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Behavior

जाग चूहे में इंट्रा-मौखिक Tastant प्रशासन के दौरान फास्ट स्कैन चक्रीय Voltammetry के साथ तेजी से डोपामिन गतिशीलता की परीक्षा

Published: August 12, 2015 doi: 10.3791/52468
Automatic Translation
1, 2, 3, 1,3,4
1Interdepartmental Neuroscience Program, Yale University, 2Department of Biotechnical and Clinical Laboratory Sciences, School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo, 3Department of Psychiatry, Yale School of Medicine, 4Department of Cellular and Molecular Physiology, Yale School of Medicine

Protocol

सभी प्रयोगों प्रयोगशाला पशु की देखभाल और उपयोग के लिए स्वास्थ्य (एनआईएच) गाइड के राष्ट्रीय संस्थान के अनुसार आयोजित की गई और येल विश्वविद्यालय संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया।

1) पूर्व शल्य तैयारी

  1. मौखिक समाधान तैयारी
    1. 10% sucrose और विआयनीकृत पानी में 0.005% एल मेन्थॉल (7.4 पीएच) का समाधान बनाएँ। आरटी पर, बंद कंटेनर में इन समाधान की दुकान, और गिरावट को रोकने के लिए, हर 2 सप्ताह रीमेक।
  2. इलेक्ट्रोड अंशांकन समाधान
    1. अंशांकन करने से पहले किसी भी समय Tris बफर (7.4 पीएच) बनाते हैं। समाधान 12.0 मिमी Tris-एचसीएल, 140 मिमी NaCl, 3.25 मिमी KCl, 1.20 मिमी CaCl2, 1.25 मिमी NaH2PO4, 1.20 मिमी 2 MgCl, और 2.00 मिमी ना 2 अतः 4 के होते हैं।
    2. 0.1 एम परक्लोरिक एसिड में; 10 मिमी डोपामाइन (डोपामाइन हाइड्रोक्लोराइड डीए) के एक शेयर के समाधान बनाएँ। परक्लोरिक एसिड dopamin के ऑक्सीकरण रोकने में मदद करता हैई। -20 डिग्री सेल्सियस पर इस शेयर के समाधान की दुकान और ऊपर से 6 महीने के लिए इस्तेमाल करते हैं। केवल एक बार प्रत्येक विभाज्य का उपयोग करने के भंडारण के लिए महंगाई भत्ते शेयर समाधान के कई aliquots बनाओ।
    3. 10 मिमी डीए स्टॉक से, 1 माइक्रोन, 500 एनएम, 250 एनएम, 125 एनएम, 62.5 एनएम, और 31.25 एनएम की सांद्रता के Tris बफर में समाधान पतला।
    4. पीएच अंशांकन के लिए, Tris का समाधान 7.2, 7.3, 7.5, और 7.6 के पीएच के साथ बफर तैयार करते हैं। इस vivo में प्रयोग के दौरान हो सकता है कि पीएच पारियों कि नकल समाधान प्रदान करेगा।
  3. इलेक्ट्रोड निर्माण
    1. वैक्यूम सक्शन करके, (व्यास 0.4 मिमी अंदर, लंबाई 10 मिमी, व्यास के बाहर 0.6 मिमी) एक borosilicate ग्लास केशिका में एक टी-650 कार्बन फाइबर (7 माइक्रोन व्यास) aspirate।
    2. एक ऊर्ध्वाधर इलेक्ट्रोड खींचने में कार्बन फाइबर के साथ भरा गिलास केशिका रखें। प्रारंभिक मापदंडों के लिए, 55.0 के लिए हीटर सेट और चुंबक बंद कर देते हैं। हीटर और चुंबकीय सेटिंग्स दोनों fr के अलग-अलग हो लेकिन, जैसा कि आगे अनुकूलन आवश्यक हो सकता हैप्रयोगशाला में ओम लैब।
      नोट: इलेक्ट्रोड यह आसानी से micromanipulator में फिट कर सकते हैं और चूहे के मस्तिष्क में ड्यूरा नीचे कम से कम 6.9 मिमी डाला जा इतना है कि (शंकु सहित) कम से कम 5.5 सेमी लंबा होना चाहिए। इलेक्ट्रोड बहुत छोटा है, नाभिक accumbens के उदर भाग से रिकॉर्डिंग प्राप्त नहीं होगा। दूसरी ओर, कुल इलेक्ट्रोड लंबाई यह micromanipulator में फिट करने के लिए बहुत देर हो जाएगी अन्यथा 6.5 सेमी से अधिक नहीं होना चाहिए।
    3. यह कांच के अंत से परे 75-100 माइक्रोन फैली तो यह है कि एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, उजागर कार्बन फाइबर काटा। इलेक्ट्रोड बाद रिकॉर्डिंग के दौरान कम से कम शोर का उत्पादन होगा, जो कांच इलेक्ट्रोड और कार्बन फाइबर, के बीच एक बहुत तंग है, मुश्किल से प्रत्यक्ष, सील किया गया है कि जाँच करें। एक गरीब मुहर का संकेत है जो गिलास में या सील ढीली है अगर किसी भी ध्यान देने योग्य दरारें, अगर वहाँ इलेक्ट्रोड त्यागें। अधिक विस्तृत निर्देश [12] और [13] देखें।
  4. Mic में इलेक्ट्रोड कोडांतरणromanipulator
    1. तार की आधी लंबाई के साथ अछूता रहता है कि एक 3, में 30G तार प्राप्त करें और चांदी की एक पतली परत तार करने के लिए सीधे रंग लागू करने के लिए एक छोटा सा ब्रश का उपयोग करें। इसके तत्काल बाद चांदी के रंग लगाने के बाद, कार्बन फाइबर के लिए एक शारीरिक और बिजली कनेक्शन प्रदान करने के लिए इलेक्ट्रोड के शीर्ष पर छेद में तार डालने। एक खुर्दबीन के नीचे, चांदी के तार कार्बन फाइबर के साथ संपर्क में आता है कि यह सुनिश्चित करने के।
    2. हटना गर्मी का उपयोग कर micromanipulator के लिए चांदी के तार और इलेक्ट्रोड सुरक्षित।
    3. इलेक्ट्रोड सतह को साफ करने के लिए और डोपामाइन के लिए बाद में संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए कम से कम 10 मिनट के लिए शुद्ध isopropyl शराब (आईपीए) में तैयार कार्बन फाइबर इलेक्ट्रोड रखें। आईपीए में भिगोने के बाद, आईपीए दूर करने के लिए पानी के नल के साथ कार्बन फाइबर कुल्ला।
  5. संदर्भ इलेक्ट्रोड निर्माण
    1. , एक लगभग 6 मिमी / एजी एजी सीएल मेष (अकेले 7 मिमी चांदी के तार, 6 मिमी जाल, 0.4 मिमी व्यास) युक्त एक 13 मिमी चांदी के तार ले लोनीचे लगभग आधे अपने मूल लंबाई करने के लिए चांदी के हिस्से में कटौती और एक सोने की पिन के लिए तार की चांदी भाग सम्मिलित करना।
    2. पिन पर मिलाप से अधिक epoxy लागू।
    3. एजी डुबकी / एजी सीएल 5% Polytetrafluroethylene और एक copolymer में अंत जाल perfluoro-3,6-dioxa-4-मिथाइल-7octene-सल्फोनिक प्रत्येक डुबकी के बीच 30 मिनट हवा सुखाने समय के साथ एसिड 5 बार।
    4. लेपित एजी / एजी सीएल शुष्क हवा हे / एन करने के लिए जाल की अनुमति दें।
    5. 1 घंटे के लिए 120 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में इलाज।

2) संयुक्त Intraoral सर्जरी और intracranial केन्युलेशन सर्जरी (लगभग 75 मिनट)

  1. ओरल कैथेटर निर्माण
    1. मौखिक कैथेटर बनाओ, और कम से कम 10 दिनों सर्जरी से पहले, इथाइलीन ऑक्साइड नसबंदी द्वारा बाँझ।
    2. 6 सेमी लंबे समय खंडों में पीई 100 ट्यूबिंग काटें।
    3. एक टांका लगाने का यंत्र का उपयोग करना, पीई ट्यूबिंग के एक छोर पिघल और तुरंत पीई ट्यूबिंग शांत करने के लिए एक ठोस सतह के खिलाफ दबाएँ। परिणाम बनाने चाहिएएक छोटी सी, फ्लैट पीई ट्यूबिंग के एक छोर पर डिस्क और flanged नहीं किया जाना चाहिए। एक सुई (18 जी) का उपयोग करें या इस डिस्क के बीच में एक छेद बनाने के लिए पिन धक्का।
    4. पीई ट्यूबिंग के दूसरे छोर पर, आराम से ट्यूब में एक 18 जी सुई की कुंद अंत डालें।
    5. एक मानक कागज छेद छेदने का उपयोग करना, Polytetrafluroethylene वाशर बनाने के लिए (3.18 मिमी मोटी, व्यास में 6 मिमी) एक Polytetrafluroethylene चादर के कई परिपत्र टुकड़े पंच।
    6. वॉशर के बीच में एक छेद बना। पीई ट्यूबिंग से जुड़ी सुई ले लो और वॉशर के माध्यम से पूरी तरह से धक्का। सुई के माध्यम से एक बार यह वॉशर के खिलाफ फ्लश है, इसलिए है कि पीई ट्यूबिंग की तह तक वॉशर स्लाइड।
  2. ओरल सर्जरी
    1. (नसबंदी से पहले कुरसी से नीचे 2.5 मिमी के लिए छंटनी की) सर्जिकल उपकरण, प्रवेशनी, और संदर्भ इलेक्ट्रोड स्टरलाइज़ के बाद, Ketamine (100 मिलीग्राम / किग्रा) और xylazine (10 मिलीग्राम / किग्रा) की intraperitoneal इंजेक्शन के साथ चूहे anesthetize।
      1. वायु सेनाआतंकवाद 5 मिनट, संज्ञाहरण के स्तर का आकलन करने के लिए एक हानिकारक प्रोत्साहन टेस्ट (पैर या पूंछ चुटकी) लागू होते हैं। विषय हानिकारक प्रोत्साहन परीक्षण करने के लिए किसी भी शारीरिक प्रतिक्रिया से पता चलता है, (श्वसन या दिल की दर में प्रतिक्रिया, वृद्धि विमुख होना) मूल खुराक के 15% से 10% की एक ketamine को बढ़ावा देने के लिए प्रशासन और ऊपर हानिकारक प्रोत्साहन प्रोटोकॉल दोहराएँ।
    2. चूहा पूरी तरह से anesthetized है और हानिकारक उत्तेजना परीक्षण करने के लिए कोई प्रतिक्रिया से पता चलता है के बाद, कान के पीछे के बारे में 2 मिमी आँखों से चूहा फर दाढ़ी बनाने के लिए पशु बाल कतरनी का उपयोग करें। तब सर्जरी के दौरान शरीर का तापमान बनाए रखने के लिए एक पतली पानी रीसर्क्युलेटिंग हीटिंग पैड पर चूहा जगह है। नेत्र स्नेहक लागू करें। पहले किसी भी चीरों प्रदर्शन करने के लिए और पूर्व intraoral cannulas डालने के लिए intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा गैर स्टेरायडल विरोधी भड़काऊ (NSAID) दवा, Carprofen (5 मिलीग्राम / किग्रा), प्रशासन। हर समय सड़न रोकनेवाला तकनीक का प्रयोग करें।
    3. त्वचा को साफ करने के लिए 70% इथेनॉल के द्वारा पीछा betadine के लागू करें। 3 बार दोहराएं।
    4. पीएलएअपनी पीठ पर चूहे सीई, और एक बाँझ कपास झाड़ू का उपयोग कर मुंह खोलें। पहले ऊपरी दाढ़ का पता लगाएं।
    5. सुई बस के पीछे से बाहर निकालता है, जब तक गाल और पहली ऊपरी दाढ़ के बीच ऊतक में सुई डालने और कानों को औसत दर्जे का।
    6. पियर्स पीई ट्यूबिंग जब तक त्वचा के माध्यम से सुई त्वचा से बाहर निकालता है और सुलभ है।
    7. (प्रवेशनी ही है और न सुई से उत्साहित) प्रवेशनी पर पुल और कैथेटर जगह में रहता है, ताकि दाढ़ में Polytetrafluroethylene वॉशर सुरक्षित।
      नोट: आसान इस कदम बनाता है एक trapezoid आकार में वॉशर काटना और गाल का सामना करना पड़ फ्लैट पक्ष के साथ दाढ़ के खिलाफ इसे हासिल।
    8. एक और Polytetrafluroethylene वॉशर ले लो और प्लास्टिक टयूबिंग नीचे, उजागर सुई से अधिक स्लाइड, और चीरा के खिलाफ abut।
    9. वॉशर स्लाइड नहीं करता है, ताकि एक त्रिकोणीय "झंडा" बनाने के लिए निष्फल टेप का उपयोग करें, Polytetrafluroethylene वॉशर सुरक्षित। धोने सुरक्षितचूहे की त्वचा और निष्फल टेप के खिलाफ एर।
    10. ट्यूबिंग के 2-4 सेमी चूहे के सिर के ऊपर उजागर करने की अनुमति देने के लिए सामने आ कैथेटर काटें।
    11. दोहराएँ मुंह के दूसरे पक्ष के लिए 2.2.10 के माध्यम से 2.2.1 कदम।
  3. Voltammetry के लिए Intracranial सर्जरी
    1. (3 चक्र पुनरावृत्ति के साथ प्रदर्शन, एक 70% इथेनॉल हाथ धोने के बाद betadine रगडें) stereotaxic फ्रेम में चूहे प्लेस और एक दो चरण में हाथ धोने का उपयोग कर पशु के सिर को साफ।
    2. खोपड़ी के ऊतकों की एक 15 x 15 मिमी अनुभाग दूर काटने के लिए निष्फल सुई नाक चिमटी और शल्य कैंची का प्रयोग करें।
    3. धीरे निष्फल कपास टिप applicators का उपयोग कर खोपड़ी की सतह को साफ। इसके अलावा 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड के 2 से 3 बूँदें लागू करने के द्वारा खोपड़ी साफ।
    4. संदर्भ चुनाव के लिए शिकंजा के बाद प्रविष्टि के लिए खोपड़ी में 3 छोटे (1 मिमी व्यास) छेद, गाइड प्रवेशनी के लिए 1 छेद, उत्तेजक इलेक्ट्रोड के लिए 1 छेद, और 1 छेद करने के लिए एक stereotaxic ड्रिल का उपयोगसवारी की।
    5. एनएसी कोर में रिकॉर्डिंग के लिए, 1.2 मिमी पूर्वकाल में गाइड प्रवेशनी स्थिति और 1.4 मिमी शीर्षस्थान के लिए पार्श्व। प्लास्टिक के आधार खोपड़ी से भरा है जब तक प्रवेशनी तंत्र को कम करें।
    6. गाइड प्रवेशनी गोलार्द्ध प्रतिपक्षी में निष्फल संदर्भ इलेक्ट्रोड रखें। संदर्भ ड्यूरा नीचे लगभग 2 मिमी कम है।
    7. 5.2 मिमी पीछे और शीर्षस्थान के लिए 1.0 मिमी पार्श्व में उत्तेजक इलेक्ट्रोड स्थिति और उदर टेगमेंटल क्षेत्र (वीटीए) को लक्षित करने ड्यूरा नीचे 8.0 मिमी उतारा।
    8. खोपड़ी के लिए शिकंजा सुरक्षित करने के लिए एक निष्फल छोटे शल्य पेचकश का प्रयोग करें। फिर, इलेक्ट्रोड उत्तेजक, संदर्भ इलेक्ट्रोड डालें, और प्रवेशनी गाइड। अंत में, cranioplastic सीमेंट का उपयोग कर सभी घटकों सुरक्षित।
    9. पोस्ट ऑपरेटिव केयर के पहले 48 घंटे के लिए, चमड़े के नीचे इंजेक्शन (5 मिलीग्राम / किग्रा) द्वारा गैर स्टेरायडल विरोधी भड़काऊ दवा (NSAID) Carprofen प्रशासन। पूर्व voltam प्रदर्शन करने के लिए पूरी तरह शल्य चिकित्सा वसूली के लिए कम से कम 1 सप्ताह की अनुमति देंmetry रिकॉर्डिंग।
      1. पोस्ट ऑपरेटिव केयर के दौरान, दैनिक पानी के साथ फ्लश मौखिक कैथेटर। चबाने और खाने में पशु सहायता करने के लिए 2 दिनों के लिए पानी में संतृप्त भोजन उपलब्ध कराने के। (कारण हल्के संक्रमण या निर्जलीकरण के लिए) दर्द के तनाव के संभावित लक्षण के लिए दैनिक निगरानी प्रदान और आवश्यक के रूप में उपयुक्त हस्तक्षेप प्रदान (तरल पदार्थ के प्रशासन, दवाइयों की सामयिक प्रशासन सहित, और या NSAID Carprofen प्रशासन 5 मिलीग्राम / किग्रा से कम)।

3) जाग में voltammetric रिकॉर्डिंग, स्वतंत्र रूप से चलती चूहा

  1. इलेक्ट्रोड को कम करने और एक डीए प्रशिक्षण सेट प्राप्त।
    1. प्रयोग के दिन, पानी की 200 μl infusing और orofacial प्रतिक्रियाएं देख द्वारा मौखिक प्रवेशनी की प्रत्यक्षता जाँच (चूहा पानी चखने है सत्यापित करने के लिए)।
    2. द्विध्रुवी उत्तेजक इलेक्ट्रोड cannu में (headstage पर) उत्तेजक इलेक्ट्रोड डालने से चूहे को FSCV headstage संलग्न करेंलुइसियाना (चूहे पर)। इस प्रकार, headstage (वर्तमान से वोल्टेज कनवर्टर छोटी) द्विध्रुवी उत्तेजक इलेक्ट्रोड से सीधे जोड़ता है।
    3. प्रवेशनी तंत्र से डमी प्रवेशनी निकालें और प्रवेशनी में 50% हेपरिन समाधान की दो बूँदें लागू होते हैं। फिर धीरे बाद में प्रयोग के दौरान डाला जाएगा कि कार्बन फाइबर इलेक्ट्रोड टूट जाएगा जो हुआ हो सकता है कि किसी भी खून के थक्के या glial जख्म, खाली करने के लिए (पहले हटा दिया गया था कि डमी प्रवेशनी कि अब थोड़ा) एक डमी प्रवेशनी डालें। (कम से कम 2 मिमी रिकॉर्डिंग साइट से ऊपर) खोपड़ी के नीचे के थक्के 3-4 मिमी समाशोधन के लिए इस्तेमाल किया प्रवेशनी बढ़ाएँ।
    4. गाइड प्रवेशनी में, इलेक्ट्रोड के साथ, micromanipulator डालें और एक "बंद" की स्थिति में ओमेगा अंगूठी जगह है।
    5. उपयुक्त पिन करने के लिए headstage से संदर्भ बिजली तार कनेक्ट करें। तब headstage पर उचित तार करने के लिए micromanipulator से काम कर रहे बिजली तार कनेक्ट।
    6. चुनाव लोअरखोपड़ी के नीचे लगभग 4-4.5 मिमी के लिए trode।
    7. एक त्रिकोणीय तरंग (400 v / s, -0.4 को 1.3 वी) लागू करने के लिए एक potentiostat का प्रयोग करें। फिर बाद में प्रयोगात्मक रिकॉर्डिंग के लिए 10 हर्ट्ज के लिए तरंग आवेदन आवृत्ति बदलने के लिए, कम से कम 10 मिनट के लिए 60 हर्ट्ज पर इलेक्ट्रोड के लिए तरंग लागू करें।
      नोट: 60 हर्ट्ज तरंग आवेदन कदम के लिए एक स्थिर कार्बन फाइबर सतह का उत्पादन और बिजली के बहाव को रोकने में मदद मिलेगी
    8. डीए जारी है और पीएच के विभिन्न सांद्रता पैदा करने के लिए, सभी 2 एमएस / चरण के पल्स चौड़ाई के साथ वीटीए विभिन्न आवृत्तियों दालों (10 से 30 दालों) और धाराओं (50 से 150 μA) (10 हर्ट्ज से 60) का उपयोग करने के लिए बिजली की उत्तेजना लागू करें पाली। डीए रिहाई के कम से कम 5 अलग अलग सांद्रता और 5 अलग अलग पीएच पारियों मोल। Vesicular reloading [14] के लिए अनुमति देने के लिए stimulations के बीच - (3 मिनट न्यूनतम 2) प्रतीक्षा करें।
      नोट: यह बाद के दौरान एकत्र किया जाएगा कि संपूर्ण रेंज भर में डीए सांद्रता है कि उत्पादन stimulations प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैवे प्रमुख घटक विश्लेषण (खंड 5.1 देखें) के लिए एक प्रशिक्षण सेट के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा के बाद से प्रयोग।
    9. एनएसी कोर (ड्यूरा के लिए 6.3 मिमी उदर) में इलेक्ट्रोड कम करें। क्षणिक डीए रिहाई की घटनाओं मिनट के अनुसार कम से कम 1 की आवृत्तियों पर मनाया जाता है जब तक इसके बाद एनएसी कोर के भीतर 100 माइक्रोन वेतन वृद्धि में इलेक्ट्रोड कम है।
    10. एक सिरिंज पंप से जुड़ी एक 20 मिलीलीटर सिरिंज, टयूबिंग (भीतरी व्यास 1/32 ", बाहरी व्यास 3/32") से कनेक्ट करें। ट्यूब के दूसरे छोर पर, चूहे प्रवेशनी टयूबिंग कनेक्ट करने के लिए एक beveled 23 जी सुई का उपयोग करें। ट्यूबिंग वांछित tastant के साथ पूरी तरह से भर जाता है और सुनिश्चित करें कि कोई बुलबुले ट्यूबिंग में मौजूद सत्यापित करें कि।
      नोट: आमतौर पर, पूर्व रिकॉर्डिंग के लिए पहला निषेचन पूर्ण अर्क राशि और नहीं ट्यूबिंग में किसी भी अवशिष्ट पानी या हवा से बचाता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए रिकॉर्डिंग करने के लिए चूहे के मुंह में tastant की एक छोटी राशि प्रशासन। इसके अलावा, यह कुछ पूर्व के अनुभव बुद्धि पास करने के लिए जानवरों की अनुमति देता हैएच उपन्यास tastants के बाद से tastant, यहां तक ​​कि भूख बढ़ाने वाले, इसकी वजह से नवीनता के लिए शुरू में प्रतिकूल हो सकता है।
    11. डेटा संग्रह के लिए, tastant के 200 μl (6.5 एक पंप का उपयोग कर सेक और पहले से वर्णित ट्यूबिंग) दिखे। Tastant हर 1-3 मिनट दिखे। Tastant प्रति 25 बार की कुल दिखे। प्रत्येक आसव समाधान के 200 μl बचाता है।
    12. कई tastants एक ही प्रयोग में दिया जा रहा है, एक tastant के लिए डेटा इकट्ठा करने के बाद पानी के साथ मौखिक कैथेटर फ्लश और नए tastant infusing पहले कम से कम 20 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
    13. डीए रिकॉर्डिंग सत्र के बाद, रिकॉर्डिंग स्थल पर एक छोटा सा घाव बनाने के द्वारा ऊतकीय सत्यापन के लिए तैयार करते हैं। बाद में अंशांकन के लिए कार्बन फाइबर इलेक्ट्रोड की रक्षा करने के लिए, पहली इलेक्ट्रोड वापस लेना और micromanipulator हटा दें। तब मूल कार्बन च के रूप में (ड्यूरा नीचे) एक ही गहराई तक एक गिलास microelectrode और (कांच टिप परे 100 माइक्रोन विस्तार) एक टंगस्टन तार के साथ एक नया micromanipulator का उपयोगiber microelectrode।
    14. 10 वी सेटिंग तक पहुँच जाता है ऊतकीय सत्यापन के लिए, टंगस्टन तार पर 3 वी लागू करने और 1 वी वेतन वृद्धि पर वोल्टेज में वृद्धि से हर 10 सेकंड में एक छोटा सा घाव पैदा करते हैं।
    15. एक मानक एकाग्रता वक्र पहले से ही कई कार्बन फाइबर इलेक्ट्रोड का उपयोग कर बनाया गया है, तो सीधे संभावित कार्बन फाइबर इलेक्ट्रोड लगाने से (3.1.14) के ऊपर घाव कदम प्रदर्शन करते हैं।
      नोट: यह घाव विधि कार्बन फाइबर को नुकसान पहुंचा और कहा कि विशिष्ट इलेक्ट्रोड के साथ बाद अंशांकन कर पाएगा।
    16. एक घातक इंजेक्शन pentobarbital (150 मिलीग्राम / किग्रा, आईपी) का उपयोग कर पशु euthanize।
    17. Headcap पर सीधे ऊपर की ओर खींच कर सरौता का उपयोग कर cannulae साथ headcap हटाना। यह मस्तिष्क को अनावश्यक नुकसान होता है और यह चुनौतीपूर्ण ऊतक विज्ञान के दौरान इलेक्ट्रोड के स्थान की पहचान करने के लिए कर देगा के बाद से headcap मोड़ मत करो।
      1. 30% सु द्वारा पीछा 3 दिनों के लिए 4% formalin में मस्तिष्क और जगह निकालें1 सप्ताह के लिए crose। एक cryostat का उपयोग कर 30 माइक्रोन स्लाइस बनाने के लिए कार्बन फाइबर या टंगस्टन घाव के स्थान की पहचान करने के लिए एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत स्लाइस कवर फिसल जाता है पर माउंट और जांच करते हैं।
        नोट: छिड़काव 3.1.17 के लिए वैकल्पिक है।

4) इलेक्ट्रोड कैलिब्रेशन

  1. एक मौजूदा एकाग्रता रूपांतरण कारक बनाने के लिए प्रवाह सेल का उपयोग करना।
    1. इलेक्ट्रोड संवेदनशीलता का निर्धारण करने के लिए, एक प्रवाह "टी-सेल 'तंत्र का उपयोग करते हुए एक प्रयोग के बाद इलेक्ट्रोड जांचना। Tris बफर, पीएच समाधान, या डीए समाधान (2 मिलीग्राम / मिनट की दर से) इलेक्ट्रोड सतह पर धो रहे हैं, जबकि "टी-सेल 'में इलेक्ट्रोड कम करें। बफर और पीएच या डीए समाधान के बीच आगे और पीछे स्विच करने के लिए एक छह स्थिति हवा solenoid के प्रवर्तक का प्रयोग करें।
    2. प्रत्येक अंशांकन के लिए, 20 सेकंड एक के द्वारा पीछा किया, पीएच या डीए समाधान के 5 सेकंड के आवेदन के बाद Tris बफर (आधारभूत) के 5 सेकंड के आवेदन के दौरान voltammetric डेटा एकत्रTris बफर (30 सेकंड कुल फ़ाइल) की pplication। प्रत्येक मानक के विभिन्न सांद्रता के बीच counterbalancing, प्रत्येक अंशांकन मानक एकाग्रता के लिए प्रत्येक रन 3 बार दोहराएं।
    3. प्रत्येक नमूना संग्रह के लिए, शिखर डीए या पीएच पैदा वर्तमान उपाय। मौजूदा शिखर संबंध बनाम एक एकाग्रता प्राप्त करने के लिए प्रत्येक परीक्षण भर में मौजूदा शिखर औसत। अधिक विस्तृत निर्देश [12] और [13] देखें।

5) डेटा विश्लेषण

  1. प्रमुख घटक विश्लेषण में सेट एक प्रशिक्षण का उपयोग करना (पीसीए)
    ध्यान दें: एक Voltammetry प्रयोग के दौरान, उत्पादन डोपामाइन ऑक्सीकरण और कमी, पीएच परिवर्तन, और विद्युत शोर का परिणाम है, जो वर्तमान के रूप में निर्मित है। एक वांछित घटकों (डीए और पीएच) को अलग करने और वांछित संकेतों को विकृत हो सकता है कि अतिरिक्त घटकों को दूर कर सकते हैं ताकि पीसीए (एक अधिक विस्तृत विवरण के लिए, 15, 16 देखें) इन कारकों में से जुदाई की अनुमति देता है।
    1. वें करने के लिए एक अंशांकन कारक असाइन करेंई उत्पादन चालू पीसीए के बाद (लगभग 5-10 एनए / माइक्रोन) analytes की एकाग्रता मूल्यों को निर्धारित किया जा करने के लिए अनुमति देने के लिए।
    2. "ट्रेन" पीसीए मॉडल डीए, पीएच, और अन्य कारकों को अलग करने के लिए एक प्रयोग के दौरान प्राप्त प्रशिक्षण सेट का प्रयोग करें। पीसीए चक्रीय voltammograms सेट प्रशिक्षण (धारा 3.1.8 में एकत्र) लेता है और voltammogram की आवश्यक विशेषताओं में विवो Voltammetry रिकॉर्डिंग के दौरान एकत्र प्रत्येक विश्लेष्य की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो निर्धारित करता है।
    3. रखने के लिए प्रमुख घटकों की संख्या निर्धारित करने के लिए, एक Malinowski एफ परीक्षण का उपयोग करें। आमतौर पर, सामान्य रूप से डेटा में विचरण के बारे में 95-99% की व्याख्या जो केवल 2 या 3 प्रमुख घटक रहते हैं। Malinowski एफ परीक्षण को लागू करने पर आगे चर्चा के लिए, 17 को देखते हैं।
      नोट: घटकों की संख्या निर्धारित कर रहे हैं एक बार, पीसीए विश्लेषण प्रभावी ढंग से महंगाई भत्ते से मापा voltammograms परियोजना जाएगा और पीएच प्रशिक्षण बरकरार रखा गया है कि प्रमुख घटकों पर सेट करता है।परिणाम (उम्मीद उत्पादन के लिए प्रतिनिधि परिणाम देखें) केवल महंगाई भत्ते (या पीएच) के आंकड़ों बनी हुई है और महंगाई भत्ते जैसे लगते हैं या पीएच नहीं करता है कि अवशिष्ट डेटा निकाल दिया जाता है, ताकि फ़िल्टर कर दिया गया है कि एक डेटा सेट है। Voltammetric विश्लेषण के लिए पीसीए का उपयोग करने के लिए कदम अनुदेश द्वारा एक और विस्तृत विवरण और कदम के लिए सामग्री चादर और 16, 17 देखें।

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Representative Results

Intraoral कैथेटर आरोपण के साथ संयुक्त FSCV कैसे सुक्रोज, एक भूख बढ़ाने वाला tastant जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, एनएसी कोर में phasic डीए रिहाई modulates। Tastant आसव, बिजली की उत्तेजना से पहले। वीटीए की (150 μA, 60 हर्ट्ज, 24 दालों लाल पट्टी द्वारा इंगित) 1 चित्रा एनएसी (चित्रा 1) में phasic डीए विज्ञप्ति में मजबूत बढ़ जाती है का उत्पादन क्षमता पर के साथ एक रंग साजिश से पता चलता है जेड अक्ष पर शाफ़्ट, एक्स-अक्ष पर समय है, और वर्तमान (झूठी रंग के रूप में प्रतिनिधित्व)। रंग प्लाट नीचे समय का पता लगाने बनाम डीए एकाग्रता है। समय बनाम एकाग्रता डोपामाइन का ऑक्सीकरण क्षमता पर वर्तमान बनाम समय का पता लगाने का उपयोग कर निर्धारित किया गया था इलेक्ट्रोड के बाद अंशांकन निम्नलिखित एकाग्रता के लिए परिवर्तित कर दिया गया है, जो (धराशायी सफेद लाइन द्वारा इंगित)। समय का पता लगाने बनाम इस दा एकाग्रता पीसीए के लिए निर्धारित प्रशिक्षण के हिस्से के रूप में इस्तेमाल किया गया था।

सुक्रोज का प्रशिक्षण सेट का अधिग्रहण किया गया था के बाद, 25 सुई लेनी(10%, संचार प्रति 200 μl) हर 1-3 मिनट दिए गए थे। Phasic डीए रिहाई की सूक्रोज मॉडुलन के उदाहरण आंकड़े 2 और 3 में दिखाया गया है। चित्रा 2 में, (लाल पट्टी द्वारा इंगित) 6.5 सेकंड अर्क ऑक्सीकरण क्षमता से कम (सफेद, नीचे का सामना करना पड़ तीर द्वारा संकेत) वर्तमान में एक पदोन्नति का उत्पादन महंगाई भत्ते की (सफेद धराशायी लाइन ने संकेत दिया)। पीसीए tastant के लिए प्रतिक्रियाओं में वृद्धि की मौजूदा महंगाई भत्ते एकाग्रता में वृद्धि का परिणाम है कि सत्यापित करने के बाद समय की साजिश बनाम एक एकाग्रता में डेटा को बदलने। समय उदाहरण या तो tastant के अर्क के बाद बढ़ी महंगाई भत्ते एकाग्रता खुलासा, इंट्रा-मौखिक sucrose और मेन्थॉल के लिए निशान बनाम एक और tastant, मेन्थॉल (0.005%, संचार प्रति 200 μl) भी एनएसी कोर में FSCV रिकॉर्डिंग के दौरान संचार किया गया था। 3 चित्रा डीए एकाग्रता से पता चलता है । एक tastants को phasic डीए विज्ञप्ति में परीक्षण परिवर्तनशीलता के लिए कुछ परीक्षण (चित्रा 2 और 3 ए) को देखने के लिए उम्मीद करनी चाहिए। हालांकि, हम आम तौर पर कई परीक्षणों से अधिक phasic डीए रिलीज में वृद्धि या कमी की दिशा में कोई गैर विशिष्ट प्रवृत्तियों नहीं दिख रहा है। 10-100 एनएम महंगाई भत्ते से लेकर एक भी जानवर में एक ठेठ प्रयोग में उम्मीद की जा सकती है।

चित्र 1
एनएसी कोर में विद्युत पैदा की डीए रिलीज के समय साजिश (नीचे) बनाम चित्रा 1. प्रतिनिधि रंग साजिश (ऊपर) और एकाग्रता। लाल पट्टी उत्तेजना समय इंगित करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
सुक्रोज के एक एकल निषेचन के दौरान समय का पता लगाने (नीचे) बनाम चित्रा 2. प्रतिनिधि रंग साजिश (ऊपर) और डीए एकाग्रता। लाल खगिरफ्तारी 6.5 सेकंड अर्क को इंगित करता है। सफेद नीचे का सामना करना पड़ तीर डीए के ऑक्सीकरण क्षमता से कम (झूठी रंग में प्रतिनिधित्व) वर्तमान में पदोन्नति में इंगित करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
(ए) 10% sucrose और (बी) intraoral प्रशासन द्वारा 0.005% मेन्थॉल के दौरान समय निशान बनाम चित्रा 3. प्रतिनिधि डीए एकाग्रता। लाल पट्टी 6.5 सेकंड intraoral अर्क को इंगित करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

FSCV के साथ संयुक्त Intraoral tastant वितरण मौखिक flavorants करने के लिए "वास्तविक समय" दा प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण परमिट। सफल डीए मापन के लिए आवश्यक हैं कि प्रोटोकॉल में तीन महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। सबसे पहले, मौखिक कैथेटर की उचित आरोपण flavorants की डिलीवरी के लिए महत्वपूर्ण है। कैथेटर पहले दाढ़ के पीछे डाला जाता है और जगह में अंकित सुनिश्चित करना है कि प्रत्यक्षता खोने से कैथेटर को रोकता है और जानवर द्वारा आकस्मिक हटाने से बचाता है। वसूली के बाद पहले कुछ दिनों के दौरान कैथेटर निस्तब्धता पहले 2 या 3 दिन के दौरान पशुओं को दिया मुलायम भोजन के बाद सर्जरी कैथेटर रोकना सकता है, यह भी महत्वपूर्ण है। दूसरा, इलेक्ट्रोड की गुणवत्ता में एक स्वतंत्र रूप से आगे बढ़ चूहे में संकेत करने वाली शोर अनुपात को बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण है। कुछ उदाहरणों में, नेत्रहीन दिखाई देते हैं कि इलेक्ट्रोड उच्च गुणवत्ता और अभी भी शोर संकेत दे सकता है अच्छी हालत में हो। इस समस्या के निवारण के लिए एक तरह से विकास में आधारभूत रिकॉर्डिंग लेने के लिए हैorsal स्ट्रिएटम (ड्यूरा नीचे 4 मिमी)। इलेक्ट्रोड बहुत ज्यादा शोर पैदा करता है, इलेक्ट्रोड हटा दिया है और पूर्व एनएसी कोर रिकॉर्डिंग साइट में (ड्यूरा नीचे 6-7 मिमी) प्रयोग का प्रदर्शन करने के लिए एक नया इलेक्ट्रोड के साथ बदला जा सकता है। एक तीसरा महत्वपूर्ण कदम सहज डीए रिहाई की घटनाओं ("यात्रियों") डीए एकाग्रता (कम से कम 20 एनएम में पर्याप्त वृद्धि के साथ एक पर्याप्त आवृत्ति (न्यूनतम अनुसार कम से कम 1) में मनाया जाता है, जहां लक्षित मस्तिष्क क्षेत्र में एक उपयुक्त रिकॉर्डिंग स्थान पा रहा है 40 एनएम)। यह अनुकूलन सहज phasic डीए रिहाई की घटनाओं से पहले flavorant प्रशासन के लिए विशिष्ट स्थान है, कम से पता लगाया जा सकता है कि यह सुनिश्चित करेंगे। उजागर कार्बन फाइबर (50-100 माइक्रोन) के आकार के बराबर वेतन वृद्धि में इलेक्ट्रोड कम पहचाने यात्रियों के साथ एक रिकॉर्डिंग साइट पाने की संभावना अधिकतम हो।

FSCV एक अलग है, क्योंकि FSCV में से एक महत्वपूर्ण चेतावनी, समय में एक बिंदु पर पूर्ण विश्लेष्य एकाग्रता का निर्धारण करने में असमर्थता हैप्रत्येक Voltammetry रिकॉर्डिंग फ़ाइल के दौरान (एक स्थिर आधारभूत की तुलना में) सापेक्ष एकाग्रता परिवर्तन उपाय है कि ferential तकनीक। हालांकि, अंतर तकनीक को भी पुरस्कृत और प्रतिकूल tastants 5 दोनों के जवाब में डोपामाइन एकाग्रता में उप-दूसरे के उतार चढ़ाव की मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है। निकोटीन की लत, ऐसे मेन्थॉल और मौखिक मिठास के रूप में तंबाकू उत्पाद additives के संदर्भ में, धूम्रपान व्यवहार से 18 प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है और हाल ही में रोकथाम और तम्बाकू नियंत्रण अधिनियम धूम्रपान परिवार द्वारा (मेन्थॉल के लिए छोड़कर) सिगरेट में प्रतिबंधित कर दिया गया गया है। इस प्रकार, FSCV के साथ संयोजन में intraoral वितरण संभावित निकोटीन की मजबूत गुण तंबाकू उत्पाद flavorants डीए संकेतन बदल सकते हैं कि कैसे जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक महत्वपूर्ण पद्धति उपकरण प्रदान करता है।

यहाँ, हम phasic डीए मापने के उद्देश्य से FSCV साथ intraoral tastant निषेचन के संयोजन की विधि का वर्णन किया हैप्राथमिक tastant उत्तेजनाओं के जवाब में जारी। यह हमारी तकनीक कार्रवाई या पसंद का स्वतंत्र tastants को phasic डीए रिहाई की परीक्षा के लिए अनुमति देता है, जबकि यह tastant वितरण की अप्रत्याशित प्रकृति phasic डीए रिहाई 19 को प्रभावित कर सकता है कि यह भी संभव है कि नोट के लिए महत्वपूर्ण है। इस प्रकार, इस तरह के पानी या कृत्रिम लार के रूप में एक उचित नियंत्रण समाधान है, ब्याज की tastant की phasic डीए रिहाई स्वतंत्र पर एक अप्रत्याशित इनाम या उत्तेजना के प्रभाव की तुलना करने और जांच करने के लिए नियंत्रण प्रयोगों में इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, तकनीक डीए रिहाई या इनाम के दोनों मापन के लिए सीमित नहीं है। उदाहरण के लिए, पिछले काम इनाम और घृणा 20 दोनों दौरान नोरेपिनेफ्रिने रिहाई की जांच की गई। जानवरों आसानी से नहीं कर FSCV साथ प्रतिकूल tastants intraoral tastant अर्क का उपभोग के बाद से प्रतिकूल tastants को phasic डीए रिहाई को मापने के लिए ही उपलब्ध तकनीक है। हालांकि, इस तकनीक का एक tastant प्रतिकूल या एक है या नहीं, यह निर्धारित नहीं करता हैppetitive, बल्कि, बस tastant की खपत के दौरान महंगाई भत्ते रिहाई के उपाय। (कहीं और 5, 21 में वर्णित के रूप में) एक tastant की hedonic मूल्य निर्धारित करने के लिए आदेश में, व्यवहार परीक्षण स्वाद जेट के दौरान ऑरो-चेहरे की प्रतिक्रियाओं का पालन करने के लिए शामिल किया जा सकता है।

यह भी FSCV भी इस तरह सेरोटोनिन 22 और ऑक्सीजन के रूप में 23 अन्य महत्वपूर्ण neurochemicals, मापने के लिए उपयुक्त है, लेकिन जाग, स्वतंत्र रूप से चलती जानवरों में इन analytes की रिकॉर्डिंग के लिए तरीके अभी तक उपलब्ध नहीं हैं कि ध्यान दिया जाना चाहिए। इसके अलावा, संयुक्त Voltammetry और इंट्रा-मौखिक अर्क विधि के साथ, tastant प्रसव के लिए समय बंद डोपामाइन की प्रतिक्रियाएं भी डीए रिहाई प्रभावित हो सकता है कि इस तरह के दृष्टिकोण व्यवहार या भोजन पुनः प्राप्ति के रूप में अन्य कार्यों, के अभाव में विश्लेषण किया जा सकता है। एक अतिरिक्त आवेदन के रूप में, संयुक्त intraoral tastant वितरण और FSCV स्फूर्त या Pavlovian conditioni दौरान पुरस्कृत या प्रतिकूल घटनाओं के लिए महंगाई भत्ते सिगनल को मापने के लिए आदर्श हो सकता हैएनजी। दरअसल, लेवी और उनके सहयोगियों द्वारा हाल ही में एक जौव प्रकाशन इंट्रा-मौखिक tastants अधिग्रहण और स्फूर्त स्वयं प्रशासन व्यवहार से 24 के रखरखाव का समर्थन निर्धारित करने के लिए स्फूर्त व्यवहार के साथ-इंट्रा मौखिक tastant वितरण को जोड़ती है। इस प्रकार, इस तरह के तरीकों में भी व्यवहार के दौरान मौखिक tastants को phasic डीए प्रतिक्रिया की पहचान करने के लिए FSCV के साथ जोड़ा जा सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stimulating electrode PlasticsOne MS303/2-A/SPC when ordering, request a 22 mm cut below pedestal
Cannula for electrode BioAnalytical Systems MD-2251
Glass capillary A-M systems 624503
Carbon fiber Thornel T650
Electrode puller Narishige International PE-22
Neurolog stimulus isolator Digitimer Ltd. DS4
Heat shrink 3M FP-301
Insulated wires for electrodes Squires electronics Custom L 3.000 x 1.000s x 1.000s UL1423 30/1 BLU
Micromanipulator Univ. of Illinois at Chicago, Engineering Machine Shop
Epoxy ITW Devcon 14250 "5 minute epoxy"
Copolymer of perfluoro-3,6-dioxa-4-methyl-7octene-sulfonic acid and tetrafluoroethylene Ion Power LQ-1105 i.e., Nafion
Silver paint GC Electronics 22-023
Power supply BK Precision 9110
Tubing for intra-oral catheters Intramedic 427426 PE 100, I.D. = 0.86 mm; O.D. = 1.52 mm
Tubing for intra-oral infusion Fischer Scientific 02-587-1A I.D. 1/32"; O.D. 3/32"
Syringe pump for flow cell Pump Systems Inc. NE 1000
Surgical cement Dentsply Caulk 675571 and 675572
Air actuator VICI A60 6 position digital valve interface
Digital valve interface VICI DVI 230 VAC
Quad headstage Univ. of N. Carolina, Electronics Facility
UEI power supply Univ. of N. Carolina, Electronics Facility
UEI breakout box Univ. of N. Carolina, Electronics Facility
Power supply for tastant syringe pump Med Associates SG-504
Tastant syringe pump Med Associates PHM-107
Tungsten microelectrode MicroProbes WE30030.5A3
Silver wire reference with AgCl InVivo Metric E255A
Sucrose Sigma 80497
Magnesium chloride Sigma M8266
Sodium chlroide Sigma S7653
Perchloric acid Sigma 244252
Hydrochloric acid (4 M) Sigma 54435
Soidum hydroxide Sigma 306576
Hydrogen peroxide Sigma H1009
Dopamine hydrochloride Sigma H8502
TarHeel HDCV Software University of North Carolina-Chapel Hill Must request software: click here for link to software request page

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References

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जाग चूहे में इंट्रा-मौखिक Tastant प्रशासन के दौरान फास्ट स्कैन चक्रीय Voltammetry के साथ तेजी से डोपामिन गतिशीलता की परीक्षा
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Wickham, R. J., Park, J., Nunes, E. J., Addy, N. A. Examination of Rapid Dopamine Dynamics with Fast Scan Cyclic Voltammetry During Intra-oral Tastant Administration in Awake Rats. J. Vis. Exp. (102), e52468, doi:10.3791/52468 (2015).

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