Protocol
Toutes les expériences ont été menées selon les National Institutes of Health (NIH) Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvés par l'institutionnel soin et l'utilisation des animaux Comité l'Université de Yale (IACUC).
Préparatifs 1) Pré-chirurgicales
- Préparation de la solution orale
- Créer des solutions de 10% de saccharose et 0,005% de L-menthol dans de l'eau désionisée (pH 7,4). Conservez ces solutions dans des récipients fermés, à température ambiante, et refaire toutes les 2 semaines, pour éviter la dégradation.
- solutions d'étalonnage de l'électrode
- Assurez-tampon Tris (pH 7,4) à tout moment avant l'étalonnage. La solution se compose de 12,0 mM de Tris-HCl, 140 mM de NaCl, KCl 3,25 mM, CaCl2 1,20 mM, 1,25 mM NaH2PO4, 1,20 mM de MgCl2, et 2,00 mM de Na 2 SO 4.
- Créer une solution de réserve de la dopamine 10 mM (DA; chlorhydrate de dopamine) dans l'acide perchlorique 0,1 M. L'acide perchlorique prévient l'oxydation de la dopaminee. Conserver cette solution de stock à -20 ° C et utiliser jusqu'à 6 mois. Faire plusieurs aliquotes de la solution stock de DA pour le stockage à utiliser chaque aliquote qu'une seule fois.
- À partir du stock mM DA 10, des solutions diluées dans un tampon Tris à des concentrations de 1 uM, 500 nM, 250 nM, 125 nM, 62,5 nM, et 31,25 nM.
- Pour l'étalonnage de pH, préparer des solutions de tampon Tris avec le pH de 7,2, 7,3, 7,5, et 7,6. Cela permettra de fournir des solutions qui imitent des variations de pH qui peuvent survenir au cours de l'expérience in vivo.
- Fabrication de l'électrode
- Par aspiration sous vide, aspirer une fibre T-650 carbone (7 um de diamètre) dans un capillaire en verre de borosilicate (longueur 10 mm, diamètre extérieur 0,6 mm, diamètre intérieur 0,4 mm).
- Passer capillaire en verre rempli de fibres de carbone dans un extracteur électrode verticale. Pour les paramètres initiaux, mettre le chauffage à 55,0 et désactiver l'aimant. Cependant, outre l'optimisation peut être nécessaire à la fois de chauffage et les paramètres magnétiques varient from laboratoire à.
Remarque: L'électrode doit être d'au moins 5,5 cm de long (y compris cône) de sorte qu'il peut facilement se glisser dans le micromanipulateur et être inséré au moins 6,9 mm en dessous de la dure-mère dans le cerveau de rat. Si l'électrode est trop court, les enregistrements de partie ventrale du noyau accumbens ne seront pas réalisables. D'autre part, la longueur de l'électrode totale ne doit pas dépasser 6,5 cm sinon il sera trop long pour tenir dans le micromanipulateur. - L'utilisation d'un microscope optique, couper la liaison carbone-fibre exposée afin qu'elle se prolonge au-delà de 75 à 100 um de l'extrémité de la vitre. Vérifiez que l'électrode a une très serré, à peine perceptible, l'étanchéité entre l'électrode de verre et fibre de carbone, qui va produire un minimum de bruit pendant l'enregistrement ultérieur. Jeter l'électrode si il ya des fissures visibles dans le verre ou si le sceau est lâche, ce qui est indicatif d'un joint pauvres. Pour des instructions plus détaillées, voir [12] et [13].
- Assemblage de l'électrode dans le microromanipulator
- Obtenir un 3, fil de 30G qui est isolé sur la moitié de la longueur du fil et utiliser une petite brosse pour appliquer une fine couche d'argent peindre directement sur le fil. Immédiatement après l'application de peinture argentée, insérer le fil dans le trou sur le dessus de l'électrode pour fournir une connexion physique et électrique avec la fibre de carbone. Sous un microscope, veiller à ce que le fil d'argent en contact avec la fibre de carbone.
- Fixez le fil d'argent et électrode à l'aide micromanipulateur thermorétractable.
- Placer l'électrode en fibre de carbone préparé dans l'alcool isopropylique purifié (IPA) pendant au moins 10 minutes pour nettoyer la surface de l'électrode et pour augmenter la sensibilité à la suite de la dopamine. Après le trempage dans de l'IPA, rincer la fibre de carbone avec de l'eau du robinet pour enlever l'IPA.
- Référence fabrication de l'électrode
- Prenez un fil de 13 mm contenant de l'argent une participation d'environ 6 mm Ag / Ag Cl maille (7 mm fil d'argent seul, 6 mm mesh, 0,4 mm de diamètre),couper la partie d'argent vers le bas pour environ la moitié de sa longueur d'origine et souder la partie de l'argent du fil à une épinglette en or.
- Appliquez l'époxy sur la soudure sur la broche.
- Tremper l'Ag / Ag Cl mesh extrémité dans un copolymère de polytétrafluoroéthylène et de 5% de perfluoro-3,6-dioxa-4-méthyl-7octene-sulfonique 5 fois, avec des périodes de séchage par air 30 min entre chaque immersion.
- Permettre à l'enduit Ag / Ag Cl maille sécher à l'air O / N.
- Cure au four à 120 ° C pendant 1 h.
2) Chirurgie combinée intra et chirurgie intracrânienne Canulation (environ 75 min)
- Oral fabrication de cathéter
- Ajouter le cathéter par voie orale, et stériliser par stérilisation à l'oxyde d'éthylène, au moins 10 jours avant la chirurgie.
- Couper PE 100 tube dans 6 cm de long segments.
- L'utilisation d'un fer à souder, faire fondre une extrémité du tube de PE et immédiatement presser contre une surface solide pour refroidir le tuyau en PE. Le résultat devrait créerun petit disque plat à une extrémité de la tubulure PE et ne doit pas être bridé. Utiliser une aiguille (18 G) ou pousser la broche pour créer un trou dans le centre de ce disque.
- À l'autre extrémité du tube de PE, insérer confortablement l'extrémité émoussée d'une aiguille G 18 dans le tube.
- Utiliser une perforatrice de papier standard, punch plusieurs pièces circulaires d'une feuille de polytétrafluoroéthylène (3,18 mm d'épaisseur, 6 mm de diamètre) pour créer les rondelles de polytétrafluoroéthylène.
- Créer un trou dans le centre de la rondelle. Prenez l'aiguille fixée sur le tube PE et poussez-le à travers la rondelle. Une fois que l'aiguille est à travers, faire glisser la rondelle vers le bas du tube de PE de sorte qu'il soit à plat contre la rondelle.
- Chirurgie buccale
- Après la stérilisation des outils chirurgicaux, la canule (coupé à 2,5 mm en dessous du socle avant stérilisation), et l'électrode de référence, anesthésier le rat par une injection intraperitoneale de kétamine (100 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg).
- After 5 min, appliquer un test de stimulus nociceptif (de pied ou pincement de la queue) pour évaluer le niveau de l'anesthésie. Si le sujet montre aucune réaction physique à l'épreuve de stimulus nociceptif (flancher réponse, augmentation de la fréquence respiratoire ou cardiaque), administrer un coup de pouce de la kétamine de 10% à 15% de la dose initiale et répétez le protocole de stimulus nociceptif ci-dessus.
- Après le rat est totalement anesthésié et ne montre aucune réaction au test de stimulus nociceptif, utiliser tondeuses animales de se raser la fourrure du rat des yeux à environ 2 mm derrière les oreilles. Ensuite, placez le rat sur un coussin chauffant de recirculation de l'eau mince pour maintenir la température du corps pendant la chirurgie. Appliquer un lubrifiant oculaire. Administrer le médicament non stéroïdien anti-inflammatoire non stéroïdien (AINS), carprofène (5 mg / kg), par injection intraperitoneale avant d'effectuer des incisions et avant l'insertion de canules intra-orales. Utiliser une technique aseptique en tout temps.
- Appliquer la bétadine suivie par 70% d'éthanol pour nettoyer la peau. Répétez 3 fois.
- PlaCE du rat sur son dos, et d'ouvrir la bouche en utilisant un coton-tige stérile. Trouver la première molaire supérieure.
- Insérez l'aiguille dans le tissu entre la joue et la première molaire supérieure jusqu'à ce que l'aiguille sort juste derrière et médiale pour les oreilles.
- Pierce l'aiguille à travers la peau jusqu'à ce que le tube de PE sort de la peau et est accessible.
- Tirez sur la canule (préhension par la canule elle-même et non de l'aiguille) et fixer la rondelle de polytétrafluoroéthylène dans les molaires sorte que le cathéter reste en place.
REMARQUE: La coupe de la rondelle en forme de trapèze et la sécurisation contre les molaires avec le côté plat vers la joue rend cette étape plus facile. - Prenez un autre polytétrafluoroéthylène rondelle et faites-le glisser sur l'aiguille exposée, sur le tube en plastique, et buter contre l'incision.
- Pour sécuriser la rondelle de polytétrafluoroéthylène, utilisez du ruban stérilisé pour créer un "drapeau" triangulaire sorte que la rondelle ne glisse pas. Fixez le lavageer contre la peau du rat et de la bande stérilisée.
- Couper le cathéter exposé pour permettre à 2-4 cm de tube d'être exposée au-dessus de la tête du rat.
- Répétez les étapes 2.2.1 à 2.2.10 pour l'autre côté de la bouche.
- Après la stérilisation des outils chirurgicaux, la canule (coupé à 2,5 mm en dessous du socle avant stérilisation), et l'électrode de référence, anesthésier le rat par une injection intraperitoneale de kétamine (100 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg).
- La chirurgie intracrânienne pour voltammetry
- Placez le rat dans le cadre stéréotaxique et nettoyer le cuir chevelu de l'animal à l'aide d'un gommage deux de scène (un gommage de la bétadine suivi d'un gommage d'éthanol à 70%, jouer avec une répétition 3 du cycle).
- Utilisez stérilisés aiguilles pinces de nez et des ciseaux chirurgicaux pour couper une section de 15 x 15 mm de tissu cuir chevelu.
- Nettoyez délicatement la surface du crâne à l'aide stérilisés applicateurs de pointe de coton. En outre nettoyer le crâne en appliquant 2 à 3 gouttes de 3% de peroxyde d'hydrogène.
- Utilisez une perceuse stéréotaxique de faire 3 petits (1 mm de diamètre) trous dans le crâne pour l'insertion ultérieure de vis, 1 trou pour la canule de guidage, 1 trou pour l'électrode de stimulation, et 1 trou pour les élus de référencerode.
- Pour les enregistrements dans le noyau NAc, positionner la canule de guidage à 1,2 mm et 1,4 mm antérieure latérale Bregma. Abaisser le dispositif de canule jusqu'à ce que la base en plastique est aligné avec le crâne.
- Placer l'électrode de référence stérilisé dans l'hémisphère controlatéral à la canule de guidage. Abaissez la référence d'environ 2 mm sous la dure-mère.
- Placez le électrode de stimulation à 5,2 mm et 1,0 mm postérieure latérale Bregma et réduit 8,0 mm au-dessous dure pour cibler l'aire tegmentale ventrale (ATV).
- Utilisez un petit tournevis chirurgical stérilisé pour fixer les vis sur le crâne. Ensuite, insérez l'électrode de référence, électrode de stimulation, et de guider la canule. Enfin, fixez tous les composants en utilisant du ciment Cranioplastic.
- Pour les premières 48 heures de soins post-opératoires, administrer le non-stéroïdiens anti-inflammatoire non stéroïdien (AINS) Carprofène par injection sous-cutanée (5 mg / kg). Prévoyez au moins 1 semaine pour la récupération chirurgicale complète avant d'effectuer Voltamenregistrement métrie.
- Au cours de soins post-opératoires, cathéters orale quotidienne Rincer avec de l'eau. Fournir de la nourriture saturée en eau pendant 2 jours pour aider l'animal à mâcher et à manger. Assurer le suivi quotidiennement les signes potentiels de stress de la douleur (due à une infection bénigne ou déshydratation) et offrir des interventions appropriées qui sont nécessaires (y compris l'administration de fluides, l'administration topique des antiseptiques, et ou l'administration AINS Carprofène à 5 mg / kg).
3) Voltammetric Recordings dans Awake, se déplacer librement Rat
- Abaisser l'électrode et l'acquisition d'un ensemble d'apprentissage DA.
- Le jour de l'expérience, vérifier la perméabilité de la canule orale en infusant 200 pi d'eau et en observant les réponses oro-faciales (pour vérifier que le rat est goûtant l'eau).
- Attacher le FSCV headstage chez le rat par l'insertion, l'électrode de stimulation (sur la headstage) dans la stimulation bipolaire électrode Cannula (sur le rat). Ainsi, la headstage (miniaturisé convertisseur courant-tension) se connecte directement à la stimulation de l'électrode bipolaire.
- Retirer la canule factice à partir de l'appareil de canule et appliquer deux gouttes d'une solution d'héparine à 50% dans la canule. Ensuite, insérer doucement une canule factice (un peu plus longue que la canule fictive qui a été précédemment retiré) pour effacer les caillots de sang ou de la cicatrisation gliale qui se sont produites, qui briseront électrodes en fibre de carbone qui seront ensuite insérées pendant l'expérience. Elargir la canule utilisée pour dédouaner caillots 3-4 mm en dessous du crâne (au moins 2 mm au-dessus du site d'enregistrement).
- Insérez le micromanipulateur, avec l'électrode, dans la canule de guidage et de placer la bague oméga dans une position "verrouillée".
- Connectez le fil de l'électrode de référence de la headstage à la broche appropriée. Ensuite connecter le fil de travail de l'électrode du micromanipulateur au fil approprié sur le headstage.
- Abaisser les electrode à environ 4-4,5 mm en dessous de crâne.
- Utilisez un potentiostat pour appliquer une forme d'onde triangulaire (400 V / s, de -0,4 à 1,3 V). Appliquer la forme d'onde à l'électrode à 60 Hz pendant au moins 10 min, puis modifiez la fréquence d'application de forme d'onde à 10 Hz pour les enregistrements expérimentaux ultérieurs.
Remarque: L'application de forme d'onde étape 60 Hz produit une surface de fibre de carbone stable et aidera à prévenir la dérive électrique - Appliquer une stimulation électrique au VTA utilisant des fréquences différentes (de 10 à 60 Hz) des impulsions (10 à 30 impulsions) et des courants (50 à 150 uA), toutes avec une largeur d'impulsion de 2 ms / phase d'évoquer différentes concentrations de la libération de DA et le pH changements. Acquérir au moins 5 concentrations différentes de la libération de DA et 5 variations de pH différentes. Attendre (2 - 3 min minimum) entre les stimulations pour permettre le rechargement vésiculaire [14].
Remarque: Il est important d'obtenir des stimulations qui produisent des concentrations DA sur toute la gamme qui seront recueillies au cours de la suiteexpérience, car ils seront utilisés comme un ensemble de formation pour l'analyse en composante principale (voir rubrique 5.1). - Abaisser l'électrode dans le noyau NAc (6,3 mm ventral Dura). Par la suite abaisser l'électrode à 100 um incréments au sein du noyau jusqu'à ce que NAc DA événements de relâchement transitoire sont observées à des fréquences d'au moins 1 par minute.
- Connecter le tube (diamètre intérieur 1/32 ', diamètre extérieur 3/32 ") pour une seringue de 20 ml, relié à une pompe à seringue. À l'autre extrémité du tube, en utilisant une aiguille 23 G biseauté pour raccorder le tube à la canule du rat. Assurez-vous que le tube est complètement rempli de l'exhausteur de goût désiré et vérifier qu'aucune bulle existent dans le tube.
Remarque: En règle générale, d'administrer une petite quantité d'exhausteur de goût dans la bouche du rat avant l'enregistrement de sorte que le premier enregistrement pour perfusion délivre la totalité de perfusion et pas d'eau ou de l'air résiduel dans le tube. En outre, cela permet à l'animal de l'esprit d'avoir une certaine expérience préalableh l'exhausteur de goût depuis nouveaux sapides, même ceux appétitives, peut être aversif d'abord en raison de sa nouveauté. - Pour la collecte des données, infuser 200 pi d'exhausteur de goût (6,5 sec à l'aide d'une pompe et de tubes décrit précédemment). Infuser l'exhausteur de goût tous les 1-3 min. Infuser un total de 25 fois par exhausteur de goût. Chaque perfusion délivre 200 pi de solution.
- Si plusieurs sapides sont livrés en une seule expérience, rincer le cathéter par voie orale avec de l'eau après la collecte de données pour une exhausteur de goût et d'attendre au moins 20 minutes avant la perfusion de la nouvelle exhausteur de goût.
- Après la session d'enregistrement DA, se préparer à la vérification histologique par la création d'une petite lésion au niveau du site d'enregistrement. Afin de préserver l'électrode en fibre de carbone pour l'étalonnage ultérieur, rétracter la première électrode et retirer le micromanipulateur. Ensuite, utilisez une nouvelle micromanipulateur avec une micro-électrode de verre et un fil de tungstène (étendant 100 um au-delà de la pointe de verre) à la même profondeur (ci-dessous dure) que le f de carbone d'originemicroélectrodes iber.
- Pour la vérification histologique, créer une petite lésion en appliquant 3 V au fil de tungstène et l'augmentation de la tension à 1 V par incréments, toutes les 10 secondes, jusqu'à ce que le paramètre 10 V soit atteinte.
- Si une courbe de concentration standard a déjà été créé en utilisant de multiples électrodes en fibres de carbone, effectuer l'étape de lésion ci-dessus (03/01/14) en appliquant directement le potentiel de l'électrode en fibre de carbone.
Remarque: Cette méthode de lésion peut endommager la fibre de carbone et empêcher étalonnage ultérieur avec cette électrode spécifique. - Euthanasier l'animal en utilisant une injection létale de pentobarbital (150 mg / kg, ip).
- Déloger la coiffe de la canule en utilisant une pince en tirant vers le haut directement sur la coiffe. Ne tordez pas la coiffe car cela provoquera des dommages inutiles au cerveau et rendre difficile pour identifier l'emplacement de l'électrode lors de l'histologie.
- Retirez le cerveau et dans 4% de formol pendant 3 jours, suivie par 30% suCROSE pour 1 semaine. Créer 30 um tranches en utilisant un cryostat, monter sur des lamelles et d'examiner les tranches sous un microscope optique pour identifier l'emplacement de la fibre de carbone ou d'une lésion de tungstène.
Remarque: Perfusion est facultative pour 3.1.17.
- Retirez le cerveau et dans 4% de formol pendant 3 jours, suivie par 30% suCROSE pour 1 semaine. Créer 30 um tranches en utilisant un cryostat, monter sur des lamelles et d'examiner les tranches sous un microscope optique pour identifier l'emplacement de la fibre de carbone ou d'une lésion de tungstène.
4) Calibrage des électrodes
- Utilisation de la cellule d'écoulement pour créer un facteur de conversion courant-concentration.
- Afin de déterminer la sensibilité de l'électrode, calibrer électrodes après chaque expérience en utilisant un flux appareil "t-cellule». Abaisser l'électrode dans le "t-cellule», tandis que le tampon Tris, de pH des solutions, ou des solutions DA sont lavés sur la surface de l'électrode (à un taux de 2 ml / min). Utiliser un à six positions solénoïde d'air actionneur pour basculer entre le tampon et le pH ou la solution DA.
- Pour chaque étalonnage, recueillir des données voltamétriques pendant 5 sec application de tampon Tris (de base), suivie par 5 application sec de pH ou une solution DA, suivi par un 20 secpplication de tampon Tris (fichier totale de 30 sec). Répétez chaque course 3 fois pour chaque concentration étalon, contrebalançant entre les différentes concentrations de chaque norme.
- Pour chaque prélèvement d'échantillons, de mesurer le pic DA ou le courant de pH-évoquée. La moyenne du courant de crête dans chaque essai pour obtenir une concentration en fonction du rapport de courant de crête. Pour des instructions plus détaillées, voir [12] et [13].
5) Analyse de données
- L'utilisation d'un ensemble d'apprentissage en analyse en composantes principales (ACP)
Remarque: Au cours d'une expérience de voltamétrie, est produit en tant que sortie de courant, qui est le résultat de l'oxydation et de la réduction de la dopamine, des changements de pH, et le bruit électrochimique. PCA permet la séparation de ces facteurs de sorte que l'on peut isoler les composants souhaités (DA et pH) et supprimer des composants supplémentaires qui pourraient fausser les signaux souhaités (pour une description plus détaillée, voir 15, 16).- Attribuer un facteur d'étalonnage à THe courant de sortie (environ 5 à 10 nA / uM) pour permettre PCA après les valeurs de concentration des analytes à déterminer.
- Utilisez l'ensemble de la formation obtenue lors d'une expérience de «former» le modèle PCA de dissocier les DA, le pH et d'autres facteurs. PCA prend la formation mis voltammogrammes cycliques (recueillies dans la section 3.1.8) et détermine les caractéristiques essentielles du voltamogramme peuvent être utilisés pour identifier chaque analyte recueillies lors des enregistrements in vivo de voltampérométrie.
- Pour déterminer le nombre de composantes principales à garder, utiliser un test F Malinowski. Typiquement, ne garder que 2 ou 3 composantes principales qui expliquent normalement environ 95-99% de la variance dans les données. Pour plus de détails sur la mise en œuvre du test F Malinowski, voir 17.
Remarque: Une fois que le nombre de composants sont déterminées, l'analyse PCA sera effectivement projeter les voltammogrammes mesurées à partir de DA et de la formation de pH fixe sur les principaux éléments qui ont été retenus.Le résultat est un ensemble de données qui a été filtré de sorte que seule DA (ou pH) des données reste et les données résiduelle qui ne ressemble pas DA ou le pH est retirée (Voir résultats représentatifs pour la sortie attendue). Pour une explication plus détaillée et étape par étape instruction pour l'utilisation de l'APC pour l'analyse voltampérométrique voir fiche Matériaux et 16, 17.
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Representative Results
FSCV combinée avec l'implantation du cathéter intra-orale a été utilisé pour examiner comment le saccharose, un exhausteur de goût appétit, module la libération phasique DA dans le noyau du CNA. Avant la perfusion exhausteur de goût, la stimulation électrique (150 uA, 60 Hz, 24 impulsions; indiqué par la barre rouge) de l'ADV produit de fortes hausses dans la libération phasique DA dans le NAc (Figure 1) Figure 1 montre un tracé de couleur avec potentiel sur. l'axe des ordonnées, le temps sur l'axe des x, et le courant (comme représenté en fausses couleurs) sur l'axe des z. Ci-dessous, la parcelle de couleur est la concentration DA par rapport trace de temps. La concentration en fonction du temps a été déterminée en utilisant la trace de courant en fonction du temps au potentiel d'oxydation de la dopamine (indiqué par la ligne en pointillé blanc) qui a été converti en concentration, à la suite post-étalonnage de l'électrode. Cette concentration DA par rapport trace de temps a été utilisé dans le cadre de la formation prévue pour APC.
Après l'ensemble de la formation a été acquise, 25 perfusions de saccharose(10%, 200 pi par perfusion) ont reçu tous les 1-3 min. Des exemples de modulation de saccharose de la libération DA phasique sont présentés dans les figures 2 et 3. Dans la figure 2, la perfusion de 6,5 sec (indiqué par la barre rouge) produit une élévation de courant (indiqué par le blanc, flèche vers le bas) au potentiel d'oxydation de DA (indiqué par la ligne en pointillé blanc). Transformer les données en une concentration par rapport au tracé de temps après PCA vérifié que le courant a augmenté dans les réponses à l'exhausteur de goût est le résultat d'une augmentation de la concentration DA. Un autre exhausteur de goût, de menthol (0,005%, 200 pi par perfusion) a également été infusé pendant les enregistrements de FSCV dans le noyau du CNA. La figure 3 montre la concentration DA contre exemple du temps retrace intra orale de saccharose et de menthol, révélant une concentration accrue DA après la perfusion soit exhausteur de goût . Il faut attendre à voir un essai à la variabilité de la libération phasique DA à sapides (Figure 2 et 3A). Cependant, nous ne voyons pas habituellement les tendances non-spécifiques vers une augmentation ou une diminution de la libération phasique DA sur plusieurs essais. Gammes de 10 à 100 nM DA peuvent être attendus dans une expérience typique chez un seul animal.
Figure 1. parcelle Représentant de couleur (en haut) et la concentration en fonction parcelle de temps (en bas) de la libération évoquée électriquement DA dans le noyau du CNA. Barre rouge indique le temps de stimulation. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Représentant parcelle de couleur (en haut) et la concentration DA par rapport trace de temps (en bas) au cours d'une perfusion unique de saccharose. Rouge bar indique perfusion de 6,5 sec. Blanc vers le bas flèche vers indique en élévation actuelle (représentée en fausses couleurs) au potentiel d'oxydation de DA. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. concentration Représentant DA par rapport traces de temps durant (A) 10% de saccharose et (B) 0,005% de menthol par l'administration intra-orale. Barre rouge indique 6.5 sec perfusion intra-orale. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Livraison intra-orale combinée avec exhausteur de goût FSCV permet l'analyse du «temps réel» des réponses DA à aromatisants oraux. Il ya trois étapes critiques dans le protocole qui sont nécessaires pour les mesures DA succès. Tout d'abord, une bonne implantation du cathéter par voie orale est essentielle pour la réalisation des aromatisants. Veiller à ce que le cathéter est inséré derrière la première molaire et coincée en place empêche le cathéter de perdre la perméabilité et empêche le retrait accidentel par l'animal. Rinçage du cathéter pendant les quelques premiers jours après la récupération est également important, puisque la nourriture molle donné à l'animal pendant les 2 ou 3 premiers jours post-chirurgie pourrait obstruer le cathéter. En second lieu, la qualité de l'électrode est critique pour l'augmentation du rapport signal-sur-bruit dans un rat se déplacer librement. Dans certains cas, des électrodes qui apparaissent visuellement pour être de haute qualité et bon état peuvent encore donner des signaux bruyants. Une façon de résoudre ce problème est de prendre des enregistrements dans la base dOrsal striatum (4 mm en dessous de la dure-mère). Si l'électrode produit trop de bruit, l'électrode peut être enlevée et remplacée par une nouvelle électrode avant de réaliser l'expérience sur le site d'enregistrement de base NAc (6-7 mm sous la dure-mère). Une troisième étape critique est de trouver un lieu d'enregistrement approprié dans la région du cerveau ciblée, où DA événements spontanés de libération ("transitoires") sont observés à une fréquence suffisante (au moins 1 par minute) avec un accroissement suffisant de la concentration DA (au moins 20 nM à 40 nM). Cette optimisation permettra d'assurer que phasique DA événements de relâchement spontanées peuvent être détectés à un emplacement spécifique, avant l'administration aromatisant. L'abaissement de l'électrode par incréments équivalents à la taille de la fibre de carbone exposée (50-100 um) permet de maximiser les chances de trouver un site d'enregistrement de transitoires détectables.
Une mise en garde importante de FSCV est l'incapacité à déterminer la concentration de l'analyte absolue à un point dans le temps, depuis FSCV est un difrentiel technique qui mesure les variations relatives de concentration (par rapport à une ligne de base stable) au cours de chaque fichier d'enregistrement de voltampérométrie. Cependant, la technique différentielle permet également de quantification de sous-secondes fluctuations de la concentration de dopamine en réponse à la fois tastants récompenser et 5 aversifs. Dans le contexte de la dépendance à la nicotine, les additifs de produits du tabac, comme le menthol et orales édulcorants ont été montré, à influencer le comportement des fumeurs de 18 ans et ont été récemment interdit dans les cigarettes (sauf le menthol) par la famille fumeurs Tobacco Control Act prévention et. Ainsi, la livraison intra-orale en combinaison avec FSCV fournit un outil méthodologique important qui peut être utilisé pour examiner comment des agents aromatisants sur les produits de tabac peuvent altérer la signalisation de DA, et potentiellement les propriétés de renforcement de la nicotine.
Ici, nous avons décrit le procédé de combinaison de perfusion intra-orale avec FSCV exhausteur de goût dans le but de mesurer phasique DAlibérer en réponse à des stimuli primaires exhausteur de goût. Il est important de noter que tandis que notre technique permet l'examen de la libération phasique DA à tastants indépendants de l'action ou de choix, il est également possible que le caractère inattendu de la livraison d'exhausteur de goût pourrait influencer phasique libération de DA 19. Ainsi, une solution de contrôle approprié, tel que l'eau ou de la salive artificielle, peut être utilisé dans des expériences de contrôle de comparer et d'examiner les effets d'une récompense inattendue ou stimulus phasique sur la libération de DA indépendant de l'exhausteur de goût d'intérêt. Cependant, la technique ne se limite pas à des mesures soit de la libération de DA ou de récompense. Par exemple, les travaux antérieurs a examiné lors de la libération de norépinéphrine fois la récompense et l'aversion 20. Puisque les animaux ne sont pas facilement consomment tastants aversion perfusion intra-orale avec exhausteur de goût FSCV est la seule technique disponible pour mesurer la libération de DA phasique tastants aversif. Cependant, cette technique ne permet pas de déterminer si oui ou non un exhausteur de goût est aversif ouppetitive, plutôt, il suffit de mesurer la libération de DA lors de la consommation de l'exhausteur de goût. Afin de déterminer la valeur hédonique d'un exhausteur de goût, des tests comportementaux peuvent être incorporés à observer les réponses oro-faciales pendant goût réactivité (comme décrit par ailleurs 5, 21).
Il convient également de noter que FSCV est également adapté pour mesurer d'autres neurotransmetteurs importants, tels que la serotonine 22 et 23 de l'oxygène, mais des procédés pour l'enregistrement de ces analytes dans les animaux qui se déplacent librement, éveillés ne sont pas encore disponibles. En outre, avec le voltammetry combiné et la méthode intra-orale perfusion, la dopamine réponses en temps-verrouillé à la livraison exhausteur de goût peuvent être analysés en l'absence d'autres comportements, comme le comportement d'approche ou de récupération alimentaire, qui pourraient également affecter la libération de DA. Comme une application supplémentaire, la livraison de exhausteur de goût intra combinée et FSCV peut être idéal pour la mesure de la signalisation de DA à des événements de rétribution ou d'aversion au cours conditioni opérant ou pavlovienng. En effet, une récente publication JoVE par Levy et ses collègues combine la prestation de exhausteur de goût intra-orale avec comportement opérant pour déterminer si tastants intra-orales soutenir l'acquisition et l'entretien de comportement opérant auto-administration 24. Ainsi, de tels procédés peuvent également être combinés avec FSCV pour identifier réponse phasique de DA tastants orale pendant comportement.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stimulating electrode | PlasticsOne | MS303/2-A/SPC | when ordering, request a 22 mm cut below pedestal |
| Cannula for electrode | BioAnalytical Systems | MD-2251 | |
| Glass capillary | A-M systems | 624503 | |
| Carbon fiber | Thornel | T650 | |
| Electrode puller | Narishige International | PE-22 | |
| Neurolog stimulus isolator |  Digitimer Ltd. |
DS4 | |
| Heat shrink | 3M | FP-301 | |
| Insulated wires for electrodes | Squires electronics | Custom | L 3.000 x 1.000s x 1.000s UL1423 30/1 BLU |
| Micromanipulator | Univ. of Illinois at Chicago, Engineering Machine Shop | ||
| Epoxy | ITW Devcon | 14250 | "5 minute epoxy" |
| Copolymer of perfluoro-3,6-dioxa-4-methyl-7octene-sulfonic acid and tetrafluoroethylene | Ion Power | LQ-1105 | i.e., Nafion |
| Silver paint | GC Electronics | 22-023 | |
| Power supply | BK Precision | 9110 | |
| Tubing for intra-oral catheters | Intramedic | 427426 | PE 100, I.D. = 0.86 mm; O.D. = 1.52 mm |
| Tubing for intra-oral infusion | Fischer Scientific | 02-587-1A | I.D. 1/32"; O.D. 3/32" |
| Syringe pump for flow cell | Pump Systems Inc. | NE 1000 | |
| Surgical cement | Dentsply Caulk | 675571 and 675572 | |
| Air actuator | VICI | A60 | 6 position digital valve interface |
| Digital valve interface | VICI | DVI | 230 VAC |
| Quad headstage | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | ||
| UEI power supply | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | ||
| UEI breakout box | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | ||
| Power supply for tastant syringe pump | Med Associates | SG-504 | |
| Tastant syringe pump | Med Associates | PHM-107 | |
| Tungsten microelectrode | MicroProbes | WE30030.5A3 | |
| Silver wire reference with AgCl | InVivo Metric | E255A | |
| Sucrose | Sigma | 80497 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| Sodium chlroide | Sigma | S7653 | |
| Perchloric acid | Sigma | 244252 | |
| Hydrochloric acid (4 M) | Sigma | 54435 | |
| Soidum hydroxide | Sigma | 306576 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma | H1009 | |
| Dopamine hydrochloride | Sigma | H8502 | |
| TarHeel HDCV Software | University of North Carolina-Chapel Hill | Must request software: click here for link to software request page |
References
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