Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd volgens de National Institutes of Health (NIH) Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren en werden goedgekeurd door de Yale University Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC).
1) Pre-operatieve Voorbereidingen
- Orale oplossing voorbereiding
- Maak oplossingen van 10% sucrose en 0,005% L-menthol in gedeïoniseerd water (pH 7,4). Bewaar deze oplossingen in gesloten containers, bij KT, en remake elke 2 weken, om degradatie te voorkomen.
- Elektrode ijkoplossingen
- Maak Tris buffer (pH 7,4) op elk moment voorafgaand aan de kalibratie. De oplossing bestaat uit 12,0 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 3,25 mM KCl, 1,20 mM CaCl2, 1,25 mM NaH2PO4, 1,20 mM MgCl2 en 2,00 mM Na 2 SO 4.
- Maak een voorraad oplossing van 10 mM dopamine (DA; dopamine hydrochloride) in 0,1 M perchloorzuur. De perchloorzuur helpt oxidatie van dopamine voorkomene. Bewaar deze voorraad oplossing bij -20 ° C en gebruik voor maximaal 6 maanden. Maak verschillende fracties van de DA voorraad oplossing voor opslag voor elk monster slechts één keer gebruiken.
- Van de 10 mM stock DA, verdunde oplossingen in Tris-buffer met concentraties van 1 uM, 500 nM, 250 nM, 125 nM, 62,5 nM, en 31,25 nM.
- Voor pH kalibratie, worden de oplossingen van Tris-buffer met pH van 7,2, 7,3, 7,5 en 7,6. Dit oplossingen pH verschuivingen die kunnen optreden tijdens het in vivo experiment nabootsen verschaffen.
- Elektrode fabricage
- Door vacuüm zuigen, zuigen een T-650 carbon fiber (7 um diameter) in een borosilicaat glazen capillair (lengte 10 mm, buitendiameter 0,6 mm, binnendiameter 0,4 mm).
- Plaats glazen capillaire gevuld met koolstofvezel in een verticale elektrode puller. Voor initiële parameters, stelt u de kachel naar 55,0 en uitschakelen van de magneet. Echter, kan verdere optimalisatie nodig zijn dat enerzijds verwarming en magnetische instellingen variëren frOM lab tot lab.
Opmerking: De elektrode dient tenminste 5,5 cm lang (met inbegrip tapsheid), zodat het gemakkelijk kan passen in de micromanipulator en toegevoegd ten minste 6,9 mm onder dura in de rattenhersenen is. Indien de elektrode te kort zal opnames van ventrale gedeelte van de nucleus accumbens niet haalbaar. Anderzijds dient de totale lengte elektrode maximaal 6,5 cm anders te lang om te passen in de micromanipulator zijn. - Met behulp van een lichtmicroscoop, snijd het blootgestelde koolstofvezel zodat deze zich 75-100 urn na afloop van het glas. Controleer of de elektrode heeft een zeer strakke, nauwelijks waarneembaar, afdichting tussen het glas elektrode en koolstofvezel, die minimale ruis zal produceren tijdens de daaropvolgende opname. Gooi de elektrode of er merkbare scheurtjes in het glas of de afdichting los, wat duidt op een slechte afdichting. Voor meer gedetailleerde instructies te zien [12] en [13].
- Montage van de elektrode in de microfoonromanipulator
- Verkrijg een 3 in, 30G draad dat is geïsoleerd over de halve lengte van de draad en gebruik een borsteltje een dunne laag zilver verf rechtstreeks op de draad. Direct na het aanbrengen zilververf, steek de draad in het gat op de top van de elektrode naar een fysieke en elektrische verbinding met de koolstof vezel. Onder een microscoop voor dat de zilverdraad contact maakt met de koolstofvezel.
- Bevestig de zilveren draad en de elektrode aan de micromanipulator met behulp van warmte krimpen.
- Plaats de bereide koolstofvezel elektrode in gezuiverd isopropylalcohol (IPA) gedurende ten minste 10 min aan het elektrodeoppervlak reinigen en latere gevoeligheid voor dopamine verhogen. Na weken in IPA, spoel de koolstofvezel met leidingwater om de IPA te verwijderen.
- Referentie-elektrode fabricage
- Neem een 13 mm zilverdraad met een ongeveer 6 mm Ag / Ag Cl mesh (7 mm zilverdraad alleen, 6 mm mesh, een diameter van 0,4 mm),snijd het zilver gedeelte tot ca. de helft van zijn oorspronkelijke lengte en soldeer de zilveren gedeelte van de draad aan een gouden pin.
- Breng epoxy over het soldeer op de pen.
- Dompel de Ag / Ag Cl gaas uiteinde in een 5% copolymeer van polytetrafluorethyleen en perfluor-3,6-dioxa-4-methyl-7octene-sulfonzuur 5 maal, met 30 min perioden luchtdrogen tussen de dip.
- Laat de coating Ag / Ag Cl mesh aan de lucht drogen O / N.
- Behandeling in een oven bij 120 * C gedurende 1 uur.
2) Gecombineerde Intraoral Chirurgie en Intracranial Canulatie Surgery (Ongeveer 75 min)
- Oral katheter fabricage
- Maak de orale catheter en steriliseer ethyleenoxide sterilisatie, ten minste 10 dagen voorafgaand aan de operatie.
- Snijd PE 100 slang in 6 cm lang segmenten.
- Een soldeerbout smelten ene uiteinde van de PE buis en direct drukken tegen een vast oppervlak om de PE buis afkoelen. Het resultaat moet makenEen kleine, platte schijf aan één uiteinde van de PE buis en mag niet worden geflensd. Gebruik een naald (18 G) of duw pin om een gat in het midden van deze schijf te creëren.
- Aan het andere uiteinde van de PE buis, stevig plaatst het stompe uiteinde van een 18 G naald in de buis.
- Met een standaardpapier perforator punch verscheidene cirkelvormige stukken van een plaat polytetrafluorethyleen (3,18 mm dikte, 6 mm in diameter) met polytetrafluorethyleen ringen maken.
- Een gat in het midden van de ring. Neem de naald bevestigd aan de PE-buizen en duw het door de wasmachine. Zodra de naald door en schuift de ring aan de onderzijde van de PE buis zodat deze strak tegen de ring.
- Kaakchirurgie
- Na het steriliseren van de chirurgische instrumenten canule (bijgesneden tot 2,5 mm onder het voetstuk vóór sterilisatie), en referentie-elektrode, verdoven de rat met een intraperitoneale injectie van ketamine (100 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg).
- After 5 min, breng dan een schadelijke stimulus proef (voet of staartknijptest) om het niveau van anesthesie beoordelen. Als het onderwerp toont een fysieke reactie op de schadelijke stimulus-test (terugdeinzen reactie, verhoging van de luchtwegen of de hartslag), het beheer van een ketamine boost van 10% tot 15% van de oorspronkelijke dosis en herhaal de schadelijke stimulus protocol boven.
- Nadat de rat volledig verdoofd en vertoont geen reactie op de schadelijke stimulus test gebruikt dierlijk tondeuse bont van de rat scheren van de ogen tot ongeveer 2 mm achter de oren. Plaats de rat op een dunne water recirculatie verwarming pad om de lichaamstemperatuur tijdens de operatie te handhaven. Breng eye smeermiddel. Dien de niet-steroïdale anti-inflammatoire (NSAID) drugs, Carprofen (5 mg / kg), door intraperitoneale injectie Vóór alle insnijdingen en voorafgaand aan het inbrengen intraorale canules. Gebruik aseptische techniek te allen tijde.
- Breng betadine gevolgd door 70% ethanol om de huid te reinigen. Herhaal dit 3 keer.
- Place de rat op zijn rug, en de monding met een steriel wattenstaafje openen. Vind de eerste bovenste molaar.
- Steek de naald in het weefsel tussen de wang en de eerste bovenste molaire totdat de naald verlaat net achter en mediaal van de oren.
- Prik de naald door de huid tot aan de PE-slang verlaat de huid en is toegankelijk.
- Trek de canule (aangrijpend door de canule zelf en niet de naald) en zet de polytetrafluorethyleen wasmachine in de kiezen, zodat de katheter op zijn plaats blijft.
Let op: Het snijden van de ring in een trapezium vorm en het veiligstellen van het tegen de kiezen met de platte kant naar de wang maakt deze stap gemakkelijker. - Neem een andere polytetrafluorethyleen wasmachine en schuif deze over de blootliggende naald, een daling van de kunststof buizen en aanliggen tegen de incisie.
- Om de polytetrafluorethyleen wasmachine te beveiligen, gebruiken gesteriliseerd band naar een driehoekige "vlag" te creëren, zodat de wasmachine niet omhoog schuiven. Bevestig het wassener tegen de huid van de rat en de gesteriliseerde tape.
- Snijd de blootgestelde katheter om 2-4 cm van de slang boven het hoofd van de rat wordt blootgesteld.
- Herhaal stap 2.2.1 tot 2.2.10 voor de andere kant van de mond.
- Na het steriliseren van de chirurgische instrumenten canule (bijgesneden tot 2,5 mm onder het voetstuk vóór sterilisatie), en referentie-elektrode, verdoven de rat met een intraperitoneale injectie van ketamine (100 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg).
- Intracraniële chirurgie voor voltametrie
- Plaats de rat in de stereotaxische frame en reinigen de hoofdhuid van het dier met behulp van een tweetraps scrub (een betadine scrub, gevolgd door een 70% ethanol scrub, uit te voeren met een 3-cyclus herhaling).
- Gebruik gesteriliseerde naald neus pincet en chirurgische schaar een sectie 15 x 15 mm van de hoofdhuid weefsel weg te snijden.
- Reinig het oppervlak van de schedel met behulp van gesteriliseerde katoen tip applicators. Verder reinigen de schedel door toepassing 2-3 druppels van 3% waterstofperoxide.
- Gebruik een stereotaxisch boor 3 kleine (1 mm diameter) gaten in de schedel voor daaropvolgende inbrengen van schroeven, 1 gat voor de gids canule, 1 gat voor de stimulerende elektrode en 1 gat voor de verwijzing uitverkorenen makenreed.
- Voor opnames in de NAc kern, de positie van de gids canule op 1,2 mm anterior en 1,4 mm lateraal van Bregma. Laat de canule apparaat totdat de plastic basis is gelijk met de schedel.
- Plaats de gesteriliseerde referentie-elektrode in de contralaterale hemisfeer naar de gids canule. Verlaag de verwijzing van ongeveer 2 mm onder de dura.
- Plaats de stimulerende elektrode van 5,2 mm posterior en 1,0 mm lateraal van Bregma en neergelaten 8,0 mm onder dura het ventrale tegmentale gebied (VTA) te verkrijgen.
- Gebruik een gesteriliseerde kleine chirurgische schroevendraaier om de schroeven vast aan de schedel. Steek dan de referentie-elektrode, het stimuleren van de elektrode, en begeleiden canule. Tot slot, veilige opslag van alle onderdelen met behulp van cranioplastic cement.
- Voor de eerste 48 uur post-operatieve zorg, bestuurt de niet-steroïde anti-inflammatoir geneesmiddel (NSAID) Carprofen door subcutane injectie (5 mg / kg). Laat minstens 1 week voor de volledige chirurgische herstel voorafgaand aan het uitvoeren voltammetry opname.
- Tijdens de post-operatieve zorg, flush orale catheters dagelijks met water. Zorgen voor voedsel verzadigd in water voor 2 dagen om het dier te helpen bij het kauwen en eten. Voorzie dagelijkse controle op mogelijke tekenen van stress pijn (door milde infectie of dehydratie) en passende maatregelen indien nodig (inclusief toediening van fluïda, topische toediening van antiseptica en of NSAID Carprofen toediening van 5 mg / kg).
3) Voltammetrische Recordings in Awake, vrij bewegende rat
- Het verlagen van de elektrode en het verwerven van een DA training set.
- Op de dag van het experiment, check de doorgankelijkheid van de mondelinge canule door het inbrengen van 200 ul water en observeren orofaciale reacties (om te controleren of de rat proeft het water).
- Bevestig de FSCV headstage aan de rat door het invoegen van de stimulerende elektrode (aan de headstage) in de bipolaire stimulerende elektrode cannula (de rat). Zo is de headstage (geminiaturiseerde stroom-spanningsomzetter) meteen contact met het bipolaire stimulerende elektrode.
- Verwijder de dummy canule de canule inrichting en twee druppels 50% heparineoplossing toepassing in de canule. Vervolgens plaatst voorzichtig een dummy canule (iets langer de dummy canule die eerder werd verwijderd) geven bloedstolsels of gliale littekenvorming die heeft plaatsgevonden, waarbij carbon fiber elektroden die vervolgens tijdens het experiment wordt ingevoegd breken duidelijk. Verleng de canule voor het opruimen stolsels 3-4 mm onder de schedel (minimaal 2 mm boven de opname site).
- Plaats de micromanipulator, met een elektrode in de gids canule en plaats de omega-ring in een "gesloten" stand.
- Sluit de referentie-elektrode draad van de headstage naar de juiste pin. Sluit vervolgens de werkende elektrode draad van de micromanipulator naar de juiste draad op de headstage.
- Laat de elecvertrad tot ongeveer 4-4,5 mm onder de schedel.
- Gebruik een potentiostaat een driehoekige golfvorm (400 V / s, -0,4 tot 1,3 V) toegepast. Breng de golfvorm aan de elektrode bij 60 Hz gedurende tenminste 10 minuten, wijzig de golfvorm toepassingsfrequentie tot 10 Hz voor daaropvolgende experimentele opnamen.
Opmerking: De 60 Hz golfvorm applicatie stap produceert een stabiele koolstofvezel oppervlak en zal helpen voorkomen dat elektrische drift - Breng elektrische stimulatie van de VTA gebruik van eigen frequenties (10-60 Hz) pulsen (10-30 pulsen) en stromen (50 tot 150 uA) allemaal met een pulsduur van 2 ms / fase verschillende concentraties DA afgifte en pH roepen verschuivingen. Verwerven ten minste 5 verschillende concentraties van DA vrijkomen en 5 verschillende pH verschuivingen. Wait (2-3 min minimum) tussen prikkels om voor vesiculaire herladen [14].
Opmerking: Het is belangrijk om prikkels die DA concentraties over het gehele bereik dat tijdens de volgende zal worden verzameld produceren verkrijgenexperiment, omdat ze zullen worden gebruikt als een training set voor Principal Component Analysis (zie paragraaf 5.1). - Laat de elektrode in de NAc kern (6.3 mm ventraal Dura). Vervolgens laat de elektrode in stappen van 100 um in de kern tot NAc DA afgifte voorbijgaande verschijnselen vertoont bij een frequentie van ten minste 1 per minuut.
- Sluit de slang (inwendige diameter 1/32 ", buitendiameter 3/32") om een 20 ml injectiespuit bevestigd aan een spuitpomp. Aan het andere uiteinde van de buis, gebruikt een afgeschuinde 23 G naald om de buis verbinden met canule van de rat. Zorg ervoor dat de slang volledig gevuld is met de gewenste tastant en controleer dat er geen luchtbellen aanwezig in de slang.
Opmerking: Meestal toedienen van een kleine hoeveelheid tastant in de mond van de rat voorafgaand aan het opnemen zodat de eerste infusie opnemen geeft de volledige infusie bedrag en geen resterend water of lucht in de slang. Bovendien, dit maakt het dier tevoren enige ervaring hebben with de tastant sinds roman tastants, zelfs appetitive degenen, kan aversieve in eerste instantie te wijten zijn aan de nieuwigheid. - Voor het verzamelen van gegevens, bezielen 200 ul tastant (6,5 sec met behulp van een pomp en eerder beschreven buizen). Infundeer de tastant om de 1-3 min. Infundeer een totaal van 25 keer per tastant. Elke infusie levert 200 ul oplossing.
- Als er meerdere tastants worden geleverd in een enkel experiment, spoelt de mondelinge katheter met water na het verzamelen van gegevens voor één tastant en wacht minstens 20 minuten voor het inbrengen van de nieuwe tastant.
- Na de DA opnamesessie, voor te bereiden op histologische verificatie door het creëren van een klein letsel aan de opname plaats. Om de carbon fiber elektrode voor volgende kalibratie te behouden, de eerste trek de elektrode en verwijder de micromanipulator. Maak dan gebruik van een nieuw micromanipulator met een glas micro-elektrode en een wolfraam draad (uitbreiding van 100 micrometer voorbij het glas tip) naar dezelfde diepte (onder dura) als de originele carbon fIber micro-elektrode.
- Voor histologische verificatie maakt een laesie door toepassing van 3 V in de wolfraamdraad en het verhogen van de spanning in stappen van 1 V, elke 10 seconden totdat de instelling 10 V bereikt.
- Als een standaard concentratie curve al is gemaakt met behulp van meerdere koolstofvezel-elektroden, het uitvoeren van de laesie stap boven (3.1.14) met toepassing van de potentiële direct de carbon fiber elektrode.
Opmerking: Deze laesie methode koolstofvezel aantasten en verhindert verdere kalibratie met die specifieke elektrode. - Euthanaseren het dier met een letale injectie pentobarbital (150 mg / kg, ip).
- Verjagen de headcap met de canules met een tang door direct omhoog te trekken op de headcap. Niet draai de headcap aangezien dit onnodige schade aan de hersenen veroorzaken en maakt het een uitdaging om de locatie van de elektrode te identificeren tijdens histologie.
- Verwijder de hersenen en plaats in 4% formaline gedurende 3 dagen gevolgd door 30% suCROSE voor 1 week. Maak 30 urn plakjes met behulp van een cryostaat, te monteren op dekglaasjes en onderzocht segmenten onder een lichtmicroscoop om de locatie van de koolstofvezel of wolfraam laesie te identificeren.
Opmerking: perfusie is optioneel voor 3.1.17.
- Verwijder de hersenen en plaats in 4% formaline gedurende 3 dagen gevolgd door 30% suCROSE voor 1 week. Maak 30 urn plakjes met behulp van een cryostaat, te monteren op dekglaasjes en onderzocht segmenten onder een lichtmicroscoop om de locatie van de koolstofvezel of wolfraam laesie te identificeren.
4) elektrode kalibratie
- De stroomcel een actuele concentratie conversiefactor maken.
- Om elektrode gevoeligheid bepalen kalibreren elektroden na elk experiment met een flow "T-cell" -apparaat. Laat de elektrode in de "t-cell" tijdens Tris buffer, pH oplossingen of DA oplossingen overspoelde het elektrodeoppervlak (met een snelheid van 2 ml / min). Gebruik zes posities luchtsolenoïde aandrijving heen en weer schakelen tussen de buffer en pH of DA oplossing.
- Voor elke kalibratie, verzamelen voltammetrische data gedurende 5 sec toepassing van Tris buffer (baseline), gevolgd door 5 sec toepassing van pH of DA-oplossing, gevolgd door 20 sec eenOEPASSING Tris buffer (30 sec totale bestand). Herhaal elke run 3 keer voor elke kalibratie standaard concentratie, tegenwicht tussen de verschillende concentraties van elke norm.
- Voor elk monster collectie, meet de piek DA of-pH opgewekte stroom. Het gemiddelde van de piekstroom over elke proef om een concentratie versus piekstroom relatie te verkrijgen. Voor meer gedetailleerde instructies te zien [12] en [13].
5) Data Analysis
- Met behulp van een training in principal component analyse (PCA)
Opmerking: Bij een voltammetrie experiment, wordt als output stroom, die het gevolg is van dopamine oxidatie en reductie, pH verschuivingen en elektrochemische ruis. PCA maakt scheiding van deze factoren zodat men de gewenste componenten (DA en pH) kunnen isoleren en andere componenten die de gewenste signalen zouden kunnen vervalsen (voor een nadere beschrijving zie 15, 16).- Wijs een kalibratiefactor aan The uitgangsstroom (ongeveer 5-10 nA / gM) na PCA om concentraties van de analyten te bepalen.
- Gebruik de training set verkregen tijdens een experiment om te "trainen" de PSO model te scheiden DA, pH, en andere factoren. PCA is van vastgestelde cyclische voltammogrammen training (in paragraaf 3.1.8 ingezameld) en bepaalt welke essentiële kenmerken van het voltammogram kan worden gebruikt om elke tijdens de in vivo voltammetrie opnames verzameld analyt identificeren.
- Om het aantal van de belangrijkste componenten te blijven bepalen, gebruik dan een Malinowski F-toets. Gewoonlijk houdt slechts 2 of 3 hoofdcomponenten die normaal vertellen over 95-99% van de variantie in de data. Voor verdere discussie over de uitvoering van de Malinowski F-test, zie 17.
Opmerking: Zodra het aantal componenten bepaald, de PCA analyse daadwerkelijk zal de gemeten voltammogrammen projecteren van DA en pH training stelt op de belangrijkste componenten die zijn behouden.Het resultaat is een dataset die is gefilterd zodat alleen DA (of pH) gegevens blijven en de overgebleven data die niet lijken DA of pH wordt verwijderd (zie Representatieve resultaten voor de verwachte productie). Voor een verdere gedetailleerde uitleg en stapsgewijze instructies voor het gebruik van PCA voor voltammetrische analyse zien Materials blad en 16, 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FSCV gecombineerd met intra-orale katheter implantatie werd gebruikt om te onderzoeken hoe sucrose, een appetitive tastant, moduleert fasische DA release in de NAc kern. Vóór tastant infusie elektrische stimulatie (150 uA, 60 Hz, 24 pulsen, aangeduid met het rode balk) van het VTA produceert sterke toename driefase DA afgifte in de NAc (figuur 1) Figuur 1 toont een kleurenplot met potentiaal op. de y-as de tijd op de x-as en stroom (weergegeven als valse kleur) op de z-as. Onder de kleur plot is DA concentratie versus tijd trace. De concentratie versus tijd werd bepaald volgens de huidige versus tijdspoor de oxidatiepotentiaal van dopamine (met streeplijnen witte lijn) die werd omgezet in concentraties worden bij een kalibratie van de elektrode. Dit DA concentratie versus tijd trace werd gebruikt als onderdeel van de voor PCA training.
Nadat de training set verworven, 25 infusies van sucrose(10%, 200 ul per infuus) werden elke 1-3 min. Voorbeelden saccharose modulatie van driefase DA afgifte worden in figuren 2 en 3. In figuur 2, de 6,5 sec infusie (aangegeven door de rode balk) produceerde een verhoging van stroom (aangegeven door de witte, naar beneden gerichte pijl) en oxidatiepotentiaal van DA (aangegeven met de witte stippellijn). Het transformeren van de gegevens in een concentratie versus tijdgrafiek daarna PCA gecontroleerd of de verhoogde stroom in reactie op de tastant is het gevolg van een toename in DA concentratie. Een andere tastant, menthol (0,005%, 200 ul per infuus) werd ook toegediend tijdens FSCV opnames in de NAC kern. Figuur 3 toont DA concentratie versus tijd voorbeeld wordt voor de intra-orale sucrose en menthol, onthullen verhoogde concentratie DA na infusie van beide tastant . Men zou verwachten dat een aantal proef om proces variabiliteit in fasische DA release tastants (figuur 2 en 3A) te zien. Maar we meestal niet zien elke niet-specifieke trends in de richting van een toename of afname in fasische DA vrijlating over meerdere studies. Bereiken 10-100 nM DA kan worden verwacht in een typisch experiment in een enkel dier.
Figuur 1. Vertegenwoordiger van kleur plot (boven) en de concentratie versus tijd grafiek (onderaan) van elektrisch opgewekte DA release in de NAC kern. De rode balk geeft stimulatie tijd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Vertegenwoordiger van kleur plot (boven) en DA concentratie versus de tijd trace (onder) tijdens een enkele infusie van sucrose. Red bar geeft 6,5 sec infusie. White naar beneden gerichte pijl geeft aan in verhoging in de huidige (vertegenwoordigd in valse kleuren) aan de oxidatie potentieel van DA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Vertegenwoordiger van DA concentratie versus de tijd sporen in (A) 10% sucrose en (B) 0,005% menthol door intra-orale toediening. De rode balk geeft 6,5 sec intraoral infusie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Intraorale tastant levering gecombineerd met FSCV maakt analyse van de "real-time" DA reacties op orale smaakstoffen. Er zijn drie belangrijke stappen in het protocol die zijn vereist voor succesvolle DA metingen. Ten eerste goede implantatie van de orale katheter kritisch voor afgifte van smaakstoffen. Ervoor zorgen dat de katheter achter de eerste kies is geplaatst en ingeklemd in plaats voorkomt dat de catheter verliest doorgankelijkheid en voorkomt onbedoelde verwijdering door het dier. Spoelen van de katheter gedurende de eerste paar dagen na herstel is belangrijk, omdat het zacht voedsel aan de dieren tijdens de eerste 2 of 3 dagen na de operatie kan de catheter verstoppen. Ten tweede, de kwaliteit van de elektrode is essentieel voor het verhogen signaal-ruisverhouding in een vrij bewegende ratten. In sommige gevallen, elektroden die visueel lijken te zijn van hoge kwaliteit en een goede conditie kan nog steeds geven luidruchtige signalen. Een manier om dit probleem op te lossen is met de basislijn opnames te nemen in de dorsal striatum (4 mm onder dura). Indien de elektrode produceert te veel lawaai kan de elektrode worden verwijderd en vervangen door een nieuwe elektrode voorafgaand aan het uitvoeren van de experimenten in de NAc kern opname onderzocht (6-7 mm onder dura). Een derde cruciale stap is het vinden van een geschikte opname-locatie in de beoogde hersenen regio, waar spontane DA gebeurtenissen release ("transiënten") worden waargenomen bij een voldoende frequentie (minimaal 1 per min) met voldoende toename van de DA-concentratie (ten minste 20 nM tot 40 nM). Deze optimalisatie zal ervoor zorgen dat spontane fasische DA gebeurtenissen release kan worden gedetecteerd bij specifieke locatie, voorafgaand aan de smaakstof administratie. Het verlagen van de elektrode in stappen ter grootte van de blootgestelde carbon fiber (50-100 urn) maximaliseert de kansen om een opname plaats met detecteerbare transiënten.
Een belangrijk nadeel van FSCV is het onvermogen om absolute analytconcentratie bepalen op een tijdstip, aangezien FSCV een differential techniek die relatieve concentratie veranderingen meet (in vergelijking met een stabiele baseline) tijdens elke voltametrie opname bestand. De differentiaal techniek maakt ook de kwantificering van een seconde fluctuaties in dopamine concentraties in respons op zowel belonen en negatieve tastants 5. In het kader van nicotineverslaving tabaksproduct toevoegsels, zoals menthol en orale zoetstoffen, bleken rookgedrag 18 beïnvloeden en zijn onlangs verboden in sigaretten (behalve menthol) Door de Family Smoking Prevention en tabak Control Act. Aldus intraorale afgifte in combinatie met FSCV een belangrijk methodologisch instrument dat kan worden gebruikt om te onderzoeken hoe tabaksproduct smaakstoffen DA signalering kan veranderen, en mogelijk de versterkende eigenschappen van nicotine.
Hier hebben wij de werkwijze van het combineren intraorale tastant infusie met FSCV voor het meten fasische DA beschrevenrelease in reactie op primaire tastant stimuli. Het is belangrijk op te merken dat terwijl onze techniek kan de behandeling van driefase DA vrijgave tastants onafhankelijk uit optreden keuze is het ook mogelijk dat de onverwachte aard van de tastant levering driefase DA afgifte 19 kunnen beïnvloeden. Zo kan een goede controle oplossing, zoals water of kunstmatige speeksel, kan worden gebruikt in controle-experimenten om de effecten van een onverwachte beloning of stimulans op driefase DA afgifte onafhankelijk van de tastant plaats te vergelijken en te onderzoeken. Echter is de techniek niet beperkt tot of metingen van DA afgifte wordt verricht. Zo heeft eerdere werk norepinefrine vrijlating onderzocht tijdens zowel beloning en afkeer 20. Omdat dieren niet gemakkelijk verbruikt aversieve tastants intraorale tastant infuus met FSCV is de enige techniek die beschikbaar is voor het meten van fasische DA release aversieve tastants. Echter, deze techniek niet bepalen of een tastant is aversief ofppetitive veeleer meet simpelweg DA afgifte in het verbruik van de tastant. Om de hedonische waarde van een tastant bepalen gedragstesten kunnen worden opgenomen om orofaciale responsen tijdens smaak reactiviteit in acht (zoals elders 5, 21 beschreven).
Ook moet worden opgemerkt dat FSCV ook geschikt voor het meten van andere belangrijke neurotransmitters, zoals serotonine 22 en zuurstof 23, maar werkwijzen voor het vastleggen van deze analyten in wakkere, vrij bewegende dieren zijn nog niet beschikbaar. Ook de gecombineerde voltammetrie en intra-orale infusiemethode, time slot dopamine reacties tastant levering kan worden geanalyseerd in afwezigheid van andere gedragingen, zoals benaderingsgedrag of voedsel opvragen, die ook invloed kunnen DA afgifte. Als extra toepassing kan gecombineerd intraoral tastant levering en FSCV ideaal voor het meten van DA signalering te belonen of aversieve gebeurtenissen tijdens operante of Pavlov conditioni zijnng. Een recent Jove publicatie van Levy en collega combineert intra-orale tastant levering met operant gedrag te bepalen of intra-orale tastants ondersteunen de aanschaf en onderhoud van operante zelftoediening gedrag 24. Derhalve kunnen dergelijke werkwijzen ook worden gecombineerd met FSCV tot driefase DA respons op orale tastants in gedrag identificeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stimulating electrode | PlasticsOne | MS303/2-A/SPC | when ordering, request a 22 mm cut below pedestal |
| Cannula for electrode | BioAnalytical Systems | MD-2251 | |
| Glass capillary | A-M systems | 624503 | |
| Carbon fiber | Thornel | T650 | |
| Electrode puller | Narishige International | PE-22 | |
| Neurolog stimulus isolator |  Digitimer Ltd. |
DS4 | |
| Heat shrink | 3M | FP-301 | |
| Insulated wires for electrodes | Squires electronics | Custom | L 3.000 x 1.000s x 1.000s UL1423 30/1 BLU |
| Micromanipulator | Univ. of Illinois at Chicago, Engineering Machine Shop | ||
| Epoxy | ITW Devcon | 14250 | "5 minute epoxy" |
| Copolymer of perfluoro-3,6-dioxa-4-methyl-7octene-sulfonic acid and tetrafluoroethylene | Ion Power | LQ-1105 | i.e., Nafion |
| Silver paint | GC Electronics | 22-023 | |
| Power supply | BK Precision | 9110 | |
| Tubing for intra-oral catheters | Intramedic | 427426 | PE 100, I.D. = 0.86 mm; O.D. = 1.52 mm |
| Tubing for intra-oral infusion | Fischer Scientific | 02-587-1A | I.D. 1/32"; O.D. 3/32" |
| Syringe pump for flow cell | Pump Systems Inc. | NE 1000 | |
| Surgical cement | Dentsply Caulk | 675571 and 675572 | |
| Air actuator | VICI | A60 | 6 position digital valve interface |
| Digital valve interface | VICI | DVI | 230 VAC |
| Quad headstage | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | ||
| UEI power supply | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | ||
| UEI breakout box | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | ||
| Power supply for tastant syringe pump | Med Associates | SG-504 | |
| Tastant syringe pump | Med Associates | PHM-107 | |
| Tungsten microelectrode | MicroProbes | WE30030.5A3 | |
| Silver wire reference with AgCl | InVivo Metric | E255A | |
| Sucrose | Sigma | 80497 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| Sodium chlroide | Sigma | S7653 | |
| Perchloric acid | Sigma | 244252 | |
| Hydrochloric acid (4 M) | Sigma | 54435 | |
| Soidum hydroxide | Sigma | 306576 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma | H1009 | |
| Dopamine hydrochloride | Sigma | H8502 | |
| TarHeel HDCV Software | University of North Carolina-Chapel Hill | Must request software: click here for link to software request page |
References
- Roitman, M. F., et al. Dopamine operates as a subsecond modulator of food seeking. J Neurosci. 24 (6), 1265-1271 (2004).
- Aragona, B. J., et al. Regional specificity in the real-time development of phasic dopamine transmission patterns during acquisition of a cue-cocaine association in rats. European Journal of Neuroscience. 30 (10), 1889-1899 (2009).
- Wheeler, R. A., et al. Cocaine cues drive opposing context-dependent shifts in reward processing and emotional state. Biol Psychiatry. 69 (11), 1067-1074 (2011).
- Wickham, R. J., et al. Advances in studying phasic dopamine signaling in brain reward mechanisms. Front Biosci (Elite Ed). 5, 982-999 (2013).
- Roitman, M. F., et al. Real-time chemical responses in the nucleus accumbens differentiate rewarding and aversive stimuli). Nature Neuroscience. 11 (12), 1376-1377 (2008).
- Cheer, J. F., et al. Phasic dopamine release evoked by abused substances requires cannabinoid receptor activation. J Neurosci. 27 (4), 791-795 (2007).
- Owesson-White, C. A., et al. Neural encoding of cocaine-seeking behavior is coincident with phasic dopamine release in the accumbens core and shell. Eur J Neurosci. 30 (6), 1117-1127 (2009).
- Phillips, P. E., et al. Subsecond dopamine release promotes cocaine seeking. Nature. 422 (6932), 614-618 (2003).
- Chen, C., et al. Levels of mint and wintergreen flavorants: smokeless tobacco products vs. confectionery products. Food Chem Toxicol. 48 (2), 755-763 (2010).
- Manning, K. C., Kelly, K. J., Comello, M. L. Flavoured cigarettes, sensation seeking and adolescents' perceptions of cigarette brands. Tob Control. 18 (6), 459-465 (2009).
- Rainey, C. L., Conder, P. A., Goodpaster, J. V. Chemical characterization of dissolvable tobacco products promoted to reduce harm. J Agric Food Chem. 59 (6), 2745-2751 (2011).
- Phillips, P. E., et al. Real-time measurements of phasic changes in extracellular dopamine concentration in freely moving rats by fast-scan cyclic voltammetry. Methods Mol Med. 79, 443-464 (2003).
- Robinson, D. L., Wightman, R. M. Rapid Dopamine Release in Freely Moving Rats. Electrochemical Methods for Neuroscience. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2007).
- Montague, P. R., et al. Dynamic gain control of dopamine delivery in freely moving animals. J Neurosci. 24 (7), 1754-1759 (2004).
- Heien, M. L., Johnson, M. A., Wightman, R. M. Resolving neurotransmitters detected by fast-scan cyclic voltammetry. Anal Chem. 76 (19), 5697-5704 (2004).
- Keithley, R. B., Heien, M. L., Wightman, R. M. Multivariate concentration determination using principal component regression with residual analysis. Trends Analyt Chem. 28 (9), 1127-1136 (2009).
- Keithley, R. B., Carelli, R. M., Wightman, R. M. Rank estimation and the multivariate analysis of in vivo fast-scan cyclic voltammetric data. Anal Chem. 82 (13), 5541-5551 (2010).
- Rising, J. P., et al. Healthy Young Adults: description and use of an innovative health insurance program. J Adolesc Health. 41 (4), 350-356 (2007).
- Day, J. J., et al. Associative learning mediates dynamic shifts in dopamine signaling in the nucleus accumbens. Nature Neuroscience. 10 (8), 1020-1028 (2007).
- Park, J., et al. Catecholamines in the bed nucleus of the stria terminalis reciprocally respond to reward and aversion. Biol Psychiatry. 71 (4), 327-334 (2012).
- Wheeler, R. A., Carelli, R. M. The neuroscience of pleasure. Focus on 'Ventral pallidum firing codes hedonic reward: when a bad taste turns good. J Neurophysiol. 96 (5), 2175-2176 (2006).
- Bunin, M. A., et al. Release and uptake rates of 5-hydroxytryptamine in the dorsal raphe and substantia nigra reticulata of the rat brain. J Neurochem. 70 (3), 1077-1087 (1998).
- Zimmerman, J. B., Wightman, R. M. Simultaneous electrochemical measurements of oxygen and dopamine in vivo. Anal Chem. 63 (1), 24-28 (1991).
- Levy, A., et al. A novel procedure for evaluating the reinforcing properties of tastants in laboratory rats: operant intraoral self-administration. J Vis Exp. (84), e50956 (2014).
