Protocol
注：此研究是通过适当的伦理委员会。
人肺成纤维细胞1.原代培养
- 收集肺组织：
- 得到直接从外科手术室人肺组织样本。收集来自癌性和非癌肺组织约1cm 3块，以收集作为远离肿瘤尽可能的非癌性样品。
- 暂停在Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）中补充有100单位/ ml青霉素，100微克/毫升链霉素和0.25微克/毫升两性霉素B（无血清培养基）的样品。保持在无菌50ml试管中悬浮的样品并转移到实验室。
注：成纤维细胞是高度洄游和增殖与其它类型的细胞，如上皮细胞，内皮细胞和平滑肌细胞。该生长方法利用了成纤维细胞的这些特征，并且outgro从组织切片翼细胞丰富的成纤维细胞。经过多次传代细胞，其他细胞类型不能存活和繁殖的DMEM，用10％胎牛血清（FBS），导致纯化的成纤维细胞培养物。所述细胞可用于3-7通道主培养以下。
- 植文化和调节细胞生长：
- 执行使用以前报道的协议进行了修改5成纤维细胞原代培养。
- 在实验室中，放置在无培养基10cm的组织培养皿的组织样品切成小切片〜2-3毫米大小用无菌镊子和手术刀。在此过程中，应避免使部分干燥，否则细胞生长的能力受到损害。
- 分离上皮细胞层和结缔组织的：
- 泡切的组织切片在含2000的PU /毫升分散酶I培养基和培养16小时，在4℃下</ li>
- 的组织切片转移到培养皿，并且从相邻的结缔组织分离上皮细胞层。处理在清洁台上的部分，以避免微生物的污染。
注意：如果需要上皮细胞原代培养，执行步骤1.3。如果只成纤维细胞将被分离，则省略步骤1.3，因为在随后的外植体培养和细胞传代是不利的上皮细胞，其产生纯化的成纤维细胞种群。
- 附件组织切片：
- 剁碎组织成使用两个手术刀1毫米件。如果这两块不足够小，它们分离更容易地从皿中，细胞将无法长大于餐具表面。
- 放置小肺组织切片彼此分开，以维持周围的每一块的空白区域。使用手术刀刀片，以促进附着的组织切片的组织培养皿的表面上的划痕。
注意：抓似乎也促进细胞生长，提供轨道沿着细胞可以迁移。- 或者，将组织糜片段单独成6孔板的每个孔中，并用盖玻片覆盖它们。附上盖玻片使用硅脂该板的表面上。
- 放置硅脂在两个点相隔1.5厘米中使用无菌针每个孔中。组织碎片覆盖增强细胞生长和细胞繁殖以下几个段落的疗效。
- 随后的外植体文化：
- 轻轻培养基添加到培养皿之前组织切片干燥，作为有效的细胞生长失去大部分如果样品变干。不要将媒体过快的组织切片会脱落。
- 培养的细胞在DMEM含10％FBS。使用足够的培养基刚好盖住组织，但不会太大，它允许浮动，作为额外的浮力促进支队从菜。
- 细胞传代：
- 小心轻放培养基在任何时候都为培养皿的重复动作可导致组织切片的脱离。
- 将培养皿在培养箱中在37℃下5-7天。刷新媒体隔日，并在媒体变化最小处理培养皿。长大成纤维细胞从组织切片，在未来几周内的边缘。
注：〜2-3周后，outgrowing成纤维细胞几乎达到汇合，这取决于表面积的量。 - 用1×PBS洗涤细胞，并加入胰蛋白酶1毫升我到板上。
- 胰蛋白酶消化后，分离使用9毫升DMEM中的细胞在补充有10％FBS中。与组织切片收集细胞悬浮在10毫升管的介质，在一起。离心以形成细胞沉淀，重悬所得的颗粒在新的平台。
- 种子的细胞和组织切片到一个新的小路TURE盘，在该点的组织中没有附着到培养皿的同时将细胞附着和生长。次日，通过抽吸除去浮动组织片，并改变介质。连接成纤维细胞繁殖与后续培养。
人肺成纤维细胞和癌细胞2.三维共培养
- 制备细胞和试剂：
- 大约用2×10 5的上皮细胞和每孔2.5×10 5个成纤维细胞。制备型胶原IA（3毫克/毫升，pH为3），FBS（100％），重建缓冲液（50mM的NaOH，260毫的NaHCO 3，200mM的HEPES），5×DMEM，DMEM补充有10％FBS的成纤维细胞培养，和三维共培养培养基（1：1的混合物的成纤维细胞的培养基和培养基的癌细胞）。
- 培养的A549肺腺癌细胞，成纤维细胞和A549三维共培养在DMEM补充有10％FBS中。
- 胶原凝胶˚Formation：
- 洗的成纤维细胞上10cm皿用1×PBS中培养，并添加胰蛋白酶1毫升我到板上。胰蛋白酶消化为〜5分钟，在37℃后，分离使用9毫升DMEM补充有10％FBS的细胞。收集的细胞悬浮在10毫升管的培养基中，离心它们在200-300×g离心以形成细胞小球。
- 重悬在100％FBS的所得粒料在5×10 5 / ml的密度。
- 准备上冰的胶原凝胶。冷却该反应物，移液器和管子在冰箱中之前执行以下步骤。甚至在冰上，在固化到某种程度，总体积小于所有组分的总和。
- 在每个孔中，通过混合0.5毫升成纤维细胞悬浮液（2.5×10 5个细胞）中的FBS的，2.3毫升IA型胶原，670微升5×DMEM，和330微升重建缓冲液制备胶原凝胶。允许凝胶容易地设定在室温。
- 大力吸管，以确保均匀的英里夹具。避免在移液过程中产生气泡。
- 该混合物（3毫升）添加至6孔板的每个孔中，并允许在孵化器在37℃凝胶化，而不扰动30-60分钟。
- 在胶原凝胶癌细胞培养：
- 使用先前报道的协议进行了修改6进行三维共培养。
- 重悬的癌细胞在三维共培养培养基（或在DMEM与A549细胞的情况下，10％FBS）以1×10 5个/ ml的密度。
- 倾2毫升再悬浮细胞溶液（2×10 5个细胞）在每个凝胶的表面上。修改癌细胞或成纤维细胞的细胞数目在共培养取决于实验条件。
- 凝胶收缩：
- 过夜孵育凝胶在37℃下这样的癌细胞可以附着在胶原凝胶。分离的每个凝胶，并生成每个“流动文化”以及Øf显示6孔板。
注意：通过使用一个浮培养，在凝胶尺寸的各种变化都受到机械张力和胶原降解，其通过共同培养的癌细胞和成纤维细胞之间的细胞相互作用介导的诱导。 - 使用成角度的21g的针或小抹刀将每个凝胶从井的边缘分开。每2-3天，刷新井用2ml三维共培养培养基。每天测量每个凝胶的尺寸为5天。
- 过夜孵育凝胶在37℃下这样的癌细胞可以附着在胶原凝胶。分离的每个凝胶，并生成每个“流动文化”以及Øf显示6孔板。
- 分析胶原凝胶：
- 测量使用胶原定量方法，如Sircol测试每个凝胶的胶原含量。从凝胶5收集的RNA后进行转录分析或定量RT-PCR。
3.气 - 液界面文化入侵检测
- 在37℃下5天培养的胶原凝胶后，通过将它们放置在一个网格（70微米孔径）在新的6-暴露收缩凝胶到空气孔板中。使从用于流式细胞市售的细胞滤网的网格。
- 轻轻地用11毫升三维共培养培养基填充每个孔中。
- 凝胶放置到使用无菌勺网格，并从凝胶中除去任何剩余的介质。在此条件下，浸入在介质中的凝胶，而露出的凝胶，以空气的上表面。定义该培养条件如空气 - 液体界面。
注：后5-7天保持在37℃的空气 - 液体界面培养在培养箱的，侵入性癌症细胞迁移到凝胶。根据细胞类型和作为细胞相互作用的结果，可变度在癌细胞中细胞形态的变化是由空气 - 液体界面培养诱导。 - 用于组织学评价，固定在福尔马林溶液中的凝胶在室温下过夜，并嵌入石蜡中。染色垂直切片（4微米）与HE染色（H＆E）。进行免疫组化分析Òn中的第4。
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Representative Results
该共培养方法，模仿肿瘤微环境，是一种有用的工具，调查癌细胞和嵌入在胶原凝胶的成纤维细胞之间的相互作用。胶原凝胶收缩，癌细胞的侵袭和形态变化：在以前的研究中，三个参数在这个实验模型进行了评价。还预计使用Ki67的免疫染色4癌细胞增殖。肺组织样品从一个切除肺叶（ 图1A）的癌性和非癌的部分收集。样品切成小片，并在DMEM中培养在补充有10％FBS的（ 图1B）。成纤维细胞生长出的组织切片进行显微镜（ 图1C）下观察。原代培养的肺成纤维细胞嵌入到胶原凝胶（ 图2A，a）和A549肺癌细胞的凝胶共培养（ 图2A，B）。浮动℃之后ulture在培养基中（ 图2A，C），将凝胶的空气-液体界面的条件下进一步培养（ 图2A中的D）。将凝胶在福尔马林中固定，并用于免疫组织化学分析（ 图2A，电子 ）。对于气-液界面培养，将凝胶置于网格中的6孔板井（ 图2B）。凝胶的组织学分析显示侵袭A549细胞成嵌入与肺癌相关成纤维细胞（ 图3）胶原蛋白凝胶。
图1：从手术切除的人肺组织的成纤维细胞的生长。 （A）的样品从切除肺叶的癌性和非癌的部分收集。（B）的样品切成小片，并在DMEM补充有10％FBS的培养。（C）成纤维细胞生长出组织切片（箭头）。需要注意的是细胞沿着由手术刀刀片上的培养皿所作的划痕迁移。比例尺，200微米。
图2：在胶原凝胶的空气-液体界面培养的A549细胞上嵌有纤维细胞胶原凝胶共培养，和A549细胞的层通过将凝胶上在介质网状暴露在空气中（A。 ）的三维共培养和空气-液体界面的实验程序。（一）胶原凝胶嵌入有肺成纤维细胞（B）A549细胞上的胶原凝胶共培养。（三）浮动培养。（四）气冷液界面（ALI）。在福尔马林凝胶（五）固定。（B）次代表图片ê凝胶放置在网格中的6孔板的孔中。 O / N：过夜。
图3.苏木和A549细胞和人肺成纤维细胞构成的三维培养的凝胶的横截面伊红染色。需要注意的是A549细胞培养在胶原蛋白凝胶侵入嵌入成纤维细胞（箭头）的凝胶。比例尺，200微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
的CAF形成周围癌细胞ECM的一个重要组成部分，而不是仅提供一个支架的肿瘤，但也积极参与肿瘤发展7。越来越多的证据揭开CAF或与其相关的分子上的最终预后的影响，突出CAF介导的肿瘤进展8的关键作用。
在以前的研究中，我们采用的方法生长隔离肺的CAF 4。在这个实验中，组织切片的粘附维持到餐具表面是关键的。细胞不能从组织切片漂浮在培养基中进行迁移，并且一旦组织切片成为脱离表面，它们不能再被用于在同一培养皿的细胞生长。切割的组织的产生渗出物，其用作胶水附着到培养皿表面。当定影带盖玻片的组织切片，使用润滑脂的量也critiCAL。少量的油脂跟不上附着盖玻片，而过多的油脂掩盖了细胞培养领域。使用盖玻片和适当的压力组织切片附件也是一个关键，促进细胞的生长。
该实验模型为癌细胞的增殖和侵袭大多依靠二维单层组织培养物或Boyden小室测定法。为了更好地了解细胞间通讯以及癌细胞行为的ECM依赖性调制，三维共培养物是有力工具。器官文化也调查多细胞的相互作用是有用的，但他们需要更高的技术能力和实验条件是有限的。
我们的联合培养模式作为一个平台来评估条件模拟肿瘤微环境下，肿瘤基质相互作用。细胞特异基因过表达或击倒很容易适用于我们的文化前进重系统，这是一个优势器官型培养。值得注意的是，我们以前的意见建议，共同培养成纤维细胞积极调节肿瘤细胞的分化和侵袭4。这将是感兴趣的测试可能的多细胞的相互作用在我们的实验设置中，如内皮细胞，炎症细胞和非癌性上皮细胞。
的CAF的鲜明特点已被证明在共培养研究或通过基因表达分析，使用的主要CAF文化和正常的同行9。另一方面，这些研究还已经表明的CAF 10，其中一部分可能归因于不同水平的生长因子信号11或转录因子的活化12的肿瘤内或个体间的异质性。因此，有必要进一步表征从癌症患者13导出异质的CAF。经反复传代细胞，原代培养的CAF的特征可能会被修改。因此，这将是更好的早期通道表征的CAF。
的CAF向ECM的沉积和重塑，这反过来，可以激活通过张力触发细胞信号的CAF。 CAF激活这样的机械传导介导的前馈回路已建议14，我们的胶原凝胶收缩模型可以提供深入了解这些机制。胶原凝胶收缩的机制包括细胞收缩，增殖，迁移，分化和胶原重塑15。使用的配位体的详细组织学研究和实验，抑制剂，或RNAi可能有助于获得一种机械洞察肿瘤基质的相互作用。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| FBS | GIBCO | 10437 | |
| Collagen type IA | Nitta gelatin Inc. | CELL-1A | |
| Reconstitution buffer | Nitta gelatin Inc. | ||
| Cover slip | NUNC | 174934 | |
| Silicone grease | Dow Corning Toray | High vacuum grease | |
| Dispase I | WAKO | 386-02271 | |
| 6-well plate | BD Falcon | 353046 | |
| Cell strainer (70 μm) | BD Falcon | 352350 |
References
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