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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Verwendung eines Hochdurchsatz- Published: December 1, 2014 doi: 10.3791/52467
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Department of Epidemiology, School of Public Health, The University of Michigan, 2Centre for Oral Health Research, School of Dental Sciences, Newcastle University

Summary

Das Ziel dieser Verfahren ist es, die Papier Verwendung eines mikrofluidischen Systems für die Entwicklung von Mehrarten Biofilmen, die typischerweise bei humanen supragingivale Plaque identifiziert Arten enthalten beschreiben. Methoden, um die Biofilmarchitektur Biofilm Lebensfähigkeit und ein Konzept für die Ernte Biofilm für kulturabhängig oder kulturunabhängige Analysen hervorgehoben zu beschreiben.

Abstract

Es gibt nur wenige Hochdurch in vitro-Systeme, die die Entwicklung von Multi-Spezies in Biofilmen zahlreiche Arten üblicherweise in in vivo oral Biofilmen detektiert enthalten erleichtern. Darüber hinaus ist ein System, das natürliche humane Speichel verwendet als Nährstoffquelle, statt künstlicher Medien, um die Expression von zellulären und Biofilm-spezifische Eigenschaften, die in vivo nachahmen Gemeinschaften unterstützt besonders wünschenswert. Wir beschreiben ein Verfahren für die Entwicklung von Mehrarten oralen Biofilmen, die vergleichbar sind, mit Bezug auf die Artenzusammensetzung, um Zahnbelag supragingivalen, unter ähnlichen Bedingungen wie die menschliche Mundhöhle. Genauer gesagt, wird diese Methoden Artikel beschreiben, wie ein im Handel erhältlicher Mikrofluidsystem kann angepasst werden, um die Entwicklung von Multi-Spezies orale Biofilme abgeleitet erleichtern und innerhalb gepoolt Speichel gezüchtet. Darüber hinaus kann eine Beschreibung, wie das System in Verbindung mit einem confoca verwendet werdenl Laserabtastmikroskop zur 3-D Biofilm Rekonstruktionen für architektonische und Lebensfähigkeit Analysen erzeugen vorgestellt. Angesichts des breiten Vielfalt von Mikroorganismen, die in Biofilmen in der mikrofluidischen Systems (einschließlich Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella und Porphyromonas) wachsen, wird ein Protokoll auch beschreiben, wie Sie die Biofilm-Zellen für die weitere Subkultur oder DNA-Extraktion und Analyse Ernte vorgelegt werden. Die Grenzen sowohl der Mikrofluidik Biofilm System und die aktuellen State-of-the-art Datenanalysen angesprochen. Letztlich ist es vorstellbar, dass dieser Artikel eine Basistechnik, die die Untersuchung der oralen Biofilmen verbessern und helfen bei der Entwicklung von weiteren Technologien, die mit dem Mikrofluid-Plattform integriert werden können, bereitzustellen.

Introduction

Biofilme sind architektonisch komplexe Gemeinschaften von Bakterien, die auf Oberflächen 1 zusammengefasst sind. Diese Gemeinschaften enthalten typischerweise zahlreiche Arten, die miteinander innerhalb des Biofilms 2 interagieren. Oral Biofilme, die optisch auffälliger als Zahnbelag, sind ein ständiges Problem bei Menschen und ihre unkontrollierte Entwicklung führt zur Erzeugung von taxonomisch diverse Mehrartengemeinschaften 3. Die Komponente Bakterien dieser verschiedenen Gemeinden können bis zu 1.000 Mal resistenter gegen Antibiotika als ihre freischwebenden (Plankton) Gegen 4-6 sein. Die Nichtbeachtung dieser mündlichen Biofilm Gemeinden, die Karies und Parodontitis verursachen können, zu behandeln, hat zu einer erheblichen Belastung der öffentlichen Gesundheit ergeben: mehr als 500 Millionen Besuche in der Zahnarztpraxis pro Jahr in den USA, und ein etwa 108 Milliarden Dollar zur Behandlung oder Vorbeugung von Zahnfleisch Erkrankung und Karies 7.

Inhalt ">" Während viele Mikrobiologen befürworten Studium mikrobiellen Verhalten unter natürlichen Bedingungen, einige von ihnen tun. Das ist, weil ihre Moral für die Überwindung der Schwierigkeiten wird ständig von den attraktiven einfache Arbeit mit Laborkulturen. "-Smith 8 geschwächt.

Derzeit wird oral Biofilm-Forschung mit einer Vielzahl von in vivo und in vitro Ansätzen durchgeführt, benachteiligt jede mit ihren eigenen Vorteile und 9,10. In-vitro-Ansätze verwenden oft Modell Biofilmsystemen, die relativ einfach zu installieren sind, aber klinische fehlt / realen Welt Relevanz 10,11. In-vivo-Ansätze bei Tiermodellsysteme, die bestimmte Aspekte der menschlichen Mundraum aufgrund der Unterschiede in Anatomie, Physiologie, Mikrobiologie und Immunologie zwischen Tieren vermehren kann, aber wiederum leiden unter Einschränkungen und Menschen 12 der Regel verlassen, 13. Es sollte angemerkt werden, dass die orale Biofilmekann auch auf Email-Oberflächen in einem Stent innerhalb der Mündungen Probanden gehalten entwickelt werden, aber dieser Ansatz ist derzeit relativ aufwendig und arbeitsintensiv, 14,15. Letztlich werden neue Wirkstoffe und Technologien zur Verbesserung der Gesundheitsversorgung Mund beim Menschen unter kontrollierten klinischen Studie Bedingungen 11 getestet. Derzeit ist eine häufig verwendete Vorgehensweise zur Ermittlung und Bewertung neuer Zahnpflegemittel, zuerst durchführen Laborstudien zur möglichen Wirksamkeit zu erkennen, und führen Sie dann Tierversuche und "Feldversuche", die Ärzte verwenden, um den Erfolg der Technologie 9 auszuwerten, 16,17. Leider neigen Laborstudien an Modellsystemen, die einen großen Platzbedarf besetzen verlassen, sind technologisch anspruchsvolle zu bedienen, und enthalten oft vereinfacht Gemeinden eine oder höchstens einige wenige Arten, potenzielle reale Bedeutung 10,18 abzuleiten. Da Zahnbelag Biofilmen enthalten mehrere Arten und Form in einem komplEx fließt Speichelmilieu, die Entwicklung von Biofilmen, die man selbst oder einige Arten in künstlichen Medien ist unwahrscheinlich, dass Gemeinden, die in einer ähnlichen Weise wie in einem realen Szenario 10,19 verhalten zu generieren. Um die Zeit, Kosten, Ausbildungsanforderungen, und die Armen Repräsentativität der Labormodell Biofilmsystemen im Vergleich zur realen Umgebung anzusprechen, haben wir vor kurzem eine Hochdurchsatz und umwelt Germane Biofilmsystem 20 (Abbildung 1). Diese Systeme profitieren von der Verwendung von zellfreien gepoolten menschlichen Speichel (CFS) als Medium und unbehandeltem menschlichem Mischbakterienzellen enthaltenden Speichel (CCS) als Inokulum. Einzigartig ist, verbindet das System auch Mikrofluidik-Technologie, einem konfokalen Laser Scanning Mikroskop und kulturunabhängige bakterielle Vielfalt Analysetechnik. Somit ist die Modellsystem umwelt Germane (mit Speichel als ein Inokulum zum Multispezies Biofilme bei 37 wachsen ° C in filtersterilisiert fließtSpeichel) und die orale Biofilme enthalten Arten (einschließlich Streptococcus, Neisseria, Veillonella und Porphyromonas-Spezies) in Häufigkeiten, die den in frühen supragingivale Plaque 20 gefunden.

Wenn man bedenkt, dass diese Arbeit beschreibt den Einsatz des neu entwickelten Modellsystem, muss besonderes Augenmerk auf die Zusammenlegung der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM) Mikrofluidik und kulturunabhängige Vielfalt Analysetechnologien geben. Die Vereinigung dieser Technologien von unserer Arbeitsgruppe beabsichtigt war und nicht nur fügt eine Hochdurchsatzfähigkeit des neu entwickelten Modellsystem, sondern erlaubt auch die Fragen, die gestellt werden, die nicht leicht adressiert werden, bevor mit anderen Systemen werden. Erstens hat CLSM deutliche Vorteile gegenüber traditionellen Mikroskopie, wie es für die dreidimensionale Analyse von Biofilmen. Oft unbeachtet, dies ist äußerst wichtig, da Biofilme heterogene Witzh bezüglich Artenzusammensetzung und räumliche Lage sowie die physiologischen Bedingungen an unterschiedlichen räumlichen Stellen innerhalb des Biofilms 6,21 auferlegt. Zusammen mit dreidimensionalen Rendering-Software und Bildanalyse-Software, die Biofilmarchitektur räumlichen Beziehungen zwischen Komponentenarten, und das Ausmaß der antimikrobiellen Abtötung analysiert 22-24 werden. Solche Fähigkeiten sind nicht mit Standard-Durchlicht oder Epifluoreszenzmikroskopie. Weiter hat Mikrofluidik insbesondere Aufmerksamkeit erregt auf dem Gebiet der Mikrobiologie es ermöglicht die Untersuchung von Biofilmen unter sorgfältig kontrollierten Bedingungen (Durchfluss, Temperatur, pH, etc.) und erfordert nur kleine Flüssigkeitsvolumina 25-27. Als Vergleichspunkt, Aufwachsen einer oralen Biofilm im menschlichen Speichel innerhalb einer Durchflußzelle Modellsystem (ein System, die wohl als die Hauptstütze Modell für viele oral Biofilm Studien wird) für 20 h bei einer ähnlichen Strömungsrate und Scher wie diejenige erreichtin einem mikrofluidischen System erfordert mindestens 200 ml, im Gegensatz zu 800 & mgr; l in der mikrofluidischen Vorrichtung 28-31. Auf diese Weise ermöglicht ein Mikrofluidik-Modell Biofilmsystem das Studium der Menge begrenzte Material unter definierten Bedingungen. Schließlich hat Pyrosequenzierungstechnologie im letzten Jahrzehnt optimiert, dass nur geringe Mengen an Material erfordern, um eine Gemeinschaft Analyse durchzuführen, und ist vielseitig genug, um Tiefe von der Ablaufsteuerung, um die Identität auch seltene Biofilmspezies erhalten. Der Einsatz dieser Technologie, wie bakterielle Tag-kodierte FLX Amplikon Pyrosequenzierung (bTEFAP) hat für relevante Fragen der Ökologie von Biofilmen dürfen angesprochen 32,33 werden. Solche Fragen durchdrungen Schwierigkeiten in der Vergangenheit, wenn Pyrosequenzierung war nicht verfügbar, da der benötigten Zeit und Plasmid-Bibliotheken und die komplexen technischen und Analyseschritte erforderlich, um Daten abzuleiten 33,34 verursachten Kosten. Natürlich ist ein großer Vorteil, mit kulturunabhängige apAnsätze, wie Pyrosequenzierung, ist, dass die Bakterienspezies, die nicht isoliert innerhalb der üblichen Labormedien (dh lebensfähigen, aber nicht-kultivierbaren Arten) gezüchtet werden können, können gezüchtet und identifiziert innerhalb der Modellsystem und ihre relative Häufigkeit in der Community quantitativ 35, 36 . Um Sicht bereits 1963 hinzufügen schätzte die späten Sigmund Socransky dass etwa 50% der Bakterien im Material von der menschlichen Mund Sulkus isoliert nicht mit Laborwachstumsbedingungen 37 kultiviert werden.

Das Ziel dieser Arbeit ist es, Methoden Beschreibung des Ansatzes zur oralen Multi-Spezies-Biofilmen in einem handelsüblichen Mikrofluid (BIOFLUX) Systems unter sich bilden: (i) Bedingungen repräsentativ für die menschliche Mundhöhle und (ii) mit einem Artenzusammensetzung und Fülle, ist vergleichbar mit supragingivale Plaque. Darüber hinaus verwenden sowohl Freeware und kommerzielle Software, markieren wir, wie Grund BiofilmArchitektur Maßnahmen von CLSM Daten abgeleitet werden, wobei der Schwerpunkt auf Ansätze zur Biofilm Biomasse, Rauheit, und Lebensfähigkeit zu quantifizieren (basierend auf Live / Dead-Färbung). Schließlich werden die erforderlich ist, um Biofilm Material für Vielfalt Analyse bTEFAP ernten Schritten beschrieben.

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Protocol

Die hier beschriebene Speichelentnahme Protokoll wurde von der University of Michigan Institutional Review Board für Menschenversuch überprüft.
HINWEIS: Im Hinblick auf die institutionelle Bewertungen für menschliche Subjekt der Arbeit dieser Art sollten nach vorheriger Vereinbarung und Berechtigungen von der Gasthochschule sammelte werden. Insbesondere in Abhängigkeit von der Institution, IRB oder Ethik Genehmigung Möglicherweise müssen gesucht und genehmigt werden, bevor Speichelentnahme aus Freiwilligen fortfahren. Als Hilfe für die Antragstellung, kann eine nützliche NIH-Algorithmus / Grafik hier: http://grants1.nih.gov/grants/policy/hs/PrivateInfoOrBioSpecimensDecisionChart.pdf

1. Vorbereitung der Pooled Speichel für die Verwendung als umwelt Germane Wachstumsmedium

  1. Rekrutieren> 5 Personen für Speichel Spende. Keine identifizierenden Informationen Nehmen Sie nicht, sicherzustellen, dass keine individuals wird Speichel spenden, wenn sie krank sind, oder haben orale Antibiotika in den letzten 3 Monaten getroffen haben oder Nahrung oder Flüssigkeit verbraucht wird, mit Ausnahme von Wasser, in der vorhergehenden 2 Stunden vor der Spende.
  2. Sammeln Speichel in 50 ml Kunststoffröhrchen. Bündeln die gesammelten Speichel in einen Kunststoffbecher, halten sie auf Eis. Verwenden Sie keine Glas als Polymere im Speichel wird auf die inneren Glasoberflächen haften.
  3. Fügen Dithiothreitol (DTT) bis zu einer Endkonzentration von 2,5 mM aus einer 100-fach Lager. (Auf in Einweg-Aliquots bei -20 froren ° C). Rühre 10 Minuten in einem Kunststoffbecher auf Eis.
  4. Um Partikel zu entfernen, Zentrifuge die gepoolte Speichel für 30 min bei 17.500 x g.
  5. Verdünne den Speichel mit 3 Volumina dH 2 O auf ein Viertel eingeengt Speichel zu ergeben.
  6. Filter-sterilisiert Speichel mit 0,22 um Polyethersulfon (PES), geringe Proteinbindung Filter. Verwenden Sie Filter mit großer Oberfläche, oder verwenden Sie mehrere Filter mit kleinen Flächen. Halten Speichel in einKunststoffbehälter auf Eis und filtert.
  7. Frieren Sie das gepoolte Speichel bei -80   ° C in 50 ml Plastikröhrchen, bis sie benötigt, um Bakterien wachsen. Jeder Kunststoffrohr ist nur für eine Verwendung und sollte nicht mehr als 35 ml enthalten, da jeder Mikrofluidik und kann maximal 1,2 ml (1,2 ml x 24 Wells = 28,8 ml) und Raum wird in jedem Röhrchen benötigt als Speichel beim Gefrieren ausdehnt.
  8. Für den Einsatz, Tauwetter die gepoolten Speichel bei Raumtemperatur. Einmal aufgetaut, Filter-Sterilisierung wieder (0,22 um Polyethersulfon, geringe Proteinbindung Filter, um alle Niederschläge zu entfernen).

2. Herstellung der Pooled Speichel für die Verwendung als Inokulum

  1. Rekrutieren> 5 Personen für Speichel Spende. Keine identifizierenden Informationen Nehmen Sie nicht, sicherzustellen, dass keine Personen werden Speichel spenden, wenn sie krank sind, haben orale Antibiotika in den letzten 3 Monaten in den letzten 2 Stunden vor der Spende entnommen oder haben Nahrung oder Flüssigkeit verbraucht wird, mit Ausnahme von Wasser,. Sammeln samples über 30 min.
  2. Sammeln Sie Speichel in 50 ml Plastikröhrchen bei Raumtemperatur und bündeln die gesammelten Speichel in einen Kunststoffbecher bei Raumtemperatur.
  3. Verdünnen gepoolte Speichel mit autoklaviertem allgemeinen Reagenzqualität Glycerin, eine Aktie mit einem letzten Quote von 25% Glycerin, 75% zellhaltigen Speichel [CCS] ergeben.
  4. Gefriert Speichel bei -80 ° C in 3 ml Einweg Aliquoten bis benötigt.
  5. Wenn erforderlich, um die Mikrofluidsystem zu inokulieren werden Aliquots bei Raumtemperatur, bevor es in dem Mikrofluidsystem, wie in Schritt 3 des Protokolls unten beschrieben pipettiert taut und vorsichtig auf einem Vortexer für 5 s geschüttelt.

3. Wachstum von Oral Multi-Spezies-Biofilme

  1. CFS Vorbehandlungs
    1. Erste Schicht die BIOFLUX mikrofluidischen Kanälen mit CFS. 100 l CFS zu jeder Steckdose gut. Mit dem BIOFLUX Steuerungssoftware, wählen Sie "Manuell" und stellen Sie Flow aus Kanälen "B1-B24" that zu verwenden.
    2. Als nächstes setzen Scher bis 1,0 dyn / cm² und starten Fluss für 2 min bei Raumtemperatur, um eine homogene Verteilung der CFS gesamten Kanal zu gewährleisten. Sorgen Sie für eine Flüssigkeit in jedem Eingangskanal, um zu überprüfen, dass CFS floss durch alle Kanäle gleichmäßig.
    3. Inkubieren Platte bei Raumtemperatur für 20 min.
    4. Entfernen Sie den CFS / Vorbehandlung Lösung, die in den Austrittsbohrungen bleibt und Transfer zu den Einlassbohrungen. Das Gesamtvolumen von 100 ul wird dazu dienen, gegen die Druckwaage mit dem Inokulum aus dem Auslaß angewendet.
  2. Impfung
    1. Zu jeder Steckdose gut, fügen Sie 100 ul der CCS-Impfstoff. Setzen Sie den mikrofluidischen Platte auf der Wärmeplatte (Temperatur auf 37 ° C eingestellt ist), wählen Sie Anleitung in der Steuerungssoftware und stellen Sie Flow aus der Steckdose Brunnen zu den Einlassbohrungen (reverse) bei 1,0 dyn / cm² für genau 6 Sek.
    2. Inkubieren der mikrofluidischen Platte bei 37 ° C für 40 min, damitfür die anfängliche Haftfähigkeit und das Wachstum der Bakterien in dem Inokulum.
  3. Übernachtung Wachstum
    1. Für die inokulierten Kanäle verwendet absaugen Abfall Inokulum aus jeder der Austrittsbohrungen. Sie können bis zu 1 ml Gesamtvolumen von CFS in jede der Einlaßbohrungen (kann auf der Oberseite des vorhandenen CFS durchgeführt werden).
    2. Inkubieren Sie die Mikrofluid-Platte bei 37 ° C, wählen Sie die manuelle und setzen das Programm bei 0,2 dyn / cm² für 20 Stunden laufen.
  4. Stain Vorwäsche
    1. Aspirieren von Fluid aus der Eintritts- und Austrittsbohrungen und mit 100 ul PBS (pH 7,4) zu jeder der Einlassbohrungen. Durchfluss für 20 min bei 0,2 dyn / cm².
  5. Stain Mischung zusätzlich
    1. Für die Lebensfähigkeit der Zellen Färbung machen 100 ul Flecken Mischung für jeden Kanal, gefärbt werden. Insbesondere hinzufügen 3 ul SYTO 9 und 3 ul Propidiumiodid pro ml PBS mit kommerziellen Lebensfähigkeit der Zellen Färbekit wie Live / Dead. Dies erzeugteine Färbelösung, enthaltend 10 uM SYTO 9 und 60 & mgr; M Propidiumiodid.
    2. Saugt den verbleibenden PBS von den Eintrittsbohrungen und dann mit 100 ul der Zelllebensfähigkeit Flecken Mischung auf jedes Einlaß gut. Soll bei 0,2 dyn / cm 2 von der Einlassfluss und führen Sie die Lösung für 45 Minuten bei Raumtemperatur Steckdose.
  6. Post-Färbung Wasch
    1. Saugt den restlichen Flecken in jeder der Einlaßbohrungen und mit 100 ul PBS in jedes Einlaß gut. Soll bei 0,2 dyn / cm² von Einlassstrom und starten Sie das PBS-Lösung für 20 Minuten bei Raumtemperatur Steckdose, um überschüssiges Fleck zu entfernen.

4. Bildsammlung, 3D-Rendering, und Bildanalyse

  1. Verwenden Sie ein umgekehrtes konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM) zur Bild Biofilm Daten aus dem mikrofluidischen System zu sammeln. Stellen Sie sicher, dass die CLSM der Lage ist, das Gewicht des BIOFLUX Platte, die 150 g erreichen können, zu widerstehen.
    HINWEIS: Angesichts der Groschennsions der mikrofluidischen Kanälen, die Notwendigkeit einer Sensibilität für Biofilm-Struktur zu erkennen, und die Anforderungen zu erkennen Fluoreszenzsignal von unterschiedlicher Intensität, passen die CLSM mit einer 40X 1,25 NA Objektiv oder eine ähnliche optische Qualität, Vergrößerung und numerische Apertur.
  2. Vereinheitlichung der Emissionserfassung Tore mit Verstärkungs- und Offset-Messungen konstant gehalten wird. Stellen Sie sicher, dass die Laserleistung 25% nicht überschreiten, da dies zu Fotobleichen führen.
  3. Konvertieren CLSM-Dateien aus dem L eica Ich mage F ile Typ (LIF) zu OME (O pen M icroscopy E nvironment) Dateityp. Dies ermöglicht eine größere Leichtigkeit des Zugangs und Kompatibilität zwischen Softwareprogramme. Verwenden Sie handelsübliche Software wie Imaris, Dateien auf diese Art umzuwandeln.

3D-Rendering für Bilder / Abbildungen

  1. Einmal auf OME-Format konvertiert, eine handelsübliche Software wie Imaris um die Bilder machenin 3D. Führen Sie dies durch eine Kombination von "Easy3D" und "übertreffen" Optionen.
    HINWEIS: Die Liebe zum Hintergrundsignal und Schwellen sollte vorgenommen werden. Die Histogramm-Funktion in Imaris kann die Sammlung Bereich zu erhalten, und dies sollte konstant gehalten zwischen den Bildern, die analysiert werden.
  2. Bilder mit der Funktion "Momentaufnahme" zu sparen und sich sorgfältig überlegen, Bildauflösung vor dem Speichern Dateitypen.
  3. Montieren Sie Bilder in Zahlen mit Bildbearbeitungssoftware wie Corel Draw oder Adobe Illustrator.

3D-Bildanalyse für Grafiken und Tabellen

  1. Nutzen Sie kostenlos verfügbare ImageJ 23 und COMSTAT / COMSTAT2 38 für die Bildanalyse. Laden Sie die Pakete von http://rsb.info.nih.gov/ij/ und http://comstat.dk/ auf. Haben die letzte Java-Update installiert.
    HINWEIS: Die Software-Plattform Java muss installiert werden Prior die Verwendung der Bildanalyse-Software.
    1. Verwenden Sie die ImageJ Software mit COMSTAT2 Plugin, um die OME-Dateien für jedes Bild in Biofilm "Hyperstack" -Modus und Ausblick mit "aufgeteilt Kanäle" zu importieren.
    2. Individuell analysieren die beiden Kanäle (rot / Propidiumiodid / tot Befinden Kanal 0, grün / SYTO-9 / LIVE-Sein Kanal 1) mit dem "Histogramm" Funktion der ImageJ. Diese Funktion führt die Gesamtzahl der Pixel von 8-Bit-OME Dateien (als "count" dargestellt) an jeder der Farbintensität von 0 bis 255 (als "Wert" gezeigt), wobei 0 die Pixel ohne Signal (Hintergrund) und 255 Befinden Pixel mit kompletten Signalsättigung.
    3. Exportieren Sie die Daten in eine Tabellenkalkulation und zu standardisieren, alle Signalwerte durch Gewichtung der einzelnen Pixel durch die entsprechende Signalintensität. Dies wird durch Multiplizieren der Gesamtzahl bei einer gegebenen Signalintensität durch den numerischen Wert von 8 Bit (0-255) der genannten Signalintensität durchgeführt wird.
    4. Zusammenfassend alle gewichteten Werte, von 0 bis 255, für beide Kanäle für jeden Biofilm Bild aufgenommen. Nehmen Sie die Summe der gewichteten Werte für beide Kanäle, um die prozentuale Gesamtsignal aus einem der Kanäle zu bestimmen. Tun dies, um das relative Verhältnis oder Prozent roten und Prozent grünes Signal (dh den Prozentsatz "tot" und die prozentuale "LIVE" für jede Behandlung) zu bestimmen.
    5. Statistische Analysen durchführen, beispielsweise mit zweiseitigen Student-T-Test für ungleiche Varianz modifiziert. Werte von p <0,05 werden als signifikant und die Werte von p <0,01 sind als sehr wichtig.

5. Ernten Biofilm-Zellen für die Kultur-unabhängige Analyse

  1. Entfernen Sie alle verbracht und unbenutzt Speichel von Ein- und Auslaufbrunnen. Mit 1 ml sterilem destilliertem Wasser dreimal Waschen Sie die Vertiefungen.
  2. 100 l sterilem destilliertem Wasser zu den Einlassbohrungen und mit Hilfe des Software-Steuerschnittstelle, übergeben diesteriles destilliertes Wasser nach vorne durch die Kanäle auf> 8,0 dyn / cm 2 (Durchfluss> 745 & mgr; l / h, Scherung von 800 s -1) für mindestens 5 min. Wiederholen in umgekehrter Richtung für mindestens 5 min und wiederholen Sie die Forward- und Reverse Waschschritt Prozess.
  3. Prüfen Sie durch Licht oder durch Epifluoreszenzmikroskopie (wenn Zellen wurden gefärbt / beschriftet) zur gründlichen Biofilmentfernung (Abbildung 2). Sammeln Sie die 100 ul Zellsuspension und bei -80 ° C für die kulturunabhängige Analyse. Eine kostengünstige Analyse von Community-Zusammensetzung kann durch Verwendung bakterieller Tag-kodierte FLX Amplikon Pyrosequenzierung (bTEFAP) mit Hilfe der in Nance et al Ansatz erreicht werden. 20

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Representative Results

3D-Rendering von Biofilmen

Repräsentative Ergebnisse sind in 3 gezeigt. Ein nützliches Werkzeug in Imaris Software ist die Möglichkeit, jede Scheibe des gesammelten Biofilm Stapel zu untersuchen und zu kombinieren, um dreidimensionale Rekonstruktionen zu erstellen. Zusätzlich können künstliche Abschattungseffekte hinzugefügt werden visuell zur Interpretation dreidimensionalen Strukturen. Die erbrachten Biofilmen kann in jede Richtung mit unterschiedlichen Vergrößerungen Biofilm oder Mikrokoloniestruktur erforschen orientieren. Die Abbildungen in Fig dargestellt. 3 zeigen die Ergebnisse der Behandlung einer oralen Multi-Spezies-Biofilm. Von besonderer Bedeutung ist, dass die Behandlung mit 70% Ethanol ergab signifikante Farbänderung für die meisten der Biofilm (von grün bis rot), was darauf hindeutet signifikanten Zelltod oder Zellschädigung. Die großen Mikrokolonien schien mehr tote Zellen enthalten als die zugrunde liegenden (und jetzt ausgesetzt) ​​Mikrokolonie-Zellen. Such ein Ergebnis ist denkbar durch Enthaftung der Biofilmzellen weil Ethanol ist ein membranaktiven antimikrobiell. Durch Umwandlung der Dateien zu OMe Format und Analysieren der gerenderten Stapeln in imagej, kann sie durch Aufbringen Histogramm Funktionen, die der Menge von Rot und Grün-Signal ist umgekehrt proportional zwischen den unbehandelten Biofilmen und die mit Ethanol behandelt wurden, beobachtet werden.

Quantifizierung von Biofilm Eigenschaften

Tabelle 1 zeigt die Mittelwerte und Standardabweichungen der wichtigsten Strukturparameter. Ein wesentlicher Vorteil der Verwendung Imaris, ImageJ und COMSTAT, ist, dass wenn Imaris zuerst verwendet wird, können OME-Dateien generiert werden, um Dateien zu durch ImageJ und COMSTAT Pipeline werden. Die Sample-Daten in Tabelle 1 zeigt, dass die Behandlung der oralen Biofilmen mit 70% Ethanol führte zu einer sehr deutlichen Rückgang der Rentabilität von 80,8% auf 28,3%. Ethanol kann eine Zellschäden und Struktur c verursachenHanges in Biofilmen, aber dies ist häufig nicht meßbar Zeiten signifikant. Dabei wurden keine Unterschiede im Hinblick auf durchschnittliche Biovolumens, mittlere Dicke und die durchschnittliche Rauhigkeit nachgewiesen (Tabelle 1).

Figur 1
Abbildung 1. Die BIOFLUX mikrofluidischen mündlichen Biofilm-System. (A) eine Darstellung, welche einen senkrechten Querschnitt des BIOFLUX System, während es auf einem invertierten SPE CLSM montiert. (B) Eine kommentierte (schwarze Linien) Foto markieren zwei mikrofluidischen Kanälen und die Ein- und Austrittsbohrungen. (C) Ein Beispiel eines gerenderten zweidimensionalen Live / Dead gefärbten oralen Biofilms mit einer 0,01% CPC-Lösung, was zu heterogenen Tötung, teilweise wegen einer Reaktion Diffusionsbegrenzungs behandelt wurde. Grüne Farbe zeigt lebende Zellen, angefärbtmit Syto 9; rot gefärbte Zellen sind tot oder beschädigt ist und mit Propidiumiodid gefärbt. 1A und 1B von Nance et al. 20 mit Genehmigung. Bar in Abb. 1C stellt 30 um.

Abbildung 2
2. Verwendung von konfokaler Laser Scanning Mikroskopie (CLSM) zur zweidimensionalen und dreidimensionalen Ansichten der wieder 20 Stunden Biofilme zu generieren. Diese Biofilme wurden in gepoolten zellfreien Speichel (CFS) von einem Inokulum von gepoolten zellhaltigen Speichel (CCS) entwickelt. Eine unbehandelte Biofilm-Gemeinschaft (linke Spalte von Bildern) gegen eine 70% Ethanol behandelt Biofilm-Gemeinschaft verglichen und ein Vertreter Biofilm in verschiedenen Ebenen Ansicht (XY, XZ und ZYZ) gezeigt. Histogramme, die die Unterschiede in rot (tot / geschädigten Zellen) und Grün (lebende Zellen) einre für jeden Bildstapel gezeigt (angemeldet in grau dargestellt schwarz und nicht-aufgezeichneten Daten angezeigt Daten). Alle Daten aus 8-Bit-Bilder und damit auf einer Skala von 0-255 (256 Stufen) abgeleitet. Maßstabsbalken repräsentieren 30 um.

Figur 3
Abbildung 3: Ablaufdiagramm zeigt das Ergebnis der Extraktion / Ernte von 20 Stunden mündliche Multi-Spezies-Biofilm aus dem BIOFLUX Mikrofluidik-Vorrichtung unter Verwendung der erhöhten Scher / Flow-Technik (von CCS Inokulum in fließenden CFS entwickelt). Gepunktete Linie auf die Bilder angewendet, um bei der Bestimmung der Lage der Kanalwände zu unterstützen. Die Gemeinde Zusammensetzung des Ernteguts Biofilm kann durch 454 Pyrosequenzierung Technologien wie Bakterien-Tag-kodierte FLX Amplikon Pyrosequenzierung (bTEFAP) je nach req analysiert und zum Ausdruck auf mehreren taxonomischen Ebenen (Stamm durch Arten) werdenuirements. Gezeigt ist ein Beispiel für die Zusammensetzung der Gemeinschaft an dem Stamm Ebene von Biofilmen von drei Mikrofluidik-Kanäle geerntet. Die Balken stellen Skala in Mikrometern.

Parameter / Behandlung Unbehandelt 70% EtOH
Durchschnittliche Lebensfähigkeit (%) 80,8 (0,9) 28,3 (5,8) **
Durchschnittliche Biovolumen (um 3 / um 2) 17,7 (8,4) 16.1 (3.0)
Durchschnittliche Dicke (& mgr; m 2) 23,3 (11,3) 15,6 (6,4)
Durchschnittliche Rauheit 0,4 (0,3) 0.50 (0.2)

Tabelle 1: Quantifizierung von Biofilm Eigenschaften von unbehandeltem und 70% Ethanol behandelt 20 in gepoolten zellfreien Speichel (CFS) entwickelt hr Biofilme aus einem Inokulum zellhaltigen Speichel (CCS). Bold-Werte sind die Mittelwerte und nicht-schwungvoller Schriftzug Werte in Klammern sind die Standardabweichungen. Die Angaben stammen aus at-mindestens fünf Bilder von drei mikrofluidischen Kanälen. Signifikante Unterschiede zur unbehandelten Kontrolle durch ein Sternchen (** P <0,01%) hervorgehoben.

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Discussion

Diese Methodenpapier hebt die grundlegenden Schritte zur Einrichtung erforderlich und führen Sie ein Mikrofluidsystem in einer Weise, die für die Entwicklung von oralen Multi-Spezies-Biofilme aus gepoolten menschlichen Speichel abgeleitet und in filtersterilisiert 25% gepoolten menschlichen Speichel wachsen lassen. Ansätze, um den Biofilm zu charakterisieren sind, gegeben, aber es sollte daran erinnert werden, dass diese beschriebenen Ansätze modifizierbar sind und zusätzliche Technologien, wie beispielsweise Flecken oder Etiketten eingebracht werden. In der beispielsweise ein möglicherweise verwenden markierte Antikörper oder einen fluoreszierenden Stamm zu visualisieren und zu untersuchen, die räumliche Position des bestimmten Spezies in der Mundmultispezies-Biofilm einzuführen. Darüber hinaus je nach Modell des mikrofluidischen Systems verwendet wird, ist es möglich, Biofilme unter anaeroben Bedingungen zu entwickeln (im Falle des BIOFLUX System, ist ein technischer Hinweis verfügbar Fluxion.com zu diesem Thema).

Ein zentraler Aspekt in die BIOFLUX Mikrofluidic Systems ist seine Kompatibilität mit verschiedenen Technologien und dies wird hier durch die Fähigkeit zur Bildung unabhängigen Diversität analysiert (Abbildung 3) auszuführen hervorgehoben. Während die Innenflächen des mikrofluidischen System nicht leicht zugänglich sind, kräftig Vor- und Rücklauf nicht aktivieren erhebliche Biofilm Biomasse entfernt werden. Während all des Biofilms kann nicht einfach entfernt werden und dies könnte als eine Schwäche für das System ist, ist es relevant, dass viele Modellbiofilmsystemen haben auch ein ähnliches Problem und die Forderungen aus solchen gesammelten Daten wurden mit diesem Wissen gemildert werden . Beispielsweise ist es möglich, dass die Fülle von Streptokokken möglicherweise höher im Biofilm als tatsächlich experimentell bestimmt, weil viele Streptococcus Spezies haben außergewöhnlich gute Fähigkeiten zur Speichel beschichteten Oberflächen 39 zu binden.

Wie bei allen Modellbiofilmsystemen, muss man darauf achten, die Fragen gestellt werden. Foder beispielsweise dieses System wäre nicht geeignet für die Langzeit Longitudinalstudien sein. Ein Modellsystem, wie beispielsweise eine konstante Tiefe Filmreaktor, einer Sorbarod System oder einer Tropf Reaktor als geeignetere 40-42 sein. Obwohl das Problem der begrenzten Mengen von Speichel nach einem Modellsystem wird zu einem Problem, da diese nicht Mikrofluidik-basierten Designs. In einer ähnlichen Licht allerdings könnte die hier beschriebene BIOFLUX System auch für Untersuchungen von Biofilmen in anderen Umgebungen, in denen biologische Flüssigkeiten sind nur in kleinen Mengen verfügbar angepasst werden. Zum Beispiel könnte dies Urin und Wundsekret aufzunehmen.

Abschließend, wie bei jeder in vitro Modellsystem hat man bewusst die Stärken und Schwächen des mikrofluidischen Systems für das Wachstum von Biofilmen oral sein. Während die Mikrofluidsystem ist wohl umwelt German und ermöglicht die Entwicklung von Biofilmen, die in der Zusammensetzung ähnlich der in vivo Situation sind, ist es nicht THe elbe wie die in vivo Situation und wird wahrscheinlich niemals so sein. Ein Labor-Modellsystem ist nur so gut wie seine Annahmen und während der mikrofluidischen System hat viele Überschneidungen mit Bedingungen in der menschlichen Mundhöhle, Faktoren wie die Host-basierte Effekte und externe biotischen und abiotischen Herausforderungen (zB durch Trinken und Essen) kann nicht einfach sein, repliziert. Es ist jedoch klar, dass die Hochdurchsatz-Art sowie der Umwelt- und mikrobiologische überschneidet sich mit der realen Welt Mundsituation machen es zu einem verführerischen Mikrofluidsystem für Vorhersagen, bevor sie ein logistisch anspruchsvollen klinischen Studien.

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Acknowledgments

Die Autoren danken William Nance (University of Michigan) um Hilfe bei der Formulierung der Biofilmwachstum Protokolle und Johannes Battista (Fluxion, San Francisco, CA) für die Beratung bei technischen Fragen im Zusammenhang mit der BIOFLUX System. (: R21DE018820 zu AHR NIH) und der University of Michigan Anschubfinanzierung, um AHR Diese Arbeit wurde von der National Institutes of Health

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-432-22
Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-49D
Dithiothreitol (White Crystals or Powder/Electrophoresis), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP172-5
Sorval ultracentrifuge  (SS-34 compatible) Thermoscientific Unit-dependent
Thermo Scientific SS-34 Rotor  Thermoscientific 28-020
Thermo Scientific Type 1 Reagent Grade Deionized Water Thermo  Scientific Inc 23-290-065
Nalgene Rapid-Flow Filter Units and Bottle Top Filters, PES Membrane, Sterile. VWR 73520-986 
Glycerol Thermo Fisher Scientific Inc NC0542269
BioFlux microfluidic system Fluxion Bioflux 200 system
Bioflux 24-channel plate Fluxion 910-0004
PBS (Gibco) Thermo Fisher Scientific Inc 10010023
LIVE/DEAD stain (Invitrogen)  Invitrogen L7012
Confocal Laser Scanning Microscope Lecia SPE or eqivalent system
Epifluorescence Microscope Multiple choices Multiple choices
Pyrosequencing facilities Multiple choices Multiple choices
Decon SaniHol 70 Ethanol Solution Fisher Scientific 04-355-122
Ultra Low Temperature Freezer -80 °C Multiple choices Multiple choices
Tips (20, 200, and 1,000 μl) Multiple choices Multiple choices
Single Channel Variable Volume Pipettors (20, 200, 1,000 μl) Multiple choices Multiple choices
Software
Bioflux dedicated software Bioflux
Imaris Bitplane
Leica SPE Leica
ImageJ Freeware (http://imagej.nih.gov/ij/)
COMSTAT/COMSTAT 2 Freeware (http://www.comstat.dk/)

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References

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Bioengineering Zahnbelag Biofilm konfokaler Laser Scanning Mikroskopie die dreidimensionale Struktur Pyrosequenzierung Bildanalyse Bildrekonstruktion Speichel Modellierung COMSTAT Imaris ImageJ Multi-Spezies-Biofilmgemeinschaften.
Verwendung eines Hochdurchsatz-<em&gt; In-vitro-</em&gt; Mikrofluidik-System auf die mündliche Multi-Spezies-Biofilme entwickeln
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Samarian, D. S., Jakubovics, N. S.,… More

Samarian, D. S., Jakubovics, N. S., Luo, T. L., Rickard, A. H. Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms. J. Vis. Exp. (94), e52467, doi:10.3791/52467 (2014).

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