Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

فحص السريع الدوبامين حيوية مع المسح الضوئي السريع Voltammetry دوري أثناء داخل الفم إدارة منبهة للذوق في الجرذان الصحوة

Published: August 12, 2015 doi: 10.3791/52468
Automatic Translation
1, 2, 3, 1,3,4
1Interdepartmental Neuroscience Program, Yale University, 2Department of Biotechnical and Clinical Laboratory Sciences, School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo, 3Department of Psychiatry, Yale School of Medicine, 4Department of Cellular and Molecular Physiology, Yale School of Medicine

Protocol

وأجريت جميع التجارب وفقا لالمعاهد الوطنية للصحة (NIH) دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية وتمت الموافقة من قبل لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدم جامعة ييل (IACUC).

الاستعدادات 1) ما قبل الجراحة

  1. إعداد حل عن طريق الفم
    1. إيجاد حلول من 10٪ سكروز و 0.005٪ L-المنثول في الماء منزوع الأيونات (7.4 درجة الحموضة). تخزين هذه الحلول في حاويات مغلقة، في RT، وإعادة تشكيل كل 2 أسابيع، لمنع تدهور.
  2. حلول القطب المعايرة
    1. جعل تريس العازلة (7.4 درجة الحموضة) في أي وقت قبل المعايرة. يتكون الحل من 12.0 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، و 140 ملي كلوريد الصوديوم، 3.25 ملي بوكل، 1.20 ملي CaCl2، 1.25 ملي NaH2PO4، 1.20 ملي MgCl 2، و2.00 ملي نا 2 SO 4.
    2. إيجاد حل الأسهم من 10 ملي الدوبامين (DA، الدوبامين هيدروكلوريد) في 0.1 M حمض البيركلوريك. حمض البيركلوريك يساعد على منع أكسدة dopaminه. تخزين هذا الحل السهم عند -20 درجة مئوية، وتستخدم لمدة تصل إلى 6 أشهر. جعل عدة قسامات من الحل الأسهم DA للتخزين لاستخدام كل قسامة مرة واحدة فقط.
    3. من المخزون 10 ملي DA، وتمييع الحلول العازلة في تريس لتركيزات من 1 ميكرومتر، 500 نانومتر و 250 نانومتر و 125 نانومتر، 62.5 نانومتر، و31،25 نانومتر.
    4. لدرجة الحموضة المعايرة، وإعداد الحلول من تريس العازلة مع الرقم الهيدروجيني 7.2، 7.3، 7.5، و 7.6. هذا وسوف توفر الحلول التي تحاكي التحولات درجة الحموضة التي قد تحدث أثناء التجربة في الجسم الحي.
  3. القطب تلفيق
    1. بواسطة الشفط، ونضح على T-650 من ألياف الكربون (7 ميكرون قطر) في الزجاج الشعرية البورسليكات (طول 10 ملم، 0.6 ملم خارج القطر، داخل القطر 0.4 مم).
    2. ضع الشعرية زجاجية مملوءة ألياف الكربون في القطب مجتذب العمودي. لالمعلمات الأولية، ضبط سخان إلى 55.0 وإيقاف المغناطيس. ومع ذلك، قد يكون من الضروري مزيد من التحسين على حد سواء سخان وإعدادات المغناطيسي تختلف الابمختبر أوم إلى المختبر.
      ملاحظة: يجب أن يكون القطب 5.5 سم على الأقل طويل (بما في ذلك تفتق) بحيث يمكن أن تناسب بسهولة في micromanipulator وتدرج 6.9 مم على الأقل تحت الجافية في الدماغ الفئران. إذا كان القطب قصيرة جدا، سوف تسجيلات من الجزء البطني من النواة المتكئة لا تكون قابلة للتحقيق. من ناحية أخرى، ينبغي ألا يتجاوز إجمالي طول القطب 6.5 سم وإلا فإنه سيكون وقتا طويلا لتنسجم مع micromanipulator.
    3. باستخدام المجهر الضوئي، وقطع يتعرض ألياف الكربون بحيث يمتد 75-100 ميكرون بعد نهاية الزجاج. تحقق من أن القطب لديه ضيق جدا، يكاد يذكر، وختم بين الزجاج الكهربائي وألياف الكربون، والتي سوف تنتج الحد الأدنى من الضوضاء أثناء التسجيل لاحق. تجاهل الكهربائي إذا كان هناك أي شقوق ملحوظة في الزجاج أو إذا ختم واهية، مما يدل على ختم الفقراء. للحصول على تعليمات أكثر تفصيلا انظر [12] و [13].
  4. تجميع الكهربائي في هيئة التصنيع العسكريromanipulator
    1. الحصول على 3 في سلك 30G التي معزول على طول نصف طول السلك واستخدام فرشاة صغيرة لتطبيق طبقة رقيقة من الفضة ترسم مباشرة على السلك. على الفور بعد تطبيق طلاء الفضة، إدراج السلك في حفرة في الجزء العلوي من القطب إلى توفير اتصال الفيزيائية والكهربائية للألياف الكربون. تحت المجهر، تأكد من أن أسلاك الفضة يجعل الاتصال مع ألياف الكربون.
    2. تأمين أسلاك الفضة والقطب إلى micromanipulator باستخدام الانكماش الحراري.
    3. وضع استعداد القطب ألياف الكربون إلى تنقية ايزوبروبيل (IPA) لمدة 10 دقيقة على الأقل لتنظيف سطح القطب وزيادة حساسية لاحقة إلى الدوبامين. بعد تمرغ في IPA، وشطف من ألياف الكربون مع ماء الصنبور لإزالة IPA.
  5. إشارة القطب تلفيق
    1. تأخذ سلك 13 ملم الفضة التي تحتوي على ما يقرب من 6 ملم شبكة حج / حج الكلورين (7 ملم الأسلاك الفضة وحدها، 6 مم عيون، 0.4 مم)،قطع جزء من الفضة وصولا الى ما يقرب من نصف طوله الأصلي وجندى الجزء الفضة من الأسلاك إلى دبوس من الذهب.
    2. تطبيق الايبوكسي خلال لحام على دبوس.
    3. تراجع حج / حج الكلورين شبكة نهاية إلى كوبوليمر من 5٪ polytetrafluroethylene وperfluoro-3،6-dioxa-4-ميثيل 7octene-السلفونيك حمض 5 مرات، مع 30 دقيقة فترات تجفيف الهواء بين كل تراجع.
    4. السماح للالمغلفة حج / حج الكلورين شبكة للهواء الجاف O / N.
    5. علاج في الفرن على حرارة 120 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.

2) جراحة المشتركة داخل الفم وجراحة داخل الجمجمة كيفية تركيب الكانيولا (حوالي 75 دقيقة)

  1. عن طريق الفم القسطرة تلفيق
    1. جعل القسطرة عن طريق الفم، وتعقيم بواسطة التعقيم أكسيد الإثيلين، 10 يوما على الأقل قبل الجراحة.
    2. قطع PE 100 أنابيب إلى 6 سم شرائح طويلة.
    3. باستخدام حام الحديد، تذوب واحدة من نهاية الأنبوب PE واضغط فورا على سطح صلب لتبريد أنابيب PE. النتيجة يجب أن تخلقلا ينبغي ذات حواف لذلك، قرص مسطح صغير في واحدة من نهاية الأنبوب PE و. استخدام إبرة (18 G) أو دفع دبوس على خلق فتحة في وسط هذا القرص.
    4. على الطرف الآخر من الأنبوب PE، بشكل مريح إدراج نهاية حادة من الإبرة G 18 في أنبوب.
    5. استخدام معيار حفرة رقة الناخس، لكمة عدة قطع دائرية من ورقة polytetrafluroethylene (3.18 مم، 6 مم في القطر) لإنشاء غسالات polytetrafluroethylene.
    6. إنشاء حفرة في وسط الغسالة. أخذ إبرة تعلق على أنابيب PE ودفعها بالكامل من خلال الغسالة. مرة واحدة على الإبرة من خلال الشريحة الغسالة إلى أسفل الأنبوب PE بحيث يكون دافق ضد الغسالة.
  2. جراحة الفم
    1. بعد تعقيم الأدوات الجراحية، قنية (خفضت إلى 2.5 ملم تحت التمثال قبل التعقيم)، والقطب المرجعية، تخدير الفئران مع حقنة داخل الصفاق من الكيتامين (100 ملغ / كلغ) وزيلازين (10 ملغ / كلغ).
      1. AFثالثا مدة 5 دقائق، وتطبيق اختبار التحفيز الضارة (الأقدام أو قرصة الذيل) لتقييم مستوى التخدير. إذا تبين هذا الموضوع أي رد فعل مادي لاختبار الحوافز الضارة (تتوانى ردا على ذلك، زيادة في معدل التنفس أو القلب)، إدارة دفعة الكيتامين من 10٪ إلى 15٪ من الجرعة الأصلية وتكرار بروتوكول الحوافز الضارة أعلاه.
    2. بعد الفأر هو تخدير كامل ولا يظهر أي رد فعل على اختبار تحفيز الضارة، استخدم كليبرز وبر أن يحلق الفراء الفئران من أعين إلى حوالي 2 ملم وراء الأذنين. ثم ضع الفئران على إعادة تدوير المياه رقيقة سادة التدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم أثناء الجراحة. تطبيق مواد التشحيم العين. إدارة غير الستيرويدية المضادة للالتهابات (NSAID) المخدرات، كاربروفين (5 ملغ / كلغ)، عن طريق الحقن داخل الصفاق قبل إجراء أي شقوق وقبل إدخال قنية داخل الفم. استخدام تقنية العقيم في جميع الأوقات.
    3. تطبيق betadine تليها الايثانول 70٪ لتنظيف الجلد. كرر 3 مرات.
    4. جيش التحرير الشعبى الصينىCE الفئران على ظهرها، وفتح الفم باستخدام قطعة من القطن المعقم. العثور على أول الرحى العلوي.
    5. ادخال الإبرة في النسيج بين الخد وأول ضرس العلوي حتى يخرج الإبرة خلف وسطي للآذان.
    6. بيرس الإبرة من خلال الجلد حتى الأنبوب PE مخارج الجلد ويمكن الوصول إليها.
    7. سحب ما يصل على قنية (تجتاح من قبل قنية نفسها وليس إبرة) وتأمين غسالة polytetrafluroethylene في الأضراس بحيث تبقى القسطرة في مكانها.
      ملاحظة: قطع الغسالة في شكل شبه منحرف، وتأمين ضد الأضراس مع الجانب المسطح التي تواجه الخد يجعل هذه الخطوة أسهل.
    8. تأخذ غسالة polytetrafluroethylene آخر، والانزلاق على الإبرة المكشوفة، أسفل أنابيب بلاستيكية، وتتاخم ضد شق.
    9. لتأمين غسالة polytetrafluroethylene، استخدم الشريط تعقيمها لخلق الثلاثي "العلم" بحيث غسالة لا تنزلق فوق. تأمين غسلإيه ضد جلد الفئران والشريط تعقيمها.
    10. قطع القسطرة تعرضوا للسماح 2-4 سم من الأنابيب إلى أن يتعرض فوق رأس فأر.
    11. كرر الخطوات من 2.2.1 من خلال 2.2.10 للجانب الآخر من الفم.
  3. جراحة داخل الجمجمة لvoltammetry
    1. وضع الفئران في إطار التجسيمي وتنظيف فروة الرأس الحيوان باستخدام مرحلتين فرك (فرك betadine تليها الايثانول 70٪ فرك، نفذ مع تكرار 3 دورة).
    2. استخدام ملاقط معقمة الأنف إبرة ومقص جراحي لخفض بعيدا قسم 15 × 15 ملم من أنسجة فروة الرأس.
    3. بلطف تنظيف سطح الجمجمة باستخدام معقم تطبيقها طرف القطن. وعلاوة على ذلك تنظيف الجمجمة عن طريق تطبيق 2-3 قطرات من 3٪ بيروكسيد الهيدروجين.
    4. استخدام الحفر التجسيمي تقديم 3 صغيرة (1 مم) ثقوب في الجمجمة لإدراجها لاحقا مسامير، 1 حفرة لقنية دليل، 1 حفرة لالقطب محفزة، و1 حفرة للانتخاب المرجعيةركب.
    5. للتسجيلات في قلب حلف شمال الأطلسي، وضع قنية دليل على 1.2 مم الأمامي و 1.4 ملم الوحشي لBregma. خفض جهاز قنية حتى قاعدة من البلاستيك هي الاحمرار مع الجمجمة.
    6. وضع القطب إشارة تعقيمها في الجانب المقابل لنصف الكرة قنية دليل. خفض المرجع حوالي 2 ملم تحت الجافية.
    7. موقف القطب تحفيز في 5.2 ملم والخلفي 1.0 ملم الوحشي لBregma وخفضت 8.0 مم تحت الجافية لاستهداف منطقة السقيفية البطنية (VTA).
    8. استخدم مفك الجراحية الصغيرة تعقيمها لتأمين مسامير في الجمجمة. ثم، تضاف القطب المرجعية، وتحفيز الكهربائي، وتوجيه قنية. أخيرا، تأمين جميع المكونات باستخدام الاسمنت cranioplastic.
    9. لمدة 48 ساعة الأولى من الرعاية اللاحقة للعمليات الجراحية وإدارة غير الستيرويدية المضادة للالتهابات المخدرات (NSAID) كاربروفين عن طريق الحقن تحت الجلد (5 ملغ / كلغ). تسمح على الأقل 1 أسبوع للتعافي الجراحي الكامل قبل تنفيذ voltamتسجيل متري.
      1. خلال الرعاية اللاحقة للعمليات الجراحية، والقسطرة تدفق يوميا عن طريق الفم بالماء. توفير الغذاء المشبعة في الماء لمدة 2 أيام لمساعدة الحيوانات في المضغ والأكل. توفير الرصد اليومي لمؤشرات محتملة للإجهاد من الألم (بسبب الإصابة خفيفة أو الجفاف) وتقديم التدخلات المناسبة عند الضرورة (بما في ذلك إدارة السوائل، والإدارة الموضعية من المطهرات، وأو الإدارة NSAID كاربروفين في 5 ملغ / كلغ).

3) Voltammetric تسجيلات في استيقظ الجرذ تتحرك بحرية

  1. خفض القطب والحصول على مجموعة التدريب DA.
    1. في يوم من التجربة، والتحقق من المباح للقنية عن طريق الفم عن طريق غرس 200 ميكرولتر من الماء ومراقبة ردود فموي وجهي (للتحقق من أن الفئران وتذوق الماء).
    2. إرفاق headstage FSCV إلى الفئران عن طريق إدخال القطب محفزة (على headstage) في تحفيز القطبين القطب cannuلا (على الفئران). وبالتالي، فإن headstage (المنمنمة تحويل الجاري إلى الجهد) يربط مباشرة إلى القطبين تحفيز الكهربائي.
    3. إزالة قنية همية من جهاز قنية وتطبيق قطرتين من 50٪ من محلول الهيبارين في قنية. ثم تضاف برفق قنية همية (أطول قليلا أن قنية همية التي تم إزالتها سابقا) لمسح أي جلطات الدم أو تندب الدبقية التي قد حدثت، والتي سوف كسر أقطاب من ألياف الكربون التي من شأنها في وقت لاحق إدراجها أثناء التجربة. تمديد قنية المستخدمة لإزالة جلطات 3-4 مم أسفل الجمجمة (2 مم على الأقل فوق موقع تسجيل).
    4. إدراج micromanipulator، مع القطب، في قنية دليل ووضع عصابة أوميغا في موقف "مؤمن".
    5. قم بتوصيل سلك كهربائي إشارة من headstage إلى دبوس الملائمة. ثم قم بتوصيل سلك كهربائي عمل من micromanipulator إلى السلك المناسب على headstage.
    6. خفض كهربائيtrode إلى حوالي 4-4.5 مم أسفل الجمجمة.
    7. استخدام potentiostat لتطبيق الموجي الثلاثي (400 V / S، -0.4 إلى +1.3 V). تطبيق الموجي إلى القطب في 60 هرتز لمدة 10 دقيقة على الأقل، ثم قم بتغيير التردد تطبيق الموجي إلى 10 هرتز للتسجيلات التجريبية لاحقة.
      ملاحظة: الخطوة تطبيق الموجي 60 هرتز تنتج استقرارا سطح ألياف الكربون، وسوف تساعد على منع الانجراف الكهربائية
    8. تطبيق التحفيز الكهربائي للVTA باستخدام ترددات مختلفة (10-60 هرتز) البقول (10-30 البقول) والتيارات (50-150 أمبير) مع كل عرض النبضة من 2 مللي / المرحلة، لاستحضار تركيزات مختلفة من الإفراج DA ودرجة الحموضة التحولات. الحصول على الأقل 5 تركيزات مختلفة من الإفراج DA و 5 التحولات درجة الحموضة المختلفة. الانتظار (2-3 دقيقة على الأقل) بين التحفيز للسماح لإعادة تحميل حويصلي [14].
      ملاحظة: من المهم الحصول على التحفيز التي تنتج تركيزات DA عبر مجموعة كاملة التي سيتم جمعها خلال احقاالتجربة لأنها سوف تستخدم مجموعة تدريبية لمدير تحليل المكونات (انظر القسم 5.1).
    9. خفض الكهربائي في صلب بريدا (6.3 ملم بطني لالجافية). بعد ذلك خفض الكهربائي في 100 ميكرون الزيادات داخل نواة بريدا حتى يتم ملاحظة عابرة الأحداث الإفراج DA على ترددات من 1 لكل دقيقة على الأقل.
    10. توصيل أنابيب (القطر الداخلي 1/32 "، القطر الخارجي 3/32") لحقنة 20 مل، تعلق على ضخ حقنة. على الطرف الآخر من الأنبوب، واستخدام مشطوف 23 G إبرة لربط الأنابيب لقنية للفأر. ضمان أن يتم تعبئة أنابيب تماما مع منبهة للذوق المرجوة وتحقق من عدم وجود فقاعات موجودة في الأنبوب.
      ملاحظة: عادة، وإدارة كمية صغيرة من منبهة للذوق في فم الفئران قبل تسجيل للتأكد من أن التسريب الأول لتسجيل يسلم كمية ضخ كامل وليس أي ماء أو الهواء المتبقي في الأنبوب. وعلاوة على ذلك، وهذا يسمح للحيوان لديك بعض الخبرة الطرافة السابقةح منبهة للذوق منذ tastants رواية، حتى تلك مشهي، يمكن أن يكون مكره في البداية نظرا لحداثته.
    11. لجمع البيانات، ولبث 200 ميكرولتر من منبهة للذوق (6.5 ثانية باستخدام مضخة وأنابيب وصفها سابقا). يبث في منبهة للذوق كل دقيقة 1-3. يبث ما مجموعه 25 مرات في منبهة للذوق. كل التسريب يسلم 200 ميكرولتر من الحل.
    12. إذا كان يتم تسليم tastants متعددة في تجربة واحدة، تدفق القسطرة عن طريق الفم بالماء بعد جمع البيانات عن منبهة للذوق واحدة وانتظر 20 دقيقة على الأقل قبل غرس منبهة للذوق جديدة.
    13. بعد تسجيل الدورة DA، وإعداد للتحقق النسيجي من خلال خلق آفة صغيرة في موقع التسجيل. للحفاظ على القطب ألياف الكربون للمعايرة لاحقة، سحب أول القطب وإزالة micromanipulator. ثم استخدام micromanipulator جديد مع مسرى مكروي زجاج وسلك التنغستن (تمتد 100 ميكرون وراء طرف زجاج) إلى نفس العمق (أقل من الجافية) كما و الكربون الأصليمسرى مكروي IBER.
    14. للتحقق النسيجي، إنشاء آفة صغيرة عن طريق تطبيق 3 V في سلك التنغستن وزيادة الجهد في 1 V الزيادات، كل 10 ثانية، حتى يتم الوصول إلى إعداد 10 V.
    15. إذا تم بالفعل إنشاء منحنى تركيز قياسي باستخدام متعددة الأقطاب من ألياف الكربون، نفذ الخطوة الآفة فوق (3.1.14) من خلال تطبيق الإمكانات مباشرة القطب ألياف الكربون.
      ملاحظة: هذه الطريقة سوف الآفة تلف ألياف الكربون ومنع المعايرة لاحقة مع أن القطب معين.
    16. الموت ببطء الحيوان باستخدام بنتوباربيتال الحقنة المميتة (150 ملغ / كغ، والملكية الفكرية).
    17. إزاحة مترسة الرأس مع حقنة عادية باستخدام كماشة عن طريق سحب مباشرة التصاعدي على مترسة الرأس. لا يلوون على مترسة الرأس لأن هذا سوف يسبب الضرر لا لزوم لها الدماغ وجعلها صعبة لتحديد موقع القطب خلال الأنسجة.
      1. إزالة الدماغ ووضعه في 4٪ من الفورمالين لمدة 3 أيام تليها 30٪ سوكروز لمدة 1 أسبوع. إنشاء 30 ميكرون شرائح باستخدام ناظم البرد، جبل على زلات الغطاء وفحص شرائح تحت المجهر الضوئي لتحديد الموقع من ألياف الكربون أو التنغستن الآفة.
        ملاحظة: الإرواء هو اختياري ل3.1.17.

4) الكهربائي المعايرة

  1. باستخدام خلية تدفق لخلق عامل التحويل الحالي على التركيز.
    1. من أجل تحديد حساسية القطب، معايرة الأقطاب بعد كل تجربة باستخدام تدفق "تي ​​خلية" الجهاز. خفض الكهربائي في "تي خلية" بينما يتم غسلها تريس العازلة، حلول درجة الحموضة، أو حلول DA على سطح القطب (بمعدل 2 مل / دقيقة). استخدام ستة الموقف الملف اللولبي الهواء المحرك إلى الانتقال ذهابا وإيابا بين العازلة ودرجة الحموضة أو حل DA.
    2. لكل معايرة، وجمع البيانات voltammetric خلال 5 تطبيق ثانية من تريس العازلة (خط الأساس) تليها 5 تطبيق ثانية من الرقم الهيدروجيني أو حل DA، تليها 20 ثانية لpplication من تريس العازلة (ملف مجموعه 30 ثانية). تكرار كل تشغيل 3 مرات لكل معايرة تركيز القياسية، موازنة بين تركيزات مختلفة من كل مستوى.
    3. لكل جمع العينات، وقياس الذروة DA أو أثار الرقم الهيدروجيني الحالية. متوسط ​​ذروة التيار عبر كل محاكمة للحصول على تركيز مقابل العلاقة الحالية الذروة. للحصول على تعليمات أكثر تفصيلا انظر [12] و [13].

5) تحليل البيانات

  1. باستخدام التدريب المنصوص عليها في تحليل المكون الرئيسي (PCA)
    ملاحظة: أثناء تجربة voltammetry، يتم إنتاج الإخراج كما الحالية، والتي هي نتيجة الأكسدة الدوبامين والحد منها، التحولات درجة الحموضة، والضجيج الكهروكيميائية. PCA يسمح الفصل بين هذه العوامل بحيث يمكن للمرء أن عزل العناصر المطلوبة (DA ودرجة الحموضة) وإزالة المكونات الإضافية التي قد تشوه إشارات المطلوبة (للحصول على وصف أكثر تفصيلا، انظر 15، 16).
    1. تعيين عامل المعايرة إلى thالناتج البريد الحالي (حوالي 5-10 غ / ميكرومتر) بعد PCA للسماح للقيم تركيز التحاليل يحدد لاحقا.
    2. استخدام مجموعة التدريب التي تم الحصول عليها خلال تجربة ل"القطار" نموذج PCA لفصل DA، ودرجة الحموضة، وعوامل أخرى. PCA يأخذ تدريب مجموعة voltammograms دوري (التي تم جمعها في القسم 3.1.8) ويحدد أي الخصائص الأساسية للvoltammogram يمكن استخدامها لتحديد كل الحليلة التي تم جمعها خلال المجراة التسجيلات voltammetry.
    3. لتحديد عدد من العناصر الأساسية للحفاظ على، واستخدام مالينوفسكي F-الاختبار. عادة، والحفاظ فقط 2 أو 3 عناصر الرئيسية التي تفسر عادة حوالي 95-99٪ من التباين في البيانات. لمزيد من المناقشة على تنفيذ مالينوفسكي F-اختبار، انظر 17.
      ملاحظة: مرة واحدة يتم تحديد عدد من العناصر، وتحليل PCA فعال سوف المشروع voltammograms تقاس من DA ويحدد درجة الحموضة التدريب على المكونات الرئيسية التي تم الاحتفاظ بها.والنتيجة هي مجموعة من البيانات التي تم تصفيتها بحيث لا يبقى سوى DA (أو درجة الحموضة) البيانات وتتم إزالة البيانات المتبقية التي لا تشبه DA أو الرقم الهيدروجيني (انظر ممثل النتائج لإخراج المتوقعة). للحصول على شرح بمزيد من التفصيل وخطوة خطوة تعليمات لاستخدام PCA لتحليل voltammetric رؤية ورقة المواد و 16 و 17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم استخدام FSCV جنبا إلى جنب مع القسطرة داخل الفم زرع لدراسة كيفية السكروز، وهو منبهة للذوق مشهي، ينظم طوري الإفراج DA في قلب بريدا. قبل ضخ منبهة للذوق، والتحفيز الكهربائي (150 أمبير، 60 هرتز، 24 البقول؛ يدل على ذلك شريط أحمر) من VTA تنتج زيادات قوية في طوري الإفراج DA في حلف شمال الأطلسي (الشكل 1) الشكل 1 يدل على مؤامرة اللون مع إمكانية جرا. المحور الصادي، الوقت على محور س، والتيار (ممثلة اللون كاذبة) على المحور Z. أقل من مؤامرة هو لون تركيز DA مقابل الوقت التتبع. تم تحديد تركيز مقابل الوقت باستخدام التتبع الحالي مقابل الوقت في إمكانية الأكسدة الدوبامين (المشار إليها متقطع الخط الأبيض) والذي تم تحويله إلى الاعتقال، التالية بعد معايرة من القطب. وقد استخدم هذا التركيز DA مقابل الوقت تتبع كجزء من التدريب المحددة لمحكمة التحكيم الدائمة.

بعد أن حصلت على مجموعة التدريب، 25 دفعات من السكروز(10٪، 200 ميكرولتر في التسريب) أعطيت كل دقيقة 1-3. وترد أمثلة التشكيل السكروز الإفراج DA طوري في الشكلين 2 و 3. في الشكل 2، ضخ 6.5 ثانية (المشار إليها بواسطة شريط أحمر) أنتجت الارتفاع في التيار (المشار إليها الأبيض، لأسفل السهم) في إمكانية الأكسدة من DA (المشار إليها بواسطة خط متقطع الأبيض). تحويل البيانات إلى تركيز مقابل مؤامرة الوقت بعد التحقق من PCA أن زيادة التيار في الردود على منبهة للذوق هو نتيجة لزيادة في تركيز DA. وقد أكسب آخر منبهة للذوق، المنثول (0.005٪، و 200 ميكرولتر في التسريب) أيضا خلال تسجيلات FSCV في قلب بريدا الشكل 3 يبين تركيز DA مقابل يتتبع سبيل المثال الوقت لداخل الفم السكروز والمنثول، وكشف عن زيادة تركيز DA بعد ضخ إما منبهة للذوق . ينبغي للمرء أن نتوقع أن نرى بعض التجربة لتقلب محاكمة في الإفراج DA طوري لtastants (الشكل 2 و3A). ومع ذلك، فإننا لا نرى عادة أي اتجاهات غير محددة نحو زيادة أو نقصان في طوري الإفراج DA خلال التجارب المتعددة. يمكن أن يتوقع في تجربة نموذجية في حيوان واحد يتراوح 10-100 نانومتر DA.

الشكل 1
الشكل 1. مؤامرة التمثيلية اللون (أعلى) والتركيز مقابل مؤامرة الوقت (القاع) من أثار كهربائيا الإفراج DA في قلب بريدا. ويشير شريط أحمر وقت التحفيز. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2. مؤامرة ممثل اللون (أعلى) وتركيز DA مقابل تتبع الوقت (القاع) خلال ضخ واحد من السكروز. الحمراء بع يشير 6.5 ثانية الحقن في الوريد. الأبيض النزولي سهم تواجه يشير في الارتفاع في التيار (ممثلة في اللون كاذبة) في إمكانية أكسدة DA. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. تركيز الممثل DA مقابل آثار وقت خلال (A) 10٪ سكروز و (B) 0.005٪ المنثول قبل الإدارة داخل الفم. ويشير شريط أحمر 6.5 ثانية التسريب داخل الفم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تسليم منبهة للذوق داخل الفم جنبا إلى جنب مع FSCV يسمح تحليل "الوقت الحقيقي" ردود DA إلى flavorants عن طريق الفم. هناك ثلاث خطوات حاسمة في البروتوكول التي مطلوبة من أجل القياسات DA ناجحة. أولا، زرع الصحيح من القسطرة عن طريق الفم هو أمر حاسم لتسليم flavorants. ضمان أن يتم إدخال القسطرة وراء الضرس الأول ومثبتة في مكانها يمنع القسطرة من فقدان المباح ويمنع إزالة عرضي من قبل الحيوانات. بيغ القسطرة خلال الأيام القليلة الأولى بعد الشفاء من المهم أيضا، لأن الطعام اللين نظرا للحيوان خلال 2 أو 3 أيام الأولى بعد الجراحة يمكن أن تسد القسطرة. الثانية، ونوعية من القطب أمر بالغ الأهمية لزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء في الفئران تتحرك بحرية. في بعض الحالات، الأقطاب الكهربائية التي تظهر بصريا لتكون ذات جودة عالية وبحالة جيدة قد لا تزال تعطي إشارات صاخبة. طريقة واحدة لاستكشاف هذه المشكلة هو أن تأخذ التسجيلات الأساسية في دorsal المخطط (4 ملم تحت الجافية). إذا كان القطب تنتج الكثير من الضجيج، يمكن إزالة القطب واستبدالها مع القطب الجديد قبل إجراء التجربة في الموقع تسجيل الأساسية بريدا (6-7 مم تحت الجافية). والخطوة الثالثة الحاسمة هو العثور على موقع مناسب تسجيل في منطقة الدماغ المستهدفة، حيث لوحظ عفوية الأحداث الإفراج DA ("العابرين") على تردد كافية (1 لكل دقيقة على الأقل) مع زيادات كافية في تركيز DA (لا يقل عن 20 نانومتر إلى 40 نانومتر). وهذا التحسين ضمان عفوية الأحداث الإفراج طوري DA يمكن أن يتم الكشف في موقع معين، وذلك قبل إدارة flavorant. خفض القطب بزيادات أي ما يعادل حجم ألياف الكربون يتعرض (50-100 ميكرون) يزيد من فرص العثور على موقع التسجيل مع العابرين للكشف.

إنذار مهم واحد من FSCV هو عدم القدرة على تحديد تركيز الحليلة المطلق عند نقطة في الوقت المناسب، منذ FSCV هو DIFتقنية ferential الذي يقيس التغيرات التركيز النسبي (مقارنة مع خط الأساس مستقر) خلال كل ملف تسجيل voltammetry. ومع ذلك، فإن تقنية التفاضلي يسمح أيضا لتقدير حجم التقلبات الفرعي الثاني في تركيز الدوبامين في الرد على كل من tastants مجزية ومكره 5. في سياق إدمان النيكوتين والمواد المضافة منتجات التبغ، مثل المنثول والشفوية المحليات، وقد ثبت أن تؤثر في سلوك التدخين 18 وتم مؤخرا منعت في السجائر (باستثناء المنثول) من قبل عائلة منع التدخين وقانون مكافحة التبغ. وهكذا، والتسليم داخل الفم في تركيبة مع FSCV يوفر أداة المنهجية الهامة التي يمكن استخدامها لدراسة كيفية flavorants منتجات التبغ يمكن أن يغير DA الإشارات، ويحتمل أن تكون خصائص يعزز من النيكوتين.

هنا، التي وصفناها طريقة للجمع بين داخل الفم منبهة للذوق التسريب مع FSCV لغرض قياس طوري DAالافراج استجابة للمؤثرات منبهة للذوق الأولية. من المهم أن نلاحظ أنه في حين أن أسلوبنا يسمح للفحص من طوري الإفراج DA إلى tastants مستقلة عن العمل أو خيار، فمن الممكن أيضا أن طبيعة غير متوقعة من تسليم منبهة للذوق يمكن أن تؤثر طوري الإفراج DA 19. وهكذا، فإن الحل السليم السيطرة، مثل الماء أو اللعاب الاصطناعي، ويمكن استخدامها في تجارب السيطرة للمقارنة ودراسة الآثار المترتبة على مكافأة غير متوقعة أو التحفيز على طوري DA الإفراج مستقلة عن منبهة للذوق المصالح. ومع ذلك، هذه التقنية لا تقتصر على أي قياسات الإفراج DA أو مكافأة. على سبيل المثال، درست العمل السابقة الإصدار بافراز خلال كل من الثواب والنفور 20. منذ الحيوانات لا تستهلك بسهولة tastants مكره داخل الفم منبهة للذوق التسريب مع FSCV هي التقنية الوحيدة المتاحة لقياس الإفراج DA طوري لtastants مكره. ومع ذلك، فإن هذا الأسلوب لا تحديد ما إذا كان أو لم يكن منبهة للذوق غير مكره أوppetitive، بدلا من ذلك، ببساطة يقيس الإفراج DA خلال استهلاك منبهة للذوق. من أجل تحديد قيمة المتعة من منبهة للذوق، يمكن إدراجها الاختبارات السلوكية لمراقبة ردود أورو-الوجه أثناء طعم التفاعل (كما هو موضح في مكان آخر 5، 21).

كما تجدر الإشارة إلى أن FSCV هو أيضا مناسبة لقياس نوروشيميكالس الهامة الأخرى، مثل السيروتونين 22 والأكسجين 23، ولكن وسائل لتسجيل هذه التحاليل في مستيقظا، والحيوانات تتحرك بحرية غير متوفرة حتى الآن. وعلاوة على ذلك، مع voltammetry المشترك وداخل الفم طريقة التسريب، ردود الدوبامين غير الساحلية الوقت لتسليم منبهة للذوق يمكن تحليلها في غياب السلوكيات الأخرى، مثل سلوك نهج أو استرجاع المواد الغذائية، التي قد تؤثر أيضا الإفراج DA. كتطبيق إضافي، جنبا إلى جنب تسليم منبهة للذوق داخل الفم وFSCV قد يكون مثاليا لقياس DA إشارة إلى الأحداث مجزية أو مكره خلال conditioni الإجرائي أو بافلوفنانوغرام. في الواقع، إن الرب نشر مؤخرا من قبل ليفي وزملاؤه يجمع داخل الفم تسليم منبهة للذوق مع السلوك الإجرائي لتحديد ما إذا tastants داخل الفم تدعم اقتناء وصيانة السلوك استثابي الإدارة الذاتية 24. وبالتالي، يمكن أيضا أن مثل هذه الأساليب تكون مجتمعة مع FSCV لتحديد استجابة DA طوري لtastants عن طريق الفم خلال السلوك.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stimulating electrode PlasticsOne MS303/2-A/SPC when ordering, request a 22 mm cut below pedestal
Cannula for electrode BioAnalytical Systems MD-2251
Glass capillary A-M systems 624503
Carbon fiber Thornel T650
Electrode puller Narishige International PE-22
Neurolog stimulus isolator Digitimer Ltd. DS4
Heat shrink 3M FP-301
Insulated wires for electrodes Squires electronics Custom L 3.000 x 1.000s x 1.000s UL1423 30/1 BLU
Micromanipulator Univ. of Illinois at Chicago, Engineering Machine Shop
Epoxy ITW Devcon 14250 "5 minute epoxy"
Copolymer of perfluoro-3,6-dioxa-4-methyl-7octene-sulfonic acid and tetrafluoroethylene Ion Power LQ-1105 i.e., Nafion
Silver paint GC Electronics 22-023
Power supply BK Precision 9110
Tubing for intra-oral catheters Intramedic 427426 PE 100, I.D. = 0.86 mm; O.D. = 1.52 mm
Tubing for intra-oral infusion Fischer Scientific 02-587-1A I.D. 1/32"; O.D. 3/32"
Syringe pump for flow cell Pump Systems Inc. NE 1000
Surgical cement Dentsply Caulk 675571 and 675572
Air actuator VICI A60 6 position digital valve interface
Digital valve interface VICI DVI 230 VAC
Quad headstage Univ. of N. Carolina, Electronics Facility
UEI power supply Univ. of N. Carolina, Electronics Facility
UEI breakout box Univ. of N. Carolina, Electronics Facility
Power supply for tastant syringe pump Med Associates SG-504
Tastant syringe pump Med Associates PHM-107
Tungsten microelectrode MicroProbes WE30030.5A3
Silver wire reference with AgCl InVivo Metric E255A
Sucrose Sigma 80497
Magnesium chloride Sigma M8266
Sodium chlroide Sigma S7653
Perchloric acid Sigma 244252
Hydrochloric acid (4 M) Sigma 54435
Soidum hydroxide Sigma 306576
Hydrogen peroxide Sigma H1009
Dopamine hydrochloride Sigma H8502
TarHeel HDCV Software University of North Carolina-Chapel Hill Must request software: click here for link to software request page

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Roitman, M. F., et al. Dopamine operates as a subsecond modulator of food seeking. J Neurosci. 24 (6), 1265-1271 (2004).
  2. Aragona, B. J., et al. Regional specificity in the real-time development of phasic dopamine transmission patterns during acquisition of a cue-cocaine association in rats. European Journal of Neuroscience. 30 (10), 1889-1899 (2009).
  3. Wheeler, R. A., et al. Cocaine cues drive opposing context-dependent shifts in reward processing and emotional state. Biol Psychiatry. 69 (11), 1067-1074 (2011).
  4. Wickham, R. J., et al. Advances in studying phasic dopamine signaling in brain reward mechanisms. Front Biosci (Elite Ed). 5, 982-999 (2013).
  5. Roitman, M. F., et al. Real-time chemical responses in the nucleus accumbens differentiate rewarding and aversive stimuli). Nature Neuroscience. 11 (12), 1376-1377 (2008).
  6. Cheer, J. F., et al. Phasic dopamine release evoked by abused substances requires cannabinoid receptor activation. J Neurosci. 27 (4), 791-795 (2007).
  7. Owesson-White, C. A., et al. Neural encoding of cocaine-seeking behavior is coincident with phasic dopamine release in the accumbens core and shell. Eur J Neurosci. 30 (6), 1117-1127 (2009).
  8. Phillips, P. E., et al. Subsecond dopamine release promotes cocaine seeking. Nature. 422 (6932), 614-618 (2003).
  9. Chen, C., et al. Levels of mint and wintergreen flavorants: smokeless tobacco products vs. confectionery products. Food Chem Toxicol. 48 (2), 755-763 (2010).
  10. Manning, K. C., Kelly, K. J., Comello, M. L. Flavoured cigarettes, sensation seeking and adolescents' perceptions of cigarette brands. Tob Control. 18 (6), 459-465 (2009).
  11. Rainey, C. L., Conder, P. A., Goodpaster, J. V. Chemical characterization of dissolvable tobacco products promoted to reduce harm. J Agric Food Chem. 59 (6), 2745-2751 (2011).
  12. Phillips, P. E., et al. Real-time measurements of phasic changes in extracellular dopamine concentration in freely moving rats by fast-scan cyclic voltammetry. Methods Mol Med. 79, 443-464 (2003).
  13. Robinson, D. L., Wightman, R. M. Rapid Dopamine Release in Freely Moving Rats. Electrochemical Methods for Neuroscience. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2007).
  14. Montague, P. R., et al. Dynamic gain control of dopamine delivery in freely moving animals. J Neurosci. 24 (7), 1754-1759 (2004).
  15. Heien, M. L., Johnson, M. A., Wightman, R. M. Resolving neurotransmitters detected by fast-scan cyclic voltammetry. Anal Chem. 76 (19), 5697-5704 (2004).
  16. Keithley, R. B., Heien, M. L., Wightman, R. M. Multivariate concentration determination using principal component regression with residual analysis. Trends Analyt Chem. 28 (9), 1127-1136 (2009).
  17. Keithley, R. B., Carelli, R. M., Wightman, R. M. Rank estimation and the multivariate analysis of in vivo fast-scan cyclic voltammetric data. Anal Chem. 82 (13), 5541-5551 (2010).
  18. Rising, J. P., et al. Healthy Young Adults: description and use of an innovative health insurance program. J Adolesc Health. 41 (4), 350-356 (2007).
  19. Day, J. J., et al. Associative learning mediates dynamic shifts in dopamine signaling in the nucleus accumbens. Nature Neuroscience. 10 (8), 1020-1028 (2007).
  20. Park, J., et al. Catecholamines in the bed nucleus of the stria terminalis reciprocally respond to reward and aversion. Biol Psychiatry. 71 (4), 327-334 (2012).
  21. Wheeler, R. A., Carelli, R. M. The neuroscience of pleasure. Focus on 'Ventral pallidum firing codes hedonic reward: when a bad taste turns good. J Neurophysiol. 96 (5), 2175-2176 (2006).
  22. Bunin, M. A., et al. Release and uptake rates of 5-hydroxytryptamine in the dorsal raphe and substantia nigra reticulata of the rat brain. J Neurochem. 70 (3), 1077-1087 (1998).
  23. Zimmerman, J. B., Wightman, R. M. Simultaneous electrochemical measurements of oxygen and dopamine in vivo. Anal Chem. 63 (1), 24-28 (1991).
  24. Levy, A., et al. A novel procedure for evaluating the reinforcing properties of tastants in laboratory rats: operant intraoral self-administration. J Vis Exp. (84), e50956 (2014).

Tags

السلوك، العدد 102، مكافأة، الدوبامين، voltammetry، النواة المتكئة، والذوق، داخل الفم التسليم، والسكروز، المنثول، تتحرك بحرية
فحص السريع الدوبامين حيوية مع المسح الضوئي السريع Voltammetry دوري أثناء داخل الفم إدارة منبهة للذوق في الجرذان الصحوة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wickham, R. J., Park, J., Nunes, E.… More

Wickham, R. J., Park, J., Nunes, E. J., Addy, N. A. Examination of Rapid Dopamine Dynamics with Fast Scan Cyclic Voltammetry During Intra-oral Tastant Administration in Awake Rats. J. Vis. Exp. (102), e52468, doi:10.3791/52468 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter