Medicine

מודל שיתוף תרבות תלת-ממדי לגידול אינטראקציה-סטרומה

Published: February 2, 2015 doi: 10.3791/52469

Masafumi Horie^1,2, Akira Saito^1,3, Yoko Yamaguchi⁴, Mitsuhiro Ohshima⁵, Takahide Nagase¹

¹Department of Respiratory Medicine, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, ²Department of Clinical Laboratory, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, ³Division for Health Service Promotion, The University of Tokyo, ⁴Department of Biochemistry, Nihon University School of Dentistry, ⁵Department of Biochemistry, Ohu University School of Pharmaceutical Sciences

Protocol

הערה: מחקר זה אושר על ידי ועדות האתיקה המתאימות.

1. יסודי תרבות של Fibroblasts ריאות האדם

אוסף של רקמת ריאה:
1. להשיג דגימות רקמת ריאה אנושיות מחדר הניתוח כירורגי ישירות. לאסוף כ 1 סנטימטר ³ בלוקים מרקמת ריאה סרטנית ולא-סרטנית, עם המדגם שאינו סרטני שנאסף כרחוק מן הגידול ככל האפשר.
2. להשעות את הדגימות במדיום של הנשר שונה Dulbecco (DMEM) בתוספת 100 יחידות / מיליליטר פניצילין, 100 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מיליליטר ו 0.25 מיקרוגרם / מיליליטר amphotericin B (בינוני סרום ללא). לשמור על הדגימות התלויות בצינורות 50 מיליליטר סטרילי ולהעביר למעבדה.
  הערה: פיברובלסטים הם נוהג לנדוד ופרוליפרטיביים לעומת סוגי תאים אחרים, כגון אפיתל, אנדותל ותאי שריר חלק. שיטת תולדה מנצלת תכונות של fibroblasts אלה, וoutgroתאי כנף מסעיפי רקמות נמצאים בשפע בfibroblasts. לאחר כמה קטעי תא, סוגי תאים אחרים לא יצליחו לשרוד ולהפיץ בDMEM עם 10% בסרום שור עוברי (FBS), וכתוצאה מכך בתרביות תאי פיברובלסטים מטוהרים. יכולים לשמש התאים 3-7 קטעים הבאים תרבות העיקרית.
תרבות explant ואוויר לתולדת תא:
1. בצע תרבות העיקרית של fibroblasts באמצעות פרוטוקול שדווח בעבר עם שינויים ^5.
2. במעבדה, למקם את דגימת הרקמה על צלחת תרבית רקמת 10 סנטימטרים מבלי מדיום התרבות וחתוך לחלקים קטנים ~ 2-3 מ"מ בגודל באמצעות מלקחיים סטרילית ואזמל. במהלך תהליך זה, להימנע מיבש הסעיף, אחרת היעילות של תולדת תא נפגמת.
הפרדה של שכבת תאי האפיתל ורקמת חיבור:
1. משרים את חלקי רקמות קיצוץ במדיום תרבות המכיל 2,000 PU / מיליליטר dispase אני ותרבות במשך 16 שעות על 4 מעלות צלזיוס. </ Li>
2. העבר את סעיפי רקמות לצלחת, ולהפריד את שכבת תאי האפיתל מרקמת חיבור הסמוכה. לעבד את החלקים בספסל נקי כדי למנוע זיהום של מיקרואורגניזמים.
  הערה: אם יש צורך בתרבות העיקרית של תאי אפיתל, לבצע שלב 1.3. אם fibroblasts רק הם להיות מבודד, להשמיט צעד 1.3 בגלל מעברי תרבות explant והתא הבאים הם שליליים עבור תאי אפיתל, אשר יניבו אוכלוסיות פיברובלסטים מטוהרים.
קובץ מצורף של סעיפי רקמות:
1. לרכך את הרקמות לחתיכות 1 מ"מ באמצעות שני אזמלים. אם החלקים אינם קטנים מספיק, הם לנתק בקלות רבה יותר מהצלחת, והתאים לא יצליחו להיגמל על פני השטח הצלחת.
2. הנח קטעי רקמת ריאות קטנים זו מזו כדי לשמור על אזור ריק המקיף את כל חתיכה. הפוך סריטות על פני השטח של צלחת תרבית רקמה באמצעות סכין אזמל כדי להקל על התקשרות של סעיפי רקמות.
  הערה: מגרדמופיע גם כדי להקל על תולדת תא, מתן מסלולים שלאורכו תאים יכולים להעביר.
  1. לחלופין, להניח את חלקי רקמות טחונים בנפרד לתוך היטב בכל צלחת 6-היטב, ומכסה אותם עם תלוש כיסוי. צרף את תלוש לכסות על פני השטח של הצלחת באמצעות גריז סיליקון.
  2. הנח גריז סיליקון בשתי נקודות בנפרד 1.5 סנטימטרים בכל אחד גם באמצעות סיכת סטרילי. כיסוי של פיסות רקמה משפר את היעילות של תולדת תא ותא התפשטות הבאה כמה קטעים.
תרבות explant לאחר:
1. בעדינות להוסיף בינוני תרבות לצלחת לפני סעיפי הרקמות להתייבש, כתולדת תא יעילה הולכת לאיבוד ברוב המקרים אם הדגימות להתייבש. אין לשפוך הבינוני מדי במהירות כמו בסעיפי הרקמות היו לנתק.
2. תרבות תאים בDMEM עם 10% FBS. השתמש מספיק בינוני רק כדי לכסות את הרקמה, אבל לא יותר מדי, כי זה מאפשר צף, כציפה נוספת מקדמת ניתוק מצלחת.
מעבר נייד:
1. ידית מדיום התרבות בזהירות בכל העת כמו תנועות חוזרות ונשנות של את המנה התרבות יכולות להוביל לניתוק של חלקי רקמות.
2. מניחים את הכלים התרבות באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5-7 ימים. רענן הבינוני בכל יום אחר, ולטפל בכלי התרבות מינימאלית במהלך השינויים בינוניים. Fibroblasts להיגמל מקצה קטעי הרקמה בשבועות הבאים.
  הערה: לאחר ~ 2-3 שבועות, fibroblasts התבגרות כמעט מגיע למפגש, בהתאם לכמות של שטח פנים.
3. לשטוף את התאים עם 1x PBS, ולהוסיף 1 מיליליטר של טריפסין אני לצלחת.
4. לאחר trypsinization, לנתק את התאים באמצעות 9 מיליליטר של DMEM בתוספת 10% FBS. איסוף תאים תלויים במדיום בצינור 10 מיליליטר, יחד עם קטעי הרקמה. בעקבות צנטריפוגה כדי ליצור כדורי תא, resuspend את כדורים וכתוצאה מהמדיום החדש.
5. זרעי התאים וחלקי רקמות על רחוב ללא מוצא חדשצלחת ture, ובשלב הרקמות מצליחות לצרף הצלחת ואילו התאים לדבוק ולגדול. למחרת, להסיר את פיסות הרקמה צף על ידי שאיפה, ולשנות את המדיום. fibroblasts המצורף להפיץ עם תרבויות שלאחר מכן.

2. Co-תרבות תלת ממדית של Fibroblasts ריאות אדם ותאי הסרטן

הכנת תאים וחומרים כימיים:
1. כ להשתמש 2 x 10 ⁵ תאי אפיתל 2.5 x 10 ⁵ fibroblasts בכל טוב. הכן סוג קולגן IA (3 מ"ג / מיליליטר, pH 3), FBS (100%), חיץ הכינון מחדש (50 מ"מ NaOH, 260 מ"מ NaHCO _3, 200 מ"מ HEPES), 5x DMEM, DMEM בתוספת 10% FBS לתרבות פיברובלסטים, ובינוני שיתוף תרבות 3D (1: 1 תערובת של מדיום תרבות פיברובלסטים ובינוני תרבות לתאים סרטניים).
2. תאי A549 תרבות אדנוקרצינומה ריאתית, fibroblasts והתרבות המשותף 3D A549 DMEM בתוספת 10% FBS.
f ג'ל קולגןormation:
1. לשטוף fibroblasts התרבותי על צלחת 10 סנטימטרים עם 1x PBS, ולהוסיף 1 מיליליטר של טריפסין אני לצלחת. לאחר trypsinization ל~ 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, לנתק את התאים באמצעות 9 מיליליטר DMEM בתוספת 10% FBS. איסוף תאים תלויים במדיום בצינור 10 מיליליטר, ו צנטריפוגות ב200-300 XG כדי ליצור כדורי תא.
2. Resuspend את כדורים וכתוצאה מכך FBS 100% בצפיפות של 5 x 10 ⁵ מיליליטר /.
3. הכן את ג'ל קולגן על קרח. לקרר את חומרים כימיים, טפטפות וצינורות במקרר לפני ההליך הבא. אפילו על קרח, התערובת מתמצקת במידה מסוימת, ואת הנפח הכולל הוא פחות מהסכום של כל המרכיבים.
4. בכל טוב, להכין ג'ל קולגן על ידי ערבוב של 0.5 מיליליטר של השעיה פיברובלסטים (2.5 x 10 ⁵ תאים) בFBS, 2.3 מיליליטר סוג IA קולגן, 670 μl 5x DMEM, ו -330 חיץ הכינון מחדש μl. לאפשר לג'לים להגדיר בקלות בטמפרטורת חדר.
  1. במרץ פיפטה כדי להבטיח מיל הומוגניתxture. הימנע מיצירת בועות בתהליך pipetting.
5. מוסיף את התערובת (3 מיליליטר) היטב בכל צלחת 6-היטב ולאפשר לgelatinize בחממה ב 37 ° C ללא הפרעה במשך 30-60 דקות.
תרבית תאי סרטן על ג'ל קולגן:
1. לבצע שיתוף תרבות תלת-ממדית באמצעות פרוטוקול שדווח בעבר עם שינויים ^6.
2. תאי סרטן גלולים במדיום שיתוף תרבות 3D (או בDMEM עם FBS 10% במקרה של תאי A549) בצפיפות של 1 x 10 ⁵ / ml.
3. יוצקים 2 מיליליטר של הפתרון המושעה בתא (2 x 10 ⁵ תאים) על פני השטח של כל ג'ל. לשנות את מספר תא של תאים סרטניים או fibroblasts בשיתוף התרבות בהתאם לתנאי ניסוי.
התכווצות ג'ל:
1. דגירה ג'לי הלילה בשעה 37 ° C כל כך התאים הסרטניים יכולים לדבוק בג'ל קולגן. לנתק את כל ג'ל, וליצור "תרבות הצפה" בכל טוב of 6-גם הצלחת.
  הערה: על ידי שימוש בתרבות צף, שינויים שונים בגודל ג'ל הנגרמים על ידי מתח מכאני והשפלה קולגן, אשר מתווכים על ידי אינטראקציה סלולרית בין תאים סרטניים שיתוף תרבותי וfibroblasts.
2. השתמש במחט בזווית 21 G או מרית קטנה כדי להפריד בין ג'ל מהקצה של הבאר. כל 2-3 ימים, לרענן את הבארות עם 2 מיליליטר של מדיום שיתוף התרבות 3D. למדוד את גודלו של כל ג'ל בכל יום במשך 5 ימים.
ניתוח של ג'ל קולגן:
1. מדוד את תוכן קולגן של כל ג'ל תוך שימוש בשיטות לכמת קולגן, כגון assay Sircol. לבצע ניתוח transcriptomic או RT-PCR לאחר איסוף RNA מהג'לי ^5.

3. אוויר נוזלי ממשק תרבות והפלישה Assay

לאחר culturing ג'ל קולגן על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 ימים, לחשוף את ג'לי נדבק לאוויר על ידי הצבת אותם ברשת (70 גודל נקבובית מיקרומטר) ב6- החדשצלחות גם. הפוך את הרשת ממסננות תא זמינות מסחרי המשמשות לזרימה cytometry.
בעדינות למלא היטב כל אחד עם 11 מיליליטר של מדיום שיתוף התרבות 3D.
מקם את ג'לי על הרשת בעזרת כף סטרילי, ולהסיר כל מדיום שנותר מהג'לי. במצב זה, לצלול ג'לי במדיום תוך לחשוף את פני השטח העליונים של ג'ל לאוויר. להגדיר מצב זה כתרבות ממשק אוויר נוזלי.
הערה: לאחר 5-7 ימים של שמירה על תרבות ממשק האוויר הנוזלית על 37 מעלות צלזיוס בחממה, תאי סרטן פולשני להגר לתוך הג'ל. בהתאם לסוג התא וכתוצאה מאינטראקציות הסלולר, מעלות משתנה של שינוי מורפולוגי תא בתאים הסרטניים הנגרמות על ידי תרבות ממשק האוויר הנוזלית.
להערכה היסטולוגית, לתקן את הג'ל בתמיסת פורמלין לילה בטמפרטורת חדר ולהטביע בפרפין. כתם חלקים אנכיים (4 מיקרומטר) עם hematoxylin ו eosin (H & E). בצע o ניתוח immunohistochemicaln הסעיפים ^4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שיטת שיתוף תרבות זו, מחקה את המיקרו-הסביבה של הגידול, היא כלי שימושי כדי לחקור את יחסי הגומלין בין תאים הסרטניים וfibroblasts המשובצים ג'ל קולגן. במחקר הקודם, שלושה פרמטרים הוערכו במודל זה ניסוי: התכווצות ג'ל קולגן, פלישה של תאי סרטן ושינוי מורפולוגי. התפשטות תאי הסרטן גם נאמדה באמצעות immunostaining Ki67 ^4. דגימות רקמת ריאה נאספו מסעיפים סרטניים ולא-סרטניים של אונת ריאה כריתה (איור 1 א). דגימות טחונות לחתיכות קטנות ותרבותית בDMEM בתוספת 10% FBS (איור 1). Fibroblasts צומח מתוך סעיף הרקמה נצפה תחת מיקרוסקופ (איור 1 ג). fibroblasts ריאות בתרבית הראשוני היו משובץ לג'ל קולגן (איור 2 א, א) ותאי סרטן ריאות A549 היו שיתוף תרבותיים על הג'ל (איור 2 א, ב). לאחר ג הצףulture במדיום (איור 2 א, ג), ג'ל היה בתרבית נוספת בתנאים של ממשק האוויר נוזלי (איור 2 א, ד). ג'ל היה קבוע בפורמלין ומשמש לניתוחי immunohistochemical (איור 2 א, ה). לתרבות ממשק אוויר נוזלי, ג'ל הונח על רשת בטוב של 6-גם צלחת (איור 2). ניתוחים היסטולוגית של ג'ל חשפו פלישה של תאי A549 לג'ל קולגן מוטבעים עם fibroblasts הקשורים לסרטן הריאות (איור 3).

איור 1: תולדה של fibroblasts מרקמת ריאה אנושית שעברה כריתה כירורגית. דוגמאות (א) נאספו מסעיפים סרטניים ולא-סרטניים של אונת ריאה שעברה כריתה. דוגמאות (ב) טחונות לחתיכות קטנות ותרבותי בDMEM בתוספת 10% FBS.(C) Fibroblasts צמח מתוך קטע הרקמה (חץ). שים לב כי התאים נדדו לאורך השריטות שנעשו על ידי להבי אזמל על צלחת התרבות. בר סולם, 200 מיקרומטר.

איור 2:. תרבות ממשק האוויר הנוזלי של ג'ל קולגן תאי A549 היו שיתוף תרבותי על ג'ל קולגן מוטבע עם fibroblasts, והשכבה של תאי A549 נחשפה לאוויר על ידי הצבת את הג'ל על רשת במדיום (. ) הפרוצדורות של תלת-ממדי שיתוף תרבות וממשק האוויר נוזלי. (א) ג'ל קולגן מוטבע עם fibroblasts ריאות. (ב) תאי A549 שיתוף תרבותיים על ג'ל קולגן. (ג) צף תרבות. (ד)-אוויר ממשק נוזלי (עלי). (ה) קיבוע של הג'ל בפורמלין. (ב) תמונה מייצגת של הג'ל דואר מונח על הרשת בטוב של 6-גם צלחת. O / N: הלילה.

איור 3
איור Hematoxylin 3. וצביעת eosin של חתכים של ג'ל בתלת ממד תרבותי מורכב מתאי A549 וfibroblasts ריאות האנושיים. שים לב שתאי A549 תרבית על ג'ל קולגן פלשו ג'ל מוטבע עם fibroblasts (חיצים). בר סולם, 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Cafs מהווה רכיב מרכזי של ECM סביב תאי סרטן ולא רק לספק פיגום לגידול, אלא גם להשתתף באופן פעיל בהתפתחות גידולי ^7. צבירת ראיות פורמת את ההשפעה של cafs או מולקולות הקשורים אליהם בסופו של דבר את הפרוגנוזה, המדגישה את התפקידים הקריטיים של התקדמות גידול בתיווך CAF ^8.

במחקר הקודם, שהועסקנו שיטת תולדה כדי לבודד cafs ריאות ^4. בניסוי זה, התחזוקה של הידבקות סעיף רקמה על פני השטח הצלחת היא קריטית. תאים אינם מסוגלים להעביר את מסעיפי רקמות צף במדיום התרבות, וברגע שסעיפי הרקמות התנתקו מהשטח, הם כבר לא יכולים לשמש לתולדת תא באותו צלחת התרבות. חיתוך הרקמה מניב יפליט, המשמשים כדבק לקובץ מצורף אל פני השטח הצלחת. כאשר תיקון סעיף הרקמה עם תלוש כיסוי, כמות השומן משמש גם critical. כמויות קטנות של שומן לא מצליחות לשמור על הכיסוי להחליק מצורף, תוך מוגזם של גריז מטשטש את אזור תרבית תאים. קובץ מצורף סעיפים רקמות באמצעות להחליק את מכסה והלחץ המתאים הוא גם מפתח לקידום תולדת תא.

המודלים הניסיוניים להתפשטות תאי הסרטן ופלישה שהסתמכו בעיקר על תרביות רקמת monolayer דו-ממדיות או מבחני קאמריים בוידן. כדי להבין תקשורת בין תאית ואפנון ECM-התלוי של תאים סרטניים התנהגות טובה יותר, שיתוף תרבויות תלת-ממדיות הן כלים רבי עוצמה. תרבויות Organotypic שימושיות גם לחקירת אינטראקציות רב-תאיות, אם כי הם צריכים כישורים טכניים גבוהים ותנאי ניסוי מוגבלים.

מודל שיתוף התרבות שלנו משמש כפלטפורמה להערכת אינטראקציות גידולי סטרומה בתנאים מחקת את המיקרו-הסביבה של הגידול. תאים עם ביטוי יתר של גן ספציפי או מציאה בקלות ישימים בcultuמחדש מערכת, שהוא יתרון על פני תרבות organotypic. יש לציין, התצפיות הקודמות שלנו הראו כי fibroblasts שיתוף תרבותי פעיל לווסת התמיינות תאי סרטן ופלישה ^4. זה יהיה עניין לבדיקת אינטראקציות אפשריות רב-תאיות בהגדרת הניסוי שלנו, כגון תאי אנדותל, תאים דלקתיים ותאי האפיתל שאינם סרטניים.

מאפיינים מובהקים של cafs הוכחו במחקרי התרבות משותפת או על ידי יצירת פרופילי ביטוי גנים, תוך שימוש בתרבויות CAF ראשוניות ועמיתיהם הרגילים ^9. מצד השני, מחקרים אלה הראו גם ההטרוגניות התוך tumoral או בין-האישית של cafs ^10, שחלקם עשוי להיות מיוחסים לרמות של גורם גדילת איתות ¹¹ או גורם שעתוק הפעלה ¹² שונות. לכן, זה הכרחי כדי להמשיך ולאפיין cafs הטרוגנית נגזר מחולי סרטן ^13. בעקבות מעברי תא חוזרים ונשנים,המאפיינים של cafs תרבית הראשוני עשויים להיות שונה. לכן, זה יהיה טוב יותר לאפיין cafs בקטעים מוקדמים.

Cafs לתרום לתצהיר ECM ושיפוץ, אשר בתורו, עשוי להפעיל cafs באמצעות איתות תא-מופעל על מתח. כגון לולאת feed-קדימה בתיווך mechanotransduction של הפעלת CAF כבר הציעה ^14, ומודל התכווצות ג'ל קולגן עשוי לספק תובנות מנגנונים אלה. המנגנונים של התכווצות ג'ל קולגן כוללים התכווצות תא, התפשטות, הגירה, בידול, ושיפוץ קולגן ^15. מחקרים מפורטים היסטולוגית וניסויים באמצעות ligands, מעכבים, או RNAi עשויים להיות מועילים כדי לקבל תובנה מכניסטית לאינטראקציות גידולי סטרומה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796
FBS	GIBCO	10437
Collagen type IA	Nitta gelatin Inc.	CELL-1A
Reconstitution buffer	Nitta gelatin Inc.
Cover slip	NUNC	174934
Silicone grease	Dow Corning Toray	High vacuum grease
Dispase I	WAKO	386-02271
6-well plate	BD Falcon	353046
Cell strainer (70 μm)	BD Falcon	352350