Protocol
Todos os experimentos foram realizados de acordo com os Institutos Nacionais de Saúde (NIH) Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pelo Institutional Animal Care e Use Committee da Universidade Yale (IACUC).
Preparativos 1) Pré-cirúrgicos
- Preparação solução oral
- Criar soluções de sacarose a 10% e 0,005% de L-mentol em água desionizada (pH 7,4). Armazenar estas soluções em recipientes fechados, à TA, e refazer a cada 2 semanas, para evitar a degradação.
- Soluções de calibração de eletrodo
- Adicione tampão Tris (pH 7,4) em qualquer momento antes da calibração. A solução consiste em 12,0 mM de Tris-HCl, NaCl 140 mM, KCl 3,25 mM, CaCl2 1,20 mM, NaH2PO4 1,25 mM, 1,20 mM de MgCl2, e 2,00 mM de Na 2 SO 4.
- Criar uma solução estoque de 10 mM de dopamina (DA; cloridrato de dopamina) em 0,1 M de ácido perclórico. O ácido perclórico ajuda a evitar a oxidação de dopaminae. Conserva-se a solução de reserva a -20 ° C e usado para até 6 meses. Adicione várias alíquotas da solução de estoque DA para armazenamento a utilizar cada alíquota apenas uma vez.
- A partir do estoque 10 mM de DA, soluções diluídas em tampão Tris para concentrações de 1 uM, 500 nM, 250 nM, 125 nM, 62,5 nM, e 31,25 nM.
- Para a calibração de pH, preparar soluções de Tris tampão com o pH de 7,2, 7,3, 7,5, e 7,6. Isto irá proporcionar soluções que imitam mudanças de pH que podem ocorrer durante a experiência in vivo.
- Fabricação eletrodo
- Por sucção a vácuo, aspirar uma T-650 de fibra de carbono (7 um de diâmetro) num tubo capilar de vidro de borossilicato (comprimento 10 mm, diâmetro exterior de 0,6 milímetros, de diâmetro interno 0,4 mm).
- Coloque capilar de vidro preenchido com fibra de carbono em um eletrodo extrator vertical. Para os parâmetros iniciais, definir o aquecedor para 55,0 e desligue o ímã. No entanto, uma maior optimização pode ser necessário que ambos aquecedor e configurações magnéticos variar from laboratório para laboratório.
Nota: O eléctrodo deve ser de pelo menos, 5,5 cm de comprimento (incluindo a conicidade) de modo que possa facilmente encaixar-se no micromanipulador e ser inserido, pelo menos, 6,9 milímetros abaixo da dura no cérebro de rato. Se o eléctrodo é demasiado curto, gravações de porção ventral do núcleo accumbens não será possível. Por outro lado, o comprimento total do eléctrodo não deve exceder 6,5 centímetros caso contrário, será demasiado grande para caber na micromanipulador. - Usando um microscópio de luz, cortar o exposto de fibra de carbono de modo que ela se estende 75-100 uM para além da extremidade do vidro. Verifique se o eletrodo tem um muito apertado, quase imperceptível, vedação entre o eletrodo de vidro e fibra de carbono, o que irá produzir o mínimo de ruído durante a gravação posterior. Descarte o eletrodo, se houver rachaduras visíveis no vidro ou se o selo está solto, o que é indicativo de um selo pobre. Para obter instruções mais detalhadas, consulte [12] e [13].
- Montagem do eletrodo no microfoneromanipulator
- Obter um 3 em, fio 30G que é isolado ao longo de metade do comprimento do fio e utilizar um pequeno pincel para aplicar uma fina camada de prata pintar directamente para o fio. Imediatamente após a aplicação da pintura de prata, inserir o fio no orifício na parte superior do eléctrodo para proporcionar uma ligação física e eléctrica para a fibra de carbono. Sob um microscópio, certifique-se de que o fio de prata faz contato com a fibra de carbono.
- Prenda o fio de prata e eletrodo para o micromanipulador usando psiquiatra do calor.
- Inserir o eléctrodo de fibra de carbono preparada em álcool isopropílico purificado (IPA) durante pelo menos 10 minutos para limpar a superfície do eléctrodo e para aumentar a sensibilidade subsequente à dopamina. Após a imersão no IPA, lavar a fibra de carbono com água da torneira para remover o IPA.
- Referência fabricação eletrodo
- Pegue um fio de 13 milímetros de prata contendo uma aproximadamente 6 mm Ag / Ag Cl mesh (fio de prata 7 milímetros sozinho, seis milímetros de malha, 0,4 mm de diâmetro),cortar a porção de prata até aproximadamente metade do seu comprimento original e soldar a porção do fio de prata a um pino de ouro.
- Aplicar epóxi sobre a solda no pino.
- Mergulhar o Ag / Ag Cl malha extremidade a um copolímero de 5% politetrafluoretileno e perfluoro-3,6-dioxa-4-metil-7octene-sulfónico ácido 5 vezes, com 30 min períodos de secagem ao ar entre cada mergulho.
- Permitir que o revestimento Ag / Ag Cl malha para o ar seco O / N.
- Da cura em forno a 120 ° C durante 1 h.
2) a cirurgia combinada intra-oral e cirurgia intracraniana Canulação (aproximadamente 75 min)
- Fabricação do cateter Oral
- Adicione o cateter por via oral, e esterilizar por esterilização por óxido de etileno, pelo menos 10 dias antes da cirurgia.
- Corte PE 100 tubos em seis centímetros segmentos longos.
- Usando um ferro de soldar, derreter uma extremidade da tubagem de PE e imediatamente pressionar de encontro a uma superfície sólida para arrefecer a tubagem de PE. O resultado deve criarum disco pequeno, plana numa extremidade do tubo de PE e não deve ser flangeado. Utilize uma agulha (18 L) ou empurrar o pino para criar um buraco no centro do disco.
- Na outra extremidade do tubo de PE, confortavelmente inserir a extremidade embotada de uma agulha G 18 para dentro do tubo.
- Usando um furador de papel padrão, soco várias peças circulares de uma folha de politetrafluoretileno (3,18 milímetros de espessura, 6 mm de diâmetro) para criar arruelas politetrafluoretileno.
- Criar um buraco no centro da máquina de lavar. Aqui a agulha ligado ao tubo de PE e empurrá-lo completamente através da máquina de lavar. Uma vez que a agulha está completamente, deslizar a anilha para a parte inferior do tubo de PE de modo a ficar à face contra a anilha.
- Cirurgia oral
- Após esterilização a instrumentos cirúrgicos, cânula (aparado a 2,5 mm abaixo do pedestal antes da esterilização), e o eléctrodo de referência, anestesiar ratos com uma injecção intraperitoneal de cetamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg).
- After 5 min, aplique um teste de estímulo nocivo (pé ou cauda pitada) para avaliar o nível de anestesia. Se o sujeito apresenta qualquer reacção física para o teste estímulo nocivo (recuar resposta, aumento da taxa respiratória ou do coração), administrar um impulso cetamina de 10% a 15% da dose original e repetir o protocolo de estímulo nocivo acima.
- Depois que o rato é totalmente anestesiado e não mostra reação ao teste estímulo nocivo, usar máquinas de cortar cabelo de animais para raspar a pele do rato dos olhos de cerca de 2 mm atrás das orelhas. Em seguida, coloque o rato sobre a recirculação de água de aquecimento almofada fina para manter a temperatura corporal durante a cirurgia. Aplique lubrificante ocular. Administrar o fármaco não esteróide anti-inflamatório (NSAID), carprofeno (5 mg / kg), por injecção intraperitoneal, antes de realizar quaisquer incisões e antes da inserção de cânulas intra-orais. Utilizar técnicas assépticas em todos os momentos.
- Aplicar betadine seguido de etanol a 70% para limpar a pele. Repita 3 vezes.
- Place o rato em sua parte traseira, e abra a boca com um cotonete estéril. Encontre o primeiro molar superior.
- Insira a agulha no tecido entre a bochecha eo primeiro molar superior até a agulha sai logo atrás e medial para os ouvidos.
- Pierce a agulha através da pele até que o tubo de PE sai da pele e é acessível.
- Puxe a cânula (agarrando pela própria cânula e não a agulha) e fixe a máquina de lavar politetrafluoretileno para os molares, de modo que o cateter permanece no lugar.
Nota: Cortando a máquina de lavar em uma forma trapezoidal e prendendo-o contra os molares com o lado plano voltado para a face torna esta etapa mais fácil. - Pegue outra máquina de lavar politetrafluoretileno e deslize-o sobre a agulha exposta, até o tubo de plástico, e encostar contra a incisão.
- Para proteger a máquina de lavar politetrafluoretileno, use fita esterilizados para criar uma "bandeira" triangular para que a máquina de lavar não deslizar para cima. Fixe a lavagemer contra a pele do rato e a fita esterilizada.
- Corte o cateter exposta para permitir 2-4 cm de tubo para ser exposto acima da cabeça do rato.
- Repita os passos através 2.2.1 2.2.10 para o outro lado da boca.
- Após esterilização a instrumentos cirúrgicos, cânula (aparado a 2,5 mm abaixo do pedestal antes da esterilização), e o eléctrodo de referência, anestesiar ratos com uma injecção intraperitoneal de cetamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg).
- Cirurgia intracraniana para voltammetry
- Coloque o rato no quadro estereotáxico e limpar couro cabeludo do animal usando um matagal fase dois (um matagal betadine seguido por um matagal etanol a 70%, se apresentar com uma repetição 3 ciclo).
- Use uma pinça de nariz de agulha esterilizadas e uma tesoura cirúrgica para cortar uma seção de 15 x 15 mm de tecido do couro cabeludo.
- Limpe suavemente a superfície do crânio utilizando esterilizados aplicadores com ponta de algodão. Além disso limpar o crânio através da aplicação de 2 a 3 gotas de 3% de peróxido de hidrogénio.
- Use uma broca estereotáxica para fazer 3 pequenos (1 mm de diâmetro) buracos no crânio para inserção posterior de parafusos, um buraco para a cânula guia, um buraco para o eletrodo estimulante e um buraco para os eleitos de referênciacavalgava.
- Para gravações no núcleo NAc, posicione o guia cânula de 1,2 mm anterior e 1,4 mm lateral para Bregma. Abaixe o aparelho cânula até a base de plástico fique nivelada com o crânio.
- Coloque o eletrodo de referência esterilizado no hemisfério contralateral à cânula guia. Diminuir a referência cerca de 2 mm abaixo da dura-máter.
- Posicionar o eléctrodo estimulante de 5,2 mm posterior e 1,0 mm lateral em relação ao bregma e abaixada 8,0 milímetros abaixo da dura para atingir a área tegmental ventral (VTA).
- Use uma chave de fenda pequena cirúrgico esterilizado para garantir parafusos no crânio. Em seguida, insira o eletrodo de referência, estimulando eletrodo, e orientar cânula. Finalmente, proteger todos os componentes usando cimento cranioplastia.
- Durante as primeiras 48 horas de cuidados pós-operatórios, administrar o fármaco não esteróide anti-inflamatório não esteróide (AINE) Carprofeno por injecção subcutânea (5 mg / kg). Permitir que pelo menos uma semana para recuperação cirúrgica completa antes de realizar voltammetry gravação.
- Durante cuidados pós-operatórios, cateteres orais lavar diariamente com água. Fornecer alimentos saturado em água durante 2 dias para auxiliar o animal na mastigação e comer. Fornecer monitoramento diário para potenciais sinais de estresse da dor (devido à infecção leve ou desidratação) e as intervenções apropriadas conforme necessário (incluindo administração de fluidos, a administração tópica de anti-sépticos, e ou administração de AINE Carprofen a 5 mg / kg).
3) voltamétricos Recordings em Awake, Rat livremente em Movimento
- Abaixar o eletrodo e adquirir um conjunto de treinamento DA.
- No dia do experimento, verificar a desobstrução da cânula oral, através da infusão de 200 mL de água e observando as respostas orofaciais (para verificar se o rato está provando a água).
- Anexar headstage FSCV ao rato através da inserção do eléctrodo estimulante (no andar de entrada) para o eléctrodo bipolar estimulante Cannula (no rato). Assim, o andar de entrada (miniaturizado conversor de corrente-tensão) liga-se directamente ao eléctrodo bipolar estimulante.
- Remover a cânula manequim do aparelho cânula e aplicar duas gotas de solução de heparina a 50% para dentro da cânula. Em seguida, insira suavemente uma cânula manequim (ligeiramente mais longo que a cânula dummy que foi previamente removido) para limpar os coágulos de sangue ou cicatriz glial que possam ter ocorrido, que vai quebrar eletrodos de fibra de carbono que serão posteriormente inseridos durante o experimento. Estender a cânula utilizada para limpar os coágulos de 3-4 mm abaixo do crânio (pelo menos 2 mm acima do local de gravação).
- Inserir o micromanipulador, com eléctrodo, na cânula guia e colocar o anel em posição omega "bloqueado".
- Conecte o fio do eletrodo de referência do headstage para o pino apropriado. Em seguida, conecte o fio do eletrodo de trabalho desde o micromanipulador para o fio apropriado no headstage.
- Abaixe os eleceléctrodo de cerca de 4-4,5 mm abaixo do crânio.
- Usar um potenciostato para aplicar uma forma de onda triangular (400 V / s, -0,4 a +1,3 V). Aplicar a forma de onda para o eletrodo a 60 Hz por pelo menos 10 min, em seguida, alterar a frequência de aplicação de forma de onda para 10 Hz para gravações experimentais subsequentes.
Nota: A etapa de aplicação de forma de onda de 60 Hz produz uma superfície de fibra de carbono estável e irá ajudar a evitar a deriva elétrica - Aplicar estimulação eléctrica à VTA utiliza frequências diferentes (10 a 60 Hz) impulsos (de 10 a 30 pulsos) e as correntes (50 a 150 mA), todos com uma largura de impulso de 2 ms / fase, para evocar diferentes concentrações de DA e de libertação de pH turnos. Adquirir pelo menos 5 concentrações diferentes de liberação DA e 5 turnos de pH diferentes. Esperar (2-3 minutos no mínimo) entre as estimulações para permitir a recarga vesicular [14].
Nota: É importante a obtenção de estimulações que produzem concentrações de DA em toda a gama que vai ser recolhida durante o subsequenteexperimento, uma vez que será usado como um conjunto de treinamento para Análise de Componentes Principais (ver secção 5.1). - Abaixe o eletrodo no núcleo NAc (6,3 milímetros ventral a dura). Subsequentemente diminuir o eléctrodo em incrementos de 100 um no interior do núcleo NAc até que os eventos de libertação de DA transientes são observadas com frequências de, pelo menos, 1 por min.
- Ligue o tubo (diâmetro interior de 1/32 ", diâmetro exterior de 3/32") para uma seringa de 20 ml, ligado a uma bomba de seringa. Na outra extremidade do tubo, usar uma agulha biselada 23 L para ligar a tubagem a cânula do rato. Certifique-se de que a tubulação é preenchida completamente com o saborizante desejado e verifique se não há bolhas de existir na tubulação.
Nota: Tipicamente, administrar uma pequena quantidade de saborizante na boca do rato antes da gravação para assegurar que a primeira infusão para a gravação proporcionam a quantidade total de infusão e não qualquer água residual ou de ar na tubagem. Além disso, isto permite que o animal ter alguma experiência prévia sagacidadeh desde o saborizante novos tastants, mesmo aqueles apetitivas, pode ser aversivo inicialmente devido à sua novidade. - Para coleta de dados, infundir 200 mL de saborizante (6,5 seg usando uma bomba e tubulação descrito anteriormente). Infundir o saborizante cada 1-3 min. Infundir um total de 25 vezes por saborizante. Cada infusão proporciona 200 ul de solução.
- Se vários tastants estão sendo entregues em um único experimento, lave o cateter por via oral com água após a coleta de dados para um saborizante e aguarde pelo menos 20 minutos antes da infusão da nova saborizante.
- Após a sessão de gravação DA, preparar-se para verificação histológica através da criação de uma pequena lesão no local de gravação. Para preservar o eletrodo de fibra de carbono para a calibração posterior, primeiro retrair o eléctrodo e retire o micromanipulador. Em seguida, usar uma nova micromanipulador com um microeléctrodo de vidro e um fio de tungsténio (que se estende de 100 um para além da ponta de vidro) com a mesma profundidade (abaixo da dura) que o original carbono fmicroeletrodos iber.
- Para verificação histológica, criar uma pequena lesão por aplicação de 3 V com o fio de tungsténio e aumentando a tensão em incrementos de 1 V, a cada 10 segundos, até que a configuração 10 V é atingido.
- Se uma curva de concentração padrão já foi criado utilizando eletrodos múltiplos de fibra de carbono, realizar a etapa de lesão acima (3.1.14), aplicando o potencial diretamente o eletrodo de fibra de carbono.
Nota: Este método lesão irá danificar a fibra de carbono e prevenir a calibração posterior com esse eletrodo específico. - Eutanásia do animal utilizando uma injecção letal de pentobarbital (150 mg / kg, ip).
- Desalojar o headcap com as cânulas usando um alicate, puxando para cima diretamente no headcap. Não torça o headcap porque isto poderá causar danos desnecessários ao cérebro e torná-lo desafiador para identificar a localização do eletrodo durante a histologia.
- Remover o cérebro e em lugar de 4% de formalina durante 3 dias, seguido por 30% de suCrose por 1 semana. Criar 30 uM fatias utilizando um criostato, de montagem em lamelas e fatias examinar com um microscópio óptico para identificar a localização da fibra de carbono ou lesão de tungsténio.
Nota: Perfusão é opcional para 3.1.17.
- Remover o cérebro e em lugar de 4% de formalina durante 3 dias, seguido por 30% de suCrose por 1 semana. Criar 30 uM fatias utilizando um criostato, de montagem em lamelas e fatias examinar com um microscópio óptico para identificar a localização da fibra de carbono ou lesão de tungsténio.
4) calibração do eletrodo
- Usando a célula de fluxo para criar um factor de conversão de corrente de concentração.
- A fim de determinar a sensibilidade do eletrodo, calibre eletrodos após cada experimento, utilizando um aparelho de fluxo "T-cell". Diminuir o eléctrodo na "T-célula", enquanto tampão Tris, pH soluções, ou soluções de DA são lavados sobre a superfície do eléctrodo (a uma taxa de 2 ml / min). Use um de seis posições solenóide de ar do atuador para alternar entre tampão e pH ou a solução DA.
- Para cada calibração, recolha de dados voltamétricas durante 5 seg aplicação de tampão Tris (linha de base), seguido de 5 seg aplicação do pH ou da solução de DA, seguido por 20 segundos de umPLICAÇÃO de tampão Tris (arquivo total 30 seg). Repita cada execução 3 vezes para cada concentração padrão de calibração, contrabalançando entre diferentes concentrações de cada norma.
- Para cada recolha de amostras, medir o pico DA ou corrente evocada pelo pH. Em média, a corrente de pico em cada teste para obter uma concentração versus relacionamento corrente de pico. Para obter instruções mais detalhadas, consulte [12] e [13].
5) Análise de Dados
- Usando um conjunto de treinamento em análise de componentes principais (PCA)
Nota: Durante uma experiência de voltametria, a saída é produzida como corrente, que é o resultado da oxidação e redução da dopamina, mudanças de pH, e ruído electroquímico. PCA permite a separação desses fatores para que se possa isolar os componentes desejados (DA e pH) e remover componentes adicionais que podem distorcer os sinais desejados (para uma descrição mais detalhada, ver 15, 16).- Atribuir um fator de calibração para pocorrente e de saída (aproximadamente 5-10 nA / uM) após APC para permitir que os valores de concentração de analitos a ser determinada.
- Use o conjunto de treinamento obtido durante um experimento para "treinar" o modelo APC para separar DA, pH, e outros fatores. APC leva o conjunto de treino voltamogramas cíclicos (recolhida na secção 3.1.8) e determina que as características essenciais do voltamograma podem ser usadas para identificar cada analito recolhidos durante gravações de voltametria in vivo.
- Para determinar o número de componentes principais para manter, usar um F-teste Malinowski. Normalmente, manter apenas 2 ou 3 principais componentes que normalmente explicam cerca de 95-99% da variância nos dados. Para uma discussão mais aprofundada sobre a aplicação da F-teste Malinowski, ver 17.
Nota: Uma vez que o número de componentes são determinadas, a análise PCA efetivamente vai projetar os voltamogramas medidos do DA e formação pH define sobre os principais componentes que foram retidos.O resultado é um conjunto de dados que foi filtrada para que somente os dados de DA (ou pH) permanece e os dados residual que não se assemelha a DA ou pH é removido (ver resultados representativos para a saída esperada). Para obter uma explicação mais detalhada e instruções passo a passo para a utilização de PCA para a análise voltamétrica veja folha de Materiais e 16, 17.
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Representative Results
FSCV combinado com implantação do cateter intra-oral foi usado para examinar como a sacarose, um saborizante appetitive, modula a liberação fásica DA no núcleo NAc. Antes da perfusão saborizante, a estimulação elétrica (150 mA, 60 Hz, 24 pulsos; indicado pela barra vermelha) do VTA produz aumentos robustos na liberação fásica DA no NAc (Figura 1) Figura 1 mostra um gráfico colorido com potencial diante. o eixo y, o tempo no eixo-x, e corrente (representada como falsa cor) no eixo z. Abaixo do gráfico colorido é concentração DA contra traço do tempo. A concentração em função do tempo foi determinado utilizando o rastreio de corrente em função do tempo para o potencial de oxidação da dopamina (indicado pela linha tracejada branco) o qual foi convertida em concentração de, na sequência de pós-calibração do eléctrodo. Esta concentração DA contra traço do tempo foi usado como parte do treinamento para definir PCA.
Após o conjunto de treinamento foi adquirida, 25 infusões de sacarose(10%, 200 ul por infusão) foram dadas a cada 1-3 minutos. Exemplos de modulação da libertação de sacarose fásica DA são mostrados nas Figuras 2 e 3. Na Figura 2, a infusão de 6,5 seg (indicado pela barra vermelha) produziu uma elevação da corrente (indicado por a, seta voltada para baixo branco) com o potencial de oxidação de DA (indicado pela linha tracejada branco). Transformando os dados para uma concentração versus tempo após a trama APC verificou-se que a corrente aumentou em respostas ao saborizante é o resultado de um aumento na concentração de AD. Outra saborizante, mentol (0,005%, 200 ul por infusão) também foi infundida durante gravações FSCV no núcleo NAc. A Figura 3 mostra a concentração de AD em relação exemplo tempo traça para intra-oral de sacarose e mentol, revelando aumento da concentração de AD após a infusão de qualquer saborizante . Deve-se esperar para ver alguma tentativa à variabilidade julgamento na liberação fásica DA para tastants (Figura 2 e 3A). No entanto, não costuma ver todas as tendências não-específicas no sentido de um aumento ou diminuição na liberação fásica DA longo de vários ensaios. Intervalos de 10-100 nM DA pode ser esperado através de uma experiência típica em um único animal.
Figura 1. Representante enredo de cor (parte superior) e concentração versus tempo enredo (parte inferior) de liberação DA eletricamente evocado no núcleo NAc. Barra vermelha indica tempo de estimulação. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Representante enredo de cor (parte superior) e concentração de AD em relação traço do tempo (inferior) durante uma única infusão de sacarose. Red bAR indica infusão 6,5 seg. Branco seta voltada para baixo indica em elevação no atual (representado em cor falsa) no potencial de oxidação do DA. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Representante concentração DA contra vestígios de tempo durante (A) 10% de sacarose e (B) de 0,005% de mentol por administração intra-oral. Barra vermelha indica 6,5 infusão intra-oral sec. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Entrega saborizante intra-oral combinado com FSCV permite a análise de "tempo real" respostas Da e aromatizantes orais. Existem três passos críticos no protocolo que são necessárias para as medições de DA bem sucedidas. Em primeiro lugar, a implantação adequada do cateter por via oral é crítica para o fornecimento de aromatizantes. Garantir que o cateter é inserido atrás do primeiro molar e encravado no lugar impede que o cateter de perder permeabilidade e impede a remoção acidental pelo animal. A lavagem do cateter durante os primeiros dias após a recuperação também é importante, uma vez que o alimento macio dado ao animal durante os primeiros 2 ou 3 dias pós-cirurgia poderia entupir o cateter. Em segundo lugar, a qualidade do eléctrodo é crítica para o aumento da razão sinal-para-ruído de um rato se mover livremente. Em alguns casos, os eletrodos que aparecem visualmente para ser de alta qualidade e boas condições ainda podem dar sinais ruidosos. Uma maneira de solucionar esse problema é fazer gravações de linha de base no dØrsal estriado (4 mm abaixo da dura). Se o eléctrodo produz muito ruído, o eléctrodo pode ser removido e substituído por um novo eléctrodo antes de se efectuar a experiência no local de gravação núcleo NAc (6-7 mm abaixo da dura). Um terceiro passo crítico é encontrar um local de gravação adequado na região alvo do cérebro, onde os eventos espontâneos de libertação de DA ("transientes") são observadas com uma frequência suficiente (pelo menos 1 por min) com aumentos na concentração de AD suficiente (pelo menos 20 nM a 40 nM). Esta optimização irá garantir que os eventos de libertação fásica DA espontâneos pode ser detectada no local específico, antes da administração aromatizante. Baixando o eléctrodo em incrementos equivalentes ao tamanho da fibra de carbono expostos (50-100 uM) maximiza as possibilidades de encontrar um local de gravação com transientes detectáveis.
Uma limitação importante dos FSCV é a incapacidade para determinar a concentração do analito absoluto num ponto no tempo, uma vez que é um dif FSCVficiente técnica que mede as mudanças de concentração relativos (comparado a uma linha de base estável) durante cada ficheiro de gravação voltammetry. No entanto, a técnica diferencial também permite a quantificação de flutuações sub-segundo em concentração de dopamina em resposta a ambos os gratificantes aversivas saborizantes e 5. No contexto da dependência da nicotina, aditivos dos produtos do tabaco, como mentol e orais adoçantes, foram mostrados para influenciar o comportamento de fumar 18 anos e foram recentemente foi proibido em cigarros (com exceção de mentol) pela família de Prevenção do Tabagismo e Ato de Controle do Tabaco. Assim, a entrega intra-oral em combinação com FSCV fornece uma ferramenta metodológica importante que pode ser usado para examinar o modo como aromatizantes produto do tabaco pode alterar a sinalização DA, e, potencialmente, as propriedades de reforço de nicotina.
Aqui, nós descrevemos o método de combinação de infusão intra-oral com FSCV saborizante com a finalidade de medir DA fásicalibertar em resposta a estímulos primários saborizante. É importante notar que, embora a técnica permite o exame de libertação fásica a saborizantes DA independentes da acção ou a escolha, é também possível que a natureza inesperada da entrega saborizante possa influenciar a libertação fásica DA 19. Assim, uma solução de controlo apropriado, tal como água ou saliva artificial, pode ser usada em experiências de controlo para comparar e examinar os efeitos de um estímulo ou recompensa inesperada em fásica libertação independente do saborizante de interesse DA. No entanto, a técnica não se limita a qualquer medições de libertação DA ou recompensa. Por exemplo, o trabalho anterior examinou a liberação de noradrenalina durante tanto recompensa e aversão 20. Dado que os animais não são facilmente consumir tastants aversivos infusão saborizante intraoral com FSCV é a única técnica disponível para medir a liberação fásica DA para tastants aversivas. No entanto, esta técnica não determinar se é ou não um saborizante é aversivo ou umppetitive, pelo contrário, simplesmente mede liberação DA durante o consumo do saborizante. A fim de determinar o valor hedónica de um saborizante, testes comportamentais podem ser incorporados para observar as respostas oro-faciais durante o sabor reactividade (como descrito noutro local 5, 21).
Deve também ser notado que FSCV também é adequado para a medição de outros importantes neurotransmissores, como a serotonina e 22 de oxigénio 23, mas os métodos para registar os referidos analitos em animais acordados, que se deslocam livremente ainda não estão disponíveis. Além disso, com a voltametria combinado e método de infusão intra-oral, as respostas de dopamina bloqueado a tempo para a entrega saborizante pode ser analisada na ausência de outros comportamentos, como o comportamento de aproximação ou de recuperação de alimentos, que também podem afetar a liberação de DA. Como uma aplicação adicional, a entrega saborizante intraoral combinadas e FSCV pode ser ideal para a medição de sinalização DA a eventos gratificantes aversivas ou durante conditioni operante ou pavlovianong. De fato, uma recente publicação JoVE por Levy e seus colegas combina a entrega intra-oral saborizante com comportamento operante para determinar se tastants intra-orais apoiar a aquisição e manutenção de comportamento auto-administração operante 24. Assim, estes métodos também podem ser combinados com FSCV para identificar resposta DA fásica saborizantes orais durante comportamento.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stimulating electrode | PlasticsOne | MS303/2-A/SPC | when ordering, request a 22 mm cut below pedestal |
| Cannula for electrode | BioAnalytical Systems | MD-2251 | |
| Glass capillary | A-M systems | 624503 | |
| Carbon fiber | Thornel | T650 | |
| Electrode puller | Narishige International | PE-22 | |
| Neurolog stimulus isolator |  Digitimer Ltd. |
DS4 | |
| Heat shrink | 3M | FP-301 | |
| Insulated wires for electrodes | Squires electronics | Custom | L 3.000 x 1.000s x 1.000s UL1423 30/1 BLU |
| Micromanipulator | Univ. of Illinois at Chicago, Engineering Machine Shop | ||
| Epoxy | ITW Devcon | 14250 | "5 minute epoxy" |
| Copolymer of perfluoro-3,6-dioxa-4-methyl-7octene-sulfonic acid and tetrafluoroethylene | Ion Power | LQ-1105 | i.e., Nafion |
| Silver paint | GC Electronics | 22-023 | |
| Power supply | BK Precision | 9110 | |
| Tubing for intra-oral catheters | Intramedic | 427426 | PE 100, I.D. = 0.86 mm; O.D. = 1.52 mm |
| Tubing for intra-oral infusion | Fischer Scientific | 02-587-1A | I.D. 1/32"; O.D. 3/32" |
| Syringe pump for flow cell | Pump Systems Inc. | NE 1000 | |
| Surgical cement | Dentsply Caulk | 675571 and 675572 | |
| Air actuator | VICI | A60 | 6 position digital valve interface |
| Digital valve interface | VICI | DVI | 230 VAC |
| Quad headstage | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | ||
| UEI power supply | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | ||
| UEI breakout box | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | ||
| Power supply for tastant syringe pump | Med Associates | SG-504 | |
| Tastant syringe pump | Med Associates | PHM-107 | |
| Tungsten microelectrode | MicroProbes | WE30030.5A3 | |
| Silver wire reference with AgCl | InVivo Metric | E255A | |
| Sucrose | Sigma | 80497 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| Sodium chlroide | Sigma | S7653 | |
| Perchloric acid | Sigma | 244252 | |
| Hydrochloric acid (4 M) | Sigma | 54435 | |
| Soidum hydroxide | Sigma | 306576 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma | H1009 | |
| Dopamine hydrochloride | Sigma | H8502 | |
| TarHeel HDCV Software | University of North Carolina-Chapel Hill | Must request software: click here for link to software request page |
References
- Roitman, M. F., et al. Dopamine operates as a subsecond modulator of food seeking. J Neurosci. 24 (6), 1265-1271 (2004).
- Aragona, B. J., et al. Regional specificity in the real-time development of phasic dopamine transmission patterns during acquisition of a cue-cocaine association in rats. European Journal of Neuroscience. 30 (10), 1889-1899 (2009).
- Wheeler, R. A., et al. Cocaine cues drive opposing context-dependent shifts in reward processing and emotional state. Biol Psychiatry. 69 (11), 1067-1074 (2011).
- Wickham, R. J., et al. Advances in studying phasic dopamine signaling in brain reward mechanisms. Front Biosci (Elite Ed). 5, 982-999 (2013).
- Roitman, M. F., et al. Real-time chemical responses in the nucleus accumbens differentiate rewarding and aversive stimuli). Nature Neuroscience. 11 (12), 1376-1377 (2008).
- Cheer, J. F., et al. Phasic dopamine release evoked by abused substances requires cannabinoid receptor activation. J Neurosci. 27 (4), 791-795 (2007).
- Owesson-White, C. A., et al. Neural encoding of cocaine-seeking behavior is coincident with phasic dopamine release in the accumbens core and shell. Eur J Neurosci. 30 (6), 1117-1127 (2009).
- Phillips, P. E., et al. Subsecond dopamine release promotes cocaine seeking. Nature. 422 (6932), 614-618 (2003).
- Chen, C., et al. Levels of mint and wintergreen flavorants: smokeless tobacco products vs. confectionery products. Food Chem Toxicol. 48 (2), 755-763 (2010).
- Manning, K. C., Kelly, K. J., Comello, M. L. Flavoured cigarettes, sensation seeking and adolescents' perceptions of cigarette brands. Tob Control. 18 (6), 459-465 (2009).
- Rainey, C. L., Conder, P. A., Goodpaster, J. V. Chemical characterization of dissolvable tobacco products promoted to reduce harm. J Agric Food Chem. 59 (6), 2745-2751 (2011).
- Phillips, P. E., et al. Real-time measurements of phasic changes in extracellular dopamine concentration in freely moving rats by fast-scan cyclic voltammetry. Methods Mol Med. 79, 443-464 (2003).
- Robinson, D. L., Wightman, R. M. Rapid Dopamine Release in Freely Moving Rats. Electrochemical Methods for Neuroscience. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2007).
- Montague, P. R., et al. Dynamic gain control of dopamine delivery in freely moving animals. J Neurosci. 24 (7), 1754-1759 (2004).
- Heien, M. L., Johnson, M. A., Wightman, R. M. Resolving neurotransmitters detected by fast-scan cyclic voltammetry. Anal Chem. 76 (19), 5697-5704 (2004).
- Keithley, R. B., Heien, M. L., Wightman, R. M. Multivariate concentration determination using principal component regression with residual analysis. Trends Analyt Chem. 28 (9), 1127-1136 (2009).
- Keithley, R. B., Carelli, R. M., Wightman, R. M. Rank estimation and the multivariate analysis of in vivo fast-scan cyclic voltammetric data. Anal Chem. 82 (13), 5541-5551 (2010).
- Rising, J. P., et al. Healthy Young Adults: description and use of an innovative health insurance program. J Adolesc Health. 41 (4), 350-356 (2007).
- Day, J. J., et al. Associative learning mediates dynamic shifts in dopamine signaling in the nucleus accumbens. Nature Neuroscience. 10 (8), 1020-1028 (2007).
- Park, J., et al. Catecholamines in the bed nucleus of the stria terminalis reciprocally respond to reward and aversion. Biol Psychiatry. 71 (4), 327-334 (2012).
- Wheeler, R. A., Carelli, R. M. The neuroscience of pleasure. Focus on 'Ventral pallidum firing codes hedonic reward: when a bad taste turns good. J Neurophysiol. 96 (5), 2175-2176 (2006).
- Bunin, M. A., et al. Release and uptake rates of 5-hydroxytryptamine in the dorsal raphe and substantia nigra reticulata of the rat brain. J Neurochem. 70 (3), 1077-1087 (1998).
- Zimmerman, J. B., Wightman, R. M. Simultaneous electrochemical measurements of oxygen and dopamine in vivo. Anal Chem. 63 (1), 24-28 (1991).
- Levy, A., et al. A novel procedure for evaluating the reinforcing properties of tastants in laboratory rats: operant intraoral self-administration. J Vis Exp. (84), e50956 (2014).
