Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Это исследование было одобрено соответствующими комитетами по этике.
1. Первичная культура легких человека фибробластов
- Коллекция легочной ткани:
- Получить образцы легочной ткани человека из хирургической операционной напрямую. Сбор около 1 см 3 кварталах от раковой и не раковая легочной ткани, с нераковая собранных образцов так далеко от опухоли, как это возможно.
- Приостановка образцы в среде Игла в модификации Игла (DMEM) с добавлением 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 0,25 мкг / мл амфотерицина В (бессывороточной среде). Поддержание взвешенные образцы в стерильных 50 мл пробирки и передать в лабораторию.
Примечание: Фибробласты мигрирующих и пролиферативной по сравнению с другими типами клеток, таких как эпителиальные, эндотелиальные и клетки гладкой мускулатуры. Метод следствием использует эти особенности фибробластов и outgroКрыло клетки из срезов тканей, имеются в изобилии в фибробласты. После нескольких пассажей клеток, и другие типы клеток не выживают и распространяются в среде DMEM с 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), в результате чего очищенных культур клеток фибробластов. Клетки могут быть использованы следующие 3-7 пассажей первичной культуре.
- Эксплант и кондиционирование для мобильного вырост:
- Выполните первичной культуры фибробластов с использованием ранее сообщалось протокол с изменениями 5.
- В лаборатории, разместить образец ткани на 10 см чашки для культивирования тканей без культуральной среды и разрезали на небольшие секции ~ 2-3 мм с использованием стерильного пинцета и скальпель. Во время этого процесса, избежать раздел сухой, в противном случае эффективность клеточной выроста ухудшается.
- Разделение эпителиальный слой клеток и соединительной ткани:
- Замачивание секции Упрощенный ткани в культуральной среде, содержащей 2000 PU / мл диспаза I и культуры в течение 16 часов при 4 ° С. </ Li>
- Передача срезах тканей к блюду, и отделить эпителиальный слой клеток из соседней соединительной ткани. Процесс разделы в чистом столе, чтобы избежать загрязнения микроорганизмами.
Примечание: Если первичные культуры эпителиальных клеток необходимо, выполнить шаг 1,3. Если только фибробласты могут быть изолированы, опустить шаг 1,3, так как последующие Эксплант и клеточные фрагменты являются неблагоприятными для эпителиальных клеток, которые дают очищенные популяции фибробластов.
- Приложение срезов ткани:
- Фарш ткани в 1 мм части, используя два скальпели. Если части не достаточно мал, что они более легко отделить от тарелки, и клетки не сможет вырасти на поверхности посуды.
- Поместите небольшие участки легочной ткани друг от друга, чтобы поддерживать пустой области, окружающей каждую часть. Сделать царапин на поверхности тканевой культуральной чашке скальпелем лезвие, чтобы облегчить прикрепление срезах тканей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Царапинытакже появляется, чтобы облегчить клеток вырост, обеспечивая треки, по которым клетки могут мигрировать.- Кроме того, место фарш кусочки ткани по отдельности в каждую лунку 6-луночного планшета, и покрыть их с покровным. Прикрепите крышку скольжения на поверхности пластины, используя силиконовую смазку.
- Поместите силиконовую смазку в двух точках 1,5 см друг от друга в каждой лунке с помощью стерильного штифт. Охват кусочки ткани повышает эффективность клеточной вырост и распространения клеток после нескольких пассажей.
- После Эксплант:
- Осторожно добавляют культуральную среду в чашке до того, как срезы ткани высохнуть, а эффективность вырост клеток теряется по большей части, если образцы высохнуть. Не лейте среду слишком быстро, как срезы тканей будет снять.
- Культура клеток в среде DMEM с 10% FBS. Используйте достаточно среду просто покрыть ткань, но не слишком много, что позволяет плавающий, как дополнительную плавучесть способствует отрыв отблюдо.
- Сотовый пассаж:
- Ручка культуральной среды с осторожностью во все времена, как повторяющиеся движения культуры блюдо может привести к отрыву срезах тканей.
- Поместите чашки для культивирования в термостате при 37 ° С в течение 5-7 дней. Обновление среды через день, и обрабатывать чашки для культивирования в течение минимально изменений средних. Фибробласты перерастают от края срезах тканей в течение ближайших нескольких недель.
Примечание: После ~ 2-3 недель, перерастает фибробласты практически достичь слияния, в зависимости от количества площади поверхности. - Вымойте клеток с 1x PBS и добавьте 1 мл трипсина я к плите.
- После обработки трипсином, открепления клеток с использованием 9 мл DMEM с добавлением 10% FBS. Собирают клетки, суспендированные в среде в 10 мл пробирку вместе с тканевых срезов. После центрифугирования с образованием клеточных гранул, ресуспендируют Полученные гранулы в новой среде.
- Семенной клеток и срезов ткани на новую культуры блюдо, после чего ткани не придают блюду в то время как клетки придерживаться и расти. На следующий день, удалить плавающие куски ткани путем аспирации и изменить среду. Прикрепленные фибробласты распространяться с последующими культурами.
2. Трехмерная Co-культуре человеческих легочных фибробластов и клеток рака
- Получение клеток и реагентов:
- Примерно использовать 2 х 10 5 клеток эпителия и 2,5 х 10 5 фибробластов на лунку. Подготовка коллаген типа Ia (3 мг / мл, рН 3), ФБС (100%), восстанавливающий буфер (50 мМ NaOH, 260 мМ NaHCO 3, 200 мМ HEPES), 5x DMEM, среде DMEM с добавлением 10% FBS для культуры фибробластов, и 3D совместно культуральную среду (1: 1 смесь фибробластов культуральной среды и питательной среды для раковых клеток).
- Культура А549 легких клетки аденокарциномы, фибробласты и А549 3D совместное культивирование в среде DMEM с добавлением 10% FBS.
- Коллаген гель Formation:
- Вымойте фибробласты, культивируемые на 10 см блюдо с 1x PBS и добавьте 1 мл трипсина я к плите. После обработки трипсином в течение ~ 5 мин при 37 ° С, открепления клеток с использованием 9 мл DMEM с добавлением 10% FBS. Собирают клетки, суспендированные в среде в 10 мл пробирку и центрифугировать их при 200-300 мкг с образованием клеточных гранул.
- Ресуспендируют Полученные гранулы в 100% FBS при плотности 5 × 10 5 / мл.
- Подготовка геля коллагена на льду. Охлаждают реагентов, пипетки и трубки в холодильнике до следующей процедуры. Даже на льду, смесь затвердевает в некоторой степени, и общий объем меньше, чем сумма всех компонентов.
- В каждую лунку, подготовить геля коллагена путем смешивания 0,5 мл фибробластов суспензии (2,5 х 10 5 клеток) в FBS, 2,3 мл типа Ia коллаген, 670 мкл 5x DMEM и 330 мкл буфера восстановление. Разрешить гели легко установить при комнатной температуре.
- Энергично пипетки, чтобы обеспечить однородную миxture. Избегайте создания пузырей в процессе пипетки.
- Добавьте смесь (3 мл) в каждую лунку 6-луночного планшета и позволяют желатинизации в инкубаторе при 37 ° С без нарушения в течение 30-60 мин.
- Культуры клеток рака на коллагеновый гель:
- Выполнять трехмерные Сотрудничество культуры с использованием ранее сообщалось протокол с изменениями 6.
- Ресуспендируют раковые клетки в 3D-со-культуральной среде (или в среде DMEM с 10% FBS, в случае клеток А549) при плотности 1 х 10 5 / мл.
- Налейте 2 мл раствора ресуспендированные клетки (2 х 10 5 клеток) на поверхности каждой геле. Изменить количество клеток раковых клеток или фибробластов в совместной культуре в зависимости от условий эксперимента.
- Гель сокращений:
- Инкубируйте гели в течение ночи при 37 ° C, так что раковые клетки могут прилипать к коллагеновым гелем. Снять каждый гель, и создать "плавающий культура» в каждую лунку оF пластины 6-а.
Примечание: При использовании плавающего культуры, различные изменения в размере гель индуцированы механического напряжения и деградации коллагена, которые опосредованы взаимодействием клеточного ко-культивируют раковых клеток и фибробластов. - Используйте углом 21 G иглы или небольшой шпатель для разделения гель от края ямы. Каждые 2-3 дней, обновить скважин с 2 мл 3D совместно культуральной среде. Измерить размер каждого гель каждый день в течение 5 дней.
- Инкубируйте гели в течение ночи при 37 ° C, так что раковые клетки могут прилипать к коллагеновым гелем. Снять каждый гель, и создать "плавающий культура» в каждую лунку оF пластины 6-а.
- Анализ коллагена гелей:
- Измерить содержание коллагена каждого геля с использованием коллагена методы количественного, таких как анализ Sircol. Выполнение транскриптомных анализа или количественной ОТ-ПЦР после сбора РНК из гелей 5.
3. Воздух-жидкость Культура и Вторжение Пробирной
- После культивирования гели коллагена при 37 ° С в течение 5 дней, подвергать контракту гели в атмосферу, поместив их на сетке (70 мкм размер пор) в новом 6-луночных планшетах. Сделать сетку из коммерчески доступных фильтров клеток, используемых для проточной цитометрии.
- Аккуратно заполните каждую лунку с 11 мл 3D совместно культуральной среде.
- Расположите гели на сетку, используя стерильный ложку, и удалить все оставшиеся среды из гелей. При этом условии, погрузить гели в среде, а подвергать верхнюю поверхность геля на воздухе. Определить эту культуру состояние как воздух-жидкость.
Примечание: После 5-7 дней сохранении культуры радиоинтерфейса-жидкость при 37 ° С в инкубаторе, инвазивные раковые клетки мигрируют в геле. В зависимости от типа клеток и в результате клеточных взаимодействий, переменной степени морфологических изменений клеток в раковые клетки индуцированы культуры радиоинтерфейса-жидкость. - Для гистологического исследования, зафиксировать гель в растворе формалина в течение ночи при комнатной температуре и вставлять в парафин. Пятно вертикальные секции (4 мкм) гематоксилином и эозином (H & E). Выполните иммуногистохимического анализа ON разделы 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот метод совместного культивирования, подражая микросреды опухоли, является полезным инструментом для изучения взаимодействия между раковыми клетками и фибробластами встроенные в коллагена гелей. В предыдущем исследовании, три параметра были оценены в этой экспериментальной модели: сокращение коллагеновый гель, вторжение раковых клеток и морфологических изменений. Распространение раковых клеток оценивалась также с помощью Ki67 иммуноокрашивания 4. Образцы ткани легкого были собраны из раковых и не раковых разделов резекции легких доли (рис 1А). Образцы измельчали на мелкие кусочки и культивировали в среде DMEM с добавлением 10% FBS (Фиг.1В). Фибробласты, растущие из секции ткани наблюдались под микроскопом (рис 1С). Первичные культивированные фибробласты легких были включены в коллагеновый гель (фиг 2А, а), и раковые клетки А549 легких культивировали совместно с гелем (2А, В). После плавающего сulture в среде (Фигура 2А, с), гель дополнительно культивировали при условии интерфейса воздух-жидкость (фиг.2а, д). Гель фиксировали в формалине и использовали для иммуногистохимического анализа (Фигура 2А, е). Для культуры радиоинтерфейса-жидкость, гель помещали на сетку на лунку 6-луночного планшета (фиг.2В). Гистологические анализы геля показало вторжение А549 клеток в коллагеновый гель с встроенной рак легких, связанных фибробластов (рисунок 3).
Рисунок 1: разрастание фибробластов хирургически удаленных человеческой легочной ткани. (A) Образцы были собраны от раковых и не раковых секций резекции доли легкого. (B) Образцы измельчали на мелкие кусочки и культивировали в среде DMEM, дополненной 10% FBS.(C) Фибробласты вырос из среза ткани (стрелка). Обратите внимание, что клетки мигрировали вдоль царапин, сделанных лезвий скальпеля на блюдо культуры. Масштаб бар, 200 мкм.
Рисунок 2:. Интерфейс культуры воздуха и жидкости из коллагенового геля А549 клетки культивировали совместно на коллагеновый гель с встроенной фибробластов, и слой клеток А549 подвергали воздействию воздуха, помещая гель на сетке в среде (. ) Экспериментальные процедуры трехмерное совместное культивирование и воздух-жидкость интерфейса. (а) коллагенового геля с встроенной фибробластов легких. (б) A549 клетки совместно культивировали на коллагеновый гель. (с) с плавающей культуры. (d) с воздушным жидкость интерфейс (ALI). (Е) Фиксация геля в формалине. (Б) представитель картина ме гель помещают на сетку в лунку 6-луночного планшета. O / N: в течение ночи.
Рисунок 3. гематоксилин-эозином поперечных сечений трехмерно культивируемых геля, состоящего из А549 клеток и фибробластов легких человека. Следует отметить, что клетки А549 культивировали на коллагеновый гель захвачена гель с встроенной фибробластов (стрелки). Масштаб бар, 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CAFS образуют основной компонент ECM окружающей раковые клетки и не только обеспечивают каркас для опухоли, но и активно участвовать в развитии опухоли 7. Накопленные данные распутывает влияние CAFS или их родственных молекул на конечную прогноза, подчеркнув критическое значение роли CAF-опосредованной опухолевой прогрессии 8.
В предыдущем исследовании мы использовали нарост метод, чтобы изолировать CAFS легких 4. В этом эксперименте содержание раздела тканей адгезии на поверхности посуды имеет решающее значение. Клетки не могут мигрировать из ткани секций, плавающие в культуральной среде, и после того, как срезы ткани отделяться от поверхности, они больше не могут быть использованы для клеточной нарост на одной и той же культуральной чашке. Резка ткани дает выделений, которые служат в качестве клея для прикрепления к поверхности посуды. При креплении срезы ткани с покровным стеклом, количество смазки, используемой также critiкал. Небольшие количества смазки не держать скольжения крышку, прикрепленную, в то время как чрезмерное смазки скрывает область клеточной культуре. Приложение срезов ткани с использованием покровного стекла и соответствующее давление также важную роль для клеток вырост.
Экспериментальные модели для пролиферации раковых клеток и вторжения в основном полагались на двумерных культур монослоя ткани или Бойдена камеры анализов. Чтобы лучше понять, межклеточной коммуникации и ECM-модуляцию поведения раковых клеток, трехмерные сокультурах являются мощными инструментами. Органотипической культуры также являются полезными для исследования многоклеточных взаимодействия, хотя они нуждаются в более высоких технических навыков и экспериментальные условия ограничены.
Наша модель совместного культивирования служит платформой для оценки опухоль стромы взаимодействия в условиях, имитирующих микроокружение опухоли. Клетки с определенной избыточной экспрессии гена или нокдаун легко применимы в нашей cultuRe системы, что является преимуществом над органотипической культуры. Примечательно, что наши предыдущие наблюдения указывают, что совместно культивировали фибробласты активно модулировать дифференцировку клеток рака и вторжение 4. Было бы интересно проверить возможные многоклеточные взаимодействия в нашей экспериментальной установки, такие как эндотелиальных клеток, воспалительных клеток и не раковых эпителиальных клеток.
Различные характеристики CAFS были продемонстрированы в совместной культуре исследований или Количественный анализ экспрессии генов с использованием первичных культур CAF и их нормальные аналоги 9. С другой стороны, эти исследования также показали, внутри-опухолевой или межиндивидуальную неоднородность CAFS 10, часть из которых могут быть связаны с различными уровнями фактора роста сигнализации 11 или транскрипционный фактор активации 12. Таким образом, крайне важно, чтобы в дальнейшем характеризуют гетерогенные CAFS, полученные из 13 больных раком. После многочисленных клеточных путей,характеристики первичных культивированных CAFS могут быть изменены. Таким образом, было бы лучше, чтобы охарактеризовать CAFS на ранних пассажах.
CAFS способствовать отложению ECM и реконструкции, который, в свою очередь, может привести в действие посредством CAFS натяжения срабатывает клеточной сигнализации. Такое механотрансдукция-опосредованной подачи вперед петля CAF активации было предложено 14, и наш коллагеновый гель сокращение модель может дать ответ на эти механизмы. Механизмы сокращения геля коллагена включить сотовый сокращение, пролиферацию, миграцию, дифференцировку и ремоделирование коллагена 15. Подробные гистологические исследования и эксперименты, используя лиганды, ингибиторы или РНК-интерференции может быть полезно, чтобы получить механистический понимание опухолевых стромальных взаимодействий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| FBS | GIBCO | 10437 | |
| Collagen type IA | Nitta gelatin Inc. | CELL-1A | |
| Reconstitution buffer | Nitta gelatin Inc. | ||
| Cover slip | NUNC | 174934 | |
| Silicone grease | Dow Corning Toray | High vacuum grease | |
| Dispase I | WAKO | 386-02271 | |
| 6-well plate | BD Falcon | 353046 | |
| Cell strainer (70 μm) | BD Falcon | 352350 |
References
- Strell, C., Rundqvist, H., Ostman, A. Fibroblasts-a key host cell type in tumor initiation, progression, and metastasis. Ups. J. Med. Sci. 117 (2), 187-195 (2012).
- Augsten, M., Hägglöf, C., Peña, C., Ostman, A. A digest on the role of the tumor microenvironment in gastrointestinal cancers. Cancer Microenviron. 3 (1), 167-176 (2010).
- Augsten, M. Cancer-Associated Fibroblasts as Another Polarized Cell Type of the Tumor Microenvironment. Front. Oncol. 4, 62 (2014).
- Horie, M., et al. Characterization of human lung cancer-associated fibroblasts in three-dimensional in vitro co-culture model. Biochem. Biophys. Res. Commun. 423 (1), 158-163 (2012).
- Ohshima, M., et al. TGF-β signaling in gingival fibroblast-epithelial interaction. J. Dent. Res. 89 (11), 1315-1321 (2010).
- Ikebe, D., Wang, B., Suzuki, H., Kato, M. Suppression of keratinocyte stratification by a dominant negative JunB mutant without blocking cell proliferation. Genes Cells. 12 (2), 197-207 (2007).
- Orimo, A., Weinberg, R. A. Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type. Cell Cycle. 5 (15), 1597-1601 (2006).
- Paulsson, J., Micke, P. Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer. Semin. Cancer Biol. 25, 61-68 (2014).
- Navab, R., et al. Prognostic gene-expression signature of carcinoma-associated fibroblasts in non-small cell lung cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 108 (17), 7160-7165 (2011).
- Herrera, M., et al. Functional heterogeneity of cancer-associated fibroblasts from human colon tumors shows specific prognostic gene expression signature. Clin. Cancer Res. 19 (21), 5914-5926 (2013).
- Hägglöf, C., et al. Stromal PDGFRbeta expression in prostate tumors and non-malignant prostate tissue predicts prostate cancer survival. PLoS One. 5 (5), e10747 (2010).
- Saito, R. A., et al. Forkhead box F1 regulates tumor-promoting properties of cancer-associated fibroblasts in lung cancer. Cancer Res. 70 (7), 2644-2654 (2010).
- Kalluri, R., Zeisberg, M. Fibroblasts in cancer. Nat. Rev. Cancer. 6 (5), 392-401 (2006).
- Calvo, F., et al. Mechanotransduction and YAP-dependent matrix remodelling is required for the generation and maintenance of cancer-associated fibroblasts. Nat. Cell Biol. 15 (6), 637-646 (2013).
- Horie, M., et al. Histamine induces human lung fibroblast-mediated collagen gel contraction via histamine H1 receptor. Exp. Lung Res. 40 (5), 222-236 (2014).
