Protocol
Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med National Institutes of Health (NIH) Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr og blev godkendt af Yale University Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC).
1) Pre-kirurgiske Forberedelser
- Oral opløsning forberedelse
- Skabe opløsninger af 10% saccharose og 0,005% L-menthol i deioniseret vand (pH 7,4). Opbevar disse løsninger i lukkede beholdere, ved RT, og genskabe hver 2. uge, for at forhindre nedbrydning.
- Elektrode kalibreringsopløsninger
- Gør Tris-buffer (pH 7,4) til enhver tid forud for kalibrering. Løsningen består af 12,0 mM Tris-HCI, 140 mM NaCl, 3,25 mM KCI, 1,20 mM CaCl2, 1,25 mM NaH2PO4, 1,20 mM MgCI2 og 2,00 mM Na 2 SO 4.
- Skabe en stamopløsning af 10 mM dopamin (DA, dopamin-hydrochlorid) i 0,1 M perchlorsyre. Den perchlorsyre med til at forhindre oxidation af dopamine. Opbevar denne stamopløsning ved -20 ° C, og brug i op til 6 måneder. Foretag flere portioner af DA stamopløsningen til opbevaring at bruge hver portion kun én gang.
- Fra 10 mM DA lager, fortyndede opløsninger i Tris-buffer til koncentrationer på 1 uM, 500 nM, 250 nM, 125 nM, 62,5 nM og 31,25 nM.
- Til pH-kalibrering, fremstille opløsninger af Tris buffer med pH 7,2, 7,3, 7,5 og 7,6. Dette vil give løsninger, der efterligner pH skift, der kan opstå i løbet af in vivo forsøg.
- Elektrode fabrikation
- Ved vakuumsugning, aspireres en T-650 carbon fiber (7 um diameter) i et borsilikatglas kapillarrør (længde 10 mm, udvendig diameter 0,6 mm, indvendig diameter 0,4 mm).
- Placere glas kapillar fyldt med carbon fiber i en lodret elektrode aftrækker. For første parametre, skal du indstille varmelegeme til 55,0, og sluk magneten. Dog kan yderligere optimering være nødvendigt, da både varmer og magnetiske indstillinger varierer from laboratoriet til lab.
Bemærk: Elektroden bør være mindst 5,5 cm lang (herunder tilspidsning), så den let kan passe ind i mikromanipulator og indsættes mindst 6,9 mm under dura i rottehjernen. Hvis elektroden er for kort, vil optagelser fra ventrale del af nucleus accumbens ikke nås. På den anden side bør den samlede elektrode længde ikke overstiger 6,5 cm ellers vil være for lang til at passe ind i mikromanipulator. - Under anvendelse af et lysmikroskop, sender en eksponerede carbon-fiber, så at den strækker sig 75-100 um forbi enden af glasset. Kontroller, at elektroden har en meget stram, knap mærkbar, tætning mellem glasset elektrode og kulfiber, som vil producere minimal støj under efterfølgende optagelse. Kassér elektroden, hvis der er nogen mærkbare revner i glas eller hvis forseglingen er løs, hvilket er tegn på en dårlig tætning. For mere detaljerede instruktioner se [12] og [13].
- Montering af elektroden ind i mikrofonenromanipulator
- Opnå en 3 i, 30G ledning, der er isoleret langs halvdelen af længden af tråden og bruge en lille pensel til at anvende et tyndt lag af sølv maling direkte til tråden. Umiddelbart efter påføring sølv maling, indsætte tråden ind i hullet i toppen af elektroden for at tilvejebringe en fysisk og elektrisk forbindelse til kulfiber. Under et mikroskop, sikre, at sølvtråd får kontakt med kulfiber.
- Fastgør sølvtråd og elektroden til mikromanipulator hjælp krympematerialet.
- Placer fremstillet carbon-fiber elektrode i renset isopropylalkohol (IPA) i mindst 10 min at rengøre elektrodeoverfladen og øge efterfølgende følsomhed over for dopamin. Efter iblødsætning i IPA, skylles kulfiber med ledningsvand til fjernelse af IPA.
- Referenceelektrode fabrikation
- Læs 13 mm sølvtråd indeholdende en tilnærmelsesvis 6 mm Ag / Ag Cl mesh (7 mm sølvtråd alene, 6 mm, diameter 0,4 mm),skære sølv del ned til ca. halvdelen af dens oprindelige længde og lodde sølv del af tråden til en guld pin.
- Påfør epoxy over lodde på stiften.
- Dyp Ag / Ag Cl mesh ende i en copolymer af 5% polytetrafluorethylen og perfluor-3,6-dioxa-4-methyl-7octene-sulfonsyre 5 gange med 30 min lufttørrende perioder mellem hver dip.
- Tillad det overtrukne Ag / Ag Cl mesh lufttørre O / N.
- Cure i ovn ved 120 * C i 1 time.
2) Kombineret Intraoral Kirurgi og Intrakraniel Kanylering Surgery (Ca. 75 min)
- Oral kateter fabrikation
- Gøre den mundtlige kateter, og der steriliseres ved ethylenoxid sterilisering, mindst 10 dage før indgrebet.
- Cut PE 100 rør i 6 cm lange segmenter.
- Ved hjælp af en loddekolbe, smelter den ene ende af PE rør og straks presses imod en fast overflade for at afkøle PE rør. Resultatet skal skabeen lille, flad skive ved den ene ende af PE rør og bør ikke flanget. Brug en nål (18 G) eller skubbe stiften for at skabe et hul i midten af denne disk.
- På den anden ende af PE slanger, indsætte stramt den stumpe ende af en 18 G nål ind i røret.
- Ved hjælp af en standard papir hul Hullemaskine, punch flere cirkulære stykker af en polytetrafluorethylen ark (3,18 mm tyk, 6 mm i diameter) til at oprette polytetrafluorethylen skiver.
- Skabe et hul i midten af skiven. Tag nålen knyttet til PE-slanger og skub det helt igennem skiven. Når nålen er gennem skubbe skiven til bunden af PE rør, således at den flugter mod skiven.
- Oral kirurgi
- Efter sterilisering af den kirurgiske værktøjer, kanyle (trimmet til 2,5 mm under soklen før sterilisering) og referenceelektrode, bedøver rotten med en intraperitoneal injektion af ketamin (100 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg).
- After 5 min, anvende en skadelig stimulus test (fods eller hale knivspids) for at vurdere niveauet af anæstesi. Hvis motivet viser nogen fysisk reaktion på skadelig stimulus test (undvigemanøvre respons, øget respiratorisk eller hjertefrekvens), administrere en ketamin boost på 10% til 15% af den oprindelige dosis, og gentag skadelig stimulus forskrift ovenfor.
- Efter rotten er fuldt bedøvede og viser ingen reaktion på skadelig stimulus test, bruge dyr hårklippemaskiner at barbere rottens pels fra øjnene til ca. 2 mm bag ørerne. Derefter placere rotten på en tynd vand recirkulerende varmepude til at opretholde kropstemperaturen under operationen. Anvend øjet smøremiddel. Administrere det ikke-steroide anti-inflammatoriske (NSAID) lægemiddel, Carprofen (5 mg / kg) ved intraperitoneal injektion før udførelse af nogen indsnit og ved indsætning intraorale kanyler. Brug aseptisk teknik på alle tidspunkter.
- Påfør betadine efterfulgt af 70% ethanol til at rense huden. Gentag 3 gange.
- Place rotte på ryggen, og åbne munden ved hjælp af en steril vatpind. Finde den første øvre molær.
- Stik nålen ind i vævet mellem kinden og den første øverste molære indtil nålen kommer ud lige bag og medialt til ørerne.
- Pierce nålen gennem huden, indtil PE rør forlader huden og er tilgængelig.
- Trække op i kanylen (gribning af kanylen selv og ikke nålen) og fastgør polytetrafluorethylen spændeskive i kindtænder, således at kateteret forbliver på plads.
Bemærk: Skæring skiven i en trapez form og sikre den mod de kindtænder med den flade side vender mod kinden gør dette skridt lettere. - Tag endnu polytetrafluorethylen vaskemaskine og skub det over udsatte nål, ned plastslange, og ligger an mod snittet.
- For at sikre polytetrafluorethylen vasker, bruge steriliseret tape til at skabe en trekantet "flag", så skiven ikke glider op. Fastgør vaskER mod rottens hud og den steriliserede bånd.
- Skær den udsatte kateter til at tillade 2-4 cm af rør at blive eksponeret over rottens hoved.
- Gentag trin 2.2.1 gennem 2.2.10 for den anden side af munden.
- Efter sterilisering af den kirurgiske værktøjer, kanyle (trimmet til 2,5 mm under soklen før sterilisering) og referenceelektrode, bedøver rotten med en intraperitoneal injektion af ketamin (100 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg).
- Intrakraniel operation for voltammetri
- Placer rotte i stereotaktisk ramme og rengør dyrets hovedbund under anvendelse af en totrins krat (a betadine krat efterfulgt af en 70% ethanol krat, udføre med en 3 cyklus gentagelse).
- Anvende steriliserede nål næse pincet og kirurgiske saks til at klippe væk en 15 x 15 mm sektion af hovedbunden væv.
- Rengør forsigtigt overfladen af kraniet ved steriliserede bomuld tip applikatorer. Yderligere rense kraniet ved at anvende 2 til 3 dråber 3% hydrogenperoxid.
- Brug en stereotaktisk boremaskine til at gøre 3 små (diameter 1 mm) huller i kraniet til efterfølgende indsættelse af skruer, 1 hul til guide kanyle, 1 hul til stimulerende elektrode, og 1 hul for referencen udvalgtered.
- For optagelser i NAC kerne, placere guide kanyle på 1,2 mm forreste og 1,4 mm lateralt til Bregma. Sænk kanylen apparatet indtil plastbasen flugter med kraniet.
- Placer steriliseret referenceelektrode i halvkugle kontralaterale til vejledning kanyle. Sænk henvisningen ca. 2 mm under dura.
- Placer stimulerende elektrode på 5,2 mm posteriort og 1,0 mm lateralt til Bregma og sænket 8,0 mm under dura at målrette det ventrale tegmentale område (VTA).
- Brug en steriliseret lille kirurgisk skruetrækker til at fastgøre skruerne til kraniet. Indsæt derefter referenceelektroden, stimulere elektrode, og guide kanyle. Endelig sikre alle komponenter ved hjælp cranioplastic cement.
- I de første 48 timer af postoperativ pleje, administrere non-steroidt antiinflammatorisk lægemiddel (NSAID) Carprofen ved subkutan injektion (5 mg / kg). Tillad mindst 1 uge for fuldstændig kirurgisk opsving før udførelse voltamMetry optagelse.
- Under postoperativ pleje, flush mundtlige katetre dagligt med vand. Sørge for mad mættet i vand i 2 dage for at hjælpe dyret i tygge og spise. Giv daglig overvågning for potentielle tegn på stress af smerte (grundet mild infektion eller dehydrering), og give passende indgreb som nødvendige (herunder administration af væsker, topikal administration af antiseptiske og eller NSAID Carprofen administration på 5 mg / kg).
3) voltametriske optagelser i Vågn op, Frit Moving Rat
- Sænkning elektroden og erhverve et DA træningssæt.
- På dagen for eksperimentet kontrollere åbenheden af mundtlige kanyle ved infusion 200 pi vand og observere orofaciale reaktioner (at verificere, at rotten prøvesmagning vandet).
- Fastgør FSCV hovedtrin til rotten ved at indsætte stimulerende elektrode (på hovedtrin) i den bipolare stimulerende elektrode cannula (på rotte). Således hovedtrin (miniaturiserede strøm-til-spænding konverter) forbinder direkte til bipolare stimulerende elektrode.
- Fjern dummy kanyle fra kanyle apparatet og anvende to dråber 50% heparinopløsning ind i kanylen. Sæt derefter forsigtigt en dummy kanyle (lidt længere, at dukkens kanyle, der tidligere blev fjernet) for at slette eventuelle blodpropper eller glial ardannelse der kan være sket, som vil bryde kulfiber elektroder, der efterfølgende vil blive indsat under eksperimentet. Forlæng kanylen anvendt til at rydde blodpropper 3-4 mm under kraniet (mindst 2 mm over optagelsen site).
- Sæt mikromanipulator, med elektrode, i guide kanylen og anbring omega ringen i en position "låst".
- Forbinde referenceelektroden ledning fra hovedtrin til den passende tap. Tilslut derefter arbejder elektrode ledning fra mikromanipulator til den relevante ledningen på hovedtrin.
- Sænk elektroden til ca. 4-4,5 mm under kraniet.
- Brug en potentiostat til at anvende en trekantet bølgeform (400 V / s, -0.4 til +1,3 V). Påfør bølgeform til elektroden ved 60 Hz i mindst 10 min, derefter ændre bølgeform ansøgning frekvens til 10 Hz for efterfølgende eksperimentelle optagelser.
Bemærk: 60 Hz bølgeform ansøgning trin giver en stabil kulfiber overflade og vil hjælpe med at forhindre elektrisk drift - Anvende elektrisk stimulering til VTA anvendelse af forskellige frekvenser (10 til 60 Hz) bælgfrugter (10 til 30 pulser) og strømme (50 til 150 uA), alle med en impulsbredde på 2 ms / fase, til at fremkalde forskellige koncentrationer af DA-frigivelse og pH skift. Erhverve mindst 5 forskellige koncentrationer af DA-frigivelse og 5 forskellige pH-skift. Vent (2 - 3 min minimum) mellem stimuleringer at muliggøre vesikulær ladning [14].
Bemærk: Det er vigtigt at få stimulationer der producerer DA-koncentrationer over hele området, der vil blive indsamlet under den efterfølgendeeksperiment, da de vil blive brugt som et træningssæt til Principal Component Analysis (se afsnit 5.1). - Sænk elektroden i NAc kerne (6,3 mm ventralt til dura). Efterfølgende sænke elektroden i 100 um intervaller inden NAC kerne indtil transiente DA release events observeres ved frekvenser på mindst 1 pr min.
- Tilslut slangen (indre diameter 1/32 ", ydre diameter 3/32") til en 20 ml sprøjte, fastgjort til en sprøjtepumpe. På den anden ende af røret, bruge en affaset 23 G nål til at forbinde slangen til rottens kanyle. Sørg for, at slangen er fyldt helt med den ønskede smagsstoffet og kontroller, at ingen bobler eksisterer i slangen.
Bemærk: Typisk administrere en lille mængde smagsstof i munden af rotte før optagelse for at sikre, at den første infusion til optagelse leverer den fulde infusion beløb og ikke eventuelt resterende vand eller luft i slangen. Desuden er dette tillader dyret at have nogle forudgående erfaring with smagsstoffet da nye smagsstoffer, selv appetitforstyrrelser dem, kan være aversive oprindeligt på grund af sin nyhedsværdi. - Til dataindsamling, indgyde 200 pi smagsstof (6,5 sek ved hjælp af en pumpe og tidligere beskrevet slanger). Tilføre smagsstoffet hver 1-3 min. Indgyde i alt 25 gange per smagsstof. Hver infusion leverer 200 pi opløsning.
- Hvis flere smagsstoffer bliver leveret i et enkelt eksperiment, skylle den mundtlige kateter med vand efter at indsamle data for én smagsstof og vent mindst 20 minutter før infusion den nye smagsstoffet.
- Efter DA indspilningen, forberede histologisk verifikation ved at skabe en lille læsion på optagelsen site. For at bevare kulfiber elektrode til efterfølgende kalibrering, først trække elektroden og fjern mikromanipulator. Brug derefter en ny mikromanipulator med et glas mikroelektrode og en wolfram tråd (udvidelse 100 um ud over glasset spids) til samme dybde (under dura) som den oprindelige kulstof fIber mikroelektrode.
- For histologisk verifikation, oprette en lille læsion ved at anvende 3 V ved wolfram tråd og øge spændingen ved 1 V intervaller, hver 10 sek, indtil 10 V indstillingen er nået.
- Hvis en standardkoncentrationskurve allerede er skabt ved hjælp af flere kulfiber elektroder, udføre læsionen trin ovenfor (3.1.14) ved at anvende den potentielle direkte kulfiber elektrode.
Bemærk: Denne læsion metode vil skade kulfiber og forhindre efterfølgende kalibrering med den specifikke elektrode. - Aflive dyret under anvendelse af en dødelig indsprøjtning pentobarbital (150 mg / kg, ip).
- Løsne headcap med kanyler hjælp af en tang ved at trække direkte opad på headcap. Vrid ikke headcap da dette vil forårsage unødig skade på hjernen og gør det udfordrende at identificere placeringen af elektroden under histologi.
- Fjern hjernen og sted i 4% formalin i 3 dage efterfulgt af 30% sucrose til 1 uge. Opret 30 um skiver ved hjælp af en kryostat, montere på dækglas og undersøge skiver under et lysmikroskop for at identificere placeringen af kulfiber eller wolfram læsion.
Bemærk: Perfusion er valgfrit for 3.1.17.
- Fjern hjernen og sted i 4% formalin i 3 dage efterfulgt af 30% sucrose til 1 uge. Opret 30 um skiver ved hjælp af en kryostat, montere på dækglas og undersøge skiver under et lysmikroskop for at identificere placeringen af kulfiber eller wolfram læsion.
4) Elektrode Kalibrering
- Brug af flowcellen for at skabe en strøm-koncentration omregningsfaktor.
- For at bestemme elektrode følsomhed, kalibrere elektroder efter hvert forsøg ved hjælp af en flow "t-celle" apparat. Sænk elektroden i "t-celle", mens Tris-buffer, pH-opløsninger, eller DA-opløsninger vaskes over elektrodens overflade (med en hastighed på 2 ml / min). Brug en seks-position luft solenoide aktuator til at skifte frem og tilbage mellem buffer og pH eller DA-opløsning.
- For hver kalibrering, indsamle voltametriske data under 5 sek anvendelse af Tris-puffer (baseline) efterfulgt af 5 sek anvendelse af pH eller DA opløsning efterfulgt af 20 sek anvendelsen af Tris-buffer (30 sek samlede fil). Gentag hver kørsel 3 gange for hver kalibrering standard koncentration, modvægt mellem forskellige koncentrationer af hver standard.
- For hver prøvetagning af toppene DA eller pH-fremkaldte strøm. Gennemsnit spidsstrømmen tværs hvert forsøg for at opnå en koncentration versus peak nuværende forhold. For mere detaljerede instruktioner se [12] og [13].
5) Data Analysis
- Ved hjælp af en uddannelse sat i principal komponent analyse (PCA)
Bemærk: Under en voltammetri eksperiment, er output produceres som strøm, som er resultatet af dopamin oxidation og reduktion, pH skift og elektrokemisk støj. PCA tillader adskillelse af disse faktorer, så man kan isolere de ønskede komponenter (DA og pH) og fjern yderligere komponenter, der kan fordreje de ønskede signaler (for en mere detaljeret beskrivelse, se 15, 16).- Tildele en kalibrering faktor til the udgangsstrøm (ca. 5-10 nA / uM) efter PCA at tillade koncentrationsværdier af analytter, der skal fastlægges.
- Brug træningssættet, der under et eksperiment for at "træne" PSA model at udskille DA, pH og andre faktorer. PCA tager uddannelsen sæt cykliske voltammogrammer (indsamlet i afsnit 3.1.8), og bestemmer, hvilke væsentlige egenskaber voltammogram kan bruges til at identificere hver analyt indsamlet under in vivo Voltammetriske optagelser.
- For at bestemme antallet af hovedkomponenter til at holde, så brug en Malinowski F-test. Typisk holder kun 2 eller 3 hovedkomponenter som normalt forklare omkring 95-99% af variansen i data. For yderligere drøftelser om gennemførelsen af Malinowski F-test, se 17.
Bemærk: Når antallet af komponenter er fastlagt, PCA analyse effektivt vil projicere de målte voltammogrammer fra DA og pH træning sætter ind på de vigtigste komponenter, der er blevet bevaret.Resultatet er et datasæt, der er blevet filtreret, så kun DA (eller pH) data forbliver, og det resterende data, der ikke ligner DA eller pH fjernes (se Repræsentative resultater for forventede output). For en yderligere detaljeret forklaring og trin for trin instruktion for brug af PCA til voltametriske analyse se Materialer plader og 16, 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FSCV kombineret med intraoral kateter implantation blev brugt til at undersøge, hvordan saccharose, en appetitforstyrrelser smagsstof, modulerer phasic DA udgivelse i NAC kerne. Forud for smagsstof infusion, elektrisk stimulering (150 uA, 60 Hz, 24 pulser, angivet af den røde bar) i VTA producerer robuste stigninger i phasic DA udgivelse i NAC (Figur 1) Figur 1 viser en farve plot med potentiale på. y-aksen, tidspunkt på x-aksen, og strøm (repræsenteret som falsk farve) på z-aksen. Nedenfor farven plot er domoinsyrekoncentration versus tid spor. Koncentration versus tid blev bestemt ved hjælp af den aktuelle versus tid spor på oxidationspotentiale af dopamin (angivet ved stiplet hvid streg), som blev omdannet til koncentration, efter post-kalibrering af elektroden. Denne koncentration DA versus tid spor blev brugt som en del af uddannelsen sat til PCA.
Efter træningssættet blev erhvervet, 25 infusioner af saccharose(10%, 200 pi per infusion) blev givet hver 1-3 min. Eksempler på saccharose modulering af fasisk dopaminfrigivelsen er vist i figur 2 og 3. I figur 2 er 6,5 sek infusion (angivet med den røde bar) frembragte en forøgelse i strøm (angivet ved den hvide, nedadvendende pil) på oxidationspotentiale af DA (angivet ved den hvide stiplet linie). Omdanne data i en koncentration versus tid plot efter PCA kontrolleret, at den øgede strøm i svarene på smagsstoffet er resultatet af en stigning i DA koncentration. En anden smagsstof, menthol (0,005%, 200 pi per infusion) blev også infunderes under FSCV optagelser i NAC kerne. Figur 3 viser domoinsyrekoncentration mod tiden eksempel spor for intra oral-saccharose og menthol, afslører øget domoinsyrekoncentration efter infusion af enten smagsstof . Man skal forvente at se nogle trial til variabilitet retssag i phasic DA udledning til smagsstoffer (figur 2 og 3A). Men vi typisk ikke se nogen ikke-specifikke tendenser til en stigning eller et fald i phasic DA frigivelse over flere forsøg. Spænder fra 10 til 100 nM DA kan forventes i et typisk eksperiment i et enkelt dyr.
Figur 1. Repræsentant farve plot (øverst) og koncentration versus tid plot (nederst) på elektrisk fremkaldte DA udgivelse i NAC kerne. Rød bjælke angiver stimulation tid. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Repræsentativ farve plot (øverst) og DA-koncentration versus tid trace (nederst) under en enkelt infusion af saccharose. Red Bar indikerer 6.5 sek infusion. Hvid nedadgående vender pilen angiver i elevation i strøm (repræsenteret i falske farver) ved oxidation potentiale DA. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Repræsentant domoinsyrekoncentration versus tid spor i løbet af (A) 10% saccharose og (B) 0,005% menthol ved intraoral administration. Red bar indikerer 6,5 sek intraoral infusion. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Intraoral smagsstof levering kombineret med FSCV tillader analyse af "real-time" DA svar på mundtlige aromastoffer. Der er tre kritiske trin i den protokol, der er nødvendige for vellykkede DA målinger. Første, korrekt implantation af den orale kateter er kritisk for levering af aromastoffer. Sikring af, at kateteret er indsat bag den første molære og kilet på plads forhindrer kateteret i at miste åbenhed og forhindrer utilsigtet fjernelse af dyret. Gennemskylning af katetret i løbet af de første par dage efter indsamling er også vigtig, idet den bløde fødevarer givet til dyret i de første 2 eller 3 dage efter operation kunne tilstoppe kateteret. Sekund, kvaliteten af elektroden er kritisk for at øge signal-støj-forhold i frit bevægelig rotte. I nogle tilfælde, at elektroder, der visuelt vises være af høj kvalitet og god tilstand kan stadig give støjende signaler. En måde at fejlfinding af problemet er at tage baseline optagelser i dorsal striatum (4 mm under dura). Hvis elektroden frembringer for meget støj, kan elektroden fjernes og erstattes med en ny elektrode før udførelse af eksperimentet i NAc kerne optagestedet (6-7 mm under dura). Et tredje afgørende skridt er at finde en passende optagelse placering i den målrettede hjernen regionen, hvor spontane DA release begivenheder ("transienter") er observeret ved en tilstrækkelig frekvens (mindst 1 pr minut) med tilstrækkelige stigninger i domoinsyrekoncentration (mindst 20 nM til 40 nM). Denne optimering vil sikre, at spontane phasic dopaminfrigivelsen begivenheder kan detekteres ved en bestemt placering, før aromastof administration. Sænkning af elektroden i intervaller svarende til størrelsen af den udsatte kulfiber (50-100 um) maksimerer chancerne for at finde en optagelse site med påviselige transienter.
En vigtig advarsel af FSCV er den manglende evne til at bestemme absolut analytkoncentration på et tidspunkt, da FSCV er en difspændet teknik, der måler relative koncentrationsændringer (sammenlignet med en stabil baseline) under hver voltammetri optagelse fil. Men forskellen teknik giver også mulighed for kvantificering af sub-sekunders udsving i dopamin koncentration som reaktion på både givende og afskrækningsmiddel smagsstoffer 5. I forbindelse med nikotinafhængighed, tobaksvarer tilsætningsstoffer, såsom mentol og mundtlige sødestoffer, er blevet vist at påvirke rygevaner 18 og har været for nylig blevet forbudt i cigaretter (med undtagelse af menthol) med familie Smoking Prevention og Tobacco Control Act. Således intraoral levering i kombination med FSCV et vigtigt metodisk redskab, der kan anvendes til at undersøge, hvordan tobaksvarer smagsstoffer kan ændre DA signalering, og potentielt de forstærkende egenskaber af nikotin.
Her har vi beskrevet metoden til at kombinere intraoral smagsstof infusion med FSCV med henblik på at måle phasic DAfrigivelse som reaktion på primære smagsstof stimuli. Det er vigtigt at bemærke, at mens vores teknik tillader undersøgelse af fasisk DA frigivelse til smagsstoffer uafhængige handling eller valg, er det også muligt, at den uventede karakter smagsstoffet levering kan påvirke fasisk dopaminfrigivelsen 19. Således er en effektiv kontrol opløsning, såsom vand eller kunstigt spyt, kan anvendes i kontrolforsøg for at sammenligne og undersøge virkningerne af en uventet belønning eller stimulus på fasisk dopaminfrigivelsen uafhængig af smagsstoffet af interesse. Imidlertid er teknikken ikke begrænset til enten målinger af DA-frigivelse eller belønning. For eksempel har tidligere arbejde undersøgt noradrenalinfrigivelse under både belønning og aversion 20. Da dyr ikke let forbruge afskrækningsmiddel smagsstoffer intraoral smagsstof infusion med FSCV er den eneste teknik til rådighed til måling af phasic DA udledning til afskrækningsmidler smagsstoffer. Men denne teknik ikke afgøre, om en smagsstoffet er afskrækningsmiddel ellerppetitive, snarere blot måler DA frigivelse under forbrug af smagsstoffet. For at bestemme den hedonistiske værdi af et smagsstof, kan adfærdsmæssige tests inkorporeres for at observere oro-facial reaktioner under smag reaktivitet (som beskrevet andetsteds 5, 21).
Det skal også bemærkes, at FSCV er også egnet til at måle andre vigtige neurokemiske stoffer, såsom serotonin 22 og oxygen 23, men fremgangsmåder til at registrere disse analytter i vågen, fritgående dyr er endnu ikke tilgængelige. Desuden vil der med den kombinerede voltammetri og intra-oral infusion metode, tid-låst dopamin reaktioner på smagsstof levering kan analyseres i mangel af andre adfærd, såsom tilgang adfærd eller mad hentning, der måske også påvirker DA udgivelse. Som en ekstra ansøgning, kan kombineres intraoral smagsstof levering og FSCV være ideel til måling DA signalering til belønning eller afskrækningsmiddel begivenheder under operant eller pavlovsk conditioning. Faktisk en nylig JOVE publikation fra Levy og kolleger kombinerer levering intra-oral smagsstof med operant adfærd for at afgøre, om intra-orale smagsstoffer støtter anskaffelse og vedligeholdelse af operant selvadministration adfærd 24. Således kan sådanne metoder også kombineres med FSCV at identificere fasisk DA respons på oral smagsstoffer under opførsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stimulating electrode | PlasticsOne | MS303/2-A/SPC | when ordering, request a 22 mm cut below pedestal |
| Cannula for electrode | BioAnalytical Systems | MD-2251 | |
| Glass capillary | A-M systems | 624503 | |
| Carbon fiber | Thornel | T650 | |
| Electrode puller | Narishige International | PE-22 | |
| Neurolog stimulus isolator |  Digitimer Ltd. |
DS4 | |
| Heat shrink | 3M | FP-301 | |
| Insulated wires for electrodes | Squires electronics | Custom | L 3.000 x 1.000s x 1.000s UL1423 30/1 BLU |
| Micromanipulator | Univ. of Illinois at Chicago, Engineering Machine Shop | ||
| Epoxy | ITW Devcon | 14250 | "5 minute epoxy" |
| Copolymer of perfluoro-3,6-dioxa-4-methyl-7octene-sulfonic acid and tetrafluoroethylene | Ion Power | LQ-1105 | i.e., Nafion |
| Silver paint | GC Electronics | 22-023 | |
| Power supply | BK Precision | 9110 | |
| Tubing for intra-oral catheters | Intramedic | 427426 | PE 100, I.D. = 0.86 mm; O.D. = 1.52 mm |
| Tubing for intra-oral infusion | Fischer Scientific | 02-587-1A | I.D. 1/32"; O.D. 3/32" |
| Syringe pump for flow cell | Pump Systems Inc. | NE 1000 | |
| Surgical cement | Dentsply Caulk | 675571 and 675572 | |
| Air actuator | VICI | A60 | 6 position digital valve interface |
| Digital valve interface | VICI | DVI | 230 VAC |
| Quad headstage | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | ||
| UEI power supply | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | ||
| UEI breakout box | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | ||
| Power supply for tastant syringe pump | Med Associates | SG-504 | |
| Tastant syringe pump | Med Associates | PHM-107 | |
| Tungsten microelectrode | MicroProbes | WE30030.5A3 | |
| Silver wire reference with AgCl | InVivo Metric | E255A | |
| Sucrose | Sigma | 80497 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| Sodium chlroide | Sigma | S7653 | |
| Perchloric acid | Sigma | 244252 | |
| Hydrochloric acid (4 M) | Sigma | 54435 | |
| Soidum hydroxide | Sigma | 306576 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma | H1009 | |
| Dopamine hydrochloride | Sigma | H8502 | |
| TarHeel HDCV Software | University of North Carolina-Chapel Hill | Must request software: click here for link to software request page |
References
- Roitman, M. F., et al. Dopamine operates as a subsecond modulator of food seeking. J Neurosci. 24 (6), 1265-1271 (2004).
- Aragona, B. J., et al. Regional specificity in the real-time development of phasic dopamine transmission patterns during acquisition of a cue-cocaine association in rats. European Journal of Neuroscience. 30 (10), 1889-1899 (2009).
- Wheeler, R. A., et al. Cocaine cues drive opposing context-dependent shifts in reward processing and emotional state. Biol Psychiatry. 69 (11), 1067-1074 (2011).
- Wickham, R. J., et al. Advances in studying phasic dopamine signaling in brain reward mechanisms. Front Biosci (Elite Ed). 5, 982-999 (2013).
- Roitman, M. F., et al. Real-time chemical responses in the nucleus accumbens differentiate rewarding and aversive stimuli). Nature Neuroscience. 11 (12), 1376-1377 (2008).
- Cheer, J. F., et al. Phasic dopamine release evoked by abused substances requires cannabinoid receptor activation. J Neurosci. 27 (4), 791-795 (2007).
- Owesson-White, C. A., et al. Neural encoding of cocaine-seeking behavior is coincident with phasic dopamine release in the accumbens core and shell. Eur J Neurosci. 30 (6), 1117-1127 (2009).
- Phillips, P. E., et al. Subsecond dopamine release promotes cocaine seeking. Nature. 422 (6932), 614-618 (2003).
- Chen, C., et al. Levels of mint and wintergreen flavorants: smokeless tobacco products vs. confectionery products. Food Chem Toxicol. 48 (2), 755-763 (2010).
- Manning, K. C., Kelly, K. J., Comello, M. L. Flavoured cigarettes, sensation seeking and adolescents' perceptions of cigarette brands. Tob Control. 18 (6), 459-465 (2009).
- Rainey, C. L., Conder, P. A., Goodpaster, J. V. Chemical characterization of dissolvable tobacco products promoted to reduce harm. J Agric Food Chem. 59 (6), 2745-2751 (2011).
- Phillips, P. E., et al. Real-time measurements of phasic changes in extracellular dopamine concentration in freely moving rats by fast-scan cyclic voltammetry. Methods Mol Med. 79, 443-464 (2003).
- Robinson, D. L., Wightman, R. M. Rapid Dopamine Release in Freely Moving Rats. Electrochemical Methods for Neuroscience. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2007).
- Montague, P. R., et al. Dynamic gain control of dopamine delivery in freely moving animals. J Neurosci. 24 (7), 1754-1759 (2004).
- Heien, M. L., Johnson, M. A., Wightman, R. M. Resolving neurotransmitters detected by fast-scan cyclic voltammetry. Anal Chem. 76 (19), 5697-5704 (2004).
- Keithley, R. B., Heien, M. L., Wightman, R. M. Multivariate concentration determination using principal component regression with residual analysis. Trends Analyt Chem. 28 (9), 1127-1136 (2009).
- Keithley, R. B., Carelli, R. M., Wightman, R. M. Rank estimation and the multivariate analysis of in vivo fast-scan cyclic voltammetric data. Anal Chem. 82 (13), 5541-5551 (2010).
- Rising, J. P., et al. Healthy Young Adults: description and use of an innovative health insurance program. J Adolesc Health. 41 (4), 350-356 (2007).
- Day, J. J., et al. Associative learning mediates dynamic shifts in dopamine signaling in the nucleus accumbens. Nature Neuroscience. 10 (8), 1020-1028 (2007).
- Park, J., et al. Catecholamines in the bed nucleus of the stria terminalis reciprocally respond to reward and aversion. Biol Psychiatry. 71 (4), 327-334 (2012).
- Wheeler, R. A., Carelli, R. M. The neuroscience of pleasure. Focus on 'Ventral pallidum firing codes hedonic reward: when a bad taste turns good. J Neurophysiol. 96 (5), 2175-2176 (2006).
- Bunin, M. A., et al. Release and uptake rates of 5-hydroxytryptamine in the dorsal raphe and substantia nigra reticulata of the rat brain. J Neurochem. 70 (3), 1077-1087 (1998).
- Zimmerman, J. B., Wightman, R. M. Simultaneous electrochemical measurements of oxygen and dopamine in vivo. Anal Chem. 63 (1), 24-28 (1991).
- Levy, A., et al. A novel procedure for evaluating the reinforcing properties of tastants in laboratory rats: operant intraoral self-administration. J Vis Exp. (84), e50956 (2014).
