruik IMARIS, ImageJ en COMSTAT, dat als IMARIS eerst wordt gebruikt, kan OME bestanden worden gegenereerd om bestanden te pijplijn door ImageJ en COMSTAT. De sample gegevens in tabel 1 blijkt dat de behandeling van de orale biofilms met 70% ethanol tot een zeer significante daling van de levensvatbaarheid van 80,8% tot 28,3%. Ethanol kan enige beschadiging van cellen en structurele c veroorzakenijzigingen in biofilms, maar dit is vaak tijden niet meetbaar significant verschillend. Hier geen verschillen in maten gemiddelde biovolume gemiddelde dikte en gemiddelde ruwheid werden gedetecteerd (Tabel 1).

Figuur 1
Figuur 1. De Bioflux microfluïdische orale biofilm systeem. (A) toont een schema van een verticale doorsnede van het Bioflux systeem tijdens een omgekeerde SPE CLSM gemonteerd. (B) Een geannoteerde (zwarte lijnen) foto markeren twee microfluïdische kanalen en de inlaat en uitlaat putten. (C) Een voorbeeld van een gerenderd tweedimensionale Levend / Dead-lood orale biofilm dat is behandeld met een 0,01% CPC-oplossing resulteert in heterogene doden, mede als gevolg van de reactie diffusiebeperking. Groene kleur geeft aan levende cellen, gekleurdmet Syto 9; rood gekleurde cellen dood of beschadigd en gekleurd met propidium jodide. Figuur 1A en 1B van Nance et al. 20 met toestemming. Bar in Fig. 1C vertegenwoordigt 30 micrometer.

Figuur 2
Figuur 2. Het gebruik van confocale laser scanning microscopie (CLSM) om tweedimensionale en driedimensionale uitzicht van gesmolten 20 uur biofilms te genereren. Deze biofilms werden ontwikkeld in samengevoegde cel-vrije speeksel (CVS) van een entstof van gepoolde cel met speeksel (CCS). Een onbehandelde biofilm gemeenschap (linkerkolom van beelden) wordt vergeleken met een 70% ethanol behandeld biofilm gemeenschap en een vertegenwoordiger biofilm wordt getoond in verschillende vlakken van het oog (XY, XZ, en ZYZ). Histogrammen tonen van de verschillen in het rood (dode / beschadigde cellen) en groene (levende cellen) eenre getoond voor elk beeld stack (gelogde gegevens getoond in zwart en niet-geregistreerde gegevens weergegeven in grijs). Alle gegevens worden afgeleid uit 8 bits afbeeldingen en dus op een schaal van 0-255 (256 stappen). Schaalbalken vertegenwoordigen 30 urn.

Figuur 3
Figuur 3. Stroomschema aantonen van de uitkomst van extractie / oogst van 20 hr mondelinge multi-species biofilm (ontwikkeld van een CCS-inoculum in stromend CVS) van de Bioflux microfluïdische apparaat met behulp van de verhoogde afschuiving / stroom techniek. Gestippelde lijnen zijn toegepast om de beelden te helpen bij het bepalen van de locatie van de kanaalwanden. De gemeenschap samenstelling van de geoogste biofilm kan worden geanalyseerd door 454 pyrosequentiebepaling technieken zoals bacteriële-tag gecodeerd FLX amplicon pyrosequencing (bTEFAP) en uitgedrukt in verschillende taxonomische niveaus (stam tot species) afhankelijk requirements. Getoond wordt een voorbeeld van de gemeenschapssamenstelling op de phylum niveau van biofilms geoogst drie microkanalen. Balken geven schaal in micrometers.

Parameter / Behandeling Onbehandelde 70% EtOH
Gemiddelde levensvatbaarheid (%) 80,8 (0,9) 28,3 (5,8) **
Gemiddelde biovolume (um 3 / um 2) 17,7 (8,4) 16,1 (3,0)
Gemiddelde dikte (um 2) 23.3 (11.3) 15,6 (6,4)
Gemiddelde ruwheid 0.4 (0.3) 0,50 (0.2)

Tabel 1. Kwantificering van biofilm eigenschappen van onbehandelde en 70% ethanol behandeld 20 uur biofilms ontwikkeld in samengevoegde cel-vrije speeksel (CVS) van een entstof-cel met speeksel (CCS). Vet waarden zijn de gemiddelden en niet-vetgedrukt waarden tussen haakjes staan ​​de standaarddeviaties. De gegevens van ten-minste vijf beelden van drie microfluïdische kanalen. Significante verschillen met de onbehandelde controle worden gemarkeerd met een asterisk (** P <0.01%).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Deze methoden paper belicht de fundamentele stappen die nodig zijn om te installeren en uitvoeren van een microfluïdische systeem op een manier te zorgen voor de ontwikkeling van mondelinge multi-species biofilms afgeleid van gepoolde humane speeksel en gekweekt in een filter gesteriliseerde 25% gepoold menselijk speeksel. Benaderingen van de biofilm kenmerken worden gegeven, maar het moet niet vergeten dat deze beschreven benaderingen aanpasbaar en aanvullende technologieën zoals, bijvoorbeeld, kunnen vlekken of labels worden ingevoerd. Als een zaak van Men zou bijvoorbeeld denkbaar gebruiken gelabelde antilichamen of de invoering van een tl-stam te visualiseren en onderzoekt de ruimtelijke positie van bepaalde soorten binnen de mondelinge multi-species biofilm. Bovendien, afhankelijk van het model van het microfluïdische systeem wordt gebruikt, is het mogelijk om biofilms onder anaërobe omstandigheden ontwikkelen (bij het Bioflux systeem, een technische toelichting is beschikbaar Fluxion.com over dit onderwerp).

Een belangrijk aspect aan de Bioflux Microfluïdieksysteemic systeem is de compatibiliteit met meerdere technologieën en dit wordt hier benadrukt door het vermogen cultuuronafhankelijke diversiteit analyses (figuur 3) uitvoeren. Terwijl de inwendige oppervlakken van het microfluïdische systeem niet gemakkelijk toegankelijk, krachtig stroomrichtingen ofwel aanzienlijke biofilm biomassa kunnen worden opgeheven. Hoewel alle biofilm niet gemakkelijk kan worden verwijderd en dit kan worden beschouwd als een zwak aan het systeem, is het relevant op te merken dat veel model biofilm-systemen hebben een soortgelijk probleem en de conclusies van zulke verzamelde gegevens worden getemperd met deze kennis . Zo is het mogelijk dat de overvloed van streptokokken hoger in de biofilm dan feitelijk experimenteel bepaald omdat veel Streptococcus species uitzonderlijk goed vermogen om te binden aan speeksel beklede oppervlakken 39 kunnen zijn.

Zoals bij alle model biofilm systemen, heeft men zich bewust van de vragen die gesteld zijn. Fof voorbeeld, zou dit systeem niet geschikt voor lange termijn longitudinale studies. Een model zoals een constante diepte film reactor, een Sorbarod systeem of een infuus reactor kan geschikter 40-42. Hoewel, het probleem van de beperkte hoeveelheden speeksel voor een modelsysteem wordt een probleem als deze zijn niet microfluidische-gebaseerde ontwerpen. Op soortgelijke licht zouden echter het Bioflux systeem beschreven worden aangepast voor studies van biofilms in andere omgevingen waar biologische vloeistoffen zijn alleen in kleine hoeveelheden. Bijvoorbeeld kan dit zijn urine en wondvocht.

Tot slot, net als bij elke in vitro model systeem, heeft men bewust van de sterke en zwakke punten van de microfluïdische systeem voor de groei van orale biofilms te zijn. Terwijl het microfluïdische systeem aantoonbaar milieuvriendelijk germaan en maakt de biofilmvorming die qua samenstelling vergelijkbaar met de in vivo situatie wordt niet the dezelfde als de in vivo situatie zal waarschijnlijk niet zo zijn. Een laboratorium model is slechts zo goed als zijn veronderstellingen en terwijl de microfluïdische systeem heeft vele overlappingen met omstandigheden in het menselijk mondholte, factoren zoals host-gebaseerde effecten en externe biotische en abiotische uitdagingen (bv door drinken en eten) niet gemakkelijk kan worden gerepliceerd. Het is echter duidelijk dat de hoge doorvoer aard, alsook de milieu- en microbiologische overlapt met de real-world mondsituatie maken dit een aantrekkelijke microfluïdische systeem voor het maken van voorspellingen alvorens in logistiek uitdagende klinische studies.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

De auteurs danken William Nance (Universiteit van Michigan) voor hulp bij het formuleren van de biofilm groei protocollen en John Battista (Fluxion, San Francisco, CA) voor advies met betrekking tot technologische kwesties met betrekking tot de Bioflux systeem. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH: R21DE018820 om AHR) en de Universiteit van Michigan start-up fondsen om AHR

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-432-22
Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-49D
Dithiothreitol (White Crystals or Powder/Electrophoresis), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP172-5
Sorval ultracentrifuge  (SS-34 compatible) Thermoscientific Unit-dependent
Thermo Scientific SS-34 Rotor  Thermoscientific 28-020
Thermo Scientific Type 1 Reagent Grade Deionized Water Thermo  Scientific Inc 23-290-065
Nalgene Rapid-Flow Filter Units and Bottle Top Filters, PES Membrane, Sterile. VWR 73520-986 
Glycerol Thermo Fisher Scientific Inc NC0542269
BioFlux microfluidic system Fluxion Bioflux 200 system
Bioflux 24-channel plate Fluxion 910-0004
PBS (Gibco) Thermo Fisher Scientific Inc 10010023
LIVE/DEAD stain (Invitrogen)  Invitrogen L7012
Confocal Laser Scanning Microscope Lecia SPE or eqivalent system
Epifluorescence Microscope Multiple choices Multiple choices
Pyrosequencing facilities Multiple choices Multiple choices
Decon SaniHol 70 Ethanol Solution Fisher Scientific 04-355-122
Ultra Low Temperature Freezer -80 °C Multiple choices Multiple choices
Tips (20, 200, and 1,000 μl) Multiple choices Multiple choices
Single Channel Variable Volume Pipettors (20, 200, 1,000 μl) Multiple choices Multiple choices
Software
Bioflux dedicated software Bioflux
Imaris Bitplane
Leica SPE Leica
ImageJ Freeware (http://imagej.nih.gov/ij/)
COMSTAT/COMSTAT 2 Freeware (http://www.comstat.dk/)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stoodley, P., Sauer, K., Davies, D. G., Costerton, J. W. Biofilms as complex differentiated communities. Annual review of microbiology. 56, 187-209 (2002).
  2. Wimpenny, J. Microbial metropolis. Advances in microbial physiology. 56, 29-84 (2009).
  3. Jakubovics, N. S., Kolenbrander, P. E. The road to ruin: the formation of disease-associated oral biofilms. Oral diseases. 16 (8), 729-739 (2010).
  4. Mah, T. F., O'Toole, G. A. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends in microbiology. 9 (1), 34-39 (2001).
  5. Cate, J. M., Zaura, E. The numerous microbial species in oral biofilms: how could antibacterial therapy be effective. Advances in dental research. 24 (2), 108-111 (2012).
  6. Gilbert, P., Maira-Litran, T., McBain, A. J., Rickard, A. H., Whyte, F. W. The physiology and collective recalcitrance of microbial biofilm communities. Advances in microbial physiology. 46, 202-256 (2002).
  7. Anon, Centers for Disease Control and Prevention (CDC): Oral health: Preventing cavities, gum disease, tooth loss, and oral cancers. , http://www.cdc.gov/chronicdisease/resources/publications/AAG/doh.htm#aag (2011).
  8. Smith, H. Microbial behavior, 'in vivo' and 'in vitro. Smith, H., Taylor, J. , Cambridge University Press. 1-29 (1964).
  9. Haffajee, A. D., Socransky, S. S. Introduction to microbial aspects of periodontal biofilm communities, development and treatment. Periodontology. 42, 7-12 (2000).
  10. McBain, A. J. Chapter 4: In vitro biofilm models: an overview. Advances in applied microbiology. 69, 99-132 (2009).
  11. Baehni, P. C., Takeuchi, Y. Anti-plaque agents in the prevention of biofilm-associated oral diseases. Oral diseases. 9 Suppl 1, 23-29 (2003).
  12. Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis. Frontiers of oral biology. 15, 117-132 (2012).
  13. Chun, J., Kim, K. Y., Lee, J. H., Choi, Y. The analysis of oral microbial communities of wild-type and toll-like receptor 2-deficient mice using a 454 GS FLX Titanium pyrosequencer. BMC microbiology. 10, 101 (2010).
  14. Diaz, P. I., et al. Molecular characterization of subject-specific oral microflora during initial colonization of enamel. Applied and environmental microbiology. 72 (4), 2837-2848 (2006).
  15. Auschill, T. M., et al. Effect of two antimicrobial agents on early in situ biofilm formation. Journal of clinical periodontology. 32 (2), 147-152 (2005).
  16. Coenye, T., Nelis, H. J. In vitro and in vivo model systems to study microbial biofilm formation. Journal of microbiological. 83 (2), 89-105 (2010).
  17. Donlan, R. M. Role of biofilms in antimicrobial resistance. ASAIO journal. 46 (6), 47-52 (2000).
  18. Wimpenny, J. W. The validity of models. Advances in dental research. 11 (1), 150-159 (1997).
  19. Umland, T. C., et al. In vivo-validated essential genes identified in Acinetobacter baumannii by using human ascites overlap poorly with essential genes detected on laboratory media. 3 (4), (2012).
  20. Nance, W. C., et al. A high-throughput microfluidic dental plaque biofilm system to visualize and quantify the effect of antimicrobials. The Journal of antimicrobial chemotherapy. 68 (11), 2550-2560 (2013).
  21. Werner, E., et al. Stratified growth in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Applied and environmental microbiology. 70 (10), 6188-6196 (2004).
  22. Rueden, C. T., Eliceiri, K. W. Visualization approaches for multidimensional biological image data. BioTechniques. 43 (1 Suppl), 33-36 (2007).
  23. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43, 25-30 (2007).
  24. Rao, D., Arvanitidou, E., Du-Thumm, L., Rickard, A. H. Efficacy of an alcohol-free CPC-containing mouthwash against oral multispecies biofilms. The Journal of clinical dentistry. 22 (6), 187-194 (2011).
  25. Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. Microfluidics expanding the frontiers of microbial ecology. Annual review of biophysics. 43, 65-91 (2014).
  26. Kim, J., Park, H. D., Chung, S. Microfluidic approaches to bacterial biofilm formation. Molecules. 17 (8), 9818-9834 (2012).
  27. Mosier, A. P., Cady, N. C. Analysis of bacterial surface interactions using microfluidic systems. Science progress. 94 (4), 431-450 (2011).
  28. Foster, J. S., Kolenbrander, P. E. Development of a multispecies oral bacterial community in a saliva-conditioned flow cell. Applied and environmental microbiology. 70 (7), 4340-4348 (2004).
  29. Cuadra-Saenz, G., et al. Autoinducer-2 influences interactions amongst pioneer colonizing streptococci in oral biofilms. Microbiology. 158 (7), 1783-1795 (2012).
  30. Rickard, A. H., et al. Autoinducer 2: a concentration-dependent signal for mutualistic bacterial biofilm growth). Molecular microbiology. 60 (6), 1446-1456 (2006).
  31. Corbin, A., Pitts, B., Parker, A., Stewart, P. S. Antimicrobial penetration and efficacy in an in vitro oral biofilm model. Antimicrobial agents and chemotherapy. 55 (7), 3338-3344 (2011).
  32. Diggle, M. A., Clarke, S. C. Pyrosequencing: sequence typing at the speed of light. Molecular biotechnology. 28 (2), 129-137 (2004).
  33. Hiyari, S., Bennett, K. M. Dental diagnostics: molecular analysis of oral biofilms. Journal of dental hygiene : JDH / American Dental Hygienists' Association. 85 (4), 256-263 (2011).
  34. Filoche, S., Wong, L., Sissons, C. H. Oral biofilms: emerging concepts in microbial ecology. Journal of dental research. 89 (1), 8-18 (2010).
  35. Xu, J. Microbial ecology in the age of genomics and metagenomics: concepts, tools, and recent advances. Molecular ecology. 15 (7), 1713-1731 (2006).
  36. Rogers, G. B., Carroll, M. P., Bruce, K. D. Studying bacterial infections through culture-independent approaches. Journal of medical microbiology. 58 (11), 1401-1418 (2009).
  37. Socransky, S. S., et al. The microbiota of the gingival crevice area of man. I. Total microscopic and viable counts and counts of specific organisms. Archives of oral biology. 8, 275-280 (1963).
  38. Heydorn, A., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146 (10), 2395-2407 (2000).
  39. Nobbs, A. H., Lamont, R. J., Jenkinson, H. F. Streptococcus adherence and colonization. Microbiology and molecular biology reviews). MMBR. 73 (3), 407-450 (2009).
  40. Hope, C. K., Clements, D., Wilson, M. Determining the spatial distribution of viable and nonviable bacteria in hydrated microcosm dental plaques by viability profiling. Journal of applied microbiology. 93 (3), 448-455 (2002).
  41. Adams, H., et al. Development of a laboratory model to assess the removal of biofilm from interproximal spaces by powered tooth brushing. American journal of dentistry Spec No 12B-17B. 15, 12-17 (2002).
  42. Ledder, R. G., McBain, A. J. An in vitro comparison of dentifrice formulations in three distinct oral microbiotas. Archives of oral biology. 57 (2), 139-147 (2012).

Tags

Biotechniek Tandplak biofilm confocale laser scanning microscopie driedimensionale structuur pyrosequencing beeldanalyse beeldreconstructie speeksel modellering COMSTAT IMARIS ImageJ multi-species biofilm gemeenschappen.
Toepassing van een High-throughput<em&gt; In Vitro</em&gt; Microfluïdische System op mondelinge Multi-species biofilms Ontwikkel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Samarian, D. S., Jakubovics, N. S.,… More

Samarian, D. S., Jakubovics, N. S., Luo, T. L., Rickard, A. H. Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms. J. Vis. Exp. (94), e52467, doi:10.3791/52467 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter