Protocol
注：この研究は、適切な倫理委員会によって承認された。
ヒト肺線維芽細胞の1。初代培養
- 肺組織のコレクション：
- 直接の外科手術室からのヒト肺組織のサンプルを得る。できるだけ離れ腫瘍から収集した非癌性サンプルと、癌性及び非癌性肺組織から約1cm 3ブロックを収集します。
- 100単位/ mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシンおよび0.25 / mlのアンホテリシンB（無血清培地）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中でサンプルを懸濁する。無菌50mlチューブ中の浮遊サンプルを維持し、実験室に移す。
NOTE：線維芽細胞は、上皮細胞、内皮細胞および平滑筋細胞などの他の細胞型と比較して高度回遊あり、増殖性。成長方法は、線維芽細胞のこれらの機能を活用し、かつoutgro組織切片から翼細胞は、線維芽細胞に豊富に存在する。いくつかの細胞継代後に、他の細胞型は、精製された線維芽細胞培養物中で得られる、生存し、10％ウシ胎児血清（FBS）を含むDMEM中で伝播することができない。細胞は、初代培養後3~7通路を使用することができる。
- 細胞成長のための移植片培養およびコンディショニング：
- 修正5と以前に報告されたプロトコルを使用して、線維芽細胞の初代培養を行います。
- 研究室では、培地なし10cmの組織培養皿に組織サンプルを配置し、小さな切片に切断〜滅菌ピンセットとメスを用いて大きさ2〜3mmの。このプロセスの間、部分乾燥を避ける、そうでなければ細胞伸長の効率が損なわれる。
- 上皮細胞層および結合組織の分離。
- 4℃で16時間培養2000 PU / mlのディスパーゼIを含む培地と培養中の切断組織切片を浸し。</ LI>
- 皿に組織切片を転送し、隣接する結合組織から上皮細胞層を分離する。微生物の汚染を避けるために、クリーンベンチ内でセクションを処理する。
注：上皮細胞の初代培養が必要な場合は、ステップ1.3を行う。唯一の線維芽細胞を単離することがある場合は、その後の移植片培養し、細胞の継代は、精製線維芽細胞集団をもたらす上皮細胞、のために不利であるため、ステップ1.3を省略します。
- 組織切片の添付ファイル：
- 2メスを使用して1ミリメートル片に組織をミンチ。片が十分に小さくない場合は、皿からより容易に切り離して、細胞をディッシュ表面に脱却することができないであろう。
- 各ピースを囲む空の領域を維持するために、互いに離間して小肺組織切片を置く。組織切片の取り付けを容易にするために、手術用メスの刃を用いて組織培養皿の表面に傷を作る。
注：スクラッチまた、細胞が移動することができ、それに沿ってトラックを提供し、細胞成長を促進するために表示されます。- 代替的に、個別に6ウェルプレートの各ウェルに細分化した組織片を置き、カバースリップでそれらをカバー。シリコーングリースを使用したプレートの表面にカバースリップを取り付けます。
- 無菌のピンを使用して、各ウェルに1.5センチメートル離れた2点でのシリコーングリースを配置します。組織片のカバレッジは、いくつかの継代後の細胞成長および細胞増殖の効力を増強する。
- その後の移植片培養：
- サンプルが完全に乾く場合は、効率的な細胞成長は大部分が失われているように、組織切片は、完全に乾く前に静かに皿に培養液を追加します。あまりにも急速に組織切片を切り離すと同じようにメディアをかけないでください。
- 10％のFBSを含むDMEM中で培養細胞。追加の浮力から脱離を促進するようにそれは、浮動可能にすることをあまりにも多くのちょうど組織をカバーするために十分なメディアを使用してではなく、一品。
- 細胞継代：
- 培養皿の繰り返し運動が組織切片の剥離につながることができように、常に注意して培養液を処理します。
- 5-7日間、37℃のインキュベーターで培養皿を置きます。一日おきに培地を更新し、培地交換の際に最小限の培養皿を扱う。線維芽細胞は、今後数週間にわたって組織切片の端から脱却する。
NOTE：〜2-3週間後、外部増殖線維芽細胞は、ほとんどの表面積の量に依存して、コンフルエンスに達する。 - 1×PBSで細胞を洗浄し、私はプレートにトリプシンの1ミリリットルを追加します。
- トリプシン処理後、10％FBSを補充したDMEMの9ミリリットルを用いて細胞を切り離す。組織切片と一緒に、10ミリリットルチューブ内の培地に懸濁した細胞を収集します。細胞ペレットを形成するために遠心分離した後、新しい培地で得られたペレットを再懸濁する。
- 新しいCUL上に細胞や組織切片をシードトゥーレの料理は、その時点で組織は、細胞が付着し、成長しながら、皿に取り付けることができない。翌日、吸引により、浮遊組織片を除去し、培地を変更してください。添付線維芽細胞は、その後の文化に伝播する。
ヒト肺癌線維芽細胞と癌細胞の2三次元共培養
- 細胞および試薬の調製
- 約2×10 5上皮細胞およびウェルあたり2.5×10 5線維芽細胞を使用しています。コラーゲンタイプIA（3 mg / mlの、pHが3）、FBS（100％）、再構成緩衝液（50mMのNaOH、260ミリモルのNaHCO 3、200mMのHEPES）、5×DMEMを調製し、DMEMは、線維芽細胞培養10％FBSを補充した3次元共培養培地（1：癌細胞に対する線維芽細胞培養培地および培地の1：1混合物）。
- 培養A549肺腺癌細胞、線維芽細胞およびDMEM中でA549の三次元共培養は、10％FBSを補充した。
- コラーゲンゲルfはormation：
- 1×PBSで10cmディッシュ上で培養した線維芽細胞を洗浄し、プレートにトリプシンの1ミリリットルに私を追加します。 37℃で約5分間トリプシン処理した後、10％のFBSを添加した9ミリリットルのDMEMを用いて細胞を切り離す。 10ミリリットルチューブに培地に懸濁した細胞を収集し、細胞ペレットを形成するために、200〜300×gで、それらを遠心する。
- 5×10 5 / mlの密度で、100％FBS中で得られたペレットを再懸濁する。
- 氷上のコラーゲンゲルを準備します。次の手順の前に冷蔵庫での試薬、ピペット、チューブクール。偶数氷上で、混合物をある程度固化し、全量を全成分の合計よりも小さい。
- 各ウェルに、（2.5×10 5細胞）、線維芽細胞懸濁液を0.5mlとを混合してコラーゲンゲルを調製FBS、2.3ミリリットルタイプIAコラーゲン、670μlの5×DMEM、および330μlの再構成緩衝液中で。ゲルは、室温で容易に設定することができます。
- 激しく均質マイルを確実にするためにピペット固定装置。ペッティングプロセス中に気泡を作成しないでください。
- 6ウェルプレートの各ウェルに、混合物（3 ml）を添加し、30〜60分間妨害することなく、37℃のインキュベーター内でゲル化することを可能にする。
- コラーゲンゲル上の癌細胞培養：
- 6変更を加えて、以前に報告されたプロトコルを使用して、3次元共培養を行います。
- 3D共培養培地に再懸濁癌細胞（またはA549細胞の場合は10％FBSを含むDMEM中で）1×10 5 / mlの密度で。
- 各ゲルの表面上に再懸濁した細胞溶液2ml（2×10 5細胞）を注ぐ。実験条件に依存して、共培養中の癌細胞または線維芽細胞の細胞数を変更する。
- ゲル収縮：
- 癌細胞がコラーゲンゲルに付着することができるように、37℃で一晩ゲルをインキュベートする。各ゲルを切り離し、およびOを各ウェルに「浮遊培養 'を生成6ウェルプレートfは。
NOTE：浮遊培養を使用することにより、ゲルの大きさの様々な変更は、共培養癌細胞と線維芽細胞との間の細胞の相互作用によって媒介される機械的張力およびコラーゲン分解によって誘導される。 - ウェルの端から各ゲルを分離するために角度の付いた21 G針や小さなへらを使用してください。 2〜3日おきに、3次元共培養培地2mlでウェルをリフレッシュ。 5日間毎日各ゲルの大きさを測定します。
- 癌細胞がコラーゲンゲルに付着することができるように、37℃で一晩ゲルをインキュベートする。各ゲルを切り離し、およびOを各ウェルに「浮遊培養 'を生成6ウェルプレートfは。
- コラーゲンゲルの分析：
- このようSircolアッセイコラーゲン定量法を用いて、各ゲルのコラーゲン含有量を測定する。ゲル5からRNAを収集した後、トランスクリプトーム解析または定量的RT-PCRを行います。
3.気液界面文化と浸潤アッセイ
- 5日間37℃でコラーゲンゲルを培養した後、新たな6-メッシュ（70μmの孔サイズ）に配置して空気に収縮したゲルを暴露ウェルプレート。フローサイトメトリーのために使用される市販の細胞ストレーナーからメッシュを作成します。
- 静かに3D共培養培地の11ミリリットルで、各ウェルを埋める。
- 無菌のスプーンを使用してメッシュ上にゲルを置き、ゲルから、残りの培地を除去。空気にゲルの上面を露出しながら、この状態では、媒体中のゲルを水没。気液界面、この培養条件を定義する。
注：インキュベーター中、37℃で気液界面培養を維持5-7日後に、浸潤性癌細胞がゲル中に移動する。細胞型および細胞の相互作用の結果として依存して、癌細胞の細胞形態変化の可変度は、気液界面培養によって誘導される。 - 組織学的評価のために、室温で一晩ホルマリン溶液中でゲルを固定し、パラフィンに埋め込む。ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）で垂直セクション（4μm）を染色する。免疫組織化学的分析のOを実行nはセクション4。
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Representative Results
この共培養法は、腫瘍微小環境を模倣し、コラーゲンゲルに埋め込まれた癌細胞と線維芽細胞との間の相互作用を研究するための有用なツールである。コラーゲンゲル収縮、癌細胞浸潤および形態学的変化：以前の研究では、3つのパラメータは、この実験モデルで評価した。癌細胞の増殖はKi67の免疫染色4を用いて推定した。肺の組織サンプルを切除肺葉（ 図1A）の癌性及び非癌切片から回収した。サンプルを小片に刻んだとDMEM中で培養し、10％FBS（ 図1B）を補充した。組織切片から成長した線維芽細胞は、顕微鏡（ 図1C）で観察した。初代培養肺線維芽細胞は、コラーゲンゲル中に包埋した（ 図2A、a）およびA549肺癌細胞をゲル上で共培養した（ 図2A、b）をフローティングCの後培地中のulture（ 図2A、c）は 、ゲルは、気液界面（ 図2A、d）の条件でさらに培養した。ゲルは、ホルマリンで固定し、免疫組織化学的分析（ 図2A、e）のために使用した。気液界面培養のために、ゲルを6ウェルプレートのウェル（ 図2B）メッシュ上に置いた。ゲルの組織学的分析は、肺癌関連線維芽細胞（ 図3）が埋め込 まれたコラーゲンゲルにA549細胞の浸潤を明らかにした。
図1：外科的に切除ヒト肺組織からの線維芽細胞の増殖。 （A）試料を切除肺葉の癌性及び非癌切片から回収した。（B）試料を小片に刻み、10％FBSを補充したDMEM中で培養した。（C）線維芽細胞は、組織切片（矢印）から生まれました。細胞は培養皿上の外科用メスの刃によって作ら傷に沿って移行していることに注意してください。スケールバーは200μm。
図2：コラーゲンゲルの空気-液体界面培養 A549細胞は、線維芽細胞が埋め込 まれたコラーゲンゲル上で共培養し、A549細胞の層は、媒体中のメッシュにゲルを配置することによって空気に曝露した（A。三次元共培養し、空気-液体界面の）実験手順。肺線維芽細胞が埋め込 まれた（a）のコラーゲンゲル（b）は、A549細胞をコラーゲンゲル上で共培養した。（c）に浮遊培養する。（d）の気中液界面（ALI）。ホルマリンゲルの（e）の固定（B）番目の代表的な画像電子ゲルを6ウェルプレートのウェル中に、メッシュ上に置いた。 O / N：一晩。
A549細胞およびヒト肺線維芽細胞からなる三次元培養ゲルの断面の図3ヘマトキシリンおよびエオシン染色。コラーゲンゲル上で培養され、そのA549細胞注線維芽細胞（矢印）が埋め込 まれたゲルに侵入した。スケールバー、200μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
CAFSは、癌細胞の周囲のECMの主要な成分を形成し、腫瘍のための足場を提供するだけでなく、積極的に腫瘍の発達7に参加するだけでなく。証拠を蓄積すると、CAF媒介腫瘍進行8の重要な役割を強調し、最終的な予後上のCAFSまたはその関連分子の影響を解く。
以前の研究では、肺CAFS 4を単離するための成長方法を用いた。この実験では、皿の表面上に組織切片接着の維持が重要である。細胞は、培地中に浮遊組織切片から移行することができない、組織切片表面から切り離されると、それらはもはや同じ培養皿上の細胞伸長のために使用することができない。組織の切断は、皿表面に付着するための接着剤として機能する排出物を、得られます。カバースリップを有する組織切片を固定する際に、使用されるグリース量もcritiあるCAL。グリース少量の過剰なグリースは、細胞培養領域を隠しながら、取り付けられたカバースリップを維持することができない。カバースリップを、適切な圧力を用いて組織切片の結合は、細胞成長を促進するための鍵である。
癌細胞増殖および浸潤のための実験モデルは、主に二次元単層組織培養物またはボイデンチャンバーアッセイに頼ってきた。より良い間通信および癌細胞の挙動のECM依存変調を理解するために、三次元の共培養は、強力なツールである。彼らは高い技術力を必要とし、実験条件が限られているものの器官培養物は、また、多細胞の相互作用を調査するために便利です。
我々の共培養モデルは、腫瘍の微小環境を模倣する条件下で、腫瘍 - 間質相互作用を評価するためのプラットフォームとして機能する。特定の遺伝子の過剰発現またはノックダウンを有する細胞は、私たちのcultuで容易に適用可能である器官の文化よりも有利であるシステム、再。注目すべきことに、我々の以前の観察は、共培養した線維芽細胞が積極的に癌細胞の分化および浸潤4を調節することを示唆した。このような内皮細胞、炎症細胞および非癌性上皮細胞としての実験設定で可能な多細胞相互作用を試験することは興味深いであろう。
CAFSの別個の特徴は、一次CAF培養物およびそれらの正常な対応物9を使用して、共培養試験または遺伝子発現プロファイリングによって実証されている。一方、これらの研究はまた、CAFS 10、11または転写因子の活性化12増殖因子シグナルの異なるレベルに起因するかもしれないそのうちの一部の腫瘍内または個人間の異質性を示している。これにより、さらに癌患者13から導出異質CAFSを特徴付けるために不可欠である。繰り返しの細胞継代後に、初代培養CAFSの特性が変更されてもよい。したがって、初期の継代でCAFSを特徴付けるために良いだろう。
CAFSは、順番に、張力誘発される細胞シグナリングを通じてCAFSを活性化し得る、ECM沈着およびリモデリングに寄与する。 CAFの活性化のようなメカノ媒介フィードフォワードループ14が示唆されており、我々のコラーゲンゲル収縮モデルは、これらのメカニズムへの洞察を提供してもよい。コラーゲンゲル収縮のメカニズムは、細胞収縮、増殖、遊走、分化、およびコラーゲン改造15を含む。リガンド、阻害剤、またはRNAiを用いて詳細な組織学的研究及び実験は、腫瘍間質相互作用に機構的洞察を得るために有用であり得る。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| FBS | GIBCO | 10437 | |
| Collagen type IA | Nitta gelatin Inc. | CELL-1A | |
| Reconstitution buffer | Nitta gelatin Inc. | ||
| Cover slip | NUNC | 174934 | |
| Silicone grease | Dow Corning Toray | High vacuum grease | |
| Dispase I | WAKO | 386-02271 | |
| 6-well plate | BD Falcon | 353046 | |
| Cell strainer (70 μm) | BD Falcon | 352350 |
References
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