Protocol
Все эксперименты были проведены в соответствии с Национальными Институтами (NIH) Руководство здравоохранения для ухода и использования лабораторных животных и были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета Йельского университета (IACUC) по.
1) Предварительно хирургические Препараты
- Оральный приготовления раствора
- Создание решения 10% сахарозы и 0,005% L-ментола в деионизированной воде (рН 7,4). Храните эти решения в закрытых контейнерах, при комнатной температуре, и переделать каждые 2 недели, чтобы предотвратить деградацию.
- Калибровки электрода решения
- Сделать Трис буфера (рН 7,4) в любой момент до калибровки. Решение состоит из 12,0 мМ Трис-HCl, 140 мМ NaCl, 3,25 мМ KCl, 1,20 мМ CaCl2, 1,25 мМ NaH2PO4, 1,20 мМ MgCl 2, и 2,00 мМ Na 2 SO 4.
- Создание исходного раствора 10 мМ дофамина (DA гидрохлорида допамина) в 0,1 М раствора хлорной кислоты. Хлорная кислота помогает предотвратить окисление допаминае. Храните этот маточный раствор при -20 ° C и использовать в течение 6 месяцев. Сделайте несколько аликвот DA раствора для хранения для использования каждый аликвоту только один раз.
- Из складе 10 мМ Д.А., разбавленные растворы в трис-буфере до концентрации 1 мкМ, 500 нМ, 250 нМ, 125 нМ, 62,5 нМ, и 31,25 нМ.
- Для калибровки рН, готовят растворы Tris буфер с рН 7,2, 7,3, 7,5, и 7,6. Это обеспечит решения, которые имитируют рН сдвиги, которые могут возникнуть в ходе эксперимента в естественных условиях.
- Изготовление электродов
- По вакуумного вакуумом, аспирации Т-650 углеродного волокна (7 мкм в диаметре) в боросиликатного стеклянного капилляра (длина 10 мм, внешний диаметр 0,6 мм, внутренний диаметр 0,4 мм).
- Поместите стеклянный капилляр, заполненный углеродного волокна в вертикальной электрода съемник. Для начальных параметров, установите обогреватель до 55.0 и выключите магнит. Тем не менее, дальнейшая оптимизация может быть необходимо и как нагреватель и магнитные параметры различаются птом лаборатории в лабораторию.
Примечание: Электрод должен быть не менее 5,5 см (в том числе конусности), так что он может легко устанавливаться в микроманипулятором и быть вставлен по меньшей мере, 6,9 мм ниже твердой мозговой оболочки в головном мозге крыс. Если электрод является слишком коротким, записи из брюшной части прилежащего ядра не будет достижима. С другой стороны, общая длина электрода не должна превышать 6,5 см, иначе будет слишком долго, чтобы вписаться в микроманипулятора. - С помощью светового микроскопа, сократить подвергается углеродного волокна так, что она простирается 75-100 мкм за пределами конца стекла. Убедитесь, что электрод имеет очень плотно, едва различимый, уплотнение между стеклянного электрода и углеродного волокна, которое будет производить минимальное шум во время последующей записи. Откажитесь от электрода, если есть какие-либо заметные трещины в стекле или если печать ослаблен, что свидетельствует о плохой печатью. Для получения более подробных инструкций см [12] и [13].
- Сборка электрод в микрофонromanipulator
- Получить 3 в, 30G провод, который изолирован вдоль половины длины провода и использовать маленькую кисть, чтобы применить тонкий слой серебра рисовать непосредственно к проводу. Сразу после нанесения краски серебра, вставьте провод в отверстие на верхней части электрода, чтобы обеспечить физическую и электрическое соединение с углеродным волокном. Под микроскопом, убедитесь, что провод серебра вступает в контакт с углеродным волокном.
- Закрепите серебряной проволоки и электродов в микроманипулятора использованием термоусадочной.
- Поместите подготовленную углеродного волокна электрода в очищенной изопропилового спирта (IPA) в течение, по меньшей мере 10 мин, чтобы очистить поверхность электрода и последующее увеличение чувствительности к допамина. После вымачивания в ПНД, промыть углеродного волокна с водопроводной водой, чтобы удалить IPA.
- Электрод изготовление
- Возьмите 13 мм серебряную проволоку, содержащую приблизительно 6 мм Ag / Ag Cl сетки (7 мм серебряную проволоку в одиночку, 6 мм сетка, диаметр 0,4 мм),сократить серебряную часть примерно до половины своей первоначальной длины и припаять серебряную часть провода к золотой булавкой.
- Применить эпоксидную смолу на припой на булавки.
- Падение Ag / Ag Cl сетки конец в сополимер 5% политетрафторэтилен и перфтор-3,6-диокса-4-метил-7octene-сульфоновой кислоты в 5 раз, с периодами 30 мин сушки воздухом между каждым погружением.
- Разрешить покрытием Ag / Ag Cl сетки, чтобы воздух сухой O / N.
- Лечение в духовке при 120 ° С в течение 1 ч.
2) Комбинированный Интраоральная хирургии и хирургии внутричерепного катетеризации (примерно 75 мин)
- Оральный изготовление катетера
- Сделать устный катетер, и стерилизовать стерилизации оксидом этилена, по крайней мере, за 10 дней до операции.
- Вырезать PE 100 трубки в 6 см длиной сегментов.
- Использование паяльник, расплавить один конец трубки PE и сразу нажмите на твердой поверхности, чтобы охладить трубы PE. Результат должен создатьнебольшой, плоский диск на одном конце трубки PE и не должны фланцевое. Используйте иглу (18 G) или нажать штифт, чтобы создать дыру в центре этого диска.
- С другой конец трубки PE, плотно вставить тупой конец иглы 18 G в трубу.
- Используя стандартный перфоратор бумаги отверстие, удар несколько круговых куски политетрафторэтилен листа (толщиной 3,18 мм, 6 мм в диаметре), чтобы создать политетрафторэтилен шайбы.
- Создать отверстие в центре шайбы. Возьмите иглу, присоединенную к трубке PE и задвиньте его через шайбу. Как только игла через, слайд шайбу в нижней части трубки PE, так чтобы она была вровень с шайбой.
- Хирургическая стоматология
- После стерилизации хирургических инструментов, канюлю (обрезается до 2,5 мм ниже пьедестал перед стерилизацией), и электрод сравнения, анестезию крыс путем внутрибрюшинной инъекции кетамина (100 мг / кг) и ксилазина (10 мг / кг).
- Мтер 5 мин, применять вредные тест стимула (ноги или хвост щепотку), чтобы оценить уровень анестезии. Если предметом показывает любую физическую реакцию на испытания вредных стимулов (дрогнул ответ, увеличение дыхательной или сердечно-курсу), администрирование кетамин повышение на 10% до 15% от первоначальной дозы и повторить протокол вредных стимулов выше.
- После крыса полностью под наркозом и не показывает никакой реакции на тест вредных стимулов, использовать машинки для стрижки волос животных для бритья мех крысы из глаз около 2 мм позади ушей. Затем поместите крысу на тонкой воды рециркуляции грелку для поддержания температуры тела во время операции. Применить глаз смазку. Администрирование нестероидные противовоспалительные (НПВП) препарат, Carprofen (5 мг / кг), по внутрибрюшинно перед выполнением каких-либо разрезов и до введения канюли внутриротовые. Используйте асептики во все времена.
- Применение бетадин с последующим 70% -ным этанолом, чтобы очистить кожу. Повторите 3 раза.
- Пласе крысу на спину, и открыть рот с помощью стерильного ватного тампона. Найти первый верхний коренной зуб.
- Вставьте иглу в ткань между щекой и первой верхней мол, пока игла не выходит позади и медиальнее ушах.
- Пирс иглу через кожу, пока трубки PE выходит из кожи и доступен.
- Поднимите канюли (захвата самим канюли и не иглы) и закрепите политетрафторэтилен шайбу в моляров, так что катетер остается на месте.
Примечание: Резка шайбу в форме трапеции и обеспечения его против коренных с плоской стороной, обращенной к щеке делает этот шаг легче. - Возьмем другой политетрафторэтилен шайбу и вставьте его на открытой иглы, вниз пластиковой трубки, и упираться в разрез.
- Для обеспечения политетрафторэтилен шайбу, используйте стерилизовать ленты, чтобы создать треугольную "флаг", так что машина не скользит вверх. Безопасный мытьэ к коже крыс и стерилизованного ленты.
- Вырезать подвергается катетер, чтобы 2-4 см из трубки подвергаться над головой крысы.
- Повторите этапы 2.2.1 через 2.2.10 для другой стороне рта.
- После стерилизации хирургических инструментов, канюлю (обрезается до 2,5 мм ниже пьедестал перед стерилизацией), и электрод сравнения, анестезию крыс путем внутрибрюшинной инъекции кетамина (100 мг / кг) и ксилазина (10 мг / кг).
- Внутричерепное хирургия вольтамперометрии
- Поместите крысу в стереотаксической рамы и очистить кожу головы животного, используя два этапа скраб (с бетадин скраб с последующим 70% этанола скраба, выполните с повторением 3 цикла).
- Используйте стерилизованные иглы нос пинцет и хирургические ножницы, чтобы вырезать 15 х 15 мм сечение кожи головы с.
- Аккуратно очистите поверхность черепа, используя стерилизованные хлопок наконечник аппликаторы. Кроме того очистить череп с применением 2 до 3 капель 3% перекиси водорода.
- Используйте стереотаксической дрель, чтобы сделать 3 маленьких (диаметром 1 мм) отверстия в черепе для последующей вставки винтов, 1 отверстие для направляющей канюли, 1 отверстие для стимулирующего электрода и 1 отверстие для опорного избранныхехал.
- Для записи в ядре NAc, положение направляющей канюли 1,2 мм передней и 1,4 мм латеральнее брегмы. Опустите канюли аппарат до тех пор, пластиковая основа не находится на одном уровне с черепом.
- Поместите стерилизовать электрод в полушарии контралатеральный направляющей канюли. Опустите ссылка примерно 2 мм ниже твердой мозговой оболочки.
- Расположите стимулирующий электрод 5,2 мм кзади и 1,0 мм сбоку брегмы и опустил 8.0 мм ниже твердой мозговой оболочки целевой вентральной области покрышки (VTA).
- Используйте стерилизованные небольшой хирургической отвертки Винты с черепом. Затем вставьте электрод, стимулирующий электрод, и направлять канюли. Наконец, закрепите все компоненты, используя cranioplastic цемента.
- За первые 48 часов послеоперационного ухода, управлять нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП) Carprofen подкожной инъекции (5 мг / кг). Позвольте по крайней мере 1 неделю для полного хирургического восстановления до выполнения voltamЗапись метрия.
- Во время послеоперационного ухода, скрытой полости рта катетеры ежедневно с водой. Обеспечить питание насыщенный в воде в течение 2 дней, чтобы помочь животному в жевании и еды. Обеспечить ежедневный мониторинг потенциальных признаки стресса боли (из-за слабой инфекции или обезвоживания) и обеспечивают надлежащих мер по мере необходимости (в том числе введения жидкостей, местного введения антисептиков и введением НСПВС или Carprofen в дозе 5 мг / кг).
3) вольтамперные Записи в Пробудитесь, свободно движущихся крыс
- Снижение электрод и приобретения обучающий набор DA.
- В день эксперимента, проверить проходимость полости канюли, вливая 200 мкл воды и наблюдая Орофациальные ответов (чтобы убедиться, что крыса дегустации воды).
- Прикрепите FSCV headstage к крысе, вставив стимулирующий электрод (на headstage) в биполярной стимулирующего электрода cannuла (на крысах). Таким образом, headstage (миниатюрный преобразователь ток-напряжение) подключается непосредственно к биполярной стимуляции электрода.
- Удалить заглушку канюли с канюлей аппарата и применить две капли 50% -ного раствора гепарина в канюлю. Затем аккуратно вставьте фиктивный канюли (чуть больше, что манекен канюли, который ранее был удален), чтобы очистить сгустков крови или глиальных рубцов, которые могли возникнуть, которые будут нарушать углеродного волокна электроды, которые впоследствии будут вставлены в ходе эксперимента. Продлить канюли используется для очистки сгустки 3-4 мм ниже черепа (по крайней мере 2 мм выше места записи).
- Вставьте микроманипулятор, с электродом в направляющей канюли и место омега кольцо в положение "закрыто".
- Подключите электродный провод от headstage к соответствующему штифта. Затем подключите электродной проволоки работает с микроманипулятора к соответствующему проводу на headstage.
- Опустите Elecрастоптал примерно 4-4,5 мм ниже черепа.
- Используйте потенциостата применять треугольной формы (400 В / с, -0.4 до +1.3 V). Нанесите сигнала к электроду при 60 Гц в течение по крайней мере 10 мин, затем измените частоту сигнала приложений до 10 Гц в течение последующих экспериментальных записей.
Примечание: шаг применение сигнала 60 Гц производит устойчивую поверхность углеродного волокна и поможет предотвратить электрический дрейф - Применение электрической стимуляции в ВТА с использованием различных частот (от 10 до 60 Гц) импульсы (от 10 до 30 импульсов) и токи (от 50 до 150 мкА) все с длительностью импульса 2 мс / фазы, чтобы вызвать различные концентрации DA выпуска и рН сдвиги. Приобретать по крайней мере 5 различных концентраций DA-релизе и 5 различных сдвигов рН. Подождите (2 - 3 мин минимум) между раздражениями, чтобы позволить везикулярного перегрузки [14].
Примечание: Важно, чтобы получить стимуляции, которые производят концентрации DA во всем диапазоне, которые будут собраны в ходе последующегоЭксперимент, так как они будут использованы в качестве обучающего множества для анализ главных компонентов (раздел 5.1). - Опустите электрод в ядре NAC (6.3 мм брюшной к твердой мозговой). Впоследствии снизить электрод с шагом 100 мкм в пределах активной зоны NAc до переходных процессов высвобождения DA не наблюдаются на частотах по крайней мере 1 в мин.
- Подключение трубки (внутренний диаметр 1/32 ", наружный диаметр 3/32") на 20 мл шприц, прикрепленной к шприцевой насос. На другом конце трубки, использовать скошенную 23 G иглу для подключения трубки с канюлей крысы. Убедитесь, что трубки полностью заполнен требуемой tastant и убедитесь, что не существует никаких пузырей в трубке.
Примечание: Как правило, вводить небольшое количество tastant в рот крысы перед записью, чтобы гарантировать, что первое вливание для записи обеспечивает полный объем инфузии и не остаточной воды или воздуха в трубке. Кроме того, это позволяет животному иметь некоторый опыт остроумиеч tastant с новым Tastants, даже с аппетитом те, может быть отвращение изначально из-за своей новизны. - Для сбора данных, влить 200 мкл tastant (6,5 сек с использованием насоса и насосно-компрессорных описано выше). Настаивать tastant каждые 1-3 мин. Настаивать в общей сложности 25 раз в tastant. Каждый инфузии обеспечивает 200 мкл раствора.
- Если несколько Tastants доставляются в одном эксперименте, промойте ротовую катетер с водой после сбора данных для одного tastant и подождите не менее 20 мин до вливая новую tastant.
- После записи сессии Д.А., подготовить для гистологического подтверждения путем создания небольшой очаг на месте записи. Чтобы сохранить углеродного волокна электрода для последующей калибровки, сначала убрать электрод и снимите микроманипулятор. Затем с помощью нового микроманипулятор со стеклянной микроэлектрода и вольфрамовой проволоки (100 мкм, проходящей за кончик стекла) в той же самой глубине (ниже твердой мозговой оболочки) в качестве исходного углерода FИбер микроэлектрод.
- Для гистологического подтверждения, создать небольшой очаг, применяя 3 V на вольфрамовой проволоки и увеличением напряжения с шагом 1 В, каждые 10 сек, пока установка 10 V не достигается.
- Если стандартная кривая концентрация уже была создана с помощью нескольких электродов из углеродного волокна, выполнять этап поражения выше (3.1.14), применяя потенциал непосредственно на электрод из углеродного волокна.
Примечание: Этот метод поражение может привести к повреждению углеродного волокна и предотвратить последующее калибровку с этой конкретной электрода. - Эвтаназии животное, используя смертельную инъекцию пентобарбитала (150 мг / кг, IP).
- Выбить headcap с использованием канюли плоскогубцы, потянув прямо вверх по headcap. Не крутите headcap, так как это вызовет ненужные повреждения мозга и сделать его сложным, чтобы определить расположение электрода во время гистологии.
- Удалить мозга и место в 4% формалине в течение 3 дней, затем на 30% суCrose в течение 1 недели. Создайте 30 мкм ломтиками, используя криостат, крепление на покровные стекла и изучить ломтики под световым микроскопом, чтобы определить расположение углеродного волокна или вольфрама поражения.
Примечание: перфузии является обязательным для 3.1.17.
- Удалить мозга и место в 4% формалине в течение 3 дней, затем на 30% суCrose в течение 1 недели. Создайте 30 мкм ломтиками, используя криостат, крепление на покровные стекла и изучить ломтики под световым микроскопом, чтобы определить расположение углеродного волокна или вольфрама поражения.
4) Электрод калибровки
- Использование проточной ячейки, чтобы создать коэффициент преобразования тока концентрации.
- Для того чтобы определить чувствительность электрода, калибровки электродов после каждого эксперимента с использованием проточного аппарата "Т-клеток". Опустить электрод в "Т-клеток", а Трис-буфер, рН растворов или растворов DA промывают по поверхности электрода (со скоростью 2 мл / мин). Используйте шесть положение воздушного электромагнитный привод с, чтобы вернуться и вперед между буфером и рН раствора или DA.
- Для каждой калибровки, собирать данные вольтамперные течение 5 сек применения трис-буфере (исходный уровень), а затем 5 сек применения рН раствора или DA, затем 20 сек AРИМЕНЕНИЕ Трис буфера (всего файлов 30 сек). Повторите каждый прогон 3 раза для каждой стандартной калибровочной концентрации, уравновешивая между различными концентрациями каждого стандарта.
- Для каждого отбора проб, измерения пика DA или рН-вызывала ток. Нормальное пиковый ток через каждом испытании, чтобы получить концентрацию в сравнении пикового отношения тока. Для получения более подробных инструкций см [12] и [13].
5) Анализ данных
- Использование обучающего множества в основной компонентного анализа (РСА)
Примечание: Во время эксперимента вольтамперометрии, выход производится как ток, который является результатом окисления дофамина и снижение рН, сдвигов и электрохимического шума. РСА позволяет разделение этих факторов таким образом, чтобы можно выделить нужные компоненты (DA и рН) и удалить дополнительные компоненты, которые могли бы исказить полезные сигналы (для более подробного описания, см 15, 16).- Связать калибровочный коэффициент для йе выходной ток (приблизительно 5-10 нА / мкм) после СПС, чтобы величины концентрации аналитов, которые будут определены.
- Используйте набор обучения, полученную в ходе эксперимента по "поезд" модель СПС выделить DA, рН и другие факторы. СПС занимает обучение набор циклических вольтамперограммы (собранной в разделе 3.1.8) и определяет, какие основные характеристики вольтамперограмме могут быть использованы для идентификации каждого аналита, собранную во время в естественных условиях вольтамперограммах записей.
- Чтобы определить число главных компонентов, чтобы держать, использовать Малиновского F-тест. Как правило, оставить только 2 или 3 основные компоненты, которые обычно объясняют о 95-99% дисперсии в данных. Для дальнейшего обсуждения реализации F-тест Малиновского, 17 см.
Примечание: После того, как количество компонентов определяется, анализ СПС эффективно будет проецировать измеренные вольтамперограммы из DA и обучение рН устанавливает на главные компоненты, которые были сохранены.Результат представляет собой набор данных, которые были отфильтрованы так, что только данные DA (или рН) остается и остаточные данные, что не похожи на DA или рН удаляется (См Представитель результаты ожидаемого результата). Для дальнейшего детального объяснения и шаг за шагом инструкции для использования СПС для вольтамперометрической анализа см Материалы лист и 16, 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FSCV в сочетании с внутриротовой катетера имплантации был использован для изучения, как сахароза, в аппетитивную tastant, модулирует фазовое DA-релиз в ядре НАК. До tastant инфузии, электрической стимуляции (150 мкА, 60 Гц, 24 импульсов, с указанием красной полосой) в VTA производит надежные увеличение фазовый Д. выпуска в NAC (рис 1) Рис 1 показывает цветную участок с потенциалом на. Ось ординат, время на оси абсцисс, а ток (представлены в условных цветах) на оси. Ниже цвета участка концентрации Д.А. от времени следа. Концентрация в зависимости от времени была определена с помощью тока от времени следы на окислительным потенциалом допамина (обозначено пунктирной белой линии), который превращают в концентрации, следующего после калибровки электрода. Эта концентрация DA в зависимости от времени след был использован как часть подготовки, установленной на PCA.
После обучения набор был приобретены, 25 вливания сахарозы(10%, 200 мкл на инфузии) получали каждые 1-3 мин. Примеры сахарозы модуляции фазовый выпуска DA показаны на рисунках 2 и 3. На рисунке 2, 6,5 сек инфузии (обозначено красной полосой) вызывает повышение тока (обозначено белой, стрелку вниз) в окислительном потенциале ДА (обозначено белой пунктирной линией). Преобразование данных в концентрации от времени после участка РСА проверяется, что увеличение тока в ответах на tastant является результатом увеличения концентрации DA. Еще tastant, ментол (0,005%, 200 мкл на инфузии) также проникнуты во FSCV записей в ядре NAc. Рисунок 3 показывает концентрацию DA против пример раз следы на интраоральных сахарозы и ментола, открывая повышенную концентрацию DA после инфузии либо tastant , Следует ожидать, чтобы увидеть некоторые испытания к испытанию изменчивости фазовый выпуска DA к Tastants (рисунок 2 и 3А), Тем не менее, мы обычно не видим никаких неспецифические тенденции к увеличению или уменьшению фазовый Д. выпуска по нескольким испытаний. Диапазоны от 10-100 нм DA можно ожидать в типичном эксперименте в одном животном.
Рисунок 1. Представитель цвет участок (сверху) и концентрация в зависимости от времени участка (внизу) электрически вызывал DA-релизе в ядре NAc. Красная полоса указывает время стимуляции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Представитель цвет участок (вверху) и концентрация DA в зависимости от времени следа (внизу) в течение одного вливания сахарозы. Красный бAR показывает 6,5 сек настой. Белый стрелку вниз указывает на возвышении в ток (представлена в условных цветах) на окислительным потенциалом DA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Концентрация представитель Д.А. против времени следы во (A) 10% сахарозы и (B) 0,005% ментола по внутриротовой администрации. Красная полоса указывает на 6,5 сек интраоральную настой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Интраоральная доставка tastant в сочетании с FSCV позволяет анализ "реального времени" ответов на устные DA ароматизаторами. Есть три важных шагов в протоколе, которые необходимы для успешных измерений DA. Во-первых, собственно имплантация полости катетера имеет решающее значение для доставки ароматизаторов. Обеспечение того, чтобы катетер позади первого моляра и зажатый в место предотвращает катетер от потери проходимости и предотвращает случайное удаление животным. Промывка катетера в течение первых нескольких дней после восстановления также важно, так как мягкая пища дается животному в течение первых 2 или 3 дней после операции может засорить катетер. Во-вторых, качество электрода является критическим для повышения отношения сигнал-шум в свободно движущейся крыс. В некоторых случаях, электроды, которые визуально кажутся высокого качества и хорошем состоянии по-прежнему может дать шумные сигналы. Один из способов устранения этой проблемы является принятие базовых записей в Dorsal стриатуме (4 мм ниже твердой мозговой оболочки). Если электрод производит слишком много шума, электрод может быть удалена и заменена новой электрода до проведения эксперимента в основной записи сайте NAC (6-7 мм ниже твердой мозговой оболочки). Третий критический шаг находит подходящее место записи в адресной области мозга, где спонтанные события релиз DA ("переходные") наблюдаются в достаточной частотой (по крайней мере 1 раз в мин) с достаточными увеличивается в концентрации DA (по крайней мере, 20 нМ 40 нМ). Эта оптимизация будет гарантировать, что спонтанные события релиз фазовое DA могут быть обнаружены в конкретном месте, до ароматизатора администрации. Понижение электрод шагом, эквивалентным размеру открытой углеродного волокна (50-100 мкм) максимизирует вероятность нахождения сайта записи с обнаруживаемыми переходных процессов.
Одним из важных предостережение FSCV является невозможность определить абсолютную концентрацию анализируемого вещества в момент времени, так как это FSCV дифдифференциальный метод, который измеряет относительные изменения концентрации (по сравнению с устойчивой базовой) в течение каждого записываемого файла вольтамперометрии. Тем не менее, дифференциал метод также позволяет для количественного определения доли секунды колебания в концентрации дофамина в ответ на оба полезных и отвращение Tastants 5. В контексте никотиновой зависимости, табачных добавок продукции, такие как ментол и устных подсластителей, как было показано, влияют на поведение курящих 18 и были недавно запрещены в сигаретах (для ментола, кроме) в семье курящих Закон борьбы против табака Профилактика и. Таким образом, внутриротовая доставка в сочетании с FSCV обеспечивает важную методологическую инструмент, который может быть использован для изучения, как ароматизаторы продуктов табачные может изменить DA сигнализации, и, возможно, армирующие свойства никотина.
Здесь мы описали метод объединения интраоральную tastant настой с FSCV с целью измерения фазовый DAвыпустить в ответ на первичных tastant раздражители. Важно отметить, что в то время как наша техника позволяет исследовать фазовый Д. выпуска в Tastants независимых действий или выбора, это также возможно, что неожиданный характер поставки tastant может повлиять фазовое DA-релиз 19. Таким образом, правильное решение управления, такие как вода или искусственной слюны, может быть использован в контрольных экспериментах, чтобы сравнить и изучить последствия неожиданного вознаграждение или стимула на фазовый Д. выпуска независимо от tastant интересов. Тем не менее, этот метод не ограничивается либо измерений DA выпуска или вознаграждения. Например, предыдущая работа рассмотрел норэпинефрина релиз как во время награды и отвращения 20. Так как животные не легко потреблять отвращение Tastants интраоральную tastant настой с FSCV это единственный метод для измерения фазовое высвобождение DA, чтобы отвращение Tastants. Тем не менее, этот метод не определить, действительно ли это tastant отвращение илиppetitive, скорее, просто измеряет DA-релиз в течение потребления tastant. Для того чтобы определить гедонической значение tastant, поведенческие тесты могут быть включены, чтобы наблюдать реакцию орально-лицевых во вкус реактивности (как описано в другом месте 5, 21).
Следует также отметить, что FSCV также подходит для измерения других важных нейрохимические вещества, такие как серотонин и кислорода 22 23, но методы записи этих аналитов в активных, свободно движущихся животных еще не доступны. Кроме того, с комбинированным методом вольтамперометрии и в полости рта инфузии, время автоподстройки допамина ответы на tastant доставки могут быть проанализированы в отсутствии других форм поведения, таких как поведение подхода или поиска пищи, что также может повлиять на DA-релиз. В качестве дополнительного приложения, в сочетании внутриротовая доставка tastant и FSCV может быть идеально подходит для измерения сигналов DA к награждению или неприятным событиям во оперантного или павловской conditioniнг. В самом деле, недавняя публикация Юпитер Леви и коллегами сочетает в полости рта доставки tastant с оперантного поведения, чтобы определить, поддерживают ли внутри устные Tastants приобретение и обслуживание поведения оперантного самоуправления 24. Таким образом, такие способы могут быть объединены с FSCV чтобы определить фазовый DA ответ на устные Tastants во поведения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stimulating electrode | PlasticsOne | MS303/2-A/SPC | when ordering, request a 22 mm cut below pedestal |
| Cannula for electrode | BioAnalytical Systems | MD-2251 | |
| Glass capillary | A-M systems | 624503 | |
| Carbon fiber | Thornel | T650 | |
| Electrode puller | Narishige International | PE-22 | |
| Neurolog stimulus isolator |  Digitimer Ltd. |
DS4 | |
| Heat shrink | 3M | FP-301 | |
| Insulated wires for electrodes | Squires electronics | Custom | L 3.000 x 1.000s x 1.000s UL1423 30/1 BLU |
| Micromanipulator | Univ. of Illinois at Chicago, Engineering Machine Shop | ||
| Epoxy | ITW Devcon | 14250 | "5 minute epoxy" |
| Copolymer of perfluoro-3,6-dioxa-4-methyl-7octene-sulfonic acid and tetrafluoroethylene | Ion Power | LQ-1105 | i.e., Nafion |
| Silver paint | GC Electronics | 22-023 | |
| Power supply | BK Precision | 9110 | |
| Tubing for intra-oral catheters | Intramedic | 427426 | PE 100, I.D. = 0.86 mm; O.D. = 1.52 mm |
| Tubing for intra-oral infusion | Fischer Scientific | 02-587-1A | I.D. 1/32"; O.D. 3/32" |
| Syringe pump for flow cell | Pump Systems Inc. | NE 1000 | |
| Surgical cement | Dentsply Caulk | 675571 and 675572 | |
| Air actuator | VICI | A60 | 6 position digital valve interface |
| Digital valve interface | VICI | DVI | 230 VAC |
| Quad headstage | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | ||
| UEI power supply | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | ||
| UEI breakout box | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | ||
| Power supply for tastant syringe pump | Med Associates | SG-504 | |
| Tastant syringe pump | Med Associates | PHM-107 | |
| Tungsten microelectrode | MicroProbes | WE30030.5A3 | |
| Silver wire reference with AgCl | InVivo Metric | E255A | |
| Sucrose | Sigma | 80497 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| Sodium chlroide | Sigma | S7653 | |
| Perchloric acid | Sigma | 244252 | |
| Hydrochloric acid (4 M) | Sigma | 54435 | |
| Soidum hydroxide | Sigma | 306576 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma | H1009 | |
| Dopamine hydrochloride | Sigma | H8502 | |
| TarHeel HDCV Software | University of North Carolina-Chapel Hill | Must request software: click here for link to software request page |
References
- Roitman, M. F., et al. Dopamine operates as a subsecond modulator of food seeking. J Neurosci. 24 (6), 1265-1271 (2004).
- Aragona, B. J., et al. Regional specificity in the real-time development of phasic dopamine transmission patterns during acquisition of a cue-cocaine association in rats. European Journal of Neuroscience. 30 (10), 1889-1899 (2009).
- Wheeler, R. A., et al. Cocaine cues drive opposing context-dependent shifts in reward processing and emotional state. Biol Psychiatry. 69 (11), 1067-1074 (2011).
- Wickham, R. J., et al. Advances in studying phasic dopamine signaling in brain reward mechanisms. Front Biosci (Elite Ed). 5, 982-999 (2013).
- Roitman, M. F., et al. Real-time chemical responses in the nucleus accumbens differentiate rewarding and aversive stimuli). Nature Neuroscience. 11 (12), 1376-1377 (2008).
- Cheer, J. F., et al. Phasic dopamine release evoked by abused substances requires cannabinoid receptor activation. J Neurosci. 27 (4), 791-795 (2007).
- Owesson-White, C. A., et al. Neural encoding of cocaine-seeking behavior is coincident with phasic dopamine release in the accumbens core and shell. Eur J Neurosci. 30 (6), 1117-1127 (2009).
- Phillips, P. E., et al. Subsecond dopamine release promotes cocaine seeking. Nature. 422 (6932), 614-618 (2003).
- Chen, C., et al. Levels of mint and wintergreen flavorants: smokeless tobacco products vs. confectionery products. Food Chem Toxicol. 48 (2), 755-763 (2010).
- Manning, K. C., Kelly, K. J., Comello, M. L. Flavoured cigarettes, sensation seeking and adolescents' perceptions of cigarette brands. Tob Control. 18 (6), 459-465 (2009).
- Rainey, C. L., Conder, P. A., Goodpaster, J. V. Chemical characterization of dissolvable tobacco products promoted to reduce harm. J Agric Food Chem. 59 (6), 2745-2751 (2011).
- Phillips, P. E., et al. Real-time measurements of phasic changes in extracellular dopamine concentration in freely moving rats by fast-scan cyclic voltammetry. Methods Mol Med. 79, 443-464 (2003).
- Robinson, D. L., Wightman, R. M. Rapid Dopamine Release in Freely Moving Rats. Electrochemical Methods for Neuroscience. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2007).
- Montague, P. R., et al. Dynamic gain control of dopamine delivery in freely moving animals. J Neurosci. 24 (7), 1754-1759 (2004).
- Heien, M. L., Johnson, M. A., Wightman, R. M. Resolving neurotransmitters detected by fast-scan cyclic voltammetry. Anal Chem. 76 (19), 5697-5704 (2004).
- Keithley, R. B., Heien, M. L., Wightman, R. M. Multivariate concentration determination using principal component regression with residual analysis. Trends Analyt Chem. 28 (9), 1127-1136 (2009).
- Keithley, R. B., Carelli, R. M., Wightman, R. M. Rank estimation and the multivariate analysis of in vivo fast-scan cyclic voltammetric data. Anal Chem. 82 (13), 5541-5551 (2010).
- Rising, J. P., et al. Healthy Young Adults: description and use of an innovative health insurance program. J Adolesc Health. 41 (4), 350-356 (2007).
- Day, J. J., et al. Associative learning mediates dynamic shifts in dopamine signaling in the nucleus accumbens. Nature Neuroscience. 10 (8), 1020-1028 (2007).
- Park, J., et al. Catecholamines in the bed nucleus of the stria terminalis reciprocally respond to reward and aversion. Biol Psychiatry. 71 (4), 327-334 (2012).
- Wheeler, R. A., Carelli, R. M. The neuroscience of pleasure. Focus on 'Ventral pallidum firing codes hedonic reward: when a bad taste turns good. J Neurophysiol. 96 (5), 2175-2176 (2006).
- Bunin, M. A., et al. Release and uptake rates of 5-hydroxytryptamine in the dorsal raphe and substantia nigra reticulata of the rat brain. J Neurochem. 70 (3), 1077-1087 (1998).
- Zimmerman, J. B., Wightman, R. M. Simultaneous electrochemical measurements of oxygen and dopamine in vivo. Anal Chem. 63 (1), 24-28 (1991).
- Levy, A., et al. A novel procedure for evaluating the reinforcing properties of tastants in laboratory rats: operant intraoral self-administration. J Vis Exp. (84), e50956 (2014).
