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Bioengineering

L'uso di un high-throughput doi: 10.3791/52467 Published: December 1, 2014

Summary

L'obiettivo di questo metodo è di descrivere l'uso di un sistema microfluidico per lo sviluppo del biofilm multispecie che contengono specie tipicamente identificate nella placca dentale sopragengivale umana. Metodi per descrivere l'architettura biofilm, la vitalità biofilm, e un approccio alla raccolta biofilm per le analisi di coltura-dipendente o indipendente dalla cultura sono evidenziati.

Abstract

Ci sono pochi-throughput elevato in sistemi in vitro che facilitano lo sviluppo di biofilm multispecie che contengono numerose specie comunemente rilevati all'interno di biofilm orali in vivo. Inoltre, un sistema che utilizza saliva umana naturale come fonte di nutrienti, invece di mezzi artificiali, è particolarmente auspicabile per sostenere l'espressione di proprietà cellulari e specifici biofilm che imitano le comunità in vivo. Noi descriviamo un metodo per lo sviluppo di multispecie biofilm orali che sono paragonabili, rispetto alla composizione delle specie, per sopragengivale placca dentale, in condizioni analoghe a cavità orale umana. In particolare, questo articolo metodi descriverà come un sistema microfluidico disponibile in commercio può essere adattato per facilitare lo sviluppo di multispecie biofilm orali derivate da e coltivata all'interno saliva pool. Inoltre, una descrizione di come il sistema può essere utilizzato in congiunzione con un confocalaser microscopio a scansione l per generare 3-D ricostruzioni biofilm per analisi di architettura e vitalità saranno presentati. Data la grande diversità dei microrganismi che si sviluppano all'interno di biofilm nel sistema microfluidica (compreso Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella, e Porphyromonas), un protocollo verrà presentato anche che descrive come raccogliere le cellule biofilm per ulteriori subcultura o l'estrazione del DNA e l'analisi. Verranno trattati i limiti sia del sistema biofilm microfluidica e le analisi attuali state-of-the-art di dati. In ultima analisi, è previsto che tale articolo fornisce una tecnica di base in grado di migliorare lo studio dei biofilm orali e contribuire allo sviluppo di tecnologie aggiuntive che possono essere integrate con la piattaforma microfluidica.

Introduction

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I biofilm sono architettonicamente comunità complesse di batteri che sono raggruppati sulle superfici 1. Queste comunità in genere contengono numerose specie che interagiscono tra loro all'interno del biofilm 2. Biofilm orali, il più visivamente evidente essendo la placca dentale, sono un problema persistente negli esseri umani e dei loro risultati di sviluppo incontrollato della generazione di tassonomicamente diverse comunità multi-specie 3. I batteri che compongono queste diverse comunità possono essere fino a 1.000 volte più resistenti agli antibiotici rispetto ai loro (planctonici) controparti free-floating 4-6. Il mancato trattamento di queste comunità biofilm orali, che possono causare carie e malattia parodontale, ha portato ad un notevole onere di salute pubblica: oltre 500 milioni di visite dal dentista all'anno negli Stati Uniti, e uno di circa 108.000 milioni dollari per trattare o prevenire parodontale malattia e carie dentale 7.

content ">" Mentre molti microbiologi sostengono lo studio del comportamento microbica in condizioni naturali, alcuni di loro lo fanno. Questo perché la loro morale per superare le difficoltà è costantemente minato dalla facilità attraente di lavorare con culture di laboratorio. "-Smith 8.

Allo stato attuale, la ricerca biofilm orale è condotta utilizzando una varietà di in vivo e in vitro approcci, ognuno con i propri vantaggi e svantaggi 9,10. In vitro avvicina spesso utilizzano sistemi biofilm modello che sono relativamente facili da impostare, ma possono mancare clinico / rilevanza nel mondo reale 10,11. In vivo approcci fanno affidamento sui sistemi modello animale che possono riprodurre alcuni aspetti dell'ambiente orale umana, ma ancora una volta soffrire di limitazioni dovute a differenze di anatomia, fisiologia, microbiologia e immunologia tra animali ed esseri umani 12, 13. Va notato che biofilm oralipuò anche essere sviluppato su superfici smaltate detenuti in uno stent all'interno delle bocche di volontari umani, ma questo approccio è attualmente relativamente costoso e 14,15 alta intensità di manodopera. In ultima analisi, nuovi agenti o tecnologie per migliorare l'assistenza sanitaria per via orale sono testati sugli esseri umani in condizioni di studi clinici controllati 11. Allo stato attuale, un modus operandi spesso utilizzato per identificare e valutare nuovi agenti sanitari orali è quello di eseguire studi di laboratorio prima di discernere potenziale efficacia, e quindi eseguire studi sugli animali e le "prove sul campo", che utilizzano i medici per valutare il successo della tecnologia 9, 16,17. Purtroppo, studi di laboratorio tendono a fare affidamento su sistemi modello che occupano una grande impronta, sono tecnologicamente difficile da usare, e spesso contengono semplificati comunità di uno o al massimo un paio di specie di trarre il potenziale del mondo reale che significa 10,18. Dato che biofilm di placca dentale contengono più specie e forma in un complex scorre ambiente salivare, sviluppando biofilm che contengono una o poche specie mezzi artificiale è improbabile generare comunità che si comportano in modo simile a quelle di un scenario reale 10,19. Per affrontare il tempo, costi, requisiti di formazione, e la rappresentatività dei poveri sistemi biofilm modelli di laboratorio rispetto per l'ambiente del mondo reale, abbiamo recentemente sviluppato un elevato throughput e di biofilm germano ambientale 20 (Figura 1). I vantaggi del sistema l'uso di pool saliva umana cell-free (CFS) come mezzo e non trattata pool saliva cellule contenenti batterica umana (CCS) come inoculo. Unicamente, il sistema combina la tecnologia microfluidica, un microscopio confocale a scansione laser, e la diversità batterica tecnologia cultura indipendente di analisi. Così, il sistema modello è attinente ambientale (utilizzando la saliva come inoculo di crescere biofilm multispecie a 37 ° C in sterilizzata per filtrazione, che scorresaliva) e biofilm orali contengono specie (tra cui Streptococcus, Neisseria, Veillonella, e specie Porphyromonas) in abbondanze rappresentante di quelle che si trovano nei primi mesi della placca sopragengivale 20.

Quando si considera che questo lavoro descrive l'utilizzo del modello di sistema di nuova concezione, particolare attenzione deve essere data alla fusione di un microscopio a scansione laser confocale (CLSM) microfluidica, e le tecnologie della cultura indipendente di analisi diversità. L'unione di queste tecnologie da parte del nostro gruppo di ricerca è stato intenzionale e non solo aggiunge una capacità high-throughput per il sistema modello di nuova concezione, ma permette anche domande da porre che non potrebbero essere facilmente affrontati prima che con altri sistemi. In primo luogo, CLSM presenta evidenti vantaggi rispetto microscopia tradizionale in quanto consente l'analisi tridimensionale di biofilm. Spesso incompreso, questo è estremamente importante in quanto biofilm sono wit eterogeneih rispetto alla composizione delle specie e posizione spaziale e le condizioni fisiologiche imposti in differenti posizioni spaziali all'interno del biofilm 6,21. In concerto con software tridimensionale di rendering e immagini software di analisi, l'architettura biofilm, relazioni spaziali tra le specie che lo compongono, e l'estensione della soppressione antimicrobica possono essere analizzati 22-24. Tali capacità non sono possibili utilizzando standard di luce trasmessa o epifluorescenza. Successivamente, microfluidica ha raccolto un'attenzione particolare nel campo della microbiologia quanto consente lo studio di biofilm in condizioni attentamente controllate (portata, temperatura, pH, ecc) e richiede solo piccoli volumi di liquido 25-27. Come punto di confronto, in crescita di biofilm orale nella saliva umana all'interno di un sistema modello cella di flusso (un sistema che è probabilmente considerato il modello di pilastro per molti studi biofilm orale) per 20 ore ad una simile portata e taglio conseguito,in un sistema microfluidico richiede almeno 200 ml, rispetto a 800 microlitri nel dispositivo microfluidico 28-31. Così, un sistema modello biofilm microfluidico consente lo studio di materiale quantità limitata determinate condizioni. Infine, la tecnologia pirosequenziamento è stata ottimizzata nell'ultimo decennio richiedere solo piccole quantità di materiale di eseguire un'analisi comunità ed è sufficientemente versatile per controllare la profondità di sequenziamento per ottenere l'identità di specie biofilm anche rare. L'uso di questa tecnologia, come ad esempio batteri tag con codifica FLX amplicone pyrosequencing (bTEFAP), ha consentito di domande pertinenti riguardanti l'ecologia di biofilm da affrontare 32,33. Queste domande imbevuti difficoltà in passato, quando pirosequenziamento non era disponibile a causa del tempo e dei costi necessari per creare librerie plasmidi e le misure tecnologiche e analitici complessi necessari per ricavare dati 33,34. Naturalmente, un grande vantaggio di cultura indipendente apapprocci, come pirosequenziamento, è che le specie batteriche che non possono essere coltivate isolatamente entro supporti laboratorio convenzionali (specie cioè vitali ma non coltivabili) possono essere coltivate ed identificati nel sistema modello e loro abbondanza relativa nella comunità quantificati 35, 36 . Per aggiungere prospettiva, già nel 1963 il ritardo Sigmund Socransky stima che circa il 50% dei batteri in materiale isolato dal gengivale orale umana non potrebbe essere coltivato utilizzando condizioni di crescita di laboratorio 37.

L'obiettivo di questo lavoro è quello di metodi descrivere l'approccio per sviluppare orale biofilm multi-specie in un sistema disponibile in commercio microfluidica (Bioflux) in: (i) condizioni rappresentative della cavità orale umana e (ii) con una composizione e abbondanza delle specie che è paragonabile alla placca sopragengivale. Inoltre, utilizzando sia software freeware e commerciali, si evidenzia come biofilm di basemisure architettura possono essere derivate da dati CLSM, con un focus sugli approcci per quantificare biofilm biomassa, rugosità, e la vitalità (basati su Live / colorazione Morto). Infine, sono descritti i passaggi necessari per raccogliere materiale biofilm per l'analisi della diversità, bTEFAP.

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Protocol

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Il protocollo di raccolta della saliva qui descritta è stata valutata da l'Università del Michigan Institutional Review Board per soggetto umano di ricerca.
NOTA: Per quanto riguarda le recensioni istituzionali per il lavoro umano soggetti di questo tipo, le modalità e le autorizzazioni precedenti dovrebbero essere raccolto dalla istituzione ospitante. In particolare, a seconda dell'istituto, IRB o approvazione etica potrebbero aver bisogno di essere cercato e approvate prima raccolta di saliva da volontari umani può procedere. Come aiuto alla preparazione di una domanda, un utile NIH algoritmo / grafico può essere trovato qui: http://grants1.nih.gov/grants/policy/hs/PrivateInfoOrBioSpecimensDecisionChart.pdf

1. Preparazione del pool saliva per l'uso come mezzo di crescita per l'ambiente Germane

  1. Reclutare> 5 individui per saliva donazione. Non prendere alcuna informazione di identificazione, assicurarsi che non individuals donerà saliva se sono malati, o hanno preso antibiotici per via orale negli ultimi 3 mesi, o hanno consumato cibi o liquidi, con l'eccezione delle acque, nel precedente 2 ore prima della donazione.
  2. Raccogliere saliva in 50 ml provette di plastica. Pool la saliva raccolta in un becher di plastica, mantenendolo in ghiaccio. Non utilizzare vetro come polimeri nella saliva aderiscono alle superfici di vetro interne.
  3. Aggiungi Ditiotreitolo (DTT) per una concentrazione finale di 2,5 mm da uno stock 100x. (Archivio è congelato in monouso aliquote a -20 ° C). Agitare per 10 minuti in un becher di plastica su ghiaccio.
  4. Al fine di rimuovere il particolato, centrifugare la saliva aggregate per 30 min a 17.500 x g.
  5. Diluire la saliva con 3 volumi di dH 2 O invia un quarto saliva concentrato.
  6. Filtro-sterilizzare saliva con 0,22 micron polietersulfone (PES), basso contenuto proteico del filtro vincolante. Usare filtro con grande superficie, o utilizzare più piccoli filtri dell'area. Tenere saliva in uncontenitore di plastica sul ghiaccio mentre filtraggio.
  7. Congelare la saliva in pool a -80   ° C in provette di plastica 50 ml fino doveva crescere batteri. Ogni tubo di plastica è solo per uso e dovrebbe contenere non più di 35 ml in ciascun pozzetto microfluidica contiene un massimo di 1,2 ml (1,2 ml x 24 pozzetti = 28,8 ml) e lo spazio è necessaria in ciascuna provetta come saliva espande durante il congelamento.
  8. Per l'uso, scongelare la saliva pool a temperatura ambiente. Una volta scongelato, il filtro-sterilizzare una volta di più (0,22 micron polietersulfone, proteine ​​a basso filtro legame per rimuovere eventuali precipitati).

2. Preparazione del pool saliva per l'uso come un inoculo

  1. Reclutare> 5 individui per saliva donazione. Non prendere alcuna informazione di identificazione, non accertare individui donare saliva se sono malati, hanno preso antibiotici per via orale negli ultimi 3 mesi, o che hanno consumato cibi o liquidi, con l'eccezione delle acque, nel precedente 2 ore prima della donazione. Raccogliere samples oltre 30 min.
  2. Raccogliere saliva in provette di plastica da 50 ml a temperatura ambiente e in comune la saliva raccolta in un becher di plastica a temperatura ambiente.
  3. Diluire saliva in pool con autoclave glicerolo grado Reattivo per produrre un titolo con un rapporto finale del 25% glicerolo, il 75% saliva cella contenente [CCS].
  4. Congelare saliva a -80 ° C in 3 ml monouso aliquote fino al momento.
  5. Quando necessario per inoculare il sistema microfluidica, aliquote sono scongelati a temperatura ambiente e agitati delicatamente su un vortex per 5 secondi prima di essere pipettati nel sistema microfluidica come descritto al punto 3 del protocollo, di seguito.

3. La crescita di biofilm orali Multi-specie

  1. Pretrattamento CFS
    1. Prima mano i canali microfluidica Bioflux con CFS. Aggiungere 100 ml di CFS per ogni presa bene. Utilizzando il software di controllo Bioflux, selezionare "Manuale" e impostare il flusso dai canali tha "B1-B24"t devono essere utilizzati.
    2. Successivamente, impostare taglio a 1,0 dyne / cm e avviare il flusso per 2 minuti a temperatura ambiente per assicurare una distribuzione omogenea dei CFS tutto il canale. Assicurarsi che sia fluido in ogni canale di ingresso per verificare che la CFS scorreva attraverso tutti i canali in modo uniforme.
    3. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 20 min.
    4. Rimuovere la soluzione / pretrattamenti CFS che rimane nei pozzetti di scarico e trasferire ai pozzi di ingresso. Questo volume totale di 100 microlitri servirà a bilanciare contro la pressione applicata alla inoculo dalla presa bene.
  2. Inoculazione
    1. Per ogni uscita bene, aggiungere 100 ml di CCS inoculo. Posizionare la piastra microfluidica sulla piastra termica (temperatura impostata a 37 ° C), selezionare manuale all'interno del software di controllo, e al flusso di uscita dai pozzi ai pozzetti di ingresso (cioè, indietro) a 1,0 dyne / cm per esattamente 6 sec.
    2. Incubare la piastra microfluidica a 37 ° C per 40 min per permettereper aderenza e la crescita dei batteri nel inoculo iniziale.
  3. Crescita Pernottamento
    1. Per i canali utilizzati inoculati, aspirare l'inoculo rifiuti da ciascuno dei pozzetti di uscita. Aggiungere fino a 1 ml di volume totale di CFS in ciascuno dei pozzetti di aspirazione (può essere fatto in cima CFS esistente).
    2. Incubare la piastra microfluidica a 37 ° C, selezionare manuale e impostare il programma per funzionare a 0,2 dyne / cm² per 20 ore.
  4. Stain prelavaggio
    1. Aspirare tutto il liquido dai pozzetti di ingresso e uscita e aggiungere 100 ml di PBS (pH 7.4) a ciascuno dei pozzetti di aspirazione. Flusso per 20 minuti a 0,2 dyne / cm².
  5. Stain Inoltre miscela
    1. Per la vitalità delle cellule colorazione fare 100 ml di miscela macchia per ogni canale da colorare. In particolare, aggiungere 3 ml di SYTO 9 e 3 ml di ioduro di propidio per ml di PBS utilizzando il kit di colorazione vitalità cellulare commerciale, come Live / Dead. Questo generauna miscela di colorazione contenente 10 mM SYTO 9 e 60 micron ioduro di propidio.
    2. Aspirare il restante PBS dai pozzetti di aspirazione e quindi aggiungere 100 microlitri della miscela colorante vitalità cellulare a ciascun bocchettone. Impostare scorrere a 0,2 dyne / cm 2 ed eseguire la soluzione dall'aspirazione alla mandata per 45 min a temperatura ambiente.
  6. Lavaggio post-colorazione
    1. Aspirare la macchia rimanente in ciascuno dei pozzetti di aspirazione e aggiungere 100 ml di soluzione salina in ogni ingresso bene. Situato a scorrere a 0,2 dyne / cm² ed eseguire la soluzione PBS da alla mandata per 20 minuti a temperatura ambiente per eliminare ogni macchia in eccesso.

4. Immagine Collection, rendering 3D, e Image Analysis

  1. Utilizzare un microscopio a scansione laser confocale invertita (CLSM) per raccogliere i dati di immagine biofilm dal sistema microfluidica. Assicurarsi che il CLSM è in grado di sopportare il peso del piatto Bioflux, che può raggiungere i 150 g.
    NOTA: Data la monetinansions dei canali microfluidica, la necessità di sensibilità di discernere la struttura biofilm, ei requisiti per rilevare il segnale di fluorescenza di varia intensità, adattano il CLSM con un 40X 1,25 NA lente dell'obiettivo o uno con qualità simile ottica, ingrandimento, e apertura numerica.
  2. Standardizzare le porte di cattura delle emissioni di guadagno e di offset misurazioni mantenuti costanti. Assicurarsi che la potenza del laser non superi il 25% in quanto ciò può causare fotometabolismo.
  3. Convertire i file CLSM dalla L EICA I Mage F tipo ile (LIF) a OME (O pen M icroscopy mbiente) tipo di file. Questo consente una maggiore facilità di accesso e compatibilità tra programmi software. Utilizzare il software disponibile in commercio come, Imaris per convertire i file di questo tipo.

Rendering 3D per le immagini / Figure

  1. Una volta convertito in formato OME, utilizzare un software disponibile in commercio come Imaris rendere le immaginiin 3D. Eseguire questo utilizzando una combinazione di opzioni "superare" "Easy3D" e.
    NOTA: Attenzione al segnale di fondo e soglia dovrebbe essere fatto. La funzione istogramma in Imaris può essere utilizzato per ottenere la gamma di raccolta e questo deve essere mantenuta costante tra immagini analizzati.
  2. Salvare le immagini utilizzando la funzione "snapshot" e fare un attento esame di risoluzione prima di salvare i tipi di file.
  3. Montare immagini in figure utilizzando immagine software di editing, come CorelDraw o Adobe Illustrator.

Image Analysis 3D per Grafici e tabelle

  1. Utilizzare liberamente disponibile ImageJ 23 e COMSTAT / COMSTAT2 38 per l'analisi delle immagini. Scaricare i pacchetti da http://rsb.info.nih.gov/ij/ e http://comstat.dk/ rispettivamente. Avere l'aggiornamento più recente di Java installato.
    NOTA: Il JAVA piattaforma software dovrà essere installato prior per l'uso del software di analisi di immagine.
    1. Utilizzare il software ImageJ con COMSTAT2 plugin per importare i file OME per ogni immagine biofilm in modalità "HyperStack" e vista con "canali SPLIT".
    2. Analizzare singolarmente i due canali (rosso / propidio-ioduro / morti canale da 0, / DIRETTA essendo canale verde / SYTO-9 1) utilizzando la funzione "istogramma" di ImageJ. Questa funzione riporta il numero totale di pixel di file OME 8 bit (indicate come "count") ad ogni intensità di colore da 0 a 255 (indicato come "valore"), con 0 essendo pixel con assenza di segnale (fondo) e 255 dell'essere pixel con saturazione del segnale completo.
    3. Esportare i dati in un foglio di calcolo e di standardizzare tutti i valori dei segnali ponderando ogni pixel per l'intensità del segnale corrispondente. Questa operazione viene eseguita moltiplicando il numero totale ad una data intensità di segnale dal valore numerico 8 bit (0-255) di tale intensità di segnale.
    4. Sommare tutti i valori ponderati, 0-255, per entrambi i canali per ogni immagine catturata biofilm. Prendere la somma dei valori ponderati per entrambi i canali di determinare il segnale totale cento da uno dei due canali. Fate questo per determinare il relativo rapporto o cento rosso e il segnale verde per cento (vale a dire la percentuale di "morto" e cento "LIVE" per ogni trattamento).
    5. Effettuare analisi statistiche, per esempio con due code T-test di Student modificato per varianza disuguale. Valori di p <0,05 sono considerati significativi e quei valori di p <0,01 sono considerati altamente significativo.

5. La raccolta Biofilm Cells per l'analisi Cultura-indipendente

  1. Rimuovere tutti saliva esaurito e inutilizzato da ingresso e di uscita pozzi. Lavare i pozzetti con 1 ml di acqua distillata sterile tre volte.
  2. Aggiungere 100 ml di acqua distillata sterile per i pozzi di ingresso e, utilizzando l'interfaccia di controllo del software, passare ilacqua distillata sterile in avanti attraverso i canali a> 8,0 dyne / cm 2 (portata> 745 ml / h, al taglio di 800 sec -1) per almeno 5 minuti. Ripetere in senso inverso per almeno 5 minuti e poi ripetere il processo in avanti e indietro fase di lavaggio.
  3. Controllare dalla luce o al microscopio a epifluorescenza (se sono state colorate cellule / etichettato) per la rimozione biofilm spinto (Figura 2). Raccogliere il 100 microlitri di cellule-sospensioni e conservare a -80 ° C per l'analisi della cultura indipendente. Un'analisi economica di composizione della comunità può essere raggiunto attraverso l'utilizzo di batteri tag con codifica FLX amplicone pyrosequencing (bTEFAP) utilizzando l'approccio descritto in Nance et al. 20

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Representative Results

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Rendering 3D di biofilm

Risultati rappresentativi sono mostrati in Figura 3. Uno strumento utile nel software Imaris è la possibilità di esaminare ogni fetta di stack biofilm raccolta e combinarli per creare ricostruzioni tridimensionali. Inoltre, gli effetti shadowing artificiali possono essere aggiunti per aiutare visivamente interpretare strutture tridimensionali. I biofilm resi possono essere orientati in qualsiasi direzione con diversi ingrandimenti da esplorare biofilm o micro-colonia struttura. Le immagini presentati in Fig. 3 mostrano i risultati del trattamento di un biofilm orale multi-specie. Di particolare nota è che il trattamento con etanolo al 70% ha comportato significativo cambiamento di colore per la maggior parte del biofilm (da verde a rosso), suggerendo significativa di morte cellulare o cella-danni. Le grandi micro-colonie sembravano contenere cellule più morti rispetto ai sottostanti (ed ora esposti) cellule micro-colonie. Such un risultato è dovuto in teoria di de-adesione delle cellule biofilm, perché l'etanolo è un antimicrobico membrana attiva. Convertendo i file OME formato e analizzare le pile resi in ImageJ, si può vedere applicando funzioni istogramma che la quantità di segnale rosso e verde è inversamente proporzionale tra i biofilm non trattati e quelli trattati con etanolo.

Quantificazione dei biofilm Properties

La tabella 1 mostra i valori medi e le deviazioni standard dei parametri strutturali chiave. Uno dei principali vantaggi di utilizzare Imaris, ImageJ e COMSTAT, è che se Imaris primo utilizzo, i file OME possono essere generati per consentire i file da pipeline attraverso ImageJ e COMSTAT. I dati di esempio presentati nella tabella 1 mostra che il trattamento dei biofilm orali con il 70% di etanolo ha provocato un calo molto significativo della redditività dal 80,8% al 28,3%. L'etanolo può causare qualche danno cellulare e c strutturaleHANGES in biofilm, ma questo è spesso volte non misurabile significativamente differenti. Qui, differenze nelle misure di biovolume media, spessore medio e rugosità media sono stati rilevati (tabella 1).

Figura 1
Figura 1. Il sistema di microfluidica biofilm orale Bioflux. (A) Un diagramma che mostra una sezione verticale del sistema Bioflux pur essendo montato su un CLSM SPE invertita. (B) Un annotato (linee nere) fotografia evidenziando due canali microfluidica ei pozzi di ingresso e uscita. (C) Un esempio di un rendering bidimensionale live Morto macchiato biofilm / orale che è stato trattato con una soluzione CPC 0,01% con conseguente uccisione eterogenea, in parte a causa di limitazioni diffusione reazione. Colore verde indica cellule vive, coloratecon Syto 9; cellule di colore rosso sono morti o danneggiati e colorati con ioduro di propidio. Fig 1A e 1B da Nance et al. 20 con il permesso. Bar in Fig. 1C rappresenta 30 micron.

Figura 2
Figura 2. L'uso del microscopio confocale a scansione laser (CLSM) per generare due viste bidimensionali e tridimensionali di resi 20 biofilm hr. Questi biofilm sono stati sviluppati in saliva cell-free pooled (CFS) da un inoculo di pool saliva cellule contenenti (CCS). Una comunità biofilm greggia (colonna di sinistra di immagini) viene confrontato con un etanolo trattata community biofilm 70% e un biofilm rappresentante è mostrato in diversi piani di vista (XY, XZ, e Zyz). Gli istogrammi che mostrano le differenze di colore rosso (cellule morte / danneggiati) e verde (cellule vive) unre mostrato per ogni pila di immagini (dati riportati nei dati nero e non registrate in grigio registrato). Tutti i dati sono derivati ​​da immagini 8 bit e quindi su una scala da 0-255 (256 incrementi). Barre di scala rappresentano 30 micron.

Figura 3
Figura 3. Diagramma di flusso dimostrando l'esito dell'estrazione / raccolta di 20 hr orale biofilm multispecie (sviluppato da un inoculo CCS in scorre CFS) dal dispositivo microfluidico Bioflux utilizzando la tecnica di taglio / portata elevata. Le linee tratteggiate sono state applicate alle immagini per aiutare a determinare la posizione delle pareti del canale. La composizione della comunità del biofilm raccolto può essere analizzato da 454 tecnologie Pyrosequencing quali batterica tag con codifica FLX amplicone pyrosequencing (bTEFAP) e ha espresso a più livelli tassonomici (phylum attraverso specie) a seconda requirements. Viene mostrato un esempio della composizione della comunità, a livello phylum, di biofilm raccolti da tre canali microfluidica. Bar rappresentano scala in micrometri.

Parametro / Trattamento Non trattata 70% EtOH
Viabilità media (%) 80,8 (0,9) 28.3 (5.8) **
Media biovolume (micron 3 / micron 2) 17,7 (8,4) 16,1 (3,0)
Spessore medio (micron 2) 23.3 (11.3) 15.6 (6.4)
Rugosità media 0.4 (0.3) 0.50 (0.2)

Tabella 1. La quantificazione di proprietà biofilm di etanolo non trattato e il 70% trattati 20 biofilm hr sviluppate in saliva cell-free pooled (CFS) da una cellula contenente saliva inoculo (CCS). I valori in grassetto sono le medie e valori non in grassetto tra parentesi sono le deviazioni standard. I dati provengono at-almeno cinque immagini da tre canali microfluidica. Differenze significative al controllo non trattato sono evidenziati da un asterisco (** P <0,01%).

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Discussion

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Questo documento mette in evidenza i metodi i passaggi di base necessari per configurare e gestire un sistema di microfluidica in modo da consentire lo sviluppo di biofilm orali multi-specie derivati ​​da pool saliva umana e coltivate in sterilizzata per filtrazione 25% pool saliva umana. Approcci per caratterizzare il biofilm sono date ma va ricordato che questi approcci descritti sono modificabili e tecnologie aggiuntive come, ad esempio, macchie o etichette possono essere introdotti. È un dato di esempio, si potrebbe concepibilmente utilizzare anticorpi marcati o introdurre un ceppo fluorescente per visualizzare e esaminare la posizione spaziale di alcune specie all'interno orale biofilm multispecie. Inoltre, a seconda del modello del sistema microfluidico in uso, è possibile sviluppare biofilm in condizioni anaerobiche (nel caso del sistema Bioflux, una nota tecnica è disponibile a Fluxion.com sull'argomento).

Un aspetto chiave del microfluidi BiofluxSistema ic è la sua compatibilità con molteplici tecnologie e questo è evidenziato qui dalla capacità di eseguire cultura diversità indipendente analisi (Figura 3). Mentre le superfici interne del sistema microfluidico non sono facilmente accessibili, vigorosa avanti e inversa flusso non consentire sostanziale biomassa biofilm da rimuovere. Mentre tutto il biofilm non possono essere facilmente rimossi e questo potrebbe essere considerato un punto debole del sistema, è importante notare che molti sistemi modello biofilm hanno anche un problema simile e rivendicazioni da tali dati raccolti devono essere temperata con questa conoscenza . Ad esempio, è possibile che l'abbondanza di streptococchi potrebbe essere superiore nel biofilm che effettivamente determinata sperimentalmente perché molte specie Streptococcus hanno eccezionalmente buone capacità di legarsi alle superfici rivestite 39 saliva.

Come tutti i sistemi modello biofilm, si deve essere consapevoli delle domande poste. Fo esempio, questo sistema non sarebbe adatto per studi longitudinali a lungo termine. Un sistema modello come un reattore continuo pellicola profondità, un sistema Sorbarod, o un reattore a goccia può essere più adatto 40-42. Sebbene, il problema di quantità limitate di saliva per un sistema modello diventa un problema in quanto questi non sono disegni basati microfluidica. In una luce simile, però, il sistema Bioflux qui descritta potrebbe essere adattato per gli studi di biofilm in altri ambienti in cui sono disponibili solo in piccole quantità liquidi biologici. Per esempio, questo potrebbe includere urina e essudato.

In conclusione, come con qualsiasi sistema modello in vitro, si deve essere consapevoli dei punti di forza e di debolezza del sistema microfluidica per la crescita di biofilm orali. Mentre il sistema microfluidico è probabilmente germano ambiente e consente lo sviluppo del biofilm che sono composizione simile alla situazione in vivo, non è the uguale alla situazione in vivo e probabilmente mai così. Un sistema modello di laboratorio è solo buono come i suoi presupposti e mentre il sistema microfluidica ha molte sovrapposizioni con le condizioni all'interno della cavità orale umana, fattori come gli effetti host-based e biotici esterni e sfide abiotici (ad esempio attraverso bere e mangiare) non possono essere facilmente replicato. È chiaro, tuttavia, che l'alta velocità natura, nonche la microbiologico ambientale e sovrapposizioni con il mondo reale situazione orale rendono questo un sistema microfluidico attraente per fare previsioni prima di impegnarsi in studi clinici logisticamente impegnative.

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Acknowledgments

Gli autori ringraziano William Nance (Università del Michigan) per un aiuto nella formulazione dei protocolli di crescita biofilm e John Battista (Fluxion, San Francisco, CA) per un parere su questioni tecnologiche relative al sistema Bioflux. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (NIH: R21DE018820 di AHR) e University of Michigan fondi di start-up a AHR

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-432-22
Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-49D
Dithiothreitol (White Crystals or Powder/Electrophoresis), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP172-5
Sorval ultracentrifuge  (SS-34 compatible) Thermoscientific Unit-dependent
Thermo Scientific SS-34 Rotor  Thermoscientific 28-020
Thermo Scientific Type 1 Reagent Grade Deionized Water Thermo  Scientific Inc 23-290-065
Nalgene Rapid-Flow Filter Units and Bottle Top Filters, PES Membrane, Sterile. VWR 73520-986 
Glycerol Thermo Fisher Scientific Inc NC0542269
BioFlux microfluidic system Fluxion Bioflux 200 system
Bioflux 24-channel plate Fluxion 910-0004
PBS (Gibco) Thermo Fisher Scientific Inc 10010023
LIVE/DEAD stain (Invitrogen)  Invitrogen L7012
Confocal Laser Scanning Microscope Lecia SPE or eqivalent system
Epifluorescence Microscope Multiple choices Multiple choices
Pyrosequencing facilities Multiple choices Multiple choices
Decon SaniHol 70 Ethanol Solution Fisher Scientific 04-355-122
Ultra Low Temperature Freezer -80 °C Multiple choices Multiple choices
Tips (20, 200, and 1,000 μl) Multiple choices Multiple choices
Single Channel Variable Volume Pipettors (20, 200, 1,000 μl) Multiple choices Multiple choices
Software
Bioflux dedicated software Bioflux
Imaris Bitplane
Leica SPE Leica
ImageJ Freeware (http://imagej.nih.gov/ij/)
COMSTAT/COMSTAT 2 Freeware (http://www.comstat.dk/)

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References

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L&#39;uso di un high-throughput<em&gt; In Vitro</em&gt; Microfluidic sistema per sviluppare orale biofilm Multi-specie
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Samarian, D. S., Jakubovics, N. S., Luo, T. L., Rickard, A. H. Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms. J. Vis. Exp. (94), e52467, doi:10.3791/52467 (2014).More

Samarian, D. S., Jakubovics, N. S., Luo, T. L., Rickard, A. H. Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms. J. Vis. Exp. (94), e52467, doi:10.3791/52467 (2014).

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