Protocol
Alle Experimente wurden nach den National Institutes of Health (NIH) Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und wurden von der Yale University Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) zugelassen.
1) Präoperative Vorbereitungen
- Lösung zum Einnehmen Vorbereitung
- Schaffen Lösungen von 10% Saccharose und 0,005% L-Menthol in entionisiertem Wasser (pH 7,4). Bewahren Sie diese Lösungen in geschlossenen Behältern bei Raumtemperatur, und Remake alle 2 Wochen, um den Abbau zu verhindern.
- Elektrode Kalibrierlösungen
- Machen Tris-Puffer (pH 7,4) zu jeder Zeit vor der Kalibrierung. Die Lösung besteht aus 12,0 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 3,25 mM KCl, 1,20 mM CaCl2, 1,25 mM NaH2PO4, 1,20 mM MgCl 2 und 2,00 mM Na 2 SO 4.
- Erstellen Sie eine Stammlösung von 10 mM Dopamin (DA; Dopamin-Hydrochlorid) in 0,1 M Perchlorsäure. Die Perchlorsäure verhindert Oxidation von Dopamine. Bewahren Sie diese Stammlösung bei -20 ° C und verwenden Sie für bis zu 6 Monaten. Machen Sie mehrere Teilmengen der DA-Stammlösung für die Lagerung zu jedem Aliquot nur einmal verwenden.
- Vom 10 mM DA Lager verdünnte Lösungen in Tris-Puffer zu einer Konzentration von 1 & mgr; M, 500 nM, 250 nM, 125 nM, 62,5 nM und 31,25 nM.
- Zur pH-Kalibrierung, die Lösungen TRIS-Puffer mit dem pH-Wert von 7,2, 7,3, 7,5 und 7,6. Dies liefert Lösungen, die pH-Verschiebungen, die während des in vivo-Experiment auftreten können, zu imitieren.
- Elektrodenherstellung
- Durch Vakuumansaugung absaugen einen T-650 Kohlenstoffaser (7 & mgr; m Durchmesser) in ein Borosilikatglas Kapillare (Länge 10 mm, Außendurchmesser 0,6 mm, Innendurchmesser 0,4 mm).
- Zeigen Glaskapillare mit Kohlefaser gefüllt in eine vertikale Elektrode Abzieher. Für Anfangsparameter, stellen Sie die Heizung auf 55,0 und schalten Sie den Magneten. Jedoch kann eine weitere Optimierung erforderlich sein, wie sowohl Heizung und Magnet Einstellungen variieren from Labor zu Labor.
Anmerkung: Die Elektrode sollte mindestens 5,5 cm lang sein (einschließlich Verjüngung), so dass es leicht in den Mikromanipulator passen und mindestens 6,9 mm unter Dura im Gehirn der Ratte eingesetzt werden. Wenn die Elektrode zu kurz ist, werden Aufnahmen von ventralen Abschnitt des Nucleus accumbens nicht erreichbar sein. Auf der anderen Seite ist die Gesamtelektrodenlänge sollte nicht 6,5 cm sonst überschreitet, wird es zu lang, um in den Mikromanipulator passen. - Verwendung eines Lichtmikroskops, schneiden die freiliegende Kohlefaser so daß es 75-100 & mgr; m über das Ende des Glases erstreckt. Überprüfen Sie, dass die Elektrode eine sehr enge, kaum erkennbar, Dichtung zwischen der Glaselektrode und Kohlenstofffaser, die minimales Rauschen bei der anschließenden Aufnahme produzieren wird. Entsorgen Sie die Elektrode, ob es irgendwelche merkliche Sprünge im Glas, oder wenn die Dichtung locker ist, was auf eine schlechte Abdichtung ist. Weitere detaillierte Anweisungen siehe [12] und [13].
- Montage der Elektrode in das Mikrofonromanipulator
- Besorgen Sie sich eine 3 in, 30G Draht, der entlang der Hälfte der Länge des Drahtes isoliert ist und eine kleine Bürste, um eine dünne Schicht aus Silber zu malen direkt auf den Draht. Unmittelbar nach dem Auftragen Silberfarbe, stecken Sie den Draht in die Öffnung an der Oberseite der Elektrode, um eine physikalische und elektrische Verbindung mit dem Kohlenstofffaser ist. Unter einem Mikroskop, dass der Silberdraht in Kontakt mit der Kohlenstofffaser.
- Sichern Sie den Silberdraht und die Elektrode an den Mikromanipulator mit Schrumpf.
- Legen Sie das vorbereitet Kohlefaserelektrode in gereinigtes Isopropylalkohol (IPA) für mindestens 10 Minuten, um die Elektrodenoberfläche zu reinigen und anschließende Empfindlichkeit zu Dopamin zu erhöhen. Nach dem Einweichen in IPA, spülen Sie die Kohlefaser mit Leitungswasser, um die IPA zu entfernen.
- Referenzelektrodenherstellung
- Nehmen Sie eine 13 mm Silberdraht, die ein etwa 6 mm Ag / Ag Cl mesh (7 mm Silberdraht allein, 6 mm mesh, Durchmesser 0,4 mm),schneiden Sie den Silberanteil auf etwa die Hälfte ihrer ursprünglichen Länge und löten die silberne Teil des Drahtes auf eine Gold-Stift.
- Bewerben Epoxy über das Lot auf den Stift.
- Tauchen die Ag / Ag Cl Netzende in ein Copolymer von 5% Polytetrafluorethylen und Perfluor-3,6-dioxa-4-methyl-7octene-sulfonsäure 5-fach, mit 30 min Lufttrocknung Perioden zwischen jedem Eintauchen.
- Lassen Sie den beschichtete Ag / Ag Cl Netz an der Luft trocknen O / N.
- Cure in Ofen bei 120 ° C für 1 Stunde.
2) Combined Intraoralchirurgie und intrakranielle Kanülierung Surgery (ca. 75 min)
- Oral Katheterherstellungs
- Machen Sie das orale Katheter, und sterilisieren von Ethylenoxid-Sterilisation, mindestens 10 Tage vor der Operation.
- Schneiden PE 100 Schlauch in 6 cm lange Segmente.
- Mit einem Lötkolben, Schmelz ein Ende des PE-Schlauch und drücken Sie sofort gegen eine feste Oberfläche, um die PE-Schlauch abkühlen. Das Ergebnis sollte zu erstelleneine kleine, flache Scheibe an einem Ende des PE-Schlauch und sollte nicht angeflanscht werden. Verwenden Sie eine Nadel (18 G) oder Push Pin, um ein Loch in der Mitte dieser Disc zu erstellen.
- Am anderen Ende des PE-Schlauch, eng einfügen das stumpfe Ende einer 18 G-Nadel in den Schlauch.
- Mit einem Standard-Papierloch Puncher, Punsch mehrere kreisförmige Stücke von einem Polytetrafluorethylen Folie (3,18 mm dick, 6 mm im Durchmesser), um Polytetrafluorethylen Unterlegscheiben erstellen.
- Erstellen Sie ein Loch in der Mitte der Scheibe. Nehmen Sie die Nadel auf die PE-Schlauch angebracht und schieben Sie es vollständig durch die Scheibe. Sobald die Nadel durch Schieben der Scheibe an der Unterseite der PE-Rohrleitung, so daß sie bündig gegen die Scheibe ist.
- Oralchirurgie
- Nach Sterilisieren des chirurgischen Werkzeugen, Kanüle (2,5 mm unter der Sockel vor der Sterilisation getrimmt) und der Referenzelektrode, betäuben die Ratte mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg).
- After 5 min, wenden Sie einen schädlichen Reiz Test (Fuß oder Schwanz pinch), um das Niveau der Narkose zu bewerten. Wenn sich das Motiv zeigt jede körperliche Reaktion auf die schädlichen Reiz Test (zusammenzucken Antwort, Erhöhung der Atem- oder Herzfrequenz), verwalten ein Ketamin Schub von 10% bis 15% der ursprünglichen Dosis und wiederholen Sie die obige schädlichen Reiz Protokoll.
- Nachdem die Ratten vollständig betäubt und zeigt keine Reaktion auf die schädlichen Reiz Test, verwenden Tierhaarschneidemaschinen, um fur die Ratte von den Augen bis etwa 2 mm hinter den Ohren zu rasieren. Dann legen Sie die Ratte auf einem dünnen Wasserumlauf Heizkissen auf Körpertemperatur während der Operation zu erhalten. Bewerben Auge Schmiermittel. Verwaltung des nicht-steroidale entzündungshemmende (NSAID) Arzneimittels, Carprofen (5 mg / kg) durch intraperitoneale Injektion der vor den Schnitten und vor dem Einbringen intraoraler Kanülen. Verwenden Sie aseptische Technik zu allen Zeiten.
- Bewerben betadine gefolgt von 70% Ethanol, um die Haut zu reinigen. 3 Mal wiederholen.
- PlaCE Das Ratte auf den Rücken, und öffnen Sie den Mund mit einem sterilen Wattestäbchen. Hier finden Sie die ersten oberen Molaren.
- Führen Sie die Nadel in das Gewebe zwischen der Wange und der ersten oberen Molaren, bis die Nadel austritt direkt hinter und medial in den Ohren.
- Pierce die Nadel durch die Haut, bis die PE-Schlauch verlässt die Haut und ist zugänglich.
- Ziehen Sie die Kanüle (Ergreifen durch die Kanüle selbst und nicht der Nadel), und sichern Sie das Polytetrafluorethylen Scheibe in die Backenzähne so dass der Katheter an Ort und Stelle bleibt.
Hinweis: Schnitt der Scheibe in eine Trapezform und sichern sie gegen die Backenzähne mit der flachen Seite der Wangenseite macht diesen Schritt erleichtern. - Nehmen wir ein anderes Polytetrafluorethylen Scheibe und schieben Sie sie über die freiliegende Nadel, auf der Kunststoffschlauch, und liegen an den Einschnitt.
- Um das Polytetrafluorethylen Scheibe zu sichern, verwenden sterilisiert Band um eine dreieckige "Flagge" zu schaffen, so dass die Scheibe nicht nach oben schieben. Sichern Sie den Wascher gegen die Haut der Ratte und dem sterilisierten Band.
- Schneiden Sie die freiliegenden Katheters zu erlauben 2-4 cm Schlauch an über dem Kopf der Ratte ausgesetzt werden.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.2.1 durch 2.2.10 für die andere Seite des Mundes.
- Nach Sterilisieren des chirurgischen Werkzeugen, Kanüle (2,5 mm unter der Sockel vor der Sterilisation getrimmt) und der Referenzelektrode, betäuben die Ratte mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg).
- Intrakranielle Chirurgie für die Voltammetrie
- Legen Sie die Ratte in der stereotaktischen Rahmen und reinigen Sie das Tier der Kopfhaut mit einem Zwei-Stufen-Peeling (eine betadine Peeling, gefolgt von einer 70% Ethanol-Peeling, führen Sie mit einem 3-Zyklus Wiederholung).
- Verwendung sterilisiert Spitz Pinzette und chirurgische Schere, eine 15 x 15 mm Abschnitt der Kopfhaut Gewebe wegzuschneiden.
- Die Oberfläche des Schädels mit sterilisierten Wattestäbchen Applikatoren reinigen sanft. Weitere Reinigung des Schädels, indem 2 bis 3 Tropfen 3% Wasserstoffperoxid.
- Verwenden Sie einen stereotaktischen Bohrer bis 3 kleinen (1 mm Durchmesser) Löcher in den Schädel für nachfolgende Einsetzen von Schrauben, 1 Loch für die Führungskanüle, 1 Loch für die Stimulationselektrode und 1 Bohrung für den Referenz Auserwählten machenritt.
- Für Aufnahmen im NAc Kern, positionieren Sie den Führungskanüle 1,2 mm vor und 1,4 mm lateral Bregma. Senken Sie die Kanüle Gerät, bis die Kunststoffbasis bündig mit dem Schädel.
- Legen Sie die sterilisiert Referenzelektrode in der Hemisphäre kontralateral zur Führungskanüle. Senken Sie die Referenz ca. 2 mm unterhalb der Dura.
- Positionieren Sie die Stimulationselektrode mit 5,2 mm posterior und 1,0 mm lateral zum Bregma und 8,0 mm abgesenkt unten dura, die ventralen Tegmentum (VTA) zielen.
- Verwenden Sie einen sterilisierten kleinen chirurgischen Schraubendreher Schrauben, um den Schädel zu sichern. Dann legen Sie die Referenzelektrode, Stimulationselektrode und Führungskanüle. Schließlich sichern Sie alle Komponenten mit cranioplastic Zement.
- Für die ersten 48 Stunden nach der post-operative Betreuung, zur Verwaltung der nicht-steroidalen Entzündungshemmer (NSAID) Carprofen durch subkutane Injektion (5 mg / kg). Lassen Sie mindestens 1 Woche für vollständige chirurgische Wiederherstellung vor der Durchführung voltamMetrie Aufnahme.
- Während der postoperativen Versorgung, Strom oral Katheter täglich mit Wasser. Liefern Nahrung in Wasser für 2 Tage gesättigt, um das Tier in das Kauen und Essen zu helfen. Bieten tägliche Überwachung für potenzielle Anzeichen von Stress Schmerzen (aufgrund der milden Infektion oder Dehydratation) und geeignete Interventionen wie nötig (einschließlich Verabreichung von Flüssigkeiten, die topische Anwendung von Antiseptika und oder NSAID Carprofen Verwaltung auf 5 mg / kg).
3) Voltammetric Recordings in Awake mit frei drehender Rat
- Das Absenken der Elektrode und den Erwerb einer DA Trainingssatz.
- Am Tag des Experiments, überprüfen Sie die Durchgängigkeit der Mundkanüle durch Infusion von 200 ul Wasser und beobachten orofacial Antworten (um sicherzustellen, dass die Ratte Verkostung der Wasser).
- Befestigen Sie die FSCV heads an die Ratte durch Einsetzen des Stimulationselektrode (auf der heads) in die bipolare Stimulationselektrode Cannula (in der Ratte). Somit ist die heads (miniaturisierte Strom-zu-Spannungs-Wandler) wird direkt an die bipolare Stimulationselektrode.
- Entfernen Sie die Dummy-Kanüle von der Kanülenvorrichtung und gelten zwei Tropfen 50% Heparin-Lösung in die Kanüle. Dann schieben Sie eine Dummy-Kanüle (etwas länger, dass die Dummy-Kanüle, die zuvor entfernt wurde) keine Blutgerinnsel oder Glia-Narben, die aufgetreten sind, die Kohlenstofffaser-Elektroden, die später während des Experiments eingesetzt werden brechen wird, um zu löschen. Verlängern Sie die Kanüle für das Clearing von Blutgerinnseln 3-4 mm unterhalb des Schädels (mindestens 2 mm über der Aufzeichnungs Website) verwendet wird.
- Setzen Sie den Mikromanipulator, mit Elektrode, in die Führungskanüle und legen Sie die Omega-Ring in einer Position "verriegelt".
- Die Bezugselektrode Draht von der heads an den entsprechenden Stift. Schließen Sie dann das Arbeitselektrodendraht aus dem Mikromanipulator an den entsprechenden Draht auf der heads.
- Senken Sie die electrode ca. 4-4,5 mm unterhalb Schädel.
- Verwenden Sie einen Potentiostaten, eine dreieckige Wellenform (400 V / s, -0,4 bis +1,3 V) Anwendung. Übernehmen Sie die Wellenform an die Elektrode bei 60 Hz für mindestens 10 min, dann ändern Sie die Wellenform-Anwendung Frequenz auf 10 Hz für die anschließende Versuchsaufnahmen.
Hinweis: Die 60 Hz-Wellenform-Anwendung Schritt eine stabile Kohlefaser-Oberfläche und beugt elektrischen Drift - Anwenden einer elektrischen Stimulation an den VTA mit verschiedenen Frequenzen (10-60 Hz) Impulsen (10 bis 30 Impulse) und Ströme (50 bis 150 & mgr; A), alle mit einer Impulsbreite von 2 ms / Phase, um verschiedene Konzentrationen von DA Freisetzung und pH hervorrufen Verschiebungen. Erfassen mindestens 5 verschiedenen Konzentrationen von DA Freisetzung und 5 verschiedenen pH-Verschiebungen. Warten (2 - 3 min Minimum) zwischen Stimulationen für vesikuläre Nachladen [14] ermöglichen.
Hinweis: Es ist wichtig, Stimulationen, die DA-Konzentrationen über den gesamten Bereich, der bei der anschließenden erhoben werden produzieren zu erhaltenExperiment, da sie als Trainingssatz für Hauptkomponentenanalyse (siehe Abschnitt 5.1) verwendet werden. - Senken Sie die Elektrode in den NAc Kern (6,3 mm ventral Dura). Anschließend senken die Elektrode in 100 & mgr; m-Schritten innerhalb des NAc Kern bis transiente DA Freigabeereignisse werden mit Frequenzen von mindestens 1 pro min beobachtet.
- Den Schlauch (Innendurchmesser 1/32 "Außendurchmesser 3/32") zu einer 20 ml Spritze mit einer Spritzenpumpe angebracht. Am anderen Ende des Rohres, mit einem abgeschrägten 23 G Nadel, um den Schlauch an der Ratte Kanüle zu verbinden. Sicherzustellen, dass der Schlauch vollständig mit dem gewünschten Geschmacksstoff gefüllt ist und zu überprüfen, dass keine Luftblasen in dem Schlauch vorhanden ist.
Hinweis: In der Regel verwalten eine kleine Menge an Geschmacksstoff in den Mund der Ratte vor der Aufzeichnung, um sicherzustellen, dass die erste Infusion für die Aufnahme liefert die volle Infusionsmenge und kein Restwasser oder Luft in der Röhre. Darüber hinaus ermöglicht diese das Tier etwas vorherige Erfahrung haben with die Geschmacksträger seit neuartigen Geschmacksstoffe, auch appetitive diejenigen, können aversive zunächst aufgrund seiner Neuheit. - Für die Datensammlung, ziehen 200 ul Geschmacksträger (6,5 sec mit Hilfe einer Pumpe und zuvor beschriebenen Schlauch). Infuse die Geschmacksträger alle 1-3 min. Infuse insgesamt 25-mal pro Geschmacksträger. Jede Infusion liefert 200 ul Lösung.
- Wenn mehrere Geschmacksstoffe werden in einem einzigen Experiment geliefert, spülen Sie die orale Katheter mit Wasser nach dem Sammeln von Daten für ein Geschmacksträger und warten Sie mindestens 20 Minuten vor der Infusion der neuen Geschmacksträger.
- Nach der DA Aufnahme-Session, die Vorbereitungen für die histologische Überprüfung durch die Schaffung einer kleinen Läsion an der Aufzeichnungsstelle. Um die Kohlenstofffaser-Elektrode für die nachfolgende Kalibrierung zu erhalten, zuerst die Elektrode zurückziehen und entfernen Sie den Mikromanipulator. Dann verwenden Sie eine neue Mikromanipulator mit einem Glas-Mikroelektrode und einem Wolframdraht (Verlängerung 100 um über die Glasspitze) auf die gleiche Tiefe (unten dura) wie das Original C-fiber Mikroelektrode.
- Zur histologischen Prüfung, erstellen Sie eine kleine Läsion durch die Anwendung 3 V an der Wolframdraht und die Erhöhung der Spannung bei 1 V-Schritten, alle 10 sec, bis die Einstellung 10 V erreicht ist.
- Wenn ein Standardkonzentrationskurve bereits mit mehreren Kohlefaserelektroden angelegt wurde, führen die Läsion obigen Schritt (3.1.14), die durch Anlegen des Potentials direkt die Carbonfaser-Elektrode ist.
Hinweis: Diese Methode wird die Läsion Kohlefaser beschädigen und verhindern spätere Kalibrierung mit diesem speziellen Elektrode. - Euthanize das Tier mit einer tödlichen Injektion Pentobarbital (150 mg / kg, ip).
- Verdrängen die Kopfhaube mit dem Kanülen mit einer Zange, indem Sie direkt nach oben auf der Kopfhaube. Nicht verdrehen headcap da dies unnötige Schädigung des Gehirns führen und machen es schwierig, die Position der Elektrode während der Histologie zu identifizieren.
- Entfernen Sie das Gehirn und in 4% Formalin für 3 Tage, gefolgt von 30% suCrose für 1 Woche. Erstellen Sie 30 um Scheiben mit einem Kryostaten, Mount auf Deckgläser und untersuchen Scheiben unter einem Lichtmikroskop, um die Position der Kohlenstofffaser oder Wolfram Läsion zu identifizieren.
Hinweis: Die Perfusion ist optional für 3.1.17.
- Entfernen Sie das Gehirn und in 4% Formalin für 3 Tage, gefolgt von 30% suCrose für 1 Woche. Erstellen Sie 30 um Scheiben mit einem Kryostaten, Mount auf Deckgläser und untersuchen Scheiben unter einem Lichtmikroskop, um die Position der Kohlenstofffaser oder Wolfram Läsion zu identifizieren.
4) Elektrodenkalibrierung
- Unter Verwendung der Durchflusszelle, um eine Stromkonzentration Umrechnungsfaktor zu erstellen.
- Um Elektrodenempfindlichkeit festzustellen, kalibrieren Elektroden nach jedem Versuch mit einem flow "t-cell" Gerät. Senken die Elektrode in die "T-Zelle", während Tris-Puffer, pH Lösungen oder DA-Lösungen werden über die Elektrodenoberfläche (mit einer Geschwindigkeit von 2 ml / min) gewaschen. Verwenden Sie ein Sechs-Position Luftmagnetantrieb zwischen Puffer und pH-Wert oder DA-Lösung hin und her schalten.
- Für jede Kalibrierungs sammeln voltammetrische Daten während 5 sec Anwendung Trispuffer (Baseline), gefolgt von 5 sec Anwendung pH oder DA-Lösung, gefolgt von 20 sec einpplication Tris-Puffer (30 sec gesamten Datei). Wiederholen Sie jeden Lauf 3-mal für jede Kalibrierungsstandardkonzentration, ein Gegengewicht zwischen verschiedenen Konzentrationen jeder Standard.
- Für jede Probe Sammlung, die Peak DA oder pH-evozierte Strom. Der Mittelwert der Spitzenstrom über jeden Versuch, eine Konzentration gegen die Spitzenstrom-Beziehung zu erhalten. Weitere detaillierte Anweisungen siehe [12] und [13].
5) Datenanalyse
- Unter Verwendung einer Ausbildung in der Hauptkomponentenanalyse gesetzt (PCA)
Anmerkung: Während einer Voltammetrie Experiment wird als Ausgangsstrom erzeugt wird, die das Ergebnis der Dopamin Oxidation und Reduktion, pH-Verschiebungen und elektrochemischen Rauschens ist. PCA ermöglicht die Trennung dieser Faktoren, so daß man die gewünschten Komponenten (DA und pH) zu isolieren und zu entfernen, zusätzliche Komponenten, die die gewünschten Signale verfälschen könnte (für eine ausführlichere Beschreibung siehe 15, 16).- Vergeben Sie einen Kalibrierungsfaktor zu the Ausgangsstrom (etwa 5-10 nA / uM) nach PCA zu ermöglichen Konzentrationswerte des Analyten zu bestimmen.
- Verwenden Sie den Trainingssatz erhalten während eines Experiments zu "trainieren" das PCA-Modell zu trennen DA, pH-Wert und anderen Faktoren. PCA nimmt der Trainingsmenge Cyclovoltammogramme (in Abschnitt 3.1.8 gesammelt) und legt fest, welche wesentlichen Merkmale des Voltammogramm kann verwendet werden, um jeden Analyten während in vivo-Voltammetrie Aufnahmen gesammelt zu identifizieren.
- Um die Anzahl der Hauptkomponenten zu halten zu bestimmen, verwenden Sie ein Malinowski F-Test. In der Regel halten nur 2 oder 3 Hauptkomponenten, die normalerweise in den Daten erklären etwa 95-99% der Varianz. Zur weiteren Diskussion über die Umsetzung der Malinowski F-Test, siehe 17.
Hinweis: Wenn die Anzahl der Komponenten bestimmt werden, die PCA-Analyse effektiv wird die Mess Voltammogramme von DA zu projizieren und pH Ausbildung setzt auf die Hauptkomponenten, die gewählt worden wäre.Das Ergebnis ist ein Datensatz, der gefiltert worden ist, so daß nur DA (oder pH) Daten verbleiben und die Restdaten, die nicht gleicht DA oder pH entfernt wird (Siehe Repräsentative Ergebnisse für erwartete Ausgang). Für eine weitere detaillierte Erklärung und Schritt für Schritt Anleitung für die Verwendung von PCA für die voltammetrische Analyse siehe Materialien Blatt und 16, 17.
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Representative Results
FSCV kombiniert mit intraoralen Katheterimplantation wurde verwendet, um zu prüfen, wie Saccharose, eine appetitive Geschmacksträger moduliert phasic DA Freisetzung im NAc Kern. Vor der Geschmacksträger Infusion, elektrische Stimulation (150 & mgr; A, 60 Hz, 24 Impulse; durch den roten Balken gekennzeichnet) der VTA produziert robuste Anstieg der phasischen DA Freisetzung im NAc (Abbildung 1) Abbildung 1 zeigt eine Farb Grundstück mit Potenzial auf. die y-Achse, die Zeit auf der x-Achse, und Strom (als Falschfarben dargestellt) auf der z-Achse. Unterhalb der Farb Grundstück ist DA-Konzentration über der Zeit. Konzentrations-Zeit wurde unter Verwendung des Stroms als Funktion der Zeitspur bei dem Oxidationspotential von Dopamin bestimmt die Konzentration überführt wurde, nach Post-Kalibrierung der Elektrode (durch gestrichelte weiße Linie angedeutet). Das DA-Konzentration über der Zeit wurde als Teil der Ausbildung für PCA eingestellt verwendet.
Nach der Trainingssatz übernommen wurde, 25 Infusionen von Saccharose(10%, 200 ul pro Infusion) wurden alle 1-3 min angegeben. Beispiele der Saccharose Modulation phasischen DA Freisetzung sind in den 2 und 3 gezeigt ist. In Figur 2 wird die 6,5 sec Infusion (durch den roten Balken angedeutet) erzeugt ein Höhen in Strom (durch den weißen, nach unten weisenden Pfeil angedeutet) an der Oxidationspotential von DA (der weiße gestrichelte Linie angedeutet). Transformieren der Daten in einer Konzentration gegenüber der Zeit nach dem PCA überprüft, ob der erhöhte Strom in Reaktion auf die Geschmacksstoff ist das Ergebnis einer Erhöhung der DA-Konzentration. Eine andere Geschmacksträger, Menthol (0,005%, 200 ul pro Infusion) wurde auch während FSCV Aufnahmen im NAc Kern infundiert. Figur 3 zeigt DA-Konzentration als Funktion der Zeit Beispiel wird zur intraoralen Saccharose und Menthol, enthüllt erhöht DA-Konzentration nach Infusion von Geschmacksstoff . Man sollte erwarten, dass einige Versuch zu Versuch Variabilität in phasischen DA Freisetzung in Geschmacksstoffe (Abbildung 2 und 3A) zu sehen. Allerdings haben wir in der Regel nicht sehen, keine nicht-spezifischen Trends in Richtung einer Zunahme oder Abnahme der phasischen DA Freisetzung über mehrere Studien. Reicht von 10 bis 100 nM DA kann in einem typischen Versuch bei einem Tier zu erwarten.
Abbildung 1. Representative Farb Grundstück (oben) und Konzentrations-Zeit-Grundstück (unten) aus elektrisch evozierte DA Freisetzung im NAc Kern. Red Balken zeigt Stimulationszeit. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Repräsentative Farb Grundstück (oben) und DA-Konzentration über der Zeit (unten) während einer einzigen Infusion von Saccharose. Red bar zeigt 6,5 sec Infusion. Weiß nach unten weisenden Pfeil zeigt in Ansicht in der aktuellen (in Falschfarben dargestellt) an der Oxidationspotential von DA. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Representative DA Konzentrations-Zeit-Spuren während (A) 10% Saccharose und (B) 0,005% Menthol durch intraorale Verabreichung. Red Balken zeigt 6,5 sec intraorale Infusion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Intraorale Geschmacksträger Lieferung kombiniert mit FSCV ermöglicht die Analyse von "real-time" DA antwortet mündlich Geschmacksstoffe. Es gibt drei kritische Schritte in dem Protokoll, das für eine erfolgreiche DA Messungen erforderlich sind. Erstens ist die richtige Implantation der mündlichen Katheter kritisch für die Lieferung von Geschmacksstoffen. Sicherzustellen, dass der Katheter hinter der ersten molaren gesteckt und eingeklemmt verhindert den Katheter verlieren Durchgängigkeit und verhindert ein versehentliches Entfernen von dem Tier. Spülen des Katheters während der ersten Tage nach der Wiederherstellung ist auch wichtig, da die weiche Nahrung an das Tier während der ersten 2 bis 3 Tage nach der Operation gegeben könnte den Katheter verstopfen. Zweitens, ist die Qualität des Elektroden kritisch für zunehmende Signal-Rausch-Verhältnis in einer sich frei bewegenden Ratten. In einigen Fällen, Elektroden, die visuell scheinen von hoher Qualität und gutem Zustand kann noch geben laute Signale sein. Ein Weg, um dieses Problem zu beheben ist, um Grundlinien Aufnahmen im d nehmenØrsal Striatum (4 mm unterhalb Dura). Wenn die Elektrode erzeugt viel Lärm kann die Elektrode entfernt und durch eine neue Elektrode vor der Durchführung des Versuchs in der NAc Kernaufnahmestelle (6-7 mm unterhalb dura) ersetzt werden. Ein dritter wichtiger Schritt ist die Suche nach einem geeigneten Aufzeichnungs Lage in der gezielten Gehirnregion, wo spontane DA Freisetzung Ereignisse ("Transienten") werden bei einer ausreichenden Frequenz (mindestens 1 pro min) mit einer ausreichenden Erhöhung der DA-Konzentration (mindestens 20 nM beobachtet bis 40 nM). Diese Optimierung wird sichergestellt, dass spontane phasische DA Freisetzung Veranstaltungen finden Sie unter bestimmten Ort, vor der Geschmacksstoff Verabreichung nachgewiesen werden. Absenken der Elektrode, die in einer Schrittweite von der Grße der freiliegenden Kohlenstofffaser (50-100 um) maximiert die Chancen, eine Aufzeichnungsstelle mit nachweisbaren Transienten.
Eine wichtige Einschränkung des FSCV ist die Unfähigkeit, absolute Analytkonzentration bei einem Zeitpunkt zu bestimmen, da FSCV eine difrenz Technik, die relative Konzentration ändert bei jedem Voltammetrie Aufnahmedatei misst (im Vergleich zu einer stabilen Basislinie). Allerdings erlaubt die Differentialtechnik auch für die Quantifizierung der Unter zweiten Schwankungen Dopamin-Konzentration als Reaktion auf interessant und aversive tastants 5. Im Zusammenhang mit der Nikotinabhängigkeit, Tabakprodukt Zusätze wie Menthol und mündlichen Süßstoffe, haben gezeigt, dass das Rauchverhalten 18 beeinflussen und wurden kürzlich in Zigaretten von der Familie Smoking Prevention und Anti-Tabak-Gesetz verboten (außer Menthol). Somit intraoralen Lieferung in Kombination mit FSCV stellt ein wichtiges Werkzeug, das die methodischen verstärkenden Eigenschaften von Nikotin verwendet werden kann, um zu prüfen, wie Tabakprodukt Geschmacksstoffe können DA-Signalisierung zu verändern und möglicherweise.
Hier haben wir das Verfahren der Kombination intraoralen Geschmacksstoff Infusion FSCV für die Zwecke der Messung der phasischen DA beschriebenloslassen Reaktion auf Grundgeschmacksträger Reize. Es ist wichtig zu beachten, dass während unsere Technik ermöglicht die Untersuchung der phasischen DA Freisetzung in tastants unabhängig von Aktion oder Auswahl, ist es auch möglich, dass die unerwartete Natur der Geschmacksträger Liefer könnte phasic DA Release 19 zu beeinflussen. Somit kann eine geeignete Steuerungslösung, wie Wasser oder künstlichem Speichel, kann in Kontrollexperimenten verwendet werden, um zu vergleichen und untersuchen die Auswirkungen einer unerwarteten Belohnung oder Anreiz auf phasische DA Freisetzung unabhängig von der Geschmacksträger von Interesse sein. Allerdings ist die Technik nicht, um entweder Messungen der DA Freisetzung oder Lohn begrenzt. Zum Beispiel hat Vorarbeiten Norepinephrin-Freisetzung während sowohl Belohnung und Abneigung 20 untersucht. Da Tiere nicht leicht zu konsumieren aversive tastants intraorale Geschmacksträger Infusion mit FSCV ist die einzige Technik zur Messung der phasischen DA Freisetzung in aversiven Geschmacksstoffe zur Verfügung. Allerdings ist diese Technik nicht bestimmen, ob oder ob nicht ein Geschmacksstoff ist oder eine aversiveppetitive vielmehr einfach misst DA Freisetzung während des Verbrauchs der Geschmacksstoff. Um die hedonische Wert eines Geschmacksträger zu ermitteln, können Verhaltenstests integriert werden, um orofazialer Reaktionen während Geschmack Reaktivität zu beobachten (wie an anderer Stelle 5, 21 beschrieben).
Es sollte auch beachtet werden, dass FSCV eignet sich auch zur Messung anderer wichtiger Neurotransmittern, wie Serotonin 22 und Sauerstoff 23, aber Verfahren zur Erfassung dieser Analyten an wachen, frei beweglichen Tieren sind noch nicht verfügbar ist. Zudem sind mit kombinierten Voltammetrie und intraorale Infusionsverfahren, zeitlich gesperrt Dopamin antwortet Geschmacksstoff Lieferung kann in Abwesenheit von anderen Verhaltensweisen wie Anfahrverhalten oder Nahrungs Retrieval, die auch beeinflussen könnten DA Freisetzung analysiert werden. Als zusätzliche Anwendung können kombiniert intraorale Geschmacksträger Lieferung und FSCV ideal zur Messung DA-Signalisierung zu belohnen oder aversive Ereignisse während oder operante Pawlow conditioning. In der Tat, eine aktuelle JoVE Publikation von Levy und Kollegen kombiniert intra-orale Geschmacksträger Lieferung mit operantes Verhalten zu bestimmen, ob die intraorale tastants unterstützt den Erwerb und die Aufrechterhaltung des operanten Selbstverwaltung Verhalten 24. Daher können solche Verfahren auch bei FSCV kombiniert werden, um phasische DA Reaktion auf orale tastants während Verhalten zu identifizieren.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stimulating electrode | PlasticsOne | MS303/2-A/SPC | when ordering, request a 22 mm cut below pedestal |
| Cannula for electrode | BioAnalytical Systems | MD-2251 | |
| Glass capillary | A-M systems | 624503 | |
| Carbon fiber | Thornel | T650 | |
| Electrode puller | Narishige International | PE-22 | |
| Neurolog stimulus isolator |  Digitimer Ltd. |
DS4 | |
| Heat shrink | 3M | FP-301 | |
| Insulated wires for electrodes | Squires electronics | Custom | L 3.000 x 1.000s x 1.000s UL1423 30/1 BLU |
| Micromanipulator | Univ. of Illinois at Chicago, Engineering Machine Shop | ||
| Epoxy | ITW Devcon | 14250 | "5 minute epoxy" |
| Copolymer of perfluoro-3,6-dioxa-4-methyl-7octene-sulfonic acid and tetrafluoroethylene | Ion Power | LQ-1105 | i.e., Nafion |
| Silver paint | GC Electronics | 22-023 | |
| Power supply | BK Precision | 9110 | |
| Tubing for intra-oral catheters | Intramedic | 427426 | PE 100, I.D. = 0.86 mm; O.D. = 1.52 mm |
| Tubing for intra-oral infusion | Fischer Scientific | 02-587-1A | I.D. 1/32"; O.D. 3/32" |
| Syringe pump for flow cell | Pump Systems Inc. | NE 1000 | |
| Surgical cement | Dentsply Caulk | 675571 and 675572 | |
| Air actuator | VICI | A60 | 6 position digital valve interface |
| Digital valve interface | VICI | DVI | 230 VAC |
| Quad headstage | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | ||
| UEI power supply | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | ||
| UEI breakout box | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | ||
| Power supply for tastant syringe pump | Med Associates | SG-504 | |
| Tastant syringe pump | Med Associates | PHM-107 | |
| Tungsten microelectrode | MicroProbes | WE30030.5A3 | |
| Silver wire reference with AgCl | InVivo Metric | E255A | |
| Sucrose | Sigma | 80497 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| Sodium chlroide | Sigma | S7653 | |
| Perchloric acid | Sigma | 244252 | |
| Hydrochloric acid (4 M) | Sigma | 54435 | |
| Soidum hydroxide | Sigma | 306576 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma | H1009 | |
| Dopamine hydrochloride | Sigma | H8502 | |
| TarHeel HDCV Software | University of North Carolina-Chapel Hill | Must request software: click here for link to software request page |
References
- Roitman, M. F., et al. Dopamine operates as a subsecond modulator of food seeking. J Neurosci. 24 (6), 1265-1271 (2004).
- Aragona, B. J., et al. Regional specificity in the real-time development of phasic dopamine transmission patterns during acquisition of a cue-cocaine association in rats. European Journal of Neuroscience. 30 (10), 1889-1899 (2009).
- Wheeler, R. A., et al. Cocaine cues drive opposing context-dependent shifts in reward processing and emotional state. Biol Psychiatry. 69 (11), 1067-1074 (2011).
- Wickham, R. J., et al. Advances in studying phasic dopamine signaling in brain reward mechanisms. Front Biosci (Elite Ed). 5, 982-999 (2013).
- Roitman, M. F., et al. Real-time chemical responses in the nucleus accumbens differentiate rewarding and aversive stimuli). Nature Neuroscience. 11 (12), 1376-1377 (2008).
- Cheer, J. F., et al. Phasic dopamine release evoked by abused substances requires cannabinoid receptor activation. J Neurosci. 27 (4), 791-795 (2007).
- Owesson-White, C. A., et al. Neural encoding of cocaine-seeking behavior is coincident with phasic dopamine release in the accumbens core and shell. Eur J Neurosci. 30 (6), 1117-1127 (2009).
- Phillips, P. E., et al. Subsecond dopamine release promotes cocaine seeking. Nature. 422 (6932), 614-618 (2003).
- Chen, C., et al. Levels of mint and wintergreen flavorants: smokeless tobacco products vs. confectionery products. Food Chem Toxicol. 48 (2), 755-763 (2010).
- Manning, K. C., Kelly, K. J., Comello, M. L. Flavoured cigarettes, sensation seeking and adolescents' perceptions of cigarette brands. Tob Control. 18 (6), 459-465 (2009).
- Rainey, C. L., Conder, P. A., Goodpaster, J. V. Chemical characterization of dissolvable tobacco products promoted to reduce harm. J Agric Food Chem. 59 (6), 2745-2751 (2011).
- Phillips, P. E., et al. Real-time measurements of phasic changes in extracellular dopamine concentration in freely moving rats by fast-scan cyclic voltammetry. Methods Mol Med. 79, 443-464 (2003).
- Robinson, D. L., Wightman, R. M. Rapid Dopamine Release in Freely Moving Rats. Electrochemical Methods for Neuroscience. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2007).
- Montague, P. R., et al. Dynamic gain control of dopamine delivery in freely moving animals. J Neurosci. 24 (7), 1754-1759 (2004).
- Heien, M. L., Johnson, M. A., Wightman, R. M. Resolving neurotransmitters detected by fast-scan cyclic voltammetry. Anal Chem. 76 (19), 5697-5704 (2004).
- Keithley, R. B., Heien, M. L., Wightman, R. M. Multivariate concentration determination using principal component regression with residual analysis. Trends Analyt Chem. 28 (9), 1127-1136 (2009).
- Keithley, R. B., Carelli, R. M., Wightman, R. M. Rank estimation and the multivariate analysis of in vivo fast-scan cyclic voltammetric data. Anal Chem. 82 (13), 5541-5551 (2010).
- Rising, J. P., et al. Healthy Young Adults: description and use of an innovative health insurance program. J Adolesc Health. 41 (4), 350-356 (2007).
- Day, J. J., et al. Associative learning mediates dynamic shifts in dopamine signaling in the nucleus accumbens. Nature Neuroscience. 10 (8), 1020-1028 (2007).
- Park, J., et al. Catecholamines in the bed nucleus of the stria terminalis reciprocally respond to reward and aversion. Biol Psychiatry. 71 (4), 327-334 (2012).
- Wheeler, R. A., Carelli, R. M. The neuroscience of pleasure. Focus on 'Ventral pallidum firing codes hedonic reward: when a bad taste turns good. J Neurophysiol. 96 (5), 2175-2176 (2006).
- Bunin, M. A., et al. Release and uptake rates of 5-hydroxytryptamine in the dorsal raphe and substantia nigra reticulata of the rat brain. J Neurochem. 70 (3), 1077-1087 (1998).
- Zimmerman, J. B., Wightman, R. M. Simultaneous electrochemical measurements of oxygen and dopamine in vivo. Anal Chem. 63 (1), 24-28 (1991).
- Levy, A., et al. A novel procedure for evaluating the reinforcing properties of tastants in laboratory rats: operant intraoral self-administration. J Vis Exp. (84), e50956 (2014).
